ข้อมูล

15.1: แบคทีเรียก่อโรค - ชีววิทยา

15.1: แบคทีเรียก่อโรค - ชีววิทยา



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

15.1: แบคทีเรียก่อโรค

การดื้อยาปฏิชีวนะ: แบคทีเรีย 'นอนหลับ' ที่สามารถอยู่รอดได้ด้วยยาระบุ

การวิจัยพบว่า 'เซลล์นอนหลับ' ซึ่งสามารถอยู่รอดได้ในปริมาณยาปฏิชีวนะและนอนพักในสภาวะสงบนิ่ง อาจเป็นกุญแจสำคัญในการทำความเข้าใจการดื้อยาปฏิชีวนะ การวิจัยพบว่า

Dr Stefano Pagliara นักชีวฟิสิกส์จากมหาวิทยาลัย Exeter ได้พัฒนาวิธีการใหม่ในการระบุเซลล์ที่มีแนวโน้มว่าจะรอดจากยาปฏิชีวนะ แม้กระทั่งก่อนการรักษาด้วยยา

งานวิจัยที่ตีพิมพ์ในวารสาร ชีววิทยา BMCวางรากฐานในการทำความเข้าใจคุณสมบัติพิเศษของแบคทีเรียที่สามารถอยู่รอดได้ด้วยยาปฏิชีวนะ เพื่อให้สามารถพัฒนาวิธีการใหม่ในการกำหนดเป้าหมายของแบคทีเรียได้

การดื้อยาปฏิชีวนะเป็นหนึ่งในความท้าทายด้านสาธารณสุขที่เร่งด่วนที่สุด และคุกคามความสามารถในการต่อสู้กับโรคติดเชื้ออย่างมีประสิทธิภาพ รวมทั้งโรคปอดบวมและวัณโรค

หลังจากให้ยาแอมพิซิลลินกับแบคทีเรีย ทีมงานของมหาวิทยาลัย Exeter พบว่าเซลล์ส่วนใหญ่ 1.3 เปอร์เซ็นต์ที่รอดชีวิตมีชีวิตแต่ไม่เติบโต

ดร.พากลิอาราเรียกพวกมันว่า 'เซลล์นอนหลับ' เพราะพวกมันดูอยู่เฉยๆ และคล้ายกับเซลล์ที่ถูกฆ่าโดยยาปฏิชีวนะ แต่อาจเป็นอันตรายได้ด้วยความสามารถในการ 'ปลุก' และแพร่เชื้อสู่คนหรือสัตว์อีกครั้ง

ทีมวิจัยของมหาวิทยาลัย Exeter พบว่าเซลล์สองประเภทที่รอดชีวิตจากยาปฏิชีวนะ ได้แก่ 'เซลล์นอนหลับ' และเซลล์คงอยู่ มีลักษณะที่คล้ายคลึงกันซึ่งบ่งชี้ว่าประชากรทั้งสองเซลล์เชื่อมโยงกัน การเรืองแสงที่เป็นเอกลักษณ์ทำให้สามารถตรวจพบทั้งคู่ได้ก่อนที่จะให้ยาปฏิชีวนะ

แต่เนื่องจาก 'เซลล์นอนหลับ' ไม่เติบโต วิธีการตรวจหามาตรฐานจึงไม่สามารถแยกความแตกต่างจากเซลล์ที่ตายแล้ว ทำให้เกิดความรู้สึกผิดๆ ว่าเซลล์จำนวนน้อยกว่ามากที่รอดชีวิตจากการใช้ยาปฏิชีวนะได้

ทีมงานของมหาวิทยาลัย Exeter รวมถึง Dr Rosie Bamford และ Ashley Smith ใช้อุปกรณ์ย่อขนาดซึ่งทำให้พวกเขาสามารถแยกและศึกษาแบคทีเรียเดี่ยวเมื่อเวลาผ่านไป อุปกรณ์นี้สามารถใช้ศึกษาแบคทีเรียที่คุกคามสุขภาพของมนุษย์หรือสัตว์ได้

โดยใช้การเรืองแสงเพื่อทำให้เซลล์แต่ละเซลล์สว่างขึ้น พวกเขาระบุ 'เซลล์หลับ' ที่ทำงานได้แต่อยู่เฉยๆ ซึ่งดูราวกับว่าพวกมันตายหรือกำลังจะตายหลังจากได้รับการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะ เซลล์ที่รอดตายอีกประเภทหนึ่งที่เรียกว่าเซลล์ถาวร ซึ่งคิดเป็นเซลล์ที่รอดตายน้อยกว่าหนึ่งในสาม เริ่มงอกใหม่หลังจากสิ้นสุดการใช้ยาปฏิชีวนะ

เซลล์ที่รอดชีวิตจากการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะสามารถแบ่งตัวได้ในที่สุด นำไปสู่การติดเชื้อซ้ำได้ในขณะที่เพิ่มความเสี่ยงของการพัฒนาการดื้อยาปฏิชีวนะ

Dr Pagliara อาจารย์อาวุโสในสถาบัน Living Systems แห่งมหาวิทยาลัย Exeter กล่าวว่า:

"การดื้อยาปฏิชีวนะเป็นหนึ่งในความท้าทายด้านสุขภาพที่ร้ายแรงในยุคของเรา เซลล์ที่เราตรวจพบว่าไม่ได้รับการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะและเป็นภัยต่อสุขภาพของมนุษย์ อันที่จริง 'เซลล์ที่หลับใหล' ต่างจากเซลล์ที่คงอยู่ซึ่งจะกลับมาเติบโตอย่างรวดเร็วหลังจากสิ้นสุดหลักสูตรยาปฏิชีวนะ 'เซลล์ที่หลับใหล' ยังคงไม่เติบโตเป็นเวลานาน และหลีกเลี่ยงการตรวจจับโดยใช้วิธีการแบบเดิม"

"การวิจัยของเราควรช่วยให้พัฒนา biomarkers เพื่อแยกเซลล์เหล่านี้ได้ง่ายขึ้นและเปิดวิธีการใหม่ในการทำแผนที่องค์ประกอบทางชีวเคมีของแบคทีเรียที่สามารถหลบหนียาปฏิชีวนะได้เพื่อให้เราสามารถหาวิธีกำหนดเป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพ"

Dr Pagliara กำลังวางแผนโปรแกรมเพื่อระบุและแยก 'เซลล์หลับ' ของแต่ละบุคคลสำหรับการวิเคราะห์อย่างละเอียดด้วยการจัดลำดับรุ่นต่อไปเพื่อดูว่าพวกมันแสดงยีนที่แตกต่างจากเซลล์ที่ไม่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะอย่างไร


15.1: แบคทีเรียก่อโรค - ชีววิทยา

บทความทั้งหมดที่เผยแพร่โดย MDPI เผยแพร่ทันทีทั่วโลกภายใต้ใบอนุญาตการเข้าถึงแบบเปิด ไม่จำเป็นต้องได้รับอนุญาตพิเศษเพื่อนำบทความทั้งหมดหรือบางส่วนที่เผยแพร่โดย MDPI กลับมาใช้ใหม่ รวมถึงตัวเลขและตาราง สำหรับบทความที่ตีพิมพ์ภายใต้ใบอนุญาต Creative Common CC BY แบบเปิด ส่วนหนึ่งส่วนใดของบทความอาจถูกนำกลับมาใช้ใหม่โดยไม่ได้รับอนุญาตโดยมีเงื่อนไขว่าบทความต้นฉบับมีการอ้างอิงอย่างชัดเจน

เอกสารคุณลักษณะแสดงถึงการวิจัยขั้นสูงสุดที่มีศักยภาพสำคัญสำหรับผลกระทบสูงในภาคสนาม เอกสารคุณลักษณะจะถูกส่งเมื่อได้รับคำเชิญหรือคำแนะนำเป็นรายบุคคลโดยบรรณาธิการทางวิทยาศาสตร์และได้รับการทบทวนโดยเพื่อนก่อนที่จะตีพิมพ์

เอกสารคุณลักษณะสามารถเป็นได้ทั้งบทความวิจัยต้นฉบับ การศึกษาวิจัยนวนิยายจำนวนมากที่มักเกี่ยวข้องกับเทคนิคหรือแนวทางต่างๆ หรือรายงานการทบทวนที่ครอบคลุมพร้อมข้อมูลอัปเดตที่กระชับและแม่นยำเกี่ยวกับความก้าวหน้าล่าสุดในสาขาที่ทบทวนความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ที่น่าตื่นเต้นที่สุดอย่างเป็นระบบ วรรณกรรม. กระดาษประเภทนี้ให้มุมมองเกี่ยวกับทิศทางการวิจัยในอนาคตหรือการใช้งานที่เป็นไปได้

บทความ Editor's Choice อิงตามคำแนะนำของบรรณาธิการทางวิทยาศาสตร์ของวารสาร MDPI จากทั่วโลก บรรณาธิการเลือกบทความจำนวนเล็กน้อยที่ตีพิมพ์เมื่อเร็วๆ นี้ในวารสารที่พวกเขาเชื่อว่าน่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับผู้เขียน หรือมีความสำคัญในสาขานี้ จุดมุ่งหมายคือการจัดทำภาพรวมของงานที่น่าตื่นเต้นที่สุดบางส่วนที่เผยแพร่ในพื้นที่การวิจัยต่างๆของวารสาร


การอภิปราย

สัญญาณที่แพร่หลายของการแนะนำตัวในยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน

ยีนหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันมีตัวแปรโบราณที่มีความถี่สูง ตัวอย่างเช่น เราระบุคลัสเตอร์ของยีนห้ายีนใน EAS รวมถึง TLR สามตัว ซึ่งแสดงอัตราการแนะนำที่สูง ยีน TLR ทั้งสามนี้เป็นคลัสเตอร์ของยีนที่เชื่อมโยงทางกายภาพ ซึ่งเป็นที่รู้กันว่าอยู่ภายใต้การเลือกในเชิงบวกและสมดุลในยูเรเซียน (Dannemann et al. 2016 Deschamps et al. 2016 Quach et al. 2016) เรายังระบุยีนที่เกี่ยวข้องกับ TLR อีก 2 ยีนที่มีส่วนต่าง ๆ ของนีแอนเดอร์ทัลใน EAS: IRAK4 และ MYD88. ยีนทั้งสองนี้เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อเชื้อโรคและเชื่อมโยงกับตัวรับ TLR ตามหน้าที่เนื่องจากเป็นรหัสสำหรับโปรตีนที่กระตุ้นโดย TLR เพื่อสร้างโปรตีนเชิงซ้อน เรายังระบุกลุ่มของยีนที่เชื่อมโยงกันสามกลุ่มซึ่งมีสายพันธุ์ที่ได้รับการแนะนำมากเกินไปซึ่งทั้งหมดอยู่ในตระกูล OAS (2′-5′-oligoadenylate synthetase) ในสกุลเงินยูโร ยีนเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อเชื้อโรคและได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ว่าเป็นผู้สมัครรับการแนะนำแบบปรับตัว ( Mendez et al. 2013 Sams et al. 2016) อีกตัวอย่างหนึ่งของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันแบบแนะนำคือบริเวณที่มี STAT2 และ ERBB3 ในปาปัว มีการแสดงอย่างชัดเจน ( Mendez et al. 2012) ว่าฮาโปโลไทป์ขนาดใหญ่ 250 kb ของบรรพบุรุษ Denisovan แยกจากกันที่ความถี่สูงและครอบคลุมยีนเหล่านี้NS. แม้ว่าเราจะไม่ระบุในเครือข่ายที่สำคัญของเราว่ามี haplotypes ที่ถูกแนะนำมากเกินไปใน STAT2/ERBB3 บริเวณคลัสเตอร์ เราพบยีนที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด เช่น JAK1และยีนอื่นๆ อีกมากมายที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน (ตารางที่ 1) มันแสดงให้เห็นว่ายีนที่เกี่ยวข้องกับหน้าที่อื่นๆ อาจถูกกำหนดเป้าหมายโดยการคัดเลือก และการแนะนำแบบปรับตัวในกรณีนี้เกี่ยวข้องกับยีนมากกว่าที่เคยคิดไว้

การต้านทานโรคมาลาเรียที่เป็นไปได้

น่าสนใจ สัญญาณแนะนำตัวบางส่วนที่เราระบุในปาปัวสามารถเชื่อมโยงกับยีนที่อาจเกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อมาลาเรีย กลยุทธ์ทั่วไปในการต้านทานโรคมาลาเรียนั้นเกี่ยวข้องกับข้อบกพร่องในการเผาผลาญและโครงสร้างของเซลล์เม็ดเลือดแดงตามปกติ (วิลเลียมส์ 2549) มีการตั้งข้อสังเกตว่าการกลายพันธุ์หลายครั้งทำให้เกิดโรคโลหิตจางชนิดเคียว (ฮีโมโกลบิน เอส) ธาลัสซีเมีย โรคไข่ตกในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ หรือกลูโคส-6-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส (G6PD) การขาดสารอาหารสามารถป้องกันโรคมาลาเรียได้โดยธรรมชาติ (ทบทวนในวิลเลียมส์ 2549) ภาวะไข่ตก ซึ่งเป็นภาวะทางพันธุกรรมที่เม็ดเลือดแดงส่วนใหญ่มีรูปร่างเป็นวงรี เป็นฟีโนไทป์ที่เกิดขึ้นในประชากร PNG มากถึง 20% หรือมากกว่า ( Amato and Booth 1977) ข้อบกพร่องของเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดงมีฐานทางพันธุกรรมหลายอย่าง หนึ่งในนั้นคือการกลายพันธุ์ในยีน SPTB ( Iolascon et al. 2003 Lelliott et al. 2017) ซึ่งเป็นหนึ่งในยีนของเราที่เสนอให้อยู่ภายใต้การแนะนำแบบปรับตัว การกลายพันธุ์บางอย่างใน SPTB ยีนที่พบในจีโนมโบราณและยีนที่แยกจากกันในปาปัว แต่ซึ่งเกือบจะขาดหายไปจากส่วนอื่นๆ ของโลก ก่อนหน้านี้มีความเกี่ยวข้องกับฟีโนไทป์ของไข่ปลา (ดูบันทึกของ ClinVar ในตารางเสริม S2 วัสดุเสริมออนไลน์) นอกจากนี้ยังเป็นที่น่าสนใจที่จะเห็นว่าตัวขนส่งกลูโคสสองตัว (GLUT2 และ GLUT12) และ G6PD2 ยีนยังมีตัวแปรโบราณที่มากเกินไป เมแทบอลิซึมของกลูโคสในเซลล์เม็ดเลือดแดงมีผลอย่างมากต่อการอยู่รอดของ พลาสโมเดียม ปรสิต ( วิลเลียมส์ 2549) และด้วยเหตุนี้จึงทำให้มนุษย์อ่อนแอต่อโรคมาลาเรีย เราสันนิษฐานว่าการแนะนำตัวอาจเป็นแหล่งที่มาของตัวแปรต่างๆ ที่ปรับเปลี่ยนได้หลายแบบซึ่งเพิ่มความเหมาะสมของบุคคลในสภาพแวดล้อมที่โรคมาลาเรียเป็นโรคประจำถิ่น เนื่องจากอัลลีลที่ดื้อต่อมาลาเรียมักปรากฏขึ้นหลังจากการเปลี่ยนแปลงยุคหินใหม่ ( Hedrick 2012) อัลลีลเหล่านี้อาจมีอยู่ในประชากรโบราณมาเป็นเวลานาน โดยจะพัฒนาอย่างเป็นกลางในกรณีที่ไม่มีมาลาเรีย และได้รับการคัดเลือกในเชิงบวกเมื่อโรคปรากฏขึ้นเท่านั้น ( Laval et al. 2019). อีกทางหนึ่ง ประชากรโบราณที่อาศัยอยู่ในพื้นที่เขตร้อนอาจได้รับเชื้อเอนโดปาราไซต์ที่คล้ายคลึงกัน ซึ่งอาจเป็นไปได้เนื่องจากปรสิตมาลาเรียแพร่เชื้อในสัตว์มีกระดูกสันหลังจำนวนมาก รวมทั้งลิงใหญ่ ซึ่งเป็นแหล่งที่มีแนวโน้มมากที่สุดของการแพร่เชื้อปรสิตสู่มนุษย์ (Prugnolle et al. 2011) ไม่ว่าในกรณีใด ผลลัพธ์ของเรายืนยันว่าการแนะนำแบบโบราณนั้นแพร่หลายในยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันและเชื้อโรคนั้นเป็นตัวแทนของแรงกดดันในการคัดเลือกที่แข็งแกร่งซึ่งอาจเป็นหนึ่งในสาเหตุหลักของวิวัฒนาการแบบปรับตัวในมนุษย์ ( Fumagalli et al. 2011 Daub et al. 2013 Dannemann et al. 2016 Quach et al. 2016 Enard และ Petrov 2018)

แนะนำตัวในตระกูล SLC

ยีนจากตระกูล SLC เข้ารหัสสำหรับโปรตีนขนส่งเมมเบรนและเกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาที่แตกต่างกันหลายประการ แวเรียนต์นีแอนเดอร์ทัลที่ตำแหน่ง SLC สองตำแหน่ง (SLC6A11 และ SLC6A13) ก่อนหน้านี้มีความเกี่ยวข้องกับลักษณะพฤติกรรม (ภาวะซึมเศร้า ความผิดปกติทางอารมณ์ และพฤติกรรมการสูบบุหรี่) และอัลลีลบางตัวได้รับการแสดงว่ามีความพิเศษในสมอง (Simonti et al. 2016 Dannemann and Kelso 2017) ในชาวปาปัว เราพบยีนที่แสดงการเกริ่นนำมากเกินไปอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสัมพันธ์กันตามลำดับกับความอ่อนแอของออทิสติกและโรคสมาธิสั้น/สมาธิสั้น เช่น SLC9A9 (Lasky-Su et al. 2008). ในที่นี้ เรารายงานยีนอื่นๆ จากตระกูลเดียวกันที่มีการแสดงออกโดยอคติของสมอง และแสดงส่วนที่เกินมาใน EAS และ EUR: SLC6A1 (ผู้ขนส่ง GABA) SLC6A5 (ตัวขนส่งสารสื่อประสาทไกลซีนที่ขึ้นกับโซเดียมและคลอไรด์) และ SLC28A1เช่นเดียวกับใน PNG: SLC4A10 (ควบคุม pH ภายในเซลล์ของเซลล์ประสาท การหลั่งของไบคาร์บอเนตไอออนในช่องท้องของคอรอยด์ และค่า pH ของของเหลวนอกเซลล์ในสมอง) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการแนะนำแบบโบราณอาจส่งผลต่อลักษณะทางพฤติกรรม/ระบบประสาทด้วย แม้ว่าจะเป็นเรื่องยากที่จะเชื่อมโยงฟีโนไทป์เหล่านี้กับแรงกดดันในการเลือกที่แม่นยำ ยีน SLC อื่น ๆ ที่แสดงการเกริ่นนำในระดับสูงรวมถึงการเข้ารหัสยีนสำหรับผู้ขนส่งกลูโคสสองตัวใน PNG (SLC2A2 และ SLC212), และ SLC24A4 ใน EAS ที่เกี่ยวข้องกับสีผมและผิวคล้ำและการแนะนำแบบปรับตัวของตัวแปรโบราณที่สถานที่นี้ได้รับการตั้งสมมติฐาน (Dannemann และ Kelso 2017) ยีน SLC ที่เหลือมีหน้าที่จำเพาะน้อยกว่า ดังนั้นจึงยากที่จะเชื่อมโยงกับกระบวนการทางชีววิทยาเฉพาะ

ตัวรับกลิ่น

แฮปโลไทป์ Neandertal ขนาดใหญ่ที่ล้อมรอบ OR หลายตัวในบริเวณศูนย์กลางของโครโมโซม 11 นั้นพบได้ที่ความถี่ประมาณ 10% ในสกุลเงินยูโร การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ชี้ให้เห็นว่าบริเวณศูนย์กลางทั้งหมดได้รับการแนะนำในสกุลเงินยูโร (Langley et al. 2019) ยีนเหล่านี้สั้นและกระจุกตัวกัน อธิบายได้ว่าทำไมวิถีของ OR จึงมีความสำคัญในการทดสอบการเสริมสมรรถนะที่ถือว่าเป็นอิสระระหว่าง loci ที่น่าสนใจกว่า 40% ของ 856 OR ยีนในจีโนมมนุษย์อยู่ในกลุ่มยีน 28 กลุ่มบนโครโมโซม 11 ( Taylor et al. 2006) อย่างไรก็ตาม แม้ว่ารูปแบบการเสริมสมรรถนะที่เราสังเกตเห็นอาจเกิดจากการเชื่อมโยงทางกายภาพ แต่เราสังเกตเห็นว่าฮาโพลไทป์ที่ยาวมากซ้อนทับเซนโทรเมียร์ของโครโมโซม 11 ซึ่งรวมถึง OR จำนวนมาก และเพิ่งได้รับการแนะนำในมนุษย์จากนีแอนเดอร์ทัล อันที่จริง อัตราการรวมตัวกันของภูมิภาคนี้ต่ำมาก แต่ก็ไม่ต่ำพอที่จะทำให้เข้ากันได้กับ ILS เนื่องจากความแตกต่างกับมนุษย์โบราณ อย่างไรก็ตาม ยังถือว่าต่ำมากที่จะยังคงสังเกตลักษณะรูปร่างสันหลังยาวเช่นนี้เป็นเวลาหลายหมื่นปีหลังจากเหตุการณ์การเกริ่นนำ แม้ว่ากรณีของการแนะนำแบบปรับตัวได้มีแนวโน้มสำหรับภูมิภาคนี้ เป็นการยากที่จะระบุข้อจำกัดในการคัดเลือกที่แน่นอนซึ่งส่งเสริมความหลากหลายนี้ในภูมิภาคนี้ เนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่าง OR เหล่านี้กับฟีโนไทป์ของมนุษย์ยังคงถูกกำหนด

เปรียบเทียบกับการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของชุดยีนอื่น ๆ ของการแนะนำแบบโบราณ

การศึกษาอื่น ๆ ได้ศึกษารูปแบบการเพิ่มคุณค่าของการแนะนำตัวในกระบวนการทางชีววิทยา โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราสอดคล้องกับแนวโน้มที่สังเกตพบในการศึกษาอื่นๆ แต่ความแตกต่างที่สังเกตได้บางอย่างอาจเกิดจากความแตกต่างในชุดข้อมูล สมมติฐาน และสมมติฐานเฉพาะที่เราทดสอบ Enard และ Petrov (2018) กำหนดชุดโปรตีน 4,534 ที่จัดการด้วยตนเองซึ่งมีปฏิสัมพันธ์กับไวรัส พวกเขาเปรียบเทียบรูปแบบการแนะนำตัวในชุดนี้และในโปรตีนประเภทอื่น และทำการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะของยีน Ontology เพื่อทดสอบว่าโปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์กับไวรัสที่ได้รับการแนะนำอย่างสูงนั้นได้รับการเสริมสมรรถนะในหน้าที่จำเพาะ ซึ่งเผยให้เห็นว่าส่วนใหญ่ตามที่คาดไว้ เส้นทางภูมิคุ้มกัน ( Enard และ Petrov 2018) การทดสอบการเพิ่มคุณค่าที่ดำเนินการในการศึกษาอื่น ๆ ใช้ฐานข้อมูล Gene Ontology ( Sankararaman et al. 2014, 2016 Enard และ Petrov 2018 Steinrücken et al. 2018) Gene Ontology มีเพียงชุดของยีนและไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับปฏิสัมพันธ์ (ดังนั้นจึงไม่มีเครือข่าย) ซึ่งจะทำให้เราไม่สามารถดำเนินการเครือข่ายย่อยที่ดำเนินการในการศึกษานี้ ดังนั้นเราจึงใช้การวิเคราะห์ของเราบนฐานข้อมูลวิถีทางชีวภาพอื่น ๆ ซึ่งรวมถึงชุดของยีนและหน้าที่ต่างกัน โดยอธิบายว่าเหตุใดกระบวนการบางอย่างจึงไม่ได้รับการทดสอบด้วยวิธีของเรา ตัวอย่างเช่น กระบวนการสร้างเส้นใยเคราตินประกอบด้วยชุดของยีนที่ได้รับการแนะนำอย่างสูงในสกุลเงิน EUR และ EAS ( Sankararaman et al. 2014, 2016 Steinrücken et al. 2018) แต่ก็ไม่ได้ผลของเราเพียงเพราะเราไม่มีสิ่งนี้ เส้นทางระหว่างเครือข่ายของเรา แม้ว่าเราจะสูญเสียข้อมูลบางส่วนไปโดยการจำกัดตัวเราไว้ที่เครือข่ายยีน แต่ข้อดีของแนวทางของเราคือ เราสามารถค้นหายีนที่มีปฏิสัมพันธ์โดยตรงและระบุว่าส่วนย่อยของเส้นทางใดที่อาจขับเคลื่อนการปรับตัวได้

การทดสอบใหม่เพื่อตรวจจับรูปแบบที่ขัดแย้งกัน

ในการศึกษานี้ เราได้แนะนำแนวทางใหม่ในการตรวจหาการเชื่อมโยงแบบไม่สุ่มของอัลลีลที่ถูกแนะนำภายในบุคคลในระดับชุดของยีน วิธีการนี้คล้ายกับการทดสอบ LD แต่ 1) ดำเนินการในระดับบุคคลมากกว่าที่ระดับประชากร 2) ถูกจำกัดให้เกี่ยวข้องกับหน้าที่ มีความหมายทางชีวภาพ ชุดของยีน และ 3) เราทำการทดสอบครั้งเดียวต่อ ชุดยีน โดยไม่คำนึงถึงจำนวนยีนที่มีอยู่ในชุดยีนนี้ ซึ่งหลีกเลี่ยงปัญหาของการทดสอบหลายชุด แนวทางนี้อาจเป็นวิธีที่ดีในการระบุยีนกลุ่มเล็กๆ ที่มีความหลากหลายซึ่งมีปฏิสัมพันธ์เชิงบวกกับ epistatic ซึ่งสมควรได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมและการตรวจสอบการทำงาน

ในการตรวจสอบสัญญาณจีโนมของการคัดเลือกโพลีจีนิกจากข้อมูลจีโนมเท่านั้น เป็นการยากที่จะแยกแยะระหว่างสองสถานการณ์ที่เป็นไปได้: การเลือกลำดับของยีนอิสระหรือการเลือกอัลลีลพร้อมกันที่ตำแหน่งต่างๆ ภายในบุคคล (ผ่านภาวะ epistasis เชิงบวก) โดยมีเงื่อนไขว่าอัลลีลสามารถจำแนกได้เป็นสองประเภท (ในกรณีของเราแบบแนะนำและไม่แนะนำ) วิธีการของเราอนุญาตให้บุคคลหนึ่งแยกความแตกต่างระหว่างการเลือกโพลีจีนิกสองประเภทนี้: การเลือกอิสระที่ตำแหน่งที่แตกต่างกัน และการเลือกแบบ epistatic ภายในชุดยีน โดยการนำวิธีนี้มาใช้กับการแนะนำแบบโบราณในมนุษย์สมัยใหม่ เราพบหลักฐานการเลือกทั้งสองประเภทนี้ อย่างไรก็ตาม โปรดทราบว่าการทดสอบของเราค่อนข้างทั่วไป เนื่องจากสามารถนำไปใช้กับความแตกต่างอื่นๆ เช่น ภูมิหลังทางพันธุกรรมที่แตกต่างกันหรือสถานะบรรพบุรุษ/ที่ได้รับมา

วิธีการของเราแสดงให้เห็นว่าสัญญาณจีโนมของการคัดเลือกโพลีจีนิกที่เราสังเกตพบนั้นมักจะถูกอธิบายโดยการเลือกตำแหน่งอิสระและอาจเป็นไปตามลำดับที่เกี่ยวข้องกับหน้าที่ที่เกี่ยวข้อง (เช่น ฟังก์ชันภูมิคุ้มกันหรือเมตาบอลิซึม ตารางที่ 1) ผลลัพธ์ของเรายังเน้นให้เห็นถึงความจริงที่ว่าการเชื่อมโยงทางกายภาพอาจเป็นส่วนสำคัญของสัญญาณที่สังเกตพบในการทดสอบการตกแต่งครั้งก่อน อันที่จริง การเชื่อมโยงทางกายภาพระหว่าง loci จะทำให้สัดส่วนของยีนที่มีนัยสำคัญเพิ่มขึ้นเกินจริงในชุดยีนที่กำหนด ตัวอย่างเช่น ในกรณีของการแนะนำแบบโบราณ OR ได้รับการระบุหลายครั้งในการทดสอบการเสริมสมรรถนะ ( Sankararaman et al. 2014 Steinrücken et al. 2018) แต่เราสังเกตว่า OR ที่ได้รับการแนะนำอย่างสูง (อย่างน้อย 24 รายการ) จะรวมกลุ่มเข้าด้วยกันใน จีโนมที่อาจนำไปสู่สัญญาณปลอมของการเสริมสร้างเมื่อพิจารณาว่ายีนเหล่านี้เป็นอิสระ ตามมาด้วยว่าควรพิจารณาความเชื่อมโยงระหว่าง loci เมื่อทำการทดสอบการตกแต่ง

ที่น่าสนใจคือ เราพบชุดยีนที่สำคัญหลายชุดพร้อมสัญญาณของการเลือกสายพันธุ์ที่เก่าแก่ในสกุล EUR, EAS และ Papuans ชุดยีนเหล่านี้ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน และยีนบางส่วนเกี่ยวข้องกับการทำงานของเมตาบอลิซึม แม้ว่าสัญญาณที่สังเกตได้ค่อนข้างอ่อน (ดูรูปที่ 2 และรูปที่ S4 เพิ่มเติม วัสดุเสริมออนไลน์) ก็ยังคงมีนัยสำคัญหลังจากการแก้ไขสำหรับการทดสอบหลายครั้ง สังเกตว่าการสังเกต LD ที่แรงระหว่างตำแหน่งที่ไม่มีการเชื่อมโยงทางกายภาพนั้นจำเป็นต้องมีการคัดเลือก epistatic ที่แข็งแกร่งมาก ( Felsenstein 1965) ดังนั้นจึงยังคงเป็นที่น่าสังเกตว่าเราสังเกตสัญญาณของ epistasis เนื่องจากขนาดตัวอย่างที่ค่อนข้างเล็กซึ่งใช้การทดสอบของเรา


สารบัญ

ในปี พ.ศ. 2445 ข. ทูรินเจียนซิส ถูกค้นพบครั้งแรกในหนอนไหมโดยวิศวกรผ้าไหมชาวญี่ปุ่น อิชิวาตาริ ชิเกทาเนะ ( 石渡 繁胤 ) เขาตั้งชื่อมันว่า ข. ซอตโต้, [8] ใช้คำภาษาญี่ปุ่น ซอตโต ( 卒倒 , 'ยุบ') ในที่นี้หมายถึงอัมพาตจากแบคทีเรีย [9] ในปี 1911 นักจุลชีววิทยาชาวเยอรมัน Ernst Berliner ได้ค้นพบมันอีกครั้งเมื่อเขาแยกมันเป็นสาเหตุของโรคที่เรียกว่า Schlaffsucht ในหนอนผีเสื้อแป้งในทูรินเจีย (ด้วยเหตุนี้จึงมีชื่อเฉพาะ ทูรินเจียนซิส, "ทูรินเจียน") [10] ข. ซอตโต้ ภายหลังจะถูกมอบหมายใหม่เป็น ข. ทูรินเจียนซิส วาร์ ซอตโต้. [11]

ในปี 1976 Robert A. Zakharyan รายงานว่ามีพลาสมิดอยู่ในสายพันธุ์ของ ข. ทูรินเจียนซิส และชี้ให้เห็นถึงการมีส่วนร่วมของพลาสมิดในเอนโดสปอร์และการเกิดผลึก [12] [13] ข. ทูรินเจียนซิส มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ ข. ซีเรียส, แบคทีเรียในดิน และ ข. แอนทราซิสสาเหตุของโรคแอนแทรกซ์ของสิ่งมีชีวิตทั้งสามนั้นแตกต่างกันในพลาสมิดเป็นหลัก [14] : 34–35 เช่นเดียวกับสมาชิกในสกุลอื่น ทั้งสามชนิดเป็นแบบไม่ใช้ออกซิเจนที่สามารถผลิตเอนโดสปอร์ได้ [1]

การจัดวางกลุ่มพันธุ์ Edit

ข. ทูรินเจียนซิส อยู่ใน บาซิลลัส ซีเรียส หมู่ซึ่งกำหนดไว้อย่างหลากหลาย ได้แก่ ๗ ชนิดที่เกี่ยวข้องกันอย่างใกล้ชิด ได้แก่ ข. ซีเรียส sensu เข้มงวด (ข. ซีเรียส), ข. แอนทราซิส, ข. ทูรินเจียนซิส, ข. mycoides, ข. pseudomycoides, และ บี. พิษต่อเซลล์ [15] หรือเป็นหกชนิดใน บาซิลลัส ซีเรียส เซ็นซู ลาโต้: B. weihenstephanensis, ข. mycoides, ข. pseudomycoides, ข. ซีเรียส, ข. ทูรินเจียนซิส, และ ข. แอนทราซิส. ภายในกลุ่มนี้ บี.ที. มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ คริสตศักราช มันมีความเกี่ยวข้องมากขึ้นกับ ข.บ., บีม, บีพี, และ ป.ตรี [16]

ชนิดย่อย แก้ไข

มีหลายสิบชนิดย่อยที่รู้จักของ ข. ทูรินเจียนซิส. ชนิดย่อยที่ใช้กันทั่วไปเป็นยาฆ่าแมลง ได้แก่ ข. ทูรินเจียนซิส ชนิดย่อย kurstaki (บีทีเค) ชนิดย่อย อิสราเอล (Bti) และชนิดย่อย ไอซาวะ. [17] [18] [19] [20] บ้าง Bti เชื้อสายเป็นโคลน [16]

เป็นที่ทราบกันดีว่าบางสายพันธุ์มียีนที่ผลิตเอนเทอโรทอกซินใน ข. ซีเรียสและดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่ทั้ง ข. ซีเรียส กลุ่ม sensu lato อาจมีศักยภาพที่จะเป็น enteropathogens [16]

โปรตีนที่ ข. ทูรินเจียนซิส เป็นที่รู้จักมากที่สุดสำหรับถูกเข้ารหัสโดย ร้องไห้ ยีน [21] ในสายพันธุ์ส่วนใหญ่ของ ข. ทูรินเจียนซิสยีนเหล่านี้ตั้งอยู่บนพลาสมิด (กล่าวอีกนัยหนึ่ง ร้องไห้ ไม่ใช่ยีนโครโมโซมในสายพันธุ์ส่วนใหญ่) [22] [23] [24] [16] หากพลาสมิดเหล่านี้หายไปก็จะแยกไม่ออกจาก ข. ซีเรียส เช่น ข. ทูรินเจียนซิส ไม่มีลักษณะเฉพาะของสายพันธุ์อื่น การแลกเปลี่ยนพลาสมิดได้รับการสังเกตทั้งโดยธรรมชาติและจากการทดลองทั้งภายใน บี.ที. และระหว่าง บี.ที. และสอง congeners, ข. ซีเรียส และ ข. mycoides. [16]

plcR เป็นตัวควบคุมการถอดรหัสที่ขาดไม่ได้ของปัจจัยความรุนแรงส่วนใหญ่ การไม่มีปัจจัยดังกล่าวช่วยลดความรุนแรงและความเป็นพิษได้อย่างมาก บางสายพันธุ์ทำให้วงจรชีวิตสมบูรณ์โดยธรรมชาติด้วย plcR ที่ปิดใช้งาน มันเป็นครึ่งหนึ่งของโอเปอรอนสองยีนพร้อมกับเฮปตาเปปไทด์ papR papR เป็นส่วนหนึ่งของการตรวจจับองค์ประชุมใน ข. ทูรินเจียนซิส. [16]

สายพันธุ์ต่างๆ รวมทั้ง Btk ATCC 33679 มีพลาสมิดที่เป็นของตระกูล pXO1 ที่กว้างขึ้น (ครอบครัว pXO1 เป็น a ข. ซีเรียส- ครอบครัวร่วมกับสมาชิกของ

ความยาว 330kb แตกต่างจาก pXO1 โดยแทนที่เกาะที่ทำให้เกิดโรค pXO1) ปรสิตแมลง Btk HD73 มีพลาสมิดคล้าย pXO2 - pBT9727 - ไม่มีเกาะที่ทำให้เกิดโรคขนาด 35kb ของ pXO2 เอง และที่จริงแล้วไม่มีปัจจัยบ่งชี้ความรุนแรงที่สามารถระบุได้ (ตระกูล pXO2 ไม่มีการทดแทนเกาะที่ทำให้เกิดโรค แทนที่จะขาดส่วนนั้นของ pXO2) [16]

จีโนมของ ข. ซีเรียส กลุ่มอาจมีอินตรอนสองประเภท ขนานนามกลุ่ม I และกลุ่ม II B.t สายพันธุ์ต่างๆ มี 0-5 กลุ่ม Is และ 0-13 กลุ่ม IIs [16]

ยังมีข้อมูลไม่เพียงพอที่จะระบุได้ว่าการวิวัฒนาการร่วมของโครโมโซม - พลาสมิดเพื่อให้สามารถปรับตัวให้เข้ากับสภาวะแวดล้อมเฉพาะได้เกิดขึ้นหรือเป็นไปได้ [16]

ร่วมกับ ข. ซีเรียส แต่จนถึงขณะนี้ยังไม่พบในที่อื่น - รวมทั้งในกลุ่มอื่น ๆ ของกลุ่มพันธุ์ - คือเครื่องสูบน้ำที่ไหลออก BC3663, NS-acyl- L -amino-acid amidohydrolase BC3664 และโปรตีนเคมีที่รับเมทิล BC5034 [16]

มีความหลากหลายของโปรตีนใกล้เคียงกับญาติสนิท ข. ซีเรียส. [16]

เมื่อสร้างสปอร์ ข. ทูรินเจียนซิส ก่อตัวเป็นผลึกของเอนโดทอกซินจากเดลต้าฆ่าแมลงที่เป็นโปรตีนสองประเภท (δ-เอนโดทอกซิน) ที่เรียกว่าคริสตัลโปรตีนหรือไครโปรตีนซึ่งเข้ารหัสโดย ร้องไห้ ยีนและโปรตีน Cyt [21]

สารพิษที่ร้องไห้มีกิจกรรมเฉพาะต่อต้านแมลงในสกุล Lepidoptera (ผีเสื้อกลางคืนและผีเสื้อ) Diptera (แมลงวันและยุง) Coleoptera (ด้วง) และ Hymenoptera (ตัวต่อ ผึ้ง มด และขี้เลื่อย) รวมทั้งต่อต้านไส้เดือนฝอย [25] (26) ดังนั้น ข. ทูรินเจียนซิส ทำหน้าที่เป็นแหล่งกักเก็บสารพิษ Cry ที่สำคัญสำหรับการผลิตยาฆ่าแมลงทางชีวภาพและพืชดัดแปลงพันธุกรรมที่ต้านทานแมลง เมื่อแมลงกินผลึกสารพิษเข้าไป ระบบย่อยอาหารที่เป็นด่างของพวกมันจะทำลายผลึกที่ไม่ละลายน้ำ ทำให้พวกมันละลายได้ ดังนั้นจึงคล้อยตามที่จะถูกตัดด้วยโปรตีเอสที่พบในลำไส้ของแมลง ซึ่งช่วยปลดปล่อยสารพิษออกจากคริสตัล [22] จากนั้น สารพิษ Cry จะถูกแทรกเข้าไปในเยื่อหุ้มเซลล์ของแมลงในลำไส้ ทำให้ระบบทางเดินอาหารเป็นอัมพาตและเกิดเป็นรูพรุน [27] แมลงหยุดกินและอดอาหารจนตาย แบคทีเรียบีทีที่มีชีวิตอาจตั้งรกรากแมลง ซึ่งอาจส่งผลให้เสียชีวิตได้ [22] [27] [28] ความตายเกิดขึ้นภายในไม่กี่ชั่วโมงหรือไม่กี่สัปดาห์ [29] อาจต้องใช้แบคทีเรีย midgut ของตัวอ่อนที่อ่อนแอสำหรับ ข. ทูรินเจียนซิส กิจกรรมการฆ่าแมลง [30]

NS ข. ทูรินเจียนซิส RNA ขนาดเล็กที่เรียกว่า BtsR1 สามารถปิดเสียงการแสดงออกของสารพิษ Cry5Ba เมื่ออยู่ภายนอกโฮสต์โดยผูกกับไซต์ RBS ของการถอดเสียงสารพิษ Cry5Ba เพื่อหลีกเลี่ยงการป้องกันพฤติกรรมของไส้เดือนฝอย การปิดเสียงส่งผลให้แบคทีเรียกินเข้าไปเพิ่มขึ้นโดย C. elegans.การแสดงออกของ BtsR1 จะลดลงหลังจากการกลืนกิน ส่งผลให้มีการผลิตสารพิษ Cry5Ba และโฮสต์ตาย [31]

ในปี พ.ศ. 2539 มีการค้นพบโปรตีนยาฆ่าแมลงอีกประเภทหนึ่งในบีที: โปรตีนยาฆ่าแมลงจากพืช (Vip InterPro: IPR022180). [32] [33] โปรตีนวีไอพีไม่แบ่งปันความคล้ายคลึงของลำดับกับโปรตีนคราย โดยทั่วไปจะไม่แข่งขันกับตัวรับเดียวกัน และบางชนิดก็ฆ่าแมลงที่ต่างจากโปรตีนคราย (32)

ในปี พ.ศ. 2543 ได้มีการค้นพบกลุ่มย่อยใหม่ของ Cry protein ซึ่งมีชื่อว่า พาราสปอริน (parasporin) จากการไม่ใช้ยาฆ่าแมลง ข. ทูรินเจียนซิส แยก [34] โปรตีนของกลุ่มพาราสปอรินถูกกำหนดเป็น ข. ทูรินเจียนซิส และโปรตีน parasporal ของแบคทีเรียที่เกี่ยวข้องซึ่งไม่ใช่ hemolytic แต่สามารถฆ่าเซลล์มะเร็งได้ [35] ณ เดือนมกราคม 2013 พาราสปอรินประกอบด้วยครอบครัวย่อยหกครอบครัว: PS1 ถึง PS6 (36)

สปอร์และโปรตีนยาฆ่าแมลงที่เป็นผลึกที่ผลิตโดย ข. ทูรินเจียนซิส ถูกนำมาใช้เพื่อควบคุมแมลงศัตรูพืชตั้งแต่ช่วงปี ค.ศ. 1920 และมักใช้เป็นสเปรย์น้ำ [37] ปัจจุบันใช้เป็นยาฆ่าแมลงเฉพาะภายใต้ชื่อทางการค้าเช่น DiPel และ Thuricide เนื่องจากมีความเฉพาะเจาะจง สารกำจัดศัตรูพืชเหล่านี้จึงถือได้ว่าเป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อม โดยมีผลกระทบเพียงเล็กน้อยต่อมนุษย์ สัตว์ป่า แมลงผสมเกสร และแมลงที่เป็นประโยชน์อื่นๆ ส่วนใหญ่ และถูกนำมาใช้ในการทำเกษตรอินทรีย์ [26] อย่างไรก็ตาม คู่มือสำหรับผลิตภัณฑ์เหล่านี้มีมากมาย คำเตือนด้านสิ่งแวดล้อมและสุขภาพของมนุษย์ [38] [39] และการตรวจสอบโดยหน่วยงานกำกับดูแลของยุโรปประจำปี 2555 พบว่ามีสายพันธุ์ที่ได้รับการอนุมัติ 5 สายพันธุ์ ในขณะที่ข้อมูลมีอยู่เพื่อสนับสนุนการเรียกร้องบางอย่างของความเป็นพิษต่ำต่อมนุษย์และสิ่งแวดล้อม ข้อมูลไม่เพียงพอที่จะพิสูจน์หลายสิ่งเหล่านี้ การเรียกร้อง [40]

บีทีสายพันธุ์ใหม่ได้รับการพัฒนาและนำมาใช้เมื่อเวลาผ่านไป [41] เนื่องจากแมลงพัฒนาความต้านทานต่อบีที [42] หรือความปรารถนาที่เกิดขึ้นเพื่อบังคับให้การกลายพันธุ์เพื่อปรับเปลี่ยนลักษณะของสิ่งมีชีวิต [43] [ ต้องการคำชี้แจง ] หรือใช้พันธุวิศวกรรมรีคอมบิแนนท์ที่คล้ายคลึงกันในการปรับปรุงขนาดผลึกและเพิ่มกิจกรรมการฆ่าแมลง [44] หรือขยายช่วงโฮสต์ของบีทีและได้รับสูตรที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น [45] แต่ละสายพันธุ์ใหม่จะได้รับหมายเลขที่ไม่ซ้ำกันและลงทะเบียนกับ US EPA [46] และอาจให้เบี้ยเลี้ยงสำหรับการดัดแปลงพันธุกรรมขึ้นอยู่กับ "สายพันธุ์ผู้ปกครอง รูปแบบการใช้สารกำจัดศัตรูพืชที่เสนอ ลักษณะและขอบเขตที่สิ่งมีชีวิต ถูกดัดแปลงพันธุกรรม" [47] สูตรของ Bt ที่ได้รับการอนุมัติสำหรับการทำเกษตรอินทรีย์ในสหรัฐอเมริกามีการระบุไว้ที่เว็บไซต์ของสถาบันตรวจสอบวัสดุอินทรีย์ (OMRI) [48] และเว็บไซต์ส่วนขยายของมหาวิทยาลัยหลายแห่งให้คำแนะนำเกี่ยวกับวิธีใช้สปอร์หรือการเตรียมโปรตีนในสารอินทรีย์ การทำฟาร์ม [49] [50]

Plant Genetic Systems บริษัทสัญชาติเบลเยียม (ปัจจุบันเป็นส่วนหนึ่งของ Bayer CropScience) เป็นบริษัทแรก (ในปี 1985) ที่พัฒนาพืชดัดแปลงพันธุกรรม (ยาสูบ) ที่มีความทนทานต่อแมลงโดยแสดงออก ร้องไห้ ยีนจาก ข. ทูรินเจียนซิส พืชผลที่ได้จะมีเดลต้าเอนโดทอกซิน [51] [52] ยาสูบบีทีไม่เคยทำการค้า พืชยาสูบจะใช้ในการทดสอบการดัดแปลงพันธุกรรมเนื่องจากง่ายต่อการจัดการทางพันธุกรรมและไม่ได้เป็นส่วนหนึ่งของแหล่งอาหาร [53] [54]

แก้ไขการใช้งาน

ในปีพ.ศ. 2528 พืชมันฝรั่งที่ผลิตสารพิษ CRY 3A Bt ได้รับการรับรองว่าปลอดภัยจากหน่วยงานคุ้มครองสิ่งแวดล้อม ทำให้เป็นพืชผลทางการเกษตรที่มนุษย์ดัดแปลงเป็นพืชแรกที่ได้รับการรับรองในสหรัฐอเมริกา [56] [57] แม้ว่าพืชจำนวนมากจะผลิตสารกำจัดศัตรูพืชตามธรรมชาติ รวมทั้งยาสูบ ต้นกาแฟ โกโก้ และวอลนัทสีดำ นี่คือมันฝรั่ง 'New Leaf' และมันถูกนำออกจากตลาดในปี 2544 เนื่องจากขาดความสนใจ [58]

ในปี พ.ศ. 2539 ข้าวโพดดัดแปลงพันธุกรรมที่ผลิตโปรตีน Bt Cry ได้รับการอนุมัติ ซึ่งฆ่าหนอนเจาะข้าวโพดในยุโรปและสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกัน ยีน Bt ต่อมาถูกนำมาใช้เพื่อฆ่าตัวอ่อนของหนอนรากข้าวโพด [59]

ยีน Bt ที่ออกแบบให้เป็นพืชผลและได้รับการอนุมัติให้ปล่อย ได้แก่ Cry1A.105, CryIAb, CryIF, Cry2Ab, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, mCry3A และ VIP และพืชวิศวกรรมรวมถึงข้าวโพดและฝ้าย [60] [61] : 285ff

ข้าวโพดดัดแปลงพันธุกรรมเพื่อผลิตวีไอพีได้รับการอนุมัติครั้งแรกในสหรัฐอเมริกาในปี 2010 [62]

ในอินเดีย ภายในปี 2014 เกษตรกรผู้ปลูกฝ้ายมากกว่า 7 ล้านคน ซึ่งครอบครองพื้นที่ 26 ล้านเอเคอร์ ได้นำฝ้ายบีทีมาใช้ [63]

Monsanto พัฒนาถั่วเหลืองที่แสดง Cry1Ac และยีนต้านทานไกลโฟเสตสำหรับตลาดบราซิล ซึ่งเสร็จสิ้นกระบวนการกำกับดูแลของบราซิลในปี 2010 [64] [65]

แอสเพนที่เปลี่ยนรูปบีที - โดยเฉพาะ Populus ลูกผสม - ได้รับการพัฒนา พวกเขาได้รับความเสียหายน้อยกว่าจากแมลงกินพืชเป็นอาหาร อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ไม่เป็นไปในเชิงบวกทั้งหมด: ผลลัพธ์ที่ตั้งใจไว้ - ผลผลิตไม้ที่ดีขึ้น - ไม่บรรลุผล โดยไม่มีข้อได้เปรียบในการเจริญเติบโตแม้ว่าสัตว์กินพืชจะทำลายพืชกินพืชน้อยลงหนึ่งในศัตรูพืชหลักของพวกมันยังคงกินต้นไม้ดัดแปรพันธุกรรมและนอกจากนี้ เศษใบไม้ของพวกมันยังย่อยสลาย แตกต่างกันเนื่องจากสารพิษแปลงพันธุ์ ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงต่อประชากรแมลงน้ำในบริเวณใกล้เคียง [66]

การศึกษาความปลอดภัย แก้ไข

การใช้สารพิษบีทีเป็นสารปกป้องจากพืช กระตุ้นให้มีการประเมินความปลอดภัยสำหรับใช้ในอาหารอย่างกว้างขวางและผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นต่อสิ่งแวดล้อมโดยไม่ได้ตั้งใจ [ ต้องการการอ้างอิง ]

การประเมินความเสี่ยงด้านอาหาร แก้ไข

ความกังวลเกี่ยวกับความปลอดภัยในการบริโภควัสดุจากพืชดัดแปลงพันธุกรรมที่มีโปรตีน Cry ได้ถูกกล่าวถึงในการศึกษาการประเมินความเสี่ยงด้านอาหารอย่างกว้างขวาง ในขณะที่ศัตรูพืชเป้าหมายสัมผัสกับสารพิษเป็นหลักผ่านวัสดุใบและก้าน โปรตีน Cry นั้นยังแสดงออกในส่วนอื่น ๆ ของพืช รวมถึงจำนวนร่องรอยในเมล็ดข้าวโพดที่มนุษย์และสัตว์บริโภคในที่สุด [67]

การศึกษาพิษวิทยา Edit

แบบจำลองสัตว์ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความเสี่ยงต่อสุขภาพของมนุษย์จากการบริโภคผลิตภัณฑ์ที่มีโปรตีน Cry สำนักงานคุ้มครองสิ่งแวดล้อมแห่งสหรัฐอเมริกายอมรับการศึกษาการให้อาหารทางปากแบบเฉียบพลันของเมาส์ โดยที่ปริมาณสูงถึง 5,000 มก./กก. ของน้ำหนักตัวไม่ส่งผลให้เกิดผลข้างเคียงที่สังเกตได้ [68] การวิจัยเกี่ยวกับโปรตีนที่เป็นพิษอื่น ๆ ที่รู้จักแสดงให้เห็นว่าความเป็นพิษเกิดขึ้นที่ปริมาณที่ต่ำกว่ามาก [ ต้องการคำชี้แจง ] แนะนำเพิ่มเติมว่าสารพิษ Bt ไม่เป็นพิษต่อสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [69] ผลของการศึกษาด้านพิษวิทยามีความเข้มแข็งมากขึ้นโดยการขาดความเป็นพิษที่สังเกตพบจากการใช้ ข. ทูรินเจียนซิส และโปรตีนที่เป็นผลึกของมันเหมือนกับสเปรย์ฆ่าแมลง [70]

การศึกษาเกี่ยวกับภูมิแพ้ แก้ไข

การแนะนำโปรตีนชนิดใหม่ทำให้เกิดความกังวลเกี่ยวกับศักยภาพในการตอบสนองต่อการแพ้ในบุคคลที่มีความอ่อนไหว การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศของสารก่อภูมิแพ้ที่ทราบได้บ่งชี้ว่าไม่มีความกังวลต่อปฏิกิริยาการแพ้อันเป็นผลมาจากการบริโภคสารพิษบีที [71] นอกจากนี้ การทดสอบทิ่มผิวหนังโดยใช้โปรตีน Bt บริสุทธิ์ทำให้ไม่สามารถตรวจพบการผลิตแอนติบอดี IgE จำเพาะของสารพิษที่ตรวจพบได้ แม้แต่ในผู้ป่วยภูมิแพ้ [72]

การศึกษาการย่อยได้

มีการศึกษาเพื่อประเมินชะตากรรมของสารพิษบีทีที่กินเข้าไปในอาหาร โปรตีนสารพิษบีทีสามารถย่อยได้ภายในไม่กี่นาทีหลังจากสัมผัสกับของเหลวในกระเพาะอาหารจำลอง [73] ความไม่แน่นอนของโปรตีนในของเหลวในทางเดินอาหารเป็นข้อบ่งชี้เพิ่มเติมว่าโปรตีนครายไม่น่าจะเป็นสารก่อภูมิแพ้ เนื่องจากสารก่อภูมิแพ้ในอาหารส่วนใหญ่รู้จักต่อต้านการย่อยสลายและถูกดูดซึมในลำไส้เล็กในที่สุด [74]

การประเมินความเสี่ยงทางนิเวศวิทยา แก้ไข

การประเมินความเสี่ยงทางนิเวศวิทยามีจุดมุ่งหมายเพื่อให้แน่ใจว่าจะไม่มีผลกระทบโดยไม่ได้ตั้งใจต่อสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่เป้าหมายและการปนเปื้อนของทรัพยากรธรรมชาติอันเป็นผลมาจากการใช้สารใหม่ เช่น การใช้บีทีในพืชดัดแปลงพันธุกรรม ผลกระทบของสารพิษบีทีต่อสิ่งแวดล้อมที่ปลูกพืชแปลงพันธุ์ได้รับการประเมินเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีผลกระทบใด ๆ นอกเหนือจากศัตรูพืชที่เป็นเป้าหมาย [75]

ความคงอยู่ในสภาพแวดล้อม แก้ไข

มีการตรวจสอบความกังวลเกี่ยวกับผลกระทบต่อสิ่งแวดล้อมที่อาจเกิดขึ้นจากการสะสมของสารพิษ Bt จากเนื้อเยื่อพืช การกระจายละอองเกสร และการหลั่งโดยตรงจากราก สารพิษบีทีอาจคงอยู่ในดินนานกว่า 200 วัน โดยมีครึ่งชีวิตระหว่าง 1.6 ถึง 22 วัน สารพิษส่วนใหญ่ในขั้นต้นย่อยสลายอย่างรวดเร็วโดยจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อม ในขณะที่บางชนิดถูกดูดซับโดยอินทรียวัตถุและคงอยู่ได้นานขึ้น [76] ในทางตรงกันข้าม งานวิจัยบางชิ้นอ้างว่าสารพิษไม่คงอยู่ในดิน [76] [77] [78] สารพิษบีทีมีโอกาสสะสมในน้ำน้อยกว่า แต่ละอองเกสรหรือการไหลบ่าของดินอาจสะสมไว้ในระบบนิเวศทางน้ำ สายพันธุ์ปลาจะไม่ไวต่อสารพิษบีทีหากสัมผัส [79]

ผลกระทบต่อสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่เป้าหมาย Edit

ลักษณะที่เป็นพิษของโปรตีนบีทีมีผลกระทบในทางลบต่อศัตรูพืชที่สำคัญหลายชนิด แต่มีการประเมินความเสี่ยงทางนิเวศวิทยาเพื่อความปลอดภัยของสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่เป้าหมายที่เป็นประโยชน์ซึ่งอาจสัมผัสกับสารพิษ ความกังวลอย่างกว้างขวางเกี่ยวกับความเป็นพิษในเลพิดอปเทอแรนที่ไม่ใช่เป้าหมาย เช่น ผีเสื้อพระมหากษัตริย์ ได้รับการพิสูจน์โดยผ่านการกำหนดลักษณะการสัมผัสที่เหมาะสม โดยพบว่าสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่เป้าหมายไม่ได้สัมผัสกับสารพิษ Bt ในปริมาณที่สูงพอที่จะส่งผลเสียต่อ ประชากร. [80] สิ่งมีชีวิตที่อาศัยอยู่ในดิน ซึ่งมีโอกาสได้รับสารพิษบีทีผ่านทางสารหลั่งของราก จะไม่ได้รับผลกระทบจากการเติบโตของพืชบีที [81]

ต้านทานแมลง แก้ไข

แมลงหลายชนิดได้พัฒนาความต้านทานต่อ ข. ทูรินเจียนซิส. ในเดือนพฤศจิกายน พ.ศ. 2552 นักวิทยาศาสตร์ของ Monsanto พบว่าหนอนพยาธิสีชมพูมีความทนทานต่อฝ้ายบีทีรุ่นแรกในส่วนต่างๆ ของรัฐคุชราต ประเทศอินเดีย ซึ่งรุ่นดังกล่าวแสดงยีนบีทีหนึ่งตัว Cry1Ac. นี่เป็นตัวอย่างแรกของการต่อต้าน Bt ที่ยืนยันโดย Monsanto ทุกที่ในโลก [82] [83] มอนซานโตตอบโต้ด้วยการแนะนำฝ้ายรุ่นที่สองที่มีโปรตีนบีทีหลายตัว ซึ่งถูกนำมาใช้อย่างรวดเร็ว [82] Bollworm ต้านทานต่อฝ้ายบีทีรุ่นแรกยังระบุในออสเตรเลีย จีน สเปน และสหรัฐอเมริกา [84] นอกจากนี้ การดื้อต่อบีทีได้รับการบันทึกไว้ในประชากรของผีเสื้อกลางคืนไดมอนด์แบ็คในฮาวาย ทวีปอเมริกา และเอเชีย [85] Studies in the cabbage looper have suggested that a mutation in the membrane transporter ABCC2 can confer resistance to Bt Cry1Ac. [86]

Secondary pests Edit

Several studies have documented surges in "sucking pests" (which are not affected by Bt toxins) within a few years of adoption of Bt cotton. In China, the main problem has been with mirids, [87] [88] which have in some cases "completely eroded all benefits from Bt cotton cultivation". [89] The increase in sucking pests depended on local temperature and rainfall conditions and increased in half the villages studied. The increase in insecticide use for the control of these secondary insects was far smaller than the reduction in total insecticide use due to Bt cotton adoption. [90] Another study in five provinces in China found the reduction in pesticide use in Bt cotton cultivars is significantly lower than that reported in research elsewhere, consistent with the hypothesis suggested by recent studies that more pesticide sprayings are needed over time to control emerging secondary pests, such as aphids, spider mites, and lygus bugs. [91]

Similar problems have been reported in India, with both mealy bugs [92] [93] and aphids [94] although a survey of small Indian farms between 2002 and 2008 concluded Bt cotton adoption has led to higher yields and lower pesticide use, decreasing over time. [95]

Controversies Edit

The controversies surrounding Bt use are among the many genetically modified food controversies more widely. [96]

Lepidopteran toxicity Edit

The most publicised problem associated with Bt crops is the claim that pollen from Bt maize could kill the monarch butterfly. [97] The paper produced a public uproar and demonstrations against Bt maize however by 2001 several follow-up studies coordinated by the USDA had asserted that "the most common types of Bt maize pollen are not toxic to monarch larvae in concentrations the insects would encounter in the fields." [98] [99] [100] [101] Similarly, ข. ทูรินเจียนซิส has been widely used for controlling Spodoptera littoralis larvae growth due to their detrimental pest activities in Africa and Southern Europe. อย่างไรก็ตาม, S. littoralis showed resistance to many strains of B. thuriginesis and were only effectively controlled by a few strains. [102]

Wild maize genetic mixing Edit

การศึกษาที่ตีพิมพ์ใน ธรรมชาติ in 2001 reported Bt-containing maize genes were found in maize in its center of origin, Oaxaca, Mexico. [103] In 2002, paper concluded, "the evidence available is not sufficient to justify the publication of the original paper." [104] A significant controversy happened over the paper and ธรรมชาติ ' s unprecedented notice. [105]

A subsequent large-scale study in 2005 failed to find any evidence of genetic mixing in Oaxaca. [106] A 2007 study found the "transgenic proteins expressed in maize were found in two (0.96%) of 208 samples from farmers' fields, located in two (8%) of 25 sampled communities." Mexico imports a substantial amount of maize from the U.S., and due to formal and informal seed networks among rural farmers, many potential routes are available for transgenic maize to enter into food and feed webs. [107] One study found small-scale (about 1%) introduction of transgenic sequences in sampled fields in Mexico it did not find evidence for or against this introduced genetic material being inherited by the next generation of plants. [108] [109] That study was immediately criticized, with the reviewer writing, "Genetically, any given plant should be either non-transgenic or transgenic, therefore for leaf tissue of a single transgenic plant, a GMO level close to 100% is expected. In their study, the authors chose to classify leaf samples as transgenic despite GMO levels of about 0.1%. We contend that results such as these are incorrectly interpreted as positive and are more likely to be indicative of contamination in the laboratory." [110]

Colony collapse disorder Edit

As of 2007, a new phenomenon called colony collapse disorder (CCD) began affecting bee hives all over North America. Initial speculation on possible causes included new parasites, pesticide use, [111] and the use of Bt transgenic crops. [112] The Mid-Atlantic Apiculture Research and Extension Consortium found no evidence that pollen from Bt crops is adversely affecting bees. [98] [113] According to the USDA, "Genetically modified (GM) crops, most commonly Bt corn, have been offered up as the cause of CCD. But there is no correlation between where GM crops are planted and the pattern of CCD incidents. Also, GM crops have been widely planted since the late 1990s, but CCD did not appear until 2006. In addition, CCD has been reported in countries that do not allow GM crops to be planted, such as Switzerland. German researchers have noted in one study a possible correlation between exposure to Bt pollen and compromised immunity to Nosema." [114] The actual cause of CCD was unknown in 2007, and scientists believe it may have multiple exacerbating causes. [115]

Some isolates of ข. ทูรินเจียนซิส produce a class of insecticidal small molecules called beta-exotoxin, the common name for which is thuringiensin. [116] A consensus document produced by the OECD says: "Beta-exotoxins are known to be toxic to humans and almost all other forms of life and its presence is prohibited in ข. ทูรินเจียนซิส microbial products". [117] Thuringiensins are nucleoside analogues. They inhibit RNA polymerase activity, a process common to all forms of life, in rats and bacteria alike. [118]

Opportunistic pathogen of animals other than insects, causing necrosis, pulmonary infection, and/or food poisoning. How common this is is unknown because these are always taken to be B. cereus infections and are rarely tested for the ร้องไห้ และ Cyt proteins that are the only factor distinguishing .B thuringiensis จาก B. cereus. [16]


Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body

Reported values in the literature on the number of cells in the body differ by orders of magnitude and are very seldom supported by any measurements or calculations. Here, we integrate the most up-to-date information on the number of human and bacterial cells in the body. We estimate the total number of bacteria in the 70 kg "reference man" to be 3.8·1013. For human cells, we identify the dominant role of the hematopoietic lineage to the total count (≈90%) and revise past estimates to 3.0·1013 human cells. Our analysis also updates the widely-cited 10:1 ratio, showing that the number of bacteria in the body is actually of the same order as the number of human cells, and their total mass is about 0.2 kg.

แถลงการณ์ความขัดแย้งทางผลประโยชน์

ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

ตัวเลข

Fig 1. Back of the envelope estimate…

Fig 1. Back of the envelope estimate of the number of cells in an adult…

Fig 2. The distribution of the number…

Fig 2. The distribution of the number of human cells by cell type.

Fig 3. Distribution of cell number and…

Fig 3. Distribution of cell number and mass for different cell types in the human…


วัสดุและวิธีการ

Reagents and Tools table

Reagent/Resource Reference or source Identifier or catalog number
Experimental models
BW25113 (อี. โคไล) CGSC 7636
JEN202 (อี. โคไล) Luciano lab (Bikard et al, 2013 PMID: 23761437)
Serovar Typhi Ty2 (ส. enterica) ATCC 700931
M5A1 (K. oxytoca) ATCC 7342
ดีเอ็นเอลูกผสม
pdCas9-bacteria แอดยีน 44249
pgRNA-bacteria แอดยีน 44251
pWJ89 Luciano lab (Bikard et al, 2013 PMID: 23761437)
pWJ96 Luciano lab (Bikard et al, 2013 PMID: 23761437)
pWJ97 Luciano lab (Bikard et al, 2013 PMID: 23761437)
pEB2-mScarlet-I แอดยีน 104007
RS7003 promoter library Johns et al, 2018 PMID: 30052624
pOSIP-Kan St-Pierre et al, 2013 PMID: 24050148
pdCas9-linker This study
pdCas9-AsiA This study
pdCas9-AsiA_m1.1 This study
pdCas9-AsiA_m2.1 This study
pHH39 This study
Additional plasmids and more information This study Appendix Table S2
Oligonucleotides and other sequence-based reagents
guide RNAs_N20 This study Appendix Table S5
Q_RT_PCR primers This study Appendix Table S6
Chemicals, enzymes and other reagents
Q5 ® High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621
T4 DNA ligase New England BioLabs M0202
T4 Polynucleotide kinase New England BioLabs M0201
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen 18080-093
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix Kapa Biosystems KK4602
Maxima reverse transcriptase Thermo Scientific EP0742
ซอฟต์แวร์
Geneious v11.1 https://www.geneious.com/
Benchling https://www.benchling.com/
Python 3.6.0 https://www.python.org/
Bowtie 2 (Langmead & Salzberg, 2012 PMID:22388286)https://github.com/BenLangmead/bowtie2
HTseq (Anders et al, 2015 PMID:25260700)https://htseq.readthedocs.io/en/master/
BBmerge (Bushnell et al, 2017 PMID:29073143) https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/bbmerge-guide/
DRAFTS (Yim et al, 2019 PMID:31464371)https://github.com/ssyim/DRAFTS
อื่น
GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit Agilent Technologies 200552
RNA Clean & Concentrator Kits Zymo Research R1030
DNA Clean & Concentrator Kits Zymo Research D4013
Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria) Illumina
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit New England BioLabs E7760
Illumina NextSeq 500/550 mid output kit v2/v2.5 (150/300 cycles) Illumina Cat #20024904/20024905
PrepGem bacteria kit MicroGEM PBA0100
BD FACS Aria II BD Biosciences
Guava ® InCyte MilliporeSigma
Synergy H1 plate reader BioTek
CFX96 Touch Real-Time PCR machine Bio-Rad

Methods and Protocols

Strains and culturing conditions

อี. โคไล strains and other bacterial species used in the study are listed in Appendix Table S1, and all อี. โคไล strains are derived from the MG1655 parental background. Cells were grown in rich LB medium at 37°C with agitation unless stated otherwise. For plasmid transformation, general protocols were followed, and plasmids were maintained under antibiotics selection at all times. For constructing genomic insertions, the GFP expression cassette amplified from pWJ89 (Bikard et al, 2013 ) was cloned between multiple cloning sites of pOSIP-Kan and inserted chromosomally following the clonetegration method (St-Pierre et al, 2013 ). For the antibiotic selection and induction of target genes, the following concentrations were used: carbenicillin (Carb) 50 μg/ml, chloramphenicol (Cam) 20 μg/ml, kanamycin (Kan) 50 μg/ml, spectinomycin (Spec) 50 μg/ml, Bleocin (Bleo) 5 μg/ml, and anhydrotetracycline (aTc) 100 ng/ml. For induction of target genes, aTc was added to the culture at the exponential growth phase for 4 h before cells were harvested for characterization.

Construction of plasmids

The dCas9 fusion library was constructed based on the pdCas9-bacteria plasmid (Addgene #44249). Linker sequences (SAGGGGSGGGGS) and fusion candidates were either amplified from DNA synthesized เดอโนโว (IDT gBlocks ® ) or อี. โคไล genomic DNA and subcloned after the dCas9 sequence in the pdCad9-bacteria plasmid (Addgene #44249). All guide RNA plasmids (pgRNA-H1 to pgRNA-H21) were constructed from the pgRNA-bacteria plasmid (Addgene #44251), using inverted PCR and blunt-end ligation to modify the N20 seed sequences. For dual gRNA plasmids (pgRNA-H4H5, pgRNA-H4H11), each gRNA was built separately and jointed subsequently. GFP reporter plasmids (pWJ89, pWJ96, pWJ97) were gifts from the Marraffini lab at Rockefeller University (Bikard et al, 2013 ). The promoter region upstream of the GFP reporter in pWJ89 was amplified for constructing other antibiotic reporter plasmids (pHH34-37). The GFP-mScarlet reporter plasmid (pHH39) was constructed by cloning the mScarlet gene from pEB2-mScarlet-I (Addgene #104007) under the WJ97 promoter and joined with the weak GFP expression cassette from pWJ89. For screening the inducible metagenomic promoter library (RS7003) (Johns et al, 2018 ), gRNA-H22 and gRNA-H23 expression cassettes were jointed with dCas9-AsiA_m2.1 separately, resulting pHH40 and pHH41. Cloning was done by Gibson assembly if not otherwise noted in all cases. Plasmids used and associated details are listed in Appendix Table S2.

Development of CasTA screening platform

The dCas9 fusion library, gRNAs, and reporter genes were built on 3 different compatible plasmids (dCas9: p15A, Cam resistance gRNA: ColE1, Carb resistance reporter: SC101, Kan resistance), so they can be transformed and propagated within the same cell (Appendix Fig S1). To use a antibiotic resistance gene as a reporter, we tested different antibiotic genes and modulated degradation rate (fusion with ssrA tag: AANDENYALAA) for selective stringency (Appendix Fig S2A and B). Dual selective reporters (Kan and Bleo) were constructed, which decrease the escape rate by 10 fold (Appendix Fig S2C and D).

Directed evolution of dCas9-AsiA using CasTA screening platform

We mutagenized the wild-type AsiA region of dCas9-AsiA using the GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit (Agilent Technologies), following the manufacture's protocol.

  • In brief, 50 ng of parental template DNA was used for amplification with error-prone DNA polymerase (Mutazyme II). Under this condition, the AsiA region contains on average ˜2 nucleotides changes per variant after PCR mutagenesis (Appendix Fig S4).
  • In the first round of directed evolution, the dCas9-AsiA mutant library was transformed to the cells expressing gRNA-H4 and dual selective reporters (pHH37 and pHH38). ˜5 × 10 8 transformants were grown under 0.2× regular Kan concentration and 2× regular Bleo concentration.
  • Grown colonies were harvested and propagated together with Cam selection to maintain solely the dCas9-AsiA variant plasmids.
  • The dCas9-AsiA plasmids were subsequently extracted and transformed to cells containing pgRNA-H4 and pWJ89.
  • Individual colonies were Sanger sequenced to identify the mutations in AsiA and characterized based on GFP intensity (Appendix Table S4). The background fluorescence was measured using the parental strain (BW25113), and auto-fluorescence was subtracted from the fluorescence readings of all samples. Fold change of fluorescence was normalized to cells expressing the GFP only plasmid (pWJ89).
  • The dCas9-AsiA_m1.1 plasmid from the most abundant mutant variant was extracted and transformed to the GFP reporter strain (containing pgRNA-H4 and pWJ89) again to verify fluorescent intensity (Fig 2C).
  • In the second round of directed evolution, the dCas9_AsiA_m1.1 variant was used as a template to generate additional variants following the same conditions.
  • The second generation of the dCas9-AsiA mutant library was transformed to GFP reporter cells, containing pgRNA-H4 and pWJ89 as described above.
  • We enriched the top 0.1% of highest GFP expression from the population of 1x10 7 transformants using fluorescence activated cell sorting (BD FACS Aria II).
  • Post-sorted cell population was plated on selective LB again to obtain clonal colonies, and individual colonies were picked for Sanger sequencing and measurement of GFP intensity.

Quantification of gene expression induced by CasTA

To examine CRISPRa on genomic targets, pdCas9-AsiA_m2.1 was transformed along with gRNA constructs (gRNA-H12 to gRNA-H21, Appendix Table S5) designed for each gene (Appendix Table S6). Cells expressing dCas9-AsiA_m2.1 and a non-specific gRNA (gRNA-H4) were used as controls.

  • After CRISPRa induction with 100 ng/ml aTc, cells were harvested for RNA extraction following the RNAsnap protocol (Stead et al, 2012 ).
  • After column purification (RNA Clean & Concentrator Kits, Zymo Research), total RNA was reverse-transcribed into cDNA using random hexmers (SuperScript III Reverse Transcriptase, Invitrogen).
  • Quantitative PCR was performed on each sample with gene-specific primers (Appendix Table S6) using the KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (Kapa Biosystems). NS rrsA gene was selected as the housekeeping gene to normalize expression between samples.

For whole-transcriptome analysis of CRISPRa specificity,

  • we extracted total RNA from the samples as described above and depleted rRNAs using Ribo-Zero rRNA removal-Bacteria kit (Illumina).
  • RNA libraries were prepared using the NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit (New England BioLabs) and sequenced on the Illumina NextSeq platform (Mid-Output Kit, 150 cycles).
  • The raw reads were aligned to the reference genome (BW25113) using Bowtie 2 (Langmead & Salzberg, 2012 ), and the read counts of each gene were quantified by HTseq (Anders et al, 2558 ). Expression level of individual genes was normalized by total read counts within each sample.

Screening for CRISPRa-mediated inducible promoters

The Metagenomic promoter library (RS7003) was derived from Johns et al ( 2018 ).

  • About 8,000 regulatory elements were transformed to cells expressing dCas9-AsiA_m2.1 and either gRNA-H22, gRNA-H23, or genomic targeting gRNA-H24 (Appendix Table S5).
  • After CRISPRa induction, four biological replicates were harvested to measure promoter activity. A constitutive promoter without CRISPRa induction (Appendix Table S7) was spiked in the cell populations for normalizing expression levels between samples.
  • Total RNA was extracted and purified as previously described. Gene-specific primers were used for cDNA generation (Maxima reverse transcriptase, Thermo Scientific), and RNA sequencing library was prepared by ligation with the common adaptor primer for downstream sequencing (Yim et al, 2019 ).
  • To quantify abundance of each promoter in the library, plasmid DNA from each sample was also extracted using PrepGem bacteria kit (MicroGEM) and used to generate a DNA amplicon sequencing library.
  • Both RNA and DNA libraries were sequenced on the Illumina NextSeq platform (Mid-output kit, 300 cycles).
  • Sequencing reads from DNA and RNA libraries were merged by BBmerge and filtered out low-quality reads (Bushnell et al, 2017 ).
  • Custom pipeline that was previously described (Yim et al, 2019 ) was adopted to identify sequencing reads corresponding to each promoter. Expression level of each promoter was quantified by determining the ratio of RNA abundance over DNA abundance. To compare across samples, expression levels were normalized to the same spiked-in control promoter in each sample. Fold change in CRISPRa induced gene expression was calculated by dividing by the reporter expression of control cells containing dCas9-AsiA_m2.1 and a genomic targeting gRNA-H24.

Biology - Bacteria

Bacteria normally comprises a large number of prokaryotic microorganisms.

Bacteria most probably were among the first life that formed to appear on the Earth.

Bacteria belong to Monera kingdom.

Bacteria usually inhabit in all range of environments, such as soil, water, acidic hot springs, radioactive waste, and the deep portions of Earth's crust.

The study of bacteria is known as bacteriology.

Bacteria play an important role in many stages of the nutrient cycle by recycling nutrients including the fixation of nitrogen from the atmosphere.

Bacteria grow to a fixed size and after maturity reproduce through asexual reproduction i.e. basically binary fission.

Under favorable conditions, bacteria can grow and divide very swiftly, and the bacterial populations can double merely in every 9.8 minutes.

When viruses that infect bacteria is known as Bacteriophages.

In order to modify themselves (to survive in the adverse environment), Bacteria frequently secrete chemicals into their environment.


เชิงนามธรรม

Bacteria utilize diffusible signals to regulate population density-dependent coordinated gene expression in a process called quorum sensing (QS). While the intracellular regulatory mechanisms of QS are well-understood, the effect of spatiotemporal changes in the population configuration on the sensitivity and robustness of the QS response remains largely unexplored. Using a microfluidic device, we quantitatively characterized the emergent behavior of a population of swimming อี. โคไล bacteria engineered with the lux QS system and a GFP reporter. We show that the QS activation time follows a power law with respect to bacterial population density, but this trend is disrupted significantly by microscale variations in population configuration and genetic circuit noise. We then developed a computational model that integrates population dynamics with genetic circuit dynamics to enable accurate (less than 7% error) quantitation of the bacterial QS activation time. Through modeling and experimental analyses, we show that changes in spatial configuration of swimming bacteria can drastically alter the QS activation time, by up to 22%. The integrative model developed herein also enables examination of the performance robustness of synthetic circuits with respect to growth rate, circuit sensitivity, and the population’s initial size and spatial structure. Our framework facilitates quantitative tuning of microbial systems performance through rational engineering of synthetic ribosomal binding sites. We have demonstrated this through modulation of QS activation time over an order of magnitude. Altogether, we conclude that predictive engineering of QS-based bacterial systems requires not only the precise temporal modulation of gene expression (intracellular dynamics) but also accounting for the spatiotemporal changes in population configuration (intercellular dynamics).


Vector Biology and Bacterial Pathogens

The Laboratory for Vector Biology and Bacterial Pathogens has two primary focus areas:

Utilizing Molecular Tools, Functional Genomics, and Animal Models to Investigate Vector-Pathogen Interactions

This project builds on recent work reporting tick transmission of relapsing fever spirochetes and genome sequencing of both the pathogen and tick vector. We have utilized both next generation and third generation sequencing technologies to investigate a number of outstanding questions in the field. We have also performed transcriptional studies on the tick to further understand how relapsing fever spirochetes adapt to the arthropod vector. Our goal by utilizing whole genome and transcriptomic analyses is to better understand vector-pathogens interactions and identify novel areas of intervention for both the vector and pathogen.

Defining the Ecology of Pathogens Transmitted by Argasid Ticks

Argasid (soft bodied) ticks not only transmit relapsing fever spirochetes but also African swine fever virus, an emerging and highly contagious pathogen with high mortality rates in domestic pigs. Through multi institutional collaborations, we utilize diagnostic assays to evaluate mammalian exposure to soft ticks and the pathogens they transmit. Moreover, we are investigating the distribution of argasids through population genetic studies and their maintenance in nature. These projects will define the disease burden and ecology in regions of the globe where the pathogens are ignored.


ดูวิดีโอ: Bioekologi Virus Patogen Tumbuhan Summary (สิงหาคม 2022).