วัตถุประสงค์ของโปรโมเตอร์ EF1 อัลฟา

We are searching data for your request:

Forums and discussions:

Manuals and reference books:

Data from registers:

Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

บริบท: ฉันเคยเห็นโปรโมเตอร์เคยมีไวรัสบำบัดด้วยยีนกำหนดเป้าหมายไปยังเซลล์เฉพาะ ดังนั้นฉันจึงหมายถึงหน้าที่ที่ชัดเจนของไวรัสเหล่านี้ ตัวอย่างเช่น ฉันเคยเห็นโปรโมเตอร์ GFAP ใช้สำหรับกำหนดเป้าหมาย astrocytes (ฉันเคยเห็นสิ่งนี้ในเอกสารอื่น ๆ อีกมากมาย แต่นี่เป็นครั้งแรกที่ฉันพบบน google)

ฉันสงสัยว่าจุดประสงค์ของโปรโมเตอร์ EF1-alpha ในไวรัส lentil/retro/Adeno-Associated สำหรับการแสดงออกของยีนคืออะไร?

ดูเหมือนว่ามักใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน แต่แล้วฉันก็เห็นอย่างอื่นที่ "ระบบการแสดงออกของ Lenti-X (เวอร์ชัน EF1α) ช่วยให้คุณสามารถผลิตไตเตรทสูงเป็นพิเศษของ recombinant lentivirus สำหรับการแสดงออกของ cDNA ใน เซลล์ชนิดใดก็ได้ที่ไวต่อการถ่ายโอน lentiviral" สิ่งนี้ทำให้ฉันคิดว่าบางทีเนื่องจากโปรโมเตอร์ 'กำหนดเป้าหมาย' สเต็มเซลล์ซึ่งต่อมาเปลี่ยนเป็นเซลล์ประเภทใดก็ได้ คำพูดนี้หมายความว่าโปรโมเตอร์ EF1-alpha สามารถใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายเซลล์ตามอำเภอใจได้หรือไม่ นี่เป็นเรื่องจริงหรือไม่?

ผิดพลาดประการใดขออภัยมา ณ ที่นี้ด้วยนะครับ ผมมือใหม่ในสาขานี้

EF1-alpha ถือเป็นโปรโมเตอร์ที่แพร่หลาย/เป็นส่วนประกอบ มีประสิทธิภาพในเซลล์สัตว์ทั้งหมดและมีแนวโน้มที่จะแสดงออกอย่างชัดเจน เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน (และอื่น ๆ ) กำหนดเป้าหมายได้ยากกว่าเซลล์อื่นเนื่องจากไม่แสดงยีนภายใต้โปรโมเตอร์เฉพาะประเภทเซลล์ที่มักใช้สำหรับประชากรเซลล์อื่น ๆ ซึ่งเป็นสาเหตุที่คุณเห็นว่าใช้เฉพาะสำหรับ แอปพลิเคชันนั้น แต่นั่นไม่ใช่การใช้งานเพียงอย่างเดียว

คุณจะพบข้อมูลผู้โปรโมตจำนวนมากในไซต์เชิงพาณิชย์แต่ละแห่ง และแทนที่จะส่งเสริมไซต์เฉพาะ ฉันขอแนะนำให้ค้นหาเช่น https://www.google.com/search?q=ef1+alpha+constituitive หรือ https:// www.google.com/search?q=ef1+alpha+ubiquitous - การใช้ EF1-alpha ไม่ได้ "มีเจ้าของ" ทุกคน ดังนั้นเมื่อพวกเขาพูดสิ่งเหล่านี้ ไม่ใช่เพียงเพราะพวกเขาพยายามขายคุณด้วยวิธีพิเศษบางอย่าง ของพวกเขา พวกเขากำลังใช้แนวทางมาตรฐานภาคสนาม

ระบบเวกเตอร์ Lentiviral สำหรับการแสดงออกของยีนที่เป็นส่วนประกอบ

ระบบการแสดงออกของ lentiviral เหล่านี้ได้รับการออกแบบสำหรับการแสดงออกของยีนที่เป็นส่วนประกอบจากโปรโมเตอร์ CMV หรือ EF1-alpha

บทนำ

เวกเตอร์การแสดงออกมีบทบาทสำคัญในการบำบัดด้วยยีน เวคเตอร์ที่ใช้ในปัจจุบันสำหรับการแสดงออกของยีนมีข้อ จำกัด 1-3 เช่นการรวมแบบสุ่มในจีโนมเจ้าบ้านหรือการคงอยู่ชั่วคราวเท่านั้น การรวมเข้าด้วยกันแบบสุ่มอาจนำไปสู่การทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่สอดแทรกและการทำให้ทรานส์ยีนหยุดนิ่ง ดังนั้นเวกเตอร์ในอุดมคติโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการบำบัดด้วยยีนจึงควรถูกเก็บไว้ในเซลล์โดยไม่มีการรวมเข้าด้วยกัน nonviral episomal plasmid vector pEPI ได้รับการพัฒนาครั้งแรกโดย Piechaczek et al. 4 . pEPI ต้องการขอบเขตการแนบนั่งร้าน/เมทริกซ์ (S/MAR) ที่เชื่อมโยงกับหน่วยนิพจน์ 5, 6 จำเป็นต้องมีการถอดรหัสต้นน้ำแบบแอ็คทีฟของ S/MAR ที่ทำงานในลำดับนี้ และอาจเพียงพอสำหรับการจำลองแบบเอพิโซม เมื่อวาง S/MAR ไว้ที่ต้นน้ำของไซต์ยุติการถอดความหรือถูกลบ เวกเตอร์จะสูญหายหรือถูกรวมเข้าด้วยกัน 7 เวกเตอร์ pEPI ทำซ้ำอย่างอิสระด้วยจำนวนสำเนาต่ำในเซลล์ที่ตรวจสอบแล้วทั้งหมด นอกเหนือจากจำนวนสำเนาต่ำ ข้อเสียอื่นๆ ของเวกเตอร์ pEPI ยังรวมถึงการแสดงออกของทรานส์ยีนที่ไม่เสถียรหรือต่ำ 8, 9 ในการศึกษาต่อๆ มา มีความพยายามอย่างมากในการปรับปรุงเวกเตอร์ที่ใช้ pEPI เช่น การแทรกกฎข้อบังคับ cis-องค์ประกอบที่ออกฤทธิ์และลดปริมาณของลำดับแบคทีเรีย 10, 11 .

ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เราสร้างเวกเตอร์อีพิโซมอลซึ่งมีลำดับดีเอ็นเอ 387-bp ซึ่งประกอบด้วยแม่ลาย MAR ที่มีลักษณะเฉพาะ และประเมินโปรโมเตอร์ที่แตกต่างกันในเวกเตอร์อีพิโซม เราพบว่าโปรโมเตอร์ CMV ทำงานได้ดีที่สุดในแง่ของขนาดการแสดงออกและความเสถียร 11, 12 . อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของทรานส์ยีนไม่เสถียร จำนวนสำเนาต่ำ และขนาดการแสดงออกยังไม่เป็นที่น่าพอใจ

องค์ประกอบของพลาสมิดเวกเตอร์ ซึ่งรวมถึงโปรโมเตอร์ เอนแฮนเซอร์ สัญญาณโพลีอะดีนิเลชันและองค์ประกอบการแสดงออกอื่นๆ มีอิทธิพลต่อขนาดและความเสถียรของการแสดงออกของทรานส์ยีน แม้ว่าโปรโมเตอร์ CMV จะให้การแสดงออกของยีนสูง แต่ก็มีรายงานว่าด้วยระยะเวลาการเพาะปลูกที่ขยายออกไป ผลผลิตจะลดลง 13, 14 CMV มีแนวโน้มที่จะปิดเสียงการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับ DNA methylation 15, 16 ในทางตรงกันข้าม โปรโมเตอร์ที่เข้มแข็งหลายคนถูกเอารัดเอาเปรียบโดยมีเป้าหมายเพื่อการแสดงออกของยีนที่มีพลังและระยะยาว โปรโมเตอร์จากแหล่งกำเนิดของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมถูกใช้อย่างแพร่หลายที่สุดเพื่อจุดประสงค์นี้ โดยที่ปัจจัยการยืดตัวของการแปลยูคาริโอตของมนุษย์ 1 อัลฟา (EF-1α สัญลักษณ์ยีน EEF1A1) โปรโมเตอร์ทำงานอย่างเป็นส่วนประกอบในเซลล์หลายประเภท โปรโมเตอร์ EF-1α มักทำงานอยู่ในเซลล์ซึ่งโปรโมเตอร์ของไวรัสไม่สามารถแสดงยีนที่ควบคุมได้ และในเซลล์ที่โปรโมเตอร์ของไวรัสค่อยๆ เงียบ 17-19 การศึกษาบางชิ้นระบุว่าโปรโมเตอร์ของยีนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมภายในร่างกายเช่น EEF1A1 อาจต้านทานการเงียบได้ดีกว่าตัวก่อการไวรัส 20-22 ตัว โปรโมเตอร์ EF-1α ที่ใช้ร่วมกับบริเวณขนาบข้างของยีน CHO EF-1α มีฤทธิ์มากขึ้นในเซลล์ CHO เมื่อเปรียบเทียบกับการใช้โปรโมเตอร์ CMV และ SV40 เพียงอย่างเดียว 23, 24

เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทำงานของโปรโมเตอร์ ได้มีการเพิ่มองค์ประกอบเสริมต่างๆ ที่ต้นน้ำของโปรโมเตอร์ ในการศึกษานี้ เราประเมินประสิทธิภาพขององค์ประกอบเอนแฮนเซอร์ต่างๆ, โปรโมเตอร์ EF-1α, โปรโมเตอร์ CAG (โปรโมเตอร์หลอมรวมที่ประกอบด้วยเอนแฮนเซอร์ CMV, โปรโมเตอร์ β-actin ไก่ และไซต์ตัวรับประกบ β-โกลบินของกระต่าย) และมิวแทนต์โปรโมเตอร์ CMV ใน เอพิโซมอลเวคเตอร์และทดสอบระดับการแสดงออกของทรานส์ยีนและความคงตัวในเซลล์ CHO-K1 การค้นพบของเราน่าจะเป็นประโยชน์ต่อนักวิจัยที่ออกแบบ episomal vector เพื่อให้ได้การแสดงออกที่สูงและความเสถียรในระยะยาว

หน้าที่ของชีววิทยาโปรโมเตอร์

โปรโมเตอร์ โปรโมเตอร์คือ ลำดับดีเอ็นเอ ซึ่งมีจุดประสงค์ไม่ใช่เพื่อเข้ารหัสข้อมูลเกี่ยวกับตัวสิ่งมีชีวิตเอง แต่กลับทำหน้าที่เป็นสวิตช์ "On" แบบหนึ่งเพื่อเริ่มต้นกระบวนการทางชีววิทยาของการถอดรหัสสำหรับยีนที่เป็นไปตามลำดับดีเอ็นเอของโปรโมเตอร์ เอ็นไซม์ RNA โพลีเมอเรส, ซึ่งดำเนินการกระบวนการถอดความ

ลำดับโปรโมเตอร์คืออะไร?

ลำดับโปรโมเตอร์ ความยาวของ DNA ที่จุดเริ่มต้นของยีนโมเลกุลใดที่เรียกว่าปัจจัยการถอดรหัสเพื่อควบคุมการทำงานของยีนไม่ว่าจะโดยการปิดกั้นหรือเพิ่มการผลิตสาร RNA ของผู้ส่งสาร

โปรโมเตอร์ใกล้เคียงคืออะไร?

โปรโมเตอร์ใกล้เคียงคือ a บริเวณกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA)ก่อนเริ่มยีนที่โปรตีนและโมเลกุลอื่นๆ จับกันเพื่อเตรียมอ่านยีนนั้น บริเวณโปรโมเตอร์มีความจำเป็นสำหรับยีนส่วนใหญ่ในการอ่านและแปลงเป็นโปรตีน & # 32 ทั้งในเซลล์โปรคาริโอตธรรมดาและยูคาริโอตที่ซับซ้อนมากขึ้น

โปรโมเตอร์เป็นโปรตีนหรือไม่?

โปรโมเตอร์คือ a บริเวณ DNA ที่เริ่มการถอดรหัสยีน. โปรโมเตอร์เป็นองค์ประกอบที่สำคัญของเวกเตอร์การแสดงออกเพราะควบคุมการผูกมัดของ RNA โพลีเมอเรส ถึงดีเอ็นเอ RNA polymerase ถ่ายทอด DNA เป็น mRNA ซึ่งในที่สุดแปลเป็นโปรตีนที่ใช้งานได้

โปรโมเตอร์ทั่วไปสำหรับยูคาริโอตและโปรคาริโอต

เราได้รวมตารางอ้างอิงสองตารางด้านล่างโดยแสดงรายการโปรโมเตอร์ของแบคทีเรียและสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่พบบ่อยที่สุดบางส่วน รายการเหล่านี้ไม่ได้ละเอียดถี่ถ้วน แต่ควรเป็นจุดเริ่มต้นที่ดีเมื่อพยายามเลือกโปรโมเตอร์ที่สมบูรณ์แบบของคุณ!

โปรโมเตอร์ยูคาริโอต

โปรโมเตอร์	ส่วนใหญ่ใช้สำหรับ	การถอดเสียง RNA	คำอธิบาย	การแสดงออก	ข้อควรพิจารณาเพิ่มเติม
CMV	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่แข็งแกร่งจาก cytomegalovirus ของมนุษย์	รัฐธรรมนูญ	อาจมีภูมิภาคเอนแฮนเซอร์ สามารถปิดเสียงได้ในเซลล์บางชนิด
EF1a	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่แข็งแกร่งจากปัจจัยการยืดตัวของมนุษย์ 1 อัลฟา	รัฐธรรมนูญ	มีแนวโน้มที่จะให้การแสดงออกที่สม่ำเสมอโดยไม่คำนึงถึงชนิดของเซลล์หรือสรีรวิทยา
SV40	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจากไวรัส simian vacuolating 40	รัฐธรรมนูญ	อาจรวมถึงการเพิ่มประสิทธิภาพ
PGK1 (มนุษย์หรือเมาส์)	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจากยีน phosphoglycerat e kinase	รัฐธรรมนูญ	นิพจน์ทั่วไป แต่อาจแตกต่างกันไปตามประเภทเซลล์ มีแนวโน้มที่จะต่อต้านการควบคุมโปรโมเตอร์เนื่องจาก methylation หรือ deacetylation
Ubc	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจากยีน ubiquitin C ของมนุษย์	รัฐธรรมนูญ	ตามชื่อที่บ่งบอก โปรโมเตอร์นี้มีอยู่ทั่วไปทุกหนทุกแห่ง
สารเบต้าของมนุษย์	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจากยีนเบตาแอกติน	รัฐธรรมนูญ	แพร่หลาย. เวอร์ชันไก่มักใช้ในโปรโมเตอร์ไฮบริด
CAG	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมลูกผสมที่แข็งแกร่ง	รัฐธรรมนูญ	ประกอบด้วยสารเสริม CMV, โปรโมเตอร์บีตาแอคตินของไก่ และตัวรับประกบประกบกระต่ายเบต้า-โกลบิน
TRE	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์องค์ประกอบการตอบสนองของ Tetracycline	เหนี่ยวนำให้เกิดเตตราไซลีนหรืออนุพันธ์ของเตตราไซลีน	โดยทั่วไปประกอบด้วยโปรโมเตอร์ขั้นต่ำที่มีกิจกรรมพื้นฐานต่ำและตัวดำเนินการเตตราไซคลินหลายตัว สามารถเปิดหรือปิดการถอดเสียงได้ขึ้นอยู่กับว่ามีการใช้ทรานส์แอคทีฟใด
UAS	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์ของแมลงหวี่มีไซต์ที่จับกับ Gal4	เฉพาะเจาะจง	ต้องมียีน Gal4 เพื่อกระตุ้นโปรโมเตอร์
Ac5	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์แมลงที่แข็งแกร่งจากยีน Drosophila Actin 5c	รัฐธรรมนูญ	นิยมใช้ในระบบการแสดงออกของแมลงหวี่
โพลีเฮดริน	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์แมลงที่แข็งแกร่งจาก baculovirus	รัฐธรรมนูญ	นิยมใช้ในระบบการแสดงออกของเซลล์แมลง
CaMKIIa	การแสดงออกของยีนสำหรับออพโตเจเนติกส์	mRNA	โปรโมเตอร์โปรตีนไคเนส II ที่ขึ้นกับ Ca2+/แคลโมดูลิน	เฉพาะเจาะจง	ใช้สำหรับการแสดงออกของเซลล์ประสาท/ระบบประสาทส่วนกลาง ดัดแปลงโดยแคลเซียมและคาโมดูลิน
GAL1, 10	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	ยีสต์ที่อยู่ติดกันโปรโมเตอร์ที่ถ่ายทอดต่างกัน	เหนี่ยวนำด้วยกาแลคโตสกดทับด้วยกลูโคส	สามารถใช้อิสระหรือร่วมกันได้ ควบคุมโดย GAL4 และ GAL 80
TEF1	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์ปัจจัยการยืดตัวของยีสต์	รัฐธรรมนูญ	คล้ายคลึงกับโปรโมเตอร์ EF1a ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
GDS	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์การแสดงออกของยีสต์ที่แข็งแกร่งจาก glyceraldehyde 3-phosphage dehydrogenase	รัฐธรรมนูญ	แข็งแกร่งมาก เรียกอีกอย่างว่า TDH3 หรือ GAPDH
ADH1	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์ยีสต์สำหรับแอลกอฮอล์ดีไฮโดรจีเนส I	อดกลั้นโดยเอทานอล	ฉบับเต็มแข็งแรงด้วยสีหน้าสูง โปรโมเตอร์ที่ถูกตัดทอนเป็นองค์ประกอบที่มีการแสดงออกที่ต่ำกว่า
CaMV35S	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์พืชที่แข็งแกร่งจากไวรัสโมเสกดอกกะหล่ำ	รัฐธรรมนูญ	ออกฤทธิ์ในพืชใบเลี้ยงเดี่ยว ออกฤทธิ์น้อยกว่าในพืชใบเลี้ยงเดี่ยว โดยมีกิจกรรมบางอย่างในเซลล์สัตว์
Ubi	นิพจน์ทั่วไป	mRNA	โปรโมเตอร์พืชจากยีนข้าวโพด ubiquitin	รัฐธรรมนูญ	ให้การแสดงออกสูงในพืช
H1	การแสดงออกของ RNA ขนาดเล็ก	shRNA	จากโปรโมเตอร์ RNA ของมนุษย์โพลิเมอเรส III	รัฐธรรมนูญ	อาจมีการแสดงออกที่ต่ำกว่า U6 เล็กน้อย อาจมีการแสดงออกที่ดีขึ้นในเซลล์ประสาท
U6	การแสดงออกของ RNA ขนาดเล็ก	shRNA	จากโปรโมเตอร์นิวเคลียร์ขนาดเล็กของมนุษย์ U6	รัฐธรรมนูญ	นอกจากนี้ยังใช้ Murine U6 แต่อาจมีประสิทธิภาพน้อยกว่า

โปรคาริโอตโปรโมเตอร์

โปรโมเตอร์	ส่วนใหญ่ใช้สำหรับ	คำอธิบาย	การแสดงออก	ข้อควรพิจารณาเพิ่มเติม
T7	การถอดความในหลอดทดลอง/ การแสดงออกทั่วไป	โปรโมเตอร์จาก T7 bacteriophage	เป็นส่วนประกอบ แต่ต้องใช้ T7 RNA polymerase	เมื่อใช้ในการถอดความในหลอดทดลอง โปรโมเตอร์จะกระตุ้นความรู้สึก OR การถอดเสียงแบบแอนติเซนส์ ขึ้นอยู่กับทิศทางของยีนของคุณ
T7lac	การแสดงออกของยีนในระดับสูง	โปรโมเตอร์จากแบคทีเรีย T7 บวกกับผู้ประกอบการครั่ง	การแสดงออกพื้นฐานเล็กน้อยเมื่อไม่ถูกเหนี่ยวนำ ต้องใช้ T7 RNA polymerase ซึ่งควบคุมโดยตัวดำเนินการ lac ด้วย สามารถเหนี่ยวนำโดย IPTG	พบได้ทั่วไปในเวกเตอร์ PET ควบคุมอย่างเข้มงวดโดยผู้ประกอบการครั่ง เหมาะสำหรับปรับการแสดงออกของยีนด้วยความเข้มข้นของตัวเหนี่ยวนำที่หลากหลาย
Sp6	การถอดความในหลอดทดลอง/ การแสดงออกทั่วไป	โปรโมเตอร์จาก Sp6 bacteriophage	เป็นส่วนประกอบ แต่ต้องใช้ SP6 RNA polymerase	SP6 พอลิเมอเรสมีกระบวนการสูง เมื่อใช้ f หรือ การถอดความในหลอดทดลอง โปรโมเตอร์จะกระตุ้นความรู้สึก หรือการถอดเสียงแบบแอนติเซนส์ ขึ้นอยู่กับทิศทางของยีนของคุณ
araBAD	นิพจน์ทั่วไป	โปรโมเตอร์ของการเผาผลาญอะราบิโนส	กระตุ้นโดยการกดขี่ของอะราบิโนสและแคแทบอไลต์แบบกดทับเมื่อมีกลูโคสหรือโดยการจับคู่กันของฟิวโคสต้านตัวเหนี่ยวนำ	อ่อนแอลง พบได้ทั่วไปในเวกเตอร์ pBAD ดีสำหรับการควบคุมอย่างรวดเร็วและการแสดงออกพื้นฐานที่ต่ำ แต่ไม่เหมาะสำหรับการปรับการแสดงออกของยีนผ่านความเข้มข้นของตัวเหนี่ยวนำที่แตกต่างกัน
trp	การแสดงออกของยีนในระดับสูง	โปรโมเตอร์จาก E. coli tryptophan operon	อดกลั้น	ถูกปิดด้วยระดับของทริปโตเฟนระดับเซลล์
แลค	นิพจน์ทั่วไป	โปรโมเตอร์จาก lac operon	ส่วนประกอบขาด lac repressor (lacI หรือ lacIq) สามารถเหนี่ยวนำโดย IPTG หรือแลคโตส	โปรโมเตอร์รั่วด้วยท่าทางอ่อนๆ การกลายพันธุ์ lacIq เพิ่มการแสดงออกของตัวยับยั้ง 10x ดังนั้นจึงควบคุมกฎของโปรโมเตอร์ที่เข้มงวดขึ้น เหมาะสำหรับปรับการแสดงออกของยีนด้วยความเข้มข้นของตัวเหนี่ยวนำที่หลากหลาย
Ptac	นิพจน์ทั่วไป	โปรโมเตอร์ไฮบริดของ lac และ trp	ถูกควบคุมเหมือนครั่งโปรโมเตอร์	ประกอบด้วยภูมิภาค -35 จาก trpB และ -10 จาก lac ระเบียบที่รัดกุมมาก เหมาะสำหรับปรับการแสดงออกของยีนด้วยความเข้มข้นของตัวเหนี่ยวนำที่หลากหลาย โดยทั่วไปแล้วแสดงออกได้ดีกว่า lac เพียงอย่างเดียว
pl	การแสดงออกของยีนในระดับสูง	โปรโมเตอร์จากแบคทีเรียแลมบ์ดา	สามารถควบคุมอุณหภูมิได้	มักจับคู่กับตัวลดอุณหภูมิ cI857 ที่มีความไวต่ออุณหภูมิ
T3	การถอดความในหลอดทดลอง/การแสดงออกทั่วไป	โปรโมเตอร์จาก T3 bacteriophage	เป็นส่วนประกอบ แต่ต้องใช้ T3 RNA polymerase	เมื่อใช้ในการถอดความในหลอดทดลอง โปรโมเตอร์จะขับความรู้สึก หรือการถอดความ antisense ขึ้นอยู่กับทิศทางของยีนของคุณ

แม้ว่ารายการนี้จะเป็นจุดเริ่มต้นที่ดี แต่ตารางด้านบนไม่ได้เจาะลึกถึงเนื้อเยื่อหรือตัวกระตุ้นเฉพาะด้านการพัฒนาที่มีให้สำหรับนักวิทยาศาสตร์ พลาสมิดมักถูกนำมาใช้ในการรักษา และในกรณีเหล่านี้ การระบุโปรโมเตอร์จำเพาะเนื้อเยื่อที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ ตามที่นักวิจัยของ NIH อธิบายไว้ที่นี่

หมายเหตุ: A. Max Juchheim สนับสนุนการเขียนบทความนี้

PSF-EF1-UB-NEO/G418 ASCI - EF1 ALPHA PROMOTER G418 ซีเล็คชั่นพลาสมิด

ระดับการแสดงออกของโปรโมเตอร์: พลาสมิดนี้มีโปรโมเตอร์ Elongation factor 1 ของมนุษย์เพื่อขับเคลื่อนการแสดงออกของโปรตีน EF1 alpha โปรโมเตอร์ประกอบด้วยอินตรอนขนาดใหญ่ที่ช่วยรักษาการแสดงออกของโปรโมเตอร์ในวัฒนธรรมระยะยาว แม้ว่ามันจะแสดงการแสดงออกที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ส่วนใหญ่เมื่อเปรียบเทียบกับโปรโมเตอร์ CMV โดยการทรานส์เฟกชันชั่วคราว แต่โปรโมเตอร์สามารถรักษากิจกรรมได้นานขึ้นในเซลล์หลายประเภทเมื่อสร้างสายพันธุ์ของเซลล์ที่เสถียร โปรโมเตอร์ ubiquitin ที่ขับเคลื่อนยีนต้านทาน G418 แสดงให้เห็นถึงระดับการแสดงออกที่คล้ายคลึงกันกับโปรโมเตอร์ EF1 alpha ในเซลล์ส่วนใหญ่ โปรโมเตอร์ Ubiquitin มีอินตรอนขนาดใหญ่ที่ช่วยรักษากิจกรรมโปรโมเตอร์

แอปพลิเคชัน

การโคลนนิ่งในยีน: พลาสมิดนี้ได้รับการออกแบบมาให้เข้ากันได้กับเทคนิคการโคลนนิ่งต่างๆ ไซต์การโคลนหลายแห่งมีไซต์การจำกัดมาตรฐานที่ใช้กันทั่วไปมากมายสำหรับการโคลน การใช้ไซต์เหล่านี้สามารถแทรกยีนโดยใช้วิธีการโคลนมาตรฐานกับ DNA ligase วิธีการอื่นๆ เช่น การโคลนนิ่งอิสระของ ligase (LIC) Gibson Assembly InFusionHD หรือ Seamless GeneArt ก็สามารถใช้ได้เช่นกัน และเนื่องจากพลาสมิดทั้งหมดของเรามีพื้นฐานอยู่บนแกนหลักเดียวกัน วิธีเดียวกันจึงสามารถใช้สำหรับการโคลนในเวกเตอร์แคตตาล็อกทั้งหมดของเรา

บันทึกไซต์โคลนหลายรายการ: มีไซต์ที่สำคัญสองสามแห่งภายใน MCS ซึ่งรวมถึงไซต์ NcoI ไซต์ XbaI และไซต์ BsgI และ BseRI ไซต์ NcoI มี codon เริ่มต้นที่อยู่ปลายน้ำของทั้งไซต์ที่มีผลผูกพันไรโบโซมของ Kozak และ Shine-Dalgarno สิ่งเหล่านี้ช่วยให้สามารถวางตำแหน่งของยีนได้อย่างเหมาะสมเมื่อวาง codon เริ่มต้นไว้ในตำแหน่งนี้ หากไม่จำเป็น และคุณต้องการใช้ไซต์ดาวน์สตรีมสำหรับการโคลนนิ่งของยีน คุณสามารถลบไซต์ NcoI ได้โดยการแยกพลาสมิดด้วย KpnI

ไซต์ XbaI มี codon หยุด codon หยุดนี้อยู่ในตำแหน่งเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับไซต์ BsgI และ BseRI ที่ปลายน้ำทันที เมื่อ BseRI หรือ BsgI ตัดพลาสมิด พวกมันจะสร้าง TA overhang จาก codon หยุดในไซต์ XbaI ที่เข้ากันได้กับพลาสมิดแท็กเปปไทด์ทั้งหมดของเราที่ตัดด้วยไซต์เดียวกัน ไซต์ BseRI และ BsgI เป็นแบบ non-palindromic และแยกฐานจำนวนที่กำหนดไว้ออกจากไซต์ที่มีผลผูกพัน

เมื่อใดก็ตามที่เราโคลนยีนลงในไซต์การโคลนหลายแห่งของเรา เราจะวางตำแหน่งเริ่มต้นและหยุด codon ในตำแหน่งเดียวกันใน MCS หากจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของยีนเข้ากันไม่ได้กับ NcoI และ XbaI เราจะขยายลำดับไปยังไซต์ภายนอกที่ใกล้ที่สุด แต่รักษาตำแหน่งเริ่มต้นและหยุด codon ให้สอดคล้องกัน

วิธีการ

วัฒนธรรมปรสิต

ในการศึกษาครั้งนี้ ข. กิบโซนี สายพันธุ์โออิตะ [17] ถูกเพาะเลี้ยง ในหลอดทดลอง ในจานเพาะเลี้ยง 24 หลุม (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ที่อุณหภูมิ 37 °C ในคาร์บอนไดออกไซด์ที่มีความชื้น₂ (5%) และ O₂ (5%) ตู้ฟักไข่ (BIO-LABO, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ปรสิตถูกเพาะเลี้ยงในเม็ดเลือดแดงของสุนัข 10% ที่แขวนลอยใน RPMI-1640 เสริมด้วยซีรัมสุนัข 20%

การประเมินผลของ ข. กิบโซนี ความไวต่อ WR99210

Babesia gibsoni ถูกเพาะเลี้ยง ในหลอดทดลอง ในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุมที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI-1640 100 ไมโครลิตรที่มีเซลล์เม็ดเลือดแดงในสุนัข 10% เสริมด้วยซีรัมสุนัข 20% และความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ WR99210 (0.1, 0.5, 1, 5, 10 และ 100 นาโนโมลาร์) สำหรับความเข้มข้นของยาแต่ละชนิด ปรสิตถูกเพาะเลี้ยงในบ่อสามเท่าและเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อทุกวัน ปรสิตถูกคำนวณในวันที่ 3 โดยการตรวจ 3000 RBCs ของคราบเลือดบาง ๆ ที่เตรียมไว้ที่ย้อมด้วยสารละลาย Giemsa

โครงสร้างพลาสมิด

แผนผังของพลาสมิดที่ใช้ในการศึกษานี้ (pBS-EGRADE) แสดงในรูปที่ 1a ยีนนักข่าวและยีนคัดเลือกยาถูกแยกออกเพื่อขับเคลื่อน gfp และ hdhfr กับ Bg 5′-ef-1α (IG-B) และ Bg 5′-แอกติน โปรโมเตอร์ ตามลำดับ Bg 5′-ef-1α (IG-B) และ Bg 3′-ef-1α ถูกใช้เป็นไซต์การรวมตัวใหม่ที่โคลนในต้นน้ำและปลายน้ำของ gfp และ hdhfr ยีนตามลำดับ คู่ไพรเมอร์ PCR ทั้งหมดที่ใช้สำหรับการสร้างพลาสมิดแสดงอยู่ในตารางที่ 1 และไซต์การจำกัดถูกขีดเส้นใต้ พลาสมิดที่สร้างขึ้นถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ Qiagen® Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับก่อนการถ่าย ลำดับของพลาสมิด pBS-EGRADE ถูกฝากไว้ในฐานข้อมูล GenBank ภายใต้เลขทะเบียน MG913246

แผนผังไดอะแกรมของการสร้างพลาสมิดที่แสดง GFP (pBS-EGRADE) และภาพกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงของการแสดง GFP ที่เสถียร ข. กิบโซนี. NS โครงสร้างพลาสมิดของ pBS-EGRADE แสดงไซต์การรวมตัวใหม่สำหรับการรวมเข้ากับ ef-1α โลคัสโดยการรวมตัวแบบโฮโมโลกัสแบบไขว้สองครั้ง ไซต์ข้อจำกัดสำหรับการทำให้เป็นเส้นตรง (Kpn I) แสดงให้เห็น NS ภาพกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงของการแสดง GFP ที่เสถียร ข. กิบโซนี. แผงที่ผสานแสดงการเรืองแสง GFP และ Hoechst (นิวเคลียสของปรสิต) ซ้อนทับกัน นิวเคลียสของปรสิตถูกย้อมด้วย Hoechst 33342

การถ่ายพยาธิ

Babesia gibsoni-เซลล์เม็ดเลือดแดงที่ติดเชื้อ (iRBCs) ได้รับการบำบัดล่วงหน้าตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [13] การทรานส์เฟกชันถูกดำเนินการโดยใช้พลาสมิด pBS-EGRADE ที่เป็นเส้นตรง 20 ไมโครกรัม ของผสมพลาสมิด-iRBCs ถูกทรานส์เฟกโดยใช้บัฟเฟอร์ Lonza SF และโปรแกรม FA113 ของอุปกรณ์ Amaxa 4D Nucleofector™ (ลอนซา, โคโลญ, เยอรมนี) และถ่ายโอนไปยังวัฒนธรรมที่อุ่นไว้ก่อนซึ่งมี RBC สด 10% ในทันที เพื่อหลีกเลี่ยงความรวดเร็ว ในหลอดทดลอง การเสื่อมสภาพของเม็ดเลือดแดงในสุนัข ปรสิตที่ถ่ายพยาธิได้รับการเพาะเลี้ยงย่อยทุกสัปดาห์และเสริมด้วย RBCs ที่สดใหม่ ในการเลือกปรสิตแปลงพันธุ์ที่แสดงออก GFP, 10 นาโนโมลาร์ WR99210 ถูกเติมไปยังอาหารเลี้ยงเชื้อสองวันหลังจากการทรานส์เฟกชัน หลังจาก 4 สัปดาห์ของการเลือกยา ประชากรปรสิตถูกโคลนในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุมโดยใช้การเจือจางแบบจำกัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [16]

การกำหนดลักษณะ PCR ของ GFP-expressing ข. กิบโซนี

ใช้ไพรเมอร์สามชุด (ตารางที่ 1) เพื่อยืนยันการรวม pBS-EGRADE เข้ากับ บี. กิบโซนี ef-1α โลคัส คู่ไพรเมอร์ Integ-F และ GFP-R ถูกใช้เพื่อขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอ 1.6 kb เพื่อยืนยันการรวมตัวใหม่ 5′ คู่ไพรเมอร์ hDHFR-F และ Integ-R ถูกใช้เพื่อขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอ 2.0 kb เพื่อตรวจสอบการรวมตัว 3′ ในขณะที่ไพรเมอร์คู่ GFP-F และ hDHFR-R ถูกใช้เพื่อขยายชิ้นส่วน DNA ขนาด 4.1 kb เพื่อตรวจจับบริเวณการแทรก ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ถูกขยายได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับ

การวิเคราะห์ซับใต้

จีโนม DNA สองไมโครกรัมจากชนิดพันธุ์ป่า (WT) และจีโนมรวม (GI) ข. กิบโซนี ถูกย่อยข้ามคืนด้วย 20 หน่วยของ สกา ฉันและ Sph I. ผลิตภัณฑ์ย่อยอาหารแยกจากกันโดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส agarose ถ่ายโอนไปยังเมมเบรน Hybond N + (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) จากนั้นผสมด้วยหัววัดที่ติดฉลากโดยใช้ AlkPhos Direct Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ตามข้อกำหนดของผู้ผลิต คำแนะนำ. โพรบสองตัวที่สอดคล้องกับกรอบการอ่านแบบเปิดที่สมบูรณ์ (ORF) ของ gfp และความยาว 0.4 kb ของ Bg 3′-ef-1α ใช้ชิ้นส่วนตามลำดับ คู่ไพรเมอร์ที่ใช้ในการขยายโพรบแสดงอยู่ในตารางที่ 1 ตรวจพบสัญญาณโพรบโดยใช้รีเอเจนต์การตรวจหาดาว CDP (GE Healthcare)

เส้นโค้งการเติบโต

ปรสิต WT และ GI ได้รับการเพาะเลี้ยงอย่างต่อเนื่องจากปรสิตประมาณ 0.5% โดยการเพาะเลี้ยงย่อยทุกๆ 3 วันเป็นเวลาสองชั่วอายุคน Parasitemia ได้รับการตรวจสอบทุกวันโดยการตรวจสอบ 3000 RBCs ด้วยการย้อมสี Giemsa

ด้วยเครื่องมือใหม่สำหรับชีววิทยาสังเคราะห์ นักวิจัยใช้แบคทีเรียเพื่อพัฒนาภาพถ่าย

นักวิจัยจาก University of Freiburg และ ETH Zurich/Switzerland ได้พัฒนาเครื่องมือ optogenetic ใหม่และแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพด้วยการตรวจแบคทีเรียของโปสเตอร์ภาพยนตร์ Blade Runner (1982) เครดิต: Universität Freiburg / Barbara Di Ventura ต้นฉบับ: Warner Bros. Pictures

แบคทีเรีย Escherischia coli เป็นสิ่งจำเป็นในห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพทุกแห่ง เช่นเดียวกับที่ยีสต์ทำหน้าที่ในเบเกอรี่ในฐานะผู้ช่วยเซลล์เดียวในเบเกอรี่ ทีมที่นำโดย Prof. Dr. Barbara Di Ventura ศาสตราจารย์ด้านการวิจัยการส่งสัญญาณทางชีววิทยาที่มหาวิทยาลัย Freiburg ได้พัฒนาเครื่องมือใหม่ที่เรียกว่า optogenetic tool ซึ่งช่วยลดความซับซ้อนของวิธีการมาตรฐานในเทคโนโลยีชีวภาพ: แทนที่จะให้แบคทีเรียกินน้ำตาลเหมือนที่ทำกันทั่วไป นักวิจัยสามารถฉายแสงบนพวกเขาได้แล้ว Di Ventura, Prof. Dr. Mustafa Hani Khammash จาก ETH Zurich/Switzerland และทีมงานของพวกเขา ซึ่งเป็นผู้เขียนคนแรกๆ อย่าง Edoardo Romano และ Dr. Armin Baumschlager ได้ตีพิมพ์ผลงานของพวกเขาใน ชีววิทยาเคมีธรรมชาติ.

"เราได้เรียกระบบใหม่ BLADE—ดิเมอร์ AraC ที่เหนี่ยวนำแสงสีน้ำเงินใน Escherichia coli" Romano อธิบาย นักวิทยาศาสตร์ควบคุมการแสดงออกของยีนที่ต้องการในแบคทีเรีย E. coli โดยใช้โปรโมเตอร์ PBAD ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของเครือข่ายพันธุกรรมที่ควบคุมการเผาผลาญน้ำตาลอาราบิโนสในแบคทีเรีย ซึ่งช่วยให้พวกเขาเลือกผลิตโปรตีนและศึกษากระบวนการส่งสัญญาณในแบคทีเรีย "โครงสร้างที่นำแสงแบบใหม่นี้สามารถแทนที่ระบบการแสดงออกของยีน arabinose แบบกว้าง ซึ่งอำนวยความสะดวกในการยอมรับออปโตเจเนติกส์ในหมู่นักจุลชีววิทยา" Di Ventura ผู้ซึ่งเป็นสมาชิกของกลุ่ม Clusters of Excellence CIBSS—Centre for Integrative Biological Signaling Studies และ BIOSS อธิบาย —ศูนย์การศึกษาสัญญาณชีวภาพ

ออปโตเจเนติกส์ใช้โปรตีนที่ตอบสนองต่อแสงเพื่อควบคุมการทำงานของเซลล์ "BLADE มีไว้สำหรับใช้ในชีววิทยาสังเคราะห์ จุลชีววิทยา และเทคโนโลยีชีวภาพ เราแสดงให้เห็นว่าเครื่องมือของเราสามารถนำมาใช้ในลักษณะที่เป็นเป้าหมาย ได้อย่างรวดเร็วและย้อนกลับได้" Di Ventura ให้ความเห็น เพื่อแสดงให้เห็นว่า BLADE ตอบสนองต่อแสงได้อย่างแม่นยำเพียงใด Di Ventura และทีมของเธอจึงได้ทำการวิเคราะห์แบคทีเรีย: รูปภาพที่สร้างขึ้นจากวัฒนธรรมของแบคทีเรีย BLADE ประกอบด้วยโปรตีนที่ไวต่อแสงและปัจจัยการถอดรหัส: โปรตีนที่จับลำดับเฉพาะของ DNA ที่พบในบริเวณที่เรียกว่าโปรโมเตอร์ของยีน และควบคุมว่ากลไกของเซลล์จะอ่านยีนที่เกี่ยวข้องหรือไม่ นักวิจัยควบคุมด้วย BLADE การแสดงออกของยีนที่เข้ารหัสโปรตีนเรืองแสงเพื่อสร้างแบคทีเรีย

นักวิทยาศาสตร์ของ Freiburg ส่องสว่างสนามหญ้าของแบคทีเรียผ่านโฟโตมาสก์ที่ติดกาวที่ฝาจานเพาะเชื้อ แบคทีเรียเรืองแสงที่จุดที่มีแสง เนื่องจาก BLADE ถูกเปิดใช้งาน: ภาพถูกสร้างขึ้นภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ในการทดลองอื่น นักวิจัยใช้ BLADE เพื่อควบคุมยีนที่ทำให้เซลล์ E. coli ยาวขึ้น หนาขึ้น และมีรูปร่างเป็นแท่ง แม้กระทั่งย้อนกลับการเปลี่ยนแปลง: เซลล์เปลี่ยนกลับเป็นรูปร่างเดิมหลังจากสี่ชั่วโมงโดยไม่มีแสง ด้วยวิธีนี้ ระบบสามารถใช้เพื่อศึกษายีนอื่นๆ ได้มากมาย แม้กระทั่งยีนที่ไม่ได้มาจากอี.โคไล

พื้นหลัง

โรคที่เกิดจากเห็บและหมัด (TBDs) มีผลกระทบอย่างมากต่อการผลิตอาหารและสาธารณสุข โรคบาบีซิโอซิสจากวัวเป็นที่รู้จักในหมู่ TBD ที่สำคัญที่สุดในแง่ของความสูญเสียทางเศรษฐกิจทั่วโลก [1] โรคบาบีซิโอซิสจากวัวสามารถควบคุมได้บางส่วนโดยใช้วัคซีนที่มีชีวิต แต่วัคซีนเหล่านี้มีความท้าทายในการผลิตและแจกจ่าย มีความเสี่ยงด้านความปลอดภัย และอายุการเก็บรักษาที่จำกัด [2] การมีอยู่ของช่องว่างการวิจัยจำนวนมากเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์และปรสิตจำกัดตัวเลือกสำหรับการพัฒนาวิธีการควบคุมที่ได้รับการปรับปรุง จำเป็นต้องมีเครื่องมือวิจัยนวนิยายเพื่อปิดช่องว่างความรู้ดังกล่าวและสนับสนุนการพัฒนาวิธีการใหม่ในการควบคุม Babesia ปรสิตและพาหะของมัน [3] Babesia bovis และ B. bigemina เป็นปรสิตหลักที่ก่อให้เกิดโรคบาบีซิโอซิสของวัวในแง่ของการแพร่กระจายของปรสิตทั่วโลกในขณะที่ Babesia divergens ส่วนใหญ่แพร่หลายในทวีปยุโรป [1]

โดยทั่วไป ข. โบวิส ถือว่ารุนแรงที่สุด Babesia ปรสิตในขณะที่ B. bigemina ทำให้เกิดโรคโลหิตจางเฉียบพลัน [4] แม้ว่า ข. โบวิส ระบบจีโนมและการถ่ายโอนข้อมูลได้รับการพัฒนาเมื่อหลายปีก่อน [5, 6] จีโนมสำหรับ B. bigemina ยังคงไม่สมบูรณ์และไม่ได้ประกอบ (http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/protozoa/babesia-bigemina.html) และระบบแก้ไขและเปลี่ยนยีนสำหรับ B. bigemina ยังคงใช้งานไม่ได้ ลดทอน transfected Babesia ปรสิตเป็นตัวเลือกในอุดมคติสำหรับการส่งแอนติเจนของวัคซีนต้านเห็บหรือสารต้าน TBD อื่นๆ [7] พิจารณาว่า B. bigemina มีเวกเตอร์เห็บช่วงกว้างกว่า ข. โบวิส, รวมทั้ง ไรพิเซฟาลัส (บูฟิลัส) ไมโครพลัส [8], ข. วงแหวน [9] และ ข. เดคัลเลอร์ตัส [10, 11] ปรสิตชนิดนี้ควรได้รับการพิจารณาว่าเป็นตัวเลือกที่มีประสิทธิภาพสำหรับการพัฒนาแนวทางวัคซีนป้องกันปรสิต-เวกเตอร์คู่

จำเป็นต้องมีระบบการแก้ไขและการถ่ายยีน นอกเหนือจากจีโนมที่สมบูรณ์ เพื่อพัฒนาความเข้าใจของเราเกี่ยวกับอณูชีววิทยาของ B. bigemina ปรสิตและเพื่อการพัฒนาวัคซีนที่ดีขึ้น ข้อจำกัดในปัจจุบันสำหรับการพัฒนาระบบวิเคราะห์ยีนดังกล่าวคือการขาดคำจำกัดความ B. bigemina โปรโมเตอร์และวิธีการนำ DNA ต่างประเทศเข้าสู่ B. bigemina. โปรโมเตอร์ควบคุมการแสดงออกของปัจจัยการยืดตัว 1-อัลฟา (ef-1α) ยีนในปรสิต apicomplexan โดยทั่วไปถือว่าเป็นตัวก่อการที่แข็งแกร่ง [12, 13] ใน ข. โบวิส NS ef-1α รวมการจัดเรียงยีนแบบตัวต่อตัวที่เหมือนกันสองตัวที่แยกจากกันโดยพื้นที่ 1.4 kb ที่มีโปรโมเตอร์ที่เห็นได้ชัดสองตัว [12, 13] ดังนั้น แนวทางที่มีเหตุผลในการระบุ B. bigemina โปรโมเตอร์ประกอบด้วยการค้นหาการมีอยู่ของการจัดโครงสร้างและการทำงานที่คล้ายคลึงกันสำหรับ ef-1α โลคัสในปรสิตตัวนี้

เนื่องจากปัจจุบันไม่มีระบบพันธุกรรมในการจำแนกลักษณะพื้นฐานของโมเลกุลสำหรับ B. bigemina ความรุนแรงและเพื่ออำนวยความสะดวกในการพัฒนาวัคซีน เราได้กำหนดโปรโมเตอร์และวิธีการที่จะนำดีเอ็นเอแปลกปลอมเข้าสู่ปรสิต ในการศึกษานี้เราอธิบาย ef-1α สถานที่ของ B. bigeminaและทดสอบการทำงานของ ef-1α โปรโมเตอร์ ข้อมูลที่สร้างขึ้นในการศึกษานี้อาจใช้เป็นพื้นฐานสำหรับการพัฒนาในอนาคตของการแก้ไขยีนที่จำเป็นอย่างเร่งด่วนและระบบการถ่ายเทที่มีเสถียรภาพสำหรับ B. bigemina.

การกำหนดลักษณะหน้าที่ของชิ้นส่วนที่มีความยาวเต็มและ 5′ การลบของ Citrus sinensis-มาจากโปรโมเตอร์ที่เป็นส่วนประกอบใน Nicotiana benthamiana

ชิ้นส่วนที่มีความยาวเต็มและลบ 5′ ของยีนโปรโมเตอร์ที่แสดงเป็นส่วนประกอบสามตัวซึ่งระบุจาก Citrus sinensis L. จีโนม (ไซโคลฟิลลิน (CsCYP), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C2 (CsGAPC2) และปัจจัยการยืดตัว 1-alpha (CsEF1)) ได้รับการประเมินสำหรับความสามารถในการแสดงออก uidยีนในเนื้อเยื่อใบ ลำต้น และรากของยีน น. เบญจมานาค พืช. ตามการทดสอบ GUS ของ fluorometric กิจกรรมโปรโมเตอร์ CsGAPC2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในใบเมื่อลำดับระหว่างตำแหน่ง − 1090 และ − 497 ถูกลบออก ในขณะที่กิจกรรมยังคงไม่เปลี่ยนแปลงในราก กิจกรรมโปรโมเตอร์ CsCYP ไม่ได้รับผลกระทบจากการลบที่แตกต่างกัน และแม้แต่ชิ้นส่วนที่ประเมินที่เล็กที่สุดก็เพียงพอที่จะรักษาการแสดงออกของ uidยีนใน น. เบญจมานาค ใบและราก. ชิ้นส่วนโปรโมเตอร์ที่ถูกตัดทอนของ CsEF1 ให้กิจกรรม GUS ในใบที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับโปรโมเตอร์ที่มีความยาวเต็มที่ ในขณะที่กิจกรรม GUS ไม่ได้รับผลกระทบในราก การกำจัดอินตรอนใน 5′ UTR ของโปรโมเตอร์ CsEF1 ลดการแสดงออกของยีนในราก แม้ว่าจะไม่ได้ทำให้ระดับการแสดงออกของยีนในใบลดลงก็ตาม ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการลบใด ๆ ในสามของโปรโมเตอร์ CsCYP สามารถใช้สำหรับการแสดงออกของยีนที่มีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ โปรโมเตอร์ CsGAPC2 แบบเต็มความยาวและชิ้นส่วนโปรโมเตอร์ CsEF1 ที่ถูกตัดทอนสองชิ้นก็เพียงพอสำหรับประสิทธิภาพ uidการแสดงออกของยีน

นี่คือตัวอย่างเนื้อหาการสมัครสมาชิก เข้าถึงผ่านสถาบันของคุณ