ข้อมูล

Hoechst สเปกตรัมสีแดงและสีน้ำเงิน - การปล่อยสีแดงบอกอะไรเรา?

Hoechst สเปกตรัมสีแดงและสีน้ำเงิน - การปล่อยสีแดงบอกอะไรเรา?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันเข้าใจว่าสเปกตรัมสีน้ำเงินถูกปล่อยออกมาเมื่อ Hoechst 33342 จับกับ DNA นิวเคลียร์ แต่สเปกตรัมสีแดงกำลังบอกอะไรเรากันแน่?

ฉันอ่านว่าสเปกตรัมสีแดงสามารถบ่งบอกถึงการตายของเซลล์ ความซับซ้อนของเซลล์ หรือพร็อกซีสำหรับเนื้อหาไซโตพลาสซึม

อะไรคือสเปกตรัมสีแดงที่บ่งบอกถึงบริบทของเซลล์?

แก้ไข**

ขออภัยที่ไม่ได้กลับไปที่คำถามนี้เร็วกว่านี้ ฉันพบคำตอบในบทความนี้: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022175995002146#

เห็นได้ชัดว่าโครมาตินที่ควบแน่นระหว่างการตายของเซลล์ทำให้ hoechst เปลี่ยนเป็นสเปกตรัมสีแดง


สเปกตรัมที่มองเห็นได้: ความยาวคลื่นและสี

ตามนุษย์มองเห็นสีในช่วงความยาวคลื่นตั้งแต่ 400 นาโนเมตร (สีม่วง) ถึง 700 นาโนเมตร (สีแดง) แสงตั้งแต่ 400–700 นาโนเมตร (นาโนเมตร) เรียกว่าแสงที่มองเห็นได้หรือสเปกตรัมที่มองเห็นได้เพราะมนุษย์สามารถมองเห็นได้ แสงที่อยู่นอกช่วงนี้อาจมองเห็นได้กับสิ่งมีชีวิตอื่น แต่ไม่สามารถรับรู้ได้ด้วยตามนุษย์ สีของแสงที่สอดคล้องกับแถบความยาวคลื่นแคบ (แสงสีเดียว) คือสีสเปกตรัมบริสุทธิ์ที่เรียนรู้โดยใช้ตัวย่อ ROYGBIV ได้แก่ สีแดง สีส้ม สีเหลือง สีเขียว สีฟ้า สีคราม และสีม่วง


Grow Light Spectrum คืออะไร?

Grow light spectrum หมายถึงความยาวคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าของแสงที่เกิดจากแหล่งกำเนิดแสงเพื่อส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืช สำหรับการสังเคราะห์ด้วยแสง พืชใช้แสงในบริเวณ PAR (การแผ่รังสีที่สังเคราะห์ด้วยแสง) ของความยาวคลื่น (400nm-700nm) ซึ่งวัดเป็นนาโนเมตร (นาโนเมตร)

นาโนเมตรเป็นหน่วยวัดสากล แต่ยังใช้เพื่อวัดสเปกตรัมของแสง – มนุษย์สามารถตรวจจับได้เท่านั้น มองเห็นได้ ความยาวคลื่นสเปกตรัมแสง (380-740nm) ในทางกลับกัน พืชจะตรวจจับความยาวคลื่น รวมทั้ง แสงที่มองเห็นของเราและอื่น ๆ เพื่อรวมสเปกตรัม UV และ Far Red

สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าสเปกตรัมแสงส่งผลต่อการเจริญเติบโตของพืชแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับสิ่งต่างๆ เช่น สภาพแวดล้อม ชนิดของพืช ฯลฯ โดยทั่วไป คลอโรฟิลล์ ซึ่งเป็นโมเลกุลในพืชที่ทำหน้าที่เปลี่ยนพลังงานแสงเป็นพลังงานเคมี จะดูดซับแสงส่วนใหญ่ในสเปกตรัมแสงสีน้ำเงินและสีแดงเพื่อสังเคราะห์แสง . พบทั้งแสงสีแดงและสีน้ำเงินที่จุดสูงสุดของช่วง PAR


วิธีหนึ่งคือผ่านเอฟเฟกต์ Zeeman การปรากฏตัวของสนามแม่เหล็กในบริเวณที่เกิดเส้นดูดกลืนสามารถแบ่งระดับพลังงานของอะตอมออกเป็นหลายองค์ประกอบ การเปลี่ยนผ่านระหว่างสถานะพลังงานแยกเหล่านี้จะนำไปสู่เส้นการดูดกลืนที่มีส่วนประกอบหลายอย่างที่ความยาวคลื่นแยกกัน จำนวนส่วนประกอบและขนาดของการแยกตัวขึ้นอยู่กับจำนวนควอนตัมของสถานะพลังงานและขนาดของสนามแม่เหล็กที่ใช้ หากสนามมีความแข็งแรงเพียงพอ ส่วนประกอบที่แยกจากกันสามารถวัดได้และการแยกจากกันสามารถบอกเราเกี่ยวกับความแรงของสนามแม่เหล็กได้ บางครั้ง เส้นที่แยกจากกันจะเบลอพร้อมกันในสเปกตรัม แต่สามารถสร้างแบบจำลองความกว้างโดยรวมของเส้นดูดกลืนเพื่อให้ความแรงของสนาม

บ่อยครั้ง ส่วนประกอบไม่ได้แยกจากกันอย่างเพียงพอในการแก้ปัญหา แต่เนื่องจากมีสถานะโพลาไรซ์ต่างกัน การแยกยังสามารถอนุมานได้ด้วยการสังเกตผ่านตัวกรองโพลาไรซ์ ความยาวคลื่นของเส้นจะเปลี่ยนไป ขึ้นอยู่กับสถานะโพลาไรซ์ที่สังเกตได้ สิ่งนี้เรียกว่าสเปกโตรโพลาริเมทรี นอกจากนี้ยังสามารถไวต่อการวางแนวของสนามแม่เหล็ก

ตัวอย่างอาจช่วยได้ พล็อตด้านล่างจาก Kochukhov (2017) แสดงสเปกตรัมความละเอียดสูงของดาวแคระ M ที่มีสนามแม่เหล็กซึ่งมองในแสงที่ไม่มีขั้วสำหรับบริเวณสเปกตรัมสามแห่งที่มีความไวต่อการแยกตัวของ Zeeman (การเปลี่ยนภาพทั้งหมดจะไม่ได้รับผลกระทบเท่าๆ กัน ซึ่งอาจเป็นประโยชน์หากคุณ ต้องรู้ แท้จริง โปรไฟล์การดูดซึม) เส้นประสีน้ำเงินแสดงสิ่งที่คุณคาดหวังโดยไม่มีสนามแม่เหล็ก และเส้นสีแดงแสดงแบบจำลองที่เข้ากับข้อมูล ซึ่งรวมเอาสนามแม่เหล็กที่แรง (หลาย kG) ครอบคลุมพื้นผิว

เส้นทางด้านซ้ายถูกขยายให้กว้างขึ้นเนื่องจากองค์ประกอบ Zeeman แต่ละส่วนไม่สามารถแก้ไขได้ (อันที่จริง จะมีเพียงส่วนประกอบที่ไม่ต่อเนื่องกันหากสนามแม่เหล็กมีค่าสม่ำเสมอทั่วทั้งพื้นผิวดาว ซึ่งดูไม่น่าจะเป็นไปได้ ดังนั้นความแรงของสนามที่พอดีจึงแสดงถึงบางส่วน เฉลี่ย). เส้นตรงกลางและด้านขวาแสดงถึงกรณีที่คุณสามารถมองเห็นส่วนประกอบ Zeeman แต่ละตัวในดาวฤกษ์ด้วยสนามแม่เหล็กที่แรงที่สุด (WX UMa)


ผลลัพธ์

ด้วยจุดมุ่งหมายของเราในการย้อม DNA ของเซลล์เดี่ยวที่เลือก เราจึงติดตั้งโฟโตเคจบน Hoechst33342 สิ่งนี้ทำได้โดยทำปฏิกิริยา Hoechst33342 แบบฟรีกับ o-ไนโตรเบนซิลโบรไมด์ 1 เพื่อมอบ Hoechst ที่ถ่ายรูปไว้ (pcHoechst, รูปที่ 1b, Scheme S1 ในข้อมูลสนับสนุน) โดยการรันปฏิกิริยาใน DMF ด้วย K2CO3 โดยเป็นฐานที่อุณหภูมิ 60 °C เราแยก pcHoechst ด้วยผลผลิตที่น่าพอใจ 39% ระหว่างวัสดุตั้งต้นและ Bis-benzylated Hoechst หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ด้วย HPLC ความบริสุทธิ์ถูกประเมินโดย UHPLC เป็น >95 % (รูปที่ S1) Benzylation ถูกกำหนดให้เกิดขึ้นครั้งแรกที่ 4-NS-หมู่เมทิล ปิเปราซิโน เพื่อให้เกลือแอมโมเนียมควอเทอร์นารี ตามที่กำหนดโดย ROESY (รูปที่ S2) การส่องสว่างด้วยแสงยูวีถึงแสงสีน้ำเงินจะแยกโมเลกุลออกและปลดปล่อย Hoechst33342 (รูปที่ 1c)

ในครั้งแรก ในหลอดทดลอง การทดลองเพื่อประเมินการเรืองแสงตามการจับเป้าหมาย ดีเอ็นเอของกิ๊บ (hpDNA) ถูกไทเทรตเทียบกับ 100 นาโนโมลาร์ pcHoechst (สีน้ำเงิน) และตรวจไม่พบการเรืองแสงที่เพิ่มขึ้นถึง 100 ไมโครโมลาร์ hpDNA (รูปที่ 1d) ความเข้มข้นของ DNA ที่สูงขึ้นส่งผลให้เกิดการเรืองแสงที่รุนแรงขึ้น (รูปที่ S3) ในขณะที่ Hoechst33342 (100 นาโนโมลาร์, สีดำ) ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่มี EC50=44.6 นาโนโมลาร์ การเปรียบเทียบสเปกตรัม UV/Vis ใน PBS (สารประกอบ 20 μM) เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นและการเปลี่ยนสีแดงเล็กน้อยในการดูดกลืนแสงสูงสุดของ pcHoechst (สีน้ำเงิน λmax=351 นาโนเมตร) เทียบกับ Hoechst33342 (สีดำ λmax=340 นาโนเมตร รูปที่ 1e) สเปกตรัม UV/Vis ของสารประกอบ 1 (สีเทา) ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันเปิดเผย λmax=350 นาโนเมตร และหลังจากคำนวณการเติมสเปกตรัม UV/Vis ของสารประกอบ 1 และ Hoechst (เส้นประ) เราพบว่าสเปกตรัมทางทฤษฎีแตกต่างจาก pcHoechst ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของสารประกอบ 1 ที่ 350 นาโนเมตรถูกกำหนดให้เป็น ϵ350 นาโนเมตร(1)∼5200 ม. -1 ซม. -1 (รูปที่ S4) การเปรียบเทียบค่าการเรืองแสงที่ความเข้มข้นของ DNA ต่ำ เราไม่สามารถสังเกตความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่าง Hoechst และ pcHoechst โดยอ้างว่าการดับการเรืองแสงพื้นหลัง bisbenzimide โดยกลุ่ม nitrobenzyl ไม่เกิดขึ้น อย่างไรก็ตาม เมื่อวัดค่าการดูดกลืนแสงซ้ำในที่ที่มี 1 mM hpDNA เราสังเกตเห็นการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (ภาพที่ 1f) และการปล่อย (รูปที่ 1g) สำหรับ Hoechst33342 เทียบกับ pcHoechst. นอกจากนี้ เรายังประเมินการเปิดใช้งานโดยการเพิ่มผลผลิตควอนตัมเรืองแสงเมื่อฟักตัว hpDNA เพิ่มขึ้น 51 เท่าและ 1.6 เท่าสำหรับ Hoechst33342 และ pcHoechst ตามลำดับ (รูปที่ 1 ชั่วโมง)

ต่อไปเราหันไปทำการทดลองเกี่ยวกับภาพ ในเซลลูโล โดยการฟักเซลล์ HeLa ด้วย Hoechst33342 และ pcHoechst (แต่ละ 10 μM) และส่องสว่างหรือไม่ใช้ UV LED (λuncage=365 นาโนเมตร, 4 วินาที, 76 μW ไฟ LED) เพื่อสังเกตการเพิ่มขึ้นของสัญญาณนิวเคลียร์และสัญญาณพื้นหลังในเซลล์ที่บำบัดด้วย pcHoechst (รูปที่ 2a, ภาพยนตร์ที่สนับสนุน 1-4) หลังจากการส่องสว่างด้วยแสงยูวี เรายังคงถ่ายภาพในโหมดไวด์ฟิลด์ (รูปที่ 2b) และหลังจาก 24 ชั่วโมงได้ประเมินวิดีโอว่ามีเซลล์จำนวนเท่าใดที่ได้รับการแบ่งตัว (รูปที่ 2c) แม้ว่าอัตราการตายจะสูงสำหรับ 10 ไมโครโมลาร์ Hoechst33342 แม้ในกรณีที่ไม่มีแสงยูวี แต่ก็มีความเด่นชัดน้อยกว่าเมื่อใช้ 100 นาโนโมลาร์ ที่น่าสนใจคือ pcHoechst ไม่แสดงความเป็นพิษเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่บำบัดด้วยกระสายยาในกรณีที่ไม่มีแสงยูวี สำหรับทุกสภาวะ การฉายรังสี UV มีแนวโน้มที่ชัดเจนในความเป็นพิษ แต่อัตราการแบ่งเซลล์สูงขึ้นหลังจากการส่องสว่างของเซลล์ที่บำบัดด้วย pcHoechst 10 μM เมื่อเทียบกับเซลล์ที่บำบัดด้วย Hoechst33342 100 นาโนโมลาร์ ด้วยการกำหนดลักษณะเบื้องต้นนี้ เราจึงกระตือรือร้นที่จะใช้ pcHoechst ร่วมกับกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลซึ่งมีข้อดีหลายประการ: i) การส่องสว่างแบบพิกเซลที่สั้นลง ii) สัญญาณที่ได้รับการปรับปรุงบนพื้นหลัง และ iii) การถอดรหัสเป้าหมายเป็นไปได้ อีกครั้ง เราเริ่มต้นด้วยเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตเพื่อทำการ uncaging ทั่วโลกเป็นครั้งแรกหลังการรักษาด้วย pcHoechst 10 μM ด้วยเหตุนี้ จึงสังเกตเห็นการเรืองแสงที่เพิ่มขึ้นทันทีหลังจากใช้การสแกนด้วยแสงยูวีความถี่สูงด้วยความเข้มสูง (λuncage=355 nm, 15 วินาที, 1.10 mW กำลังเลเซอร์) ก่อนรับภาพ (λอดีต=355 นาโนเมตร, λเอม=420–500 นาโนเมตร) ถึงความอิ่มตัวภายใน 5 นาที (รูปที่ 2d, e, รองรับภาพยนตร์ 5) การถ่ายภาพที่ยาวขึ้นช่วยลดการเรืองแสงในพื้นที่นิวเคลียร์ สันนิษฐานว่าสะท้อนการฟอกขาว ซึ่งสนับสนุนโดยใช้กำลังเลเซอร์ที่สูงขึ้นไปอีก (รูปที่ S5) การวิเคราะห์ความเข้มของการเรืองแสงของเส้นโปรไฟล์ในช่วงเวลาหนึ่งบ่งชี้ถึงสัญญาณเริ่มต้นในบริเวณที่อุดมด้วยเฮเทอโรโครมาตินที่แผ่นลามินานิวเคลียร์ภายในหนึ่งนาทีหลังจากการคลายกรง ตามด้วยการเพิ่มขึ้นของภายในนิวเคลียสภายใน 3 นาทีหลังจากการคลายกรง (รูปที่ 2f) นี่อาจสะท้อนถึงความจริงที่ว่าบริเวณเฮเทอโรโครมาติกที่ควบแน่นนั้นถูกย้อมเป็นพิเศษ ซึ่งเป็นที่รู้จักสำหรับอนุพันธ์ของ Hoechst, 22 หรือ Hoechst ที่ไม่มีเซลล์ไซโตพลาสซึมจำนวนมากกระจายเข้าไปในนิวเคลียสและทำให้บริเวณที่มันสัมผัสก่อนเป็นคราบ มองเห็นจุดที่อยู่นอกนิวเคลียสที่เรากำหนดให้สะสมในระบบไลโซโซม สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนโดยการถ่ายภาพต่อหน้า mCLING, 23 คราบสำหรับการตรวจจับของระบบ endo- และ lysosomal และ LysoTracker red ซึ่งเป็นรอยเปื้อนสำหรับไลโซโซมที่เป็นกรด ซึ่งทั้งคู่แสดงการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นร่วมกับ pcHoechst ที่ไม่มีการแบ่งส่วนโดยไม่มีเลือดออกชัดเจน (รูปที่ 2g, S6 และ S7) และมีค่าสัมประสิทธิ์ของเพียร์สันเป็นบวก NS=0.338±0.151 (รูปที่ 2 ชม. NS=−0.260±0.115 สำหรับรูปภาพที่ไม่มี LysoTracker) เรายังวัดปริมาณสัญญาณนอกนิวเคลียร์เป็น 7.2±3.2 % ของความหนาแน่นของสัญญาณรวมทั้งหมด ที่น่าสนใจและสนับสนุนเพิ่มเติมสำหรับการสังเกตสัญญาณ lysosomal ของเรา Hoechst33342 และ pcHoechst แสดงสเปกตรัมที่แตกต่างกันเล็กน้อยและให้ผลตอบแทนควอนตัมที่สูงขึ้นในบัฟเฟอร์กรดซิตริก (pH 4 รูปที่ S8)

ในเซลลูโล Uncaging ของ pcHoechst. A) การถ่ายภาพ Epifluorescence ของเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตซึ่งฟักตัวด้วย Hoechst33342 หรือ pcHoechst (แต่ละ 10 μM) ก่อนและหลังการฉายรังสี UV 4 วินาที แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของการเรืองแสงนิวเคลียร์สำหรับเซลล์ที่ได้รับการบำบัดด้วย pcHoechst แถบมาตราส่วน: 20 μm. B) เช่นเดียวกับใน (A) แต่เฟสคอนทราสต์ภาพ C) เซลล์จาก (A) ถูกสร้างภาพตลอด 24 ชั่วโมงเพื่อกำหนดหาความอยู่รอดของเซลล์เดียวเพื่อให้เจริญผ่านวัฏจักรของเซลล์ที่สมบูรณ์ในระหว่างการบำบัดด้วยสารประกอบและรังสียูวี ตัวเลขบ่งชี้เหตุการณ์การแบ่งเซลล์แบบสัมบูรณ์ D) ภาพคอนโฟคอลของเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตซึ่งฟักไข่ด้วย pcHoechst (10 μM) ระหว่างแต่ละภาพ แสง UV ถูกนำไปใช้ด้วยความเข้มที่สูงขึ้นเพื่อแยก pcHoechst แถบมาตราส่วน: 20 μm. E) การเรืองแสงเพิ่มขึ้นเมื่อเวลาผ่านไปเมื่อ pcHoechst uncaging (NS=15 เซลล์) F) การสแกนเส้นส่งผลให้เกิดการเรืองแสงเพิ่มขึ้นเมื่อเวลาผ่านไปเมื่อ pcHoechst uncaging (จากเส้นประใน D) G) Colocalization ของสัญญาณ cytosolic จาก pcHoechst ด้วยระบบ lysosomal ที่ติดฉลากด้วย LysoTracker Red แถบมาตราส่วน: 5 ไมโครเมตร H) ความสัมพันธ์ของเพียร์สัน NS ค่าสำหรับ cytosolic colocalization เป็นค่าบวกสำหรับ pcHoechst และ LysoTracker Red ที่นำไปใช้ร่วมกัน และมีค่าลบในตัวควบคุม ดังนั้นจึงเป็นการโต้เถียงสำหรับสัญญาณนอกนิวเคลียร์ที่เกิดจากส่วนที่เป็นกรด NS=6 เซลล์

ต่อไปเราจะตรวจสอบว่า pcHoechst สามารถใช้ในสัตว์ที่มีชีวิตเพื่อย้อมและติดตามนิวเคลียสเดี่ยวได้หรือไม่ ดังนั้นเราจึงตรวจสอบการย้อมสีนิวเคลียสของ pcHoechst ในเซลล์ม้าลายก่อน ในร่างกาย และเปรียบเทียบประสิทธิภาพกับ Hoechst33342 เอ็มบริโอของปลาม้าลายถูกฟักใน pcHoechst (100 ไมโครโมลาร์) หรือ Hoechst33342 (100 นาโนโมลาร์, 1 ไมโครโมลาร์, 10 ไมโครโมลาร์ และ 100 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง 100 นาโนโมลาร์และ 1 ไมโครโมลาร์ Hoechst33342 สามารถทนได้ดี ที่ 10 ไมโครโมลาร์ Hoechst33342 การรอดชีวิตลดลงเล็กน้อย ในขณะที่ 100 ไมโครโมลาร์ Hoechst33342 เป็นอันตรายถึงชีวิต และ 10 ไมโครโมลาร์ Hoechst33342 ยังคงแสดงความเป็นพิษอยู่บ้าง ในทางตรงกันข้าม 100 μM pcHoechst ไม่ส่งผลต่อการพัฒนาของ zebrafish เมื่อปลาถูกเลี้ยงไว้ภายใต้แสงแวดล้อมหรือในที่มืด (รูปที่ S9) ห้านาที ถึงกระนั้น เราสังเกตเห็นว่าการฉายรังสี UV นี้ประสบความสำเร็จในการทำลาย pcHoechst เนื่องจากนิวเคลียสหลายตัวมองเห็นได้ ซึ่งบ่งชี้ว่า pcHoechst สามารถใช้ในตัวอ่อนของปลาม้าลายได้ ปลาที่เลี้ยงในที่มืดหรือภายใต้แสงโดยรอบไม่แสดงโครงสร้างที่ติดฉลาก Hoechst ใดๆ แสดงว่า pcHoechst ไม่รั่วไหลภายใต้สภาวะเหล่านี้ (รูปที่ S10)

เพื่อแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างที่ติดฉลาก pcHoechst ใน zebrafish เป็นนิวเคลียสอย่างแท้จริง เราใช้ฮิสโตนโปรตีน H2B ที่แท็กด้วย mRFP (H2B-mRFP) เป็นคราบอ้างอิงนิวเคลียร์ (รูปที่ 3a) H2B-mRFP ที่แสดงตัวอ่อนถูกกำจัดและบ่มใน 10 ไมโครโมลาร์ Hoechst33342 หรือ 100 ไมโครโมลาร์ pcHoechst เริ่มต้นที่ 32 แรงม้า ที่ 52 แรงม้า pcHoechst เปิดใช้งานโดยใช้แสงเลเซอร์ UV 405 นาโนเมตรที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นบนกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลที่กำหนดเป้าหมายไปยังกลุ่มเซลล์ เช่นเดียวกับ Hoechst33342 pcHoechst ย้อมสีนิวเคลียสของเซลล์ zebrafish และ colocalized ด้วย H2B-mRFP หลังจากการให้แสง UV ซึ่งบ่งชี้ว่า pcHoechst จับกับ DNA หลังจากการคลายกรง (รูปที่ 3b) อีกครั้ง ไม่พบสัญญาณ pcHoechst เรืองแสงในตัวอ่อนของ zebrafish เมื่อจัดการภายใต้แสงแวดล้อมและไม่มีแสง UV แสดงว่า pcHoechst ไม่ไวต่อแสงมาก เราสังเกตการย้อมสีนิวเคลียสเฉพาะในชั้นเซลล์ผิวเผินด้วยทั้ง Hoechst33342 และ pcHoechst ดังนั้นจึงยังคงกำหนดเป้าหมายเฉพาะเซลล์ผิวเผินในการทดลองต่อไปนี้

ในร่างกาย การถ่ายภาพนิวเคลียสของเซลล์ในปลาม้าลายด้วย pcHoechst A) เวิร์กโฟลว์แผนผังทั่วไปสำหรับการทดลองในรูปที่ 3, 4, S11 และ S12 H2B-RFP mRNA ถูกฉีดเข้าไปในเอ็มบริโอของ zebrafish แบบเซลล์เดียวสำหรับการย้อมสีนิวเคลียร์แบบสหสัมพันธ์ของ pcHoechst ด้วยฟิวชันโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ DNA เรืองแสงสีแดง (Histone 2B ที่หลอมรวมกับ mRFP) Hoechst33342 หรือ pcHoechst ใช้ (ระหว่าง 32–56 hpf) โดยใช้เวลาฟักไข่ 4–16 ชั่วโมงในที่มืดก่อนการ uncaging เป้าหมายและการถ่ายภาพที่ตามมา B) เอ็มบริโอของปลาม้าลายที่แสดงออก H2B-RFP ที่ฝัง Agarose ถูกฟักด้วย 10 ไมโครโมลาร์ Hoechst 33342 (แถวบน) หรือ 100 ไมโครโมลาร์ pcHoechst (แถวล่าง) ค้างคืนที่ 32 แรงม้า ทำการฉายรังสีเฉพาะจุดโดยใช้เลเซอร์ยูวี 405 นาโนเมตรที่กำหนดเป้าหมายที่กลุ่มเซลล์ขนาดใหญ่เพื่อแยก pcHoechst ที่ 52 แรงม้า การถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลของพื้นที่เป้าหมายที่ครีบหางม้าลายที่ 54 แรงม้า แสดงให้เห็นถึงการ colocalization ของ pcHoechst (สีน้ำเงิน แถวล่างสุด) ด้วย mRFP-tagged H2B (สีแดง) เมื่อเปรียบเทียบกับ Hoechst33342 (สีน้ำเงิน แถวบนสุด) ผสานรวมภาพที่สว่างสดใส รูปภาพที่แสดงเป็นตัวแทนของการทดลองที่ไม่มีการกักขังสามครั้งโดยใช้พารามิเตอร์เดียวกัน

เพื่อสร้างการเปิดใช้งานการควบคุมเชิงพื้นที่ของ pcHoechst ในร่างกายเราใช้ฟังก์ชันจุดฟอกขาวของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลเพื่อกำหนดเป้าหมายเซลล์เดี่ยวในตัวอ่อนของม้าลาย การส่องสว่างดำเนินการโดยใช้พัลส์แสง 100 รอบ 100 มิลลิวินาทีของเลเซอร์ยูวี 405 นาโนเมตร เพื่อระบุกำลังเลเซอร์ที่เหมาะสมที่สุดที่จำเป็นสำหรับการแกะ pcHoechst ในพื้นที่ในปลาม้าลายด้วยความเสียหายน้อยที่สุดจากรังสียูวี เราได้ทดสอบช่วงของกำลังแสงเลเซอร์ตั้งแต่ 0.0175 ถึง 0.24 มิลลิวัตต์ ที่พลังงานสูง (0.20–0.24 mW) การย้อมสีนิวเคลียสในบริเวณใกล้เคียงกับเซลล์เป้าหมายสามารถสังเกตได้ แต่การเรืองแสงของ H2B ที่ติดแท็ก mRFP ถูกฟอกขาวและบริเวณเป้าหมายที่ส่วนท้ายของตัวอ่อนได้รับบาดเจ็บอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ S11) ในการตั้งค่านี้ สัญญาณ pcHoechst ไม่ถูกสังเกตโดยตรงในนิวเคลียสเป้าหมาย ส่วนใหญ่น่าจะเกิดจากการตายของเซลล์เป้าหมายหรือการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่ออันเนื่องมาจากการบาดเจ็บ ลดกำลังแสงเลเซอร์ UV ลงเหลือ 0.07 mW ที่เปิดใช้งาน pcHoechst ที่ความละเอียดเซลล์เดียว รักษาสัญญาณ H2B-mRFP ของเซลล์เป้าหมาย และลดความเสียหายที่เกิดขึ้นกับเซลล์เป้าหมายโดยทั่วไป (รูปที่ 4) การสแกนเลเซอร์ยูวีด้วยพลังงานต่ำ (0.0175 mW) สำหรับการถ่ายภาพไม่ได้เปิดใช้งาน pcHoechst ในเซลล์ใดๆ ซึ่งบ่งชี้ถึงความเข้มของเกณฑ์ระหว่าง 0.0175 ถึง 0.07 mW สำหรับการเปิดใช้งาน pcHoechst ในการตั้งค่าของเรา ในการตรวจสอบว่าสามารถใช้ pcHoechst ที่เปิดใช้งานสำหรับการติดตามเซลล์ได้หรือไม่ เราทำการบันทึกไทม์แลปส์หลังจากแกะ pcHoechst ด้วย 0.07 mW นานสูงสุด 1.5 ชั่วโมง (รองรับภาพยนตร์ 6) เราสังเกตว่านิวเคลียสที่เปื้อนรักษาสัญญาณ pcHoechst ในช่วงเวลานี้ การทดลองเพิ่มเติมเปิดเผยว่านิวเคลียสที่ย้อมด้วย pcHoechst สามารถมองเห็นได้เป็นเวลาอย่างน้อย 10 ชั่วโมงหลังการส่องสว่าง (รูปที่ S12) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการติดตามเซลล์ที่เลือกสามารถทำได้ด้วย pcHoechst เป็นเวลาหลายชั่วโมง

ในร่างกาย Uncaging ของ pcHoechst ด้วยความเข้มแสงที่ปรับให้เหมาะสมที่ความละเอียดเซลล์เดียว H2B-mRFP (สีแดง) เอ็มบริโอของ zebrafish ที่ฉีดถูกฟักด้วย 100 μM pcHoechst ในที่มืดในชั่วข้ามคืนและกระตุ้นโดยใช้เลเซอร์ UV 405 nm ที่ 0.07 mW และที่ 74 hpf ลูกศรบ่งชี้นิวเคลียสที่มีจุดฟอกขาวสองจุด ภาพก่อนการฟอกขาวถูกบันทึกก่อนการส่องสว่าง ภาพหลังการฟอกสี 7.5 นาทีและ 1.5 ชั่วโมงหลังจากการฟอกสี สี่เหลี่ยมสีขาวแสดงถึงพื้นที่ขยาย pcHoechst ที่ไม่มีกรง (สีน้ำเงิน) สามารถสังเกตได้ 7.5 นาทีและ 1.5 ชั่วโมงหลังจากการให้แสงยูวีและรวมเข้ากับ H2B-mRFP (สีแดง) ในนิวเคลียสเดียว ภาพแทนของการทดลองสองครั้งที่มีความเข้มข้นเท่ากัน และการทดลองทั้งหมดสิบครั้ง

ต่อไป เราสงสัยว่าเราจะได้รับการแปล DNA ที่ละเอียดยิ่งขึ้นด้วย pcHoechst หรือไม่ ซึ่งทำให้เกิดการย้อมสีใต้นิวเคลียร์ เพื่อพิสูจน์สิ่งนี้ เราได้เปลี่ยนมาใช้เซลล์ HeLa อีกครั้ง ซึ่งช่วยให้ตั้งค่าได้ง่ายกว่าปลาม้าลาย ด้วยการใช้ฟังก์ชันจุดฟอกขาวในการกู้คืนการเรืองแสงหลังจากการทดลอง photobleaching (FRAP) เราสามารถแยก pcHoechst ออกจากกรงด้วยความจำเพาะของเซลล์ได้ คล้ายกับเซบราฟิช เพื่อให้บรรลุสิ่งนี้ เราได้เพิ่ม 100 nM pcHoechst ให้กับเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตก่อนการถ่ายภาพ และใช้แสงยูวีในพื้นที่ (λuncage=355 nm, 10–15 s, 0.11–1.10 mW) เพื่อสังเกตการเรืองแสงทันทีหลังจากนั้น (λอดีต=355 นาโนเมตร, λเอม=420–500 นาโนเมตร) ส่วนใหญ่อยู่ในนิวเคลียสของเซลล์เป้าหมาย (รูปที่ 5a) สามารถสังเกตเห็นจุดมืดในพื้นที่เป้าหมายได้หลังจากใช้แสงยูวี ซึ่งเราถือว่าเกิดจากการฟอกสี Hoechst ดังที่แสดงในเซลล์ที่มีชีวิต (รูปที่ S13) ด้วยการสนับสนุนจากสิ่งนี้ เราจึงตั้งเป้าที่จะผลักดันสิ่งนี้ให้ไกลยิ่งขึ้นด้วยการย้อมสี DNA ที่แม่นยำเชิงเวลาในพื้นที่ใต้นิวเคลียร์ที่เล็กกว่า โดยการลดความเข้มของเลเซอร์ในการตั้งค่าของเรา (λuncage=355 นาโนเมตร, 10–15 วินาที, 1.42 ไมโครวัตต์) บนจุดที่กำหนดในท้องที่ เราสามารถย้อม DNA ด้วย Hoechst ที่ไม่อยู่ในกรงด้วยความละเอียดลงไปที่ 1.4 ไมโครเมตร (รูปที่ 5b, c) ซึ่งปูทางสำหรับการย้อมสีโครโมโซมอย่างละเอียดและ การสังเกต น่าแปลกที่เราสามารถสังเกตสัญญาณที่สอดคล้องกันได้ตลอด 90 วินาทีโดยไม่ต้องสังเกตการขยายสัญญาณที่มีนัยสำคัญ ทำให้สามารถติดตาม DNA ในเศษส่วนย่อยนิวเคลียร์ได้ในระยะสั้น (รูปที่ 5d)

pcHoechst uncaging ช่วยให้สามารถกำหนดเป้าหมายเซลล์และการสร้างภาพดีเอ็นเอของ subnuclear A) การถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลของเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตซึ่งฟักตัวด้วย pcHoechst (100 นาโนโมลาร์) โดยใช้จุดฟอกสี FRAP พร้อมแสงยูวีในบริเวณที่ระบุ (วงกลมสีขาว) แสดงให้เห็นการย้อมด้วยนิวเคลียร์ กำลังเลเซอร์สูง (110–1100 μW เป็นเวลา 10-15 วินาที) เปิดใช้งานทั้งเซลล์ แถบมาตราส่วน: 10 μm.B) สำหรับ (A) แต่ด้วยกำลังเลเซอร์ที่ต่ำกว่า (1.42 μW เป็นเวลา 10–15 วินาที) ช่วยให้แกะชิ้นส่วนได้แม่นยำยิ่งขึ้นในเศษส่วนของนิวเคลียส C) ด้วยความละเอียด 1.4–1.7 μm ที่ D) คงที่ตลอด 90 วินาที ภาพตัวแทนจากการทำซ้ำสามครั้ง E) ภาพคอนโฟคอลของเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตซึ่งฟักด้วย pcHoechst (10 μM) โดยมุ่งเป้าไปที่จุดฟอกขาวด้วยเลเซอร์สองโฟตอน (720 นาโนเมตร, 19.7 มิลลิวัตต์) ในบริเวณที่ระบุ (วงกลมสีขาว) แสดงให้เห็นการย้อมสีใต้ผิวหนังบริเวณขอบนอกที่ส่องสว่าง ภาพตัวแทนของ NS>15 เซลล์ แถบมาตราส่วน: 10 μm.

ในที่สุด และเพื่อลดความเป็นพิษต่อแสง เราจึงตั้งเป้าที่จะใช้การกระตุ้นด้วยโฟตอนสองโฟตอนเพื่อแยก pcHoechst เนื่องจากความยาวคลื่นอยู่ในบริเวณ NIR กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนช่วยให้สามารถแทรกซึมเนื้อเยื่อได้ลึกขึ้นโดยมีการกระเจิง แบ็คกราวด์และความเป็นพิษต่อแสงที่ลดลงนอกระนาบโฟกัส อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องใช้ความเข้มของเลเซอร์ที่สูงขึ้น 24 ด้วยเหตุนี้ เราจึงทำการบ่มเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตด้วย pcHoechst 10 μM เป็นเวลา 3 ชั่วโมง จากนั้นจึงถ่ายโอนเซลล์ไปยังกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์แบบตั้งตรงที่ติดตั้งเลเซอร์ NLO แบบปรับได้สำหรับการกระตุ้นด้วยโฟตอนสองโฟตอน น่าเสียดายที่เราไม่สามารถเปิดกรงได้ทั่วโลก แต่สามารถฟอกสัญญาณนิวเคลียร์สลัวของ pcHoechst ด้วยความเข้มต่ำ (λ=720 nm, 5.6 mW รองรับภาพยนตร์ 7) ดังนั้นเราจึงทำการ uncaging และถ่ายภาพด้วยกำลังแสงเลเซอร์สูงและต่ำ (λuncage=720 นาโนเมตร, 19.7 มิลลิวัตต์, λภาพ=720 nm, 2.5 mW) ตามลำดับ ซึ่งนำไปสู่การฟอกขาวในพื้นที่เป้าหมาย อย่างไรก็ตาม สัญญาณเรืองแสงที่ปล่อยออกมาในบริเวณรอบนอกของจุดฟอกขาวที่แผ่ขยายไปตามกาลเวลาแสดงให้เห็นว่าการแยกโฟตอนสองโฟตอนเป็นไปได้ (รูปที่ 5e)

การย้อมสี DNA อยู่ในระดับแนวหน้าของอณูชีววิทยา และสามารถแยกแยะแนวทางหลักสี่วิธี: i) พันธุวิศวกรรม ซึ่งโปรตีนที่จับกับดีเอ็นเอ เช่น ฮิสโตน ซิงค์ฟิงเกอร์ และ Cas9 ถูกหลอมรวมกับโปรตีนเรืองแสง ii) โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ย้อมด้วยสี ตามที่ใช้สำหรับ FISH และ DNA-PAINT iii) การใช้สารยึดเกาะ DNA โมเลกุลขนาดเล็ก และ iv) การติดฉลากเมแทบอลิซึมของ DNA โดยที่นิวคลีโอไทด์ที่ผิดธรรมชาติถูกรวมเข้าไว้ในระหว่างการสังเคราะห์ DNA และหลังจากนั้นทำปฏิกิริยาในลักษณะมุมฉากทางชีวภาพ ทาง คลิกเคมี แม้ว่าเทคนิคทั้งหมดเหล่านี้จะมีประสิทธิภาพในแบบของตัวเอง แต่เราพยายามขยายจานสีนี้ด้วยเครื่องมือเพิ่มเติม ซึ่งสามารถใช้ได้ ในร่างกาย ด้วยความแม่นยำในระดับเซลล์ย่อยและไม่จำเป็นต้องสร้างสัตว์ดัดแปรพันธุกรรม คุณลักษณะที่พึงประสงค์เหล่านี้จำกัดการออกแบบให้เหลือเพียงโพรบโมเลกุลขนาดเล็กที่มุ่งเป้าไปที่ DNA ซึ่งมีการพัฒนาจำนวนมากในอดีต: ตั้งแต่ Hoechst33342 เอง สีย้อมเรืองแสงได้ถูกหลอมรวมทางเคมีกับโครงนั่งร้านบิสเบนซิไมด์เพื่อเปลี่ยนสเปกตรัมเป็นค่า 25 และที่มองเห็นได้ เพื่อเปิดใช้งานการถ่ายภาพที่มีความละเอียดสูง 22, 26 อย่างไรก็ตาม สีย้อมเหล่านี้ย้อม DNA ไปทั่วโลก ดังนั้นเราจึงต้องหาวิธีเปิดใช้งานการสอบสวนของเราตามต้องการ ในอดีต คราบโมเลกุลได้รับการพัฒนาขึ้นโดยใช้แสงเพื่อให้สามารถจับกับ DNA ได้ เช่น อนุพันธ์ styrylbenzothiazole 27 และ thiazole orange modified diarylethenes 28 ดังนั้นจึงอาจแก้ไขความแม่นยำของ spatiotemporal ที่ให้แสงสว่างได้ อย่างไรก็ตาม สไตริลเบนโซไทอะโซลต้องการแสง UV-C (220 นาโนเมตร) เพื่อแปลงเป็นคู่ที่มีผลผูกพันกับ DNA ดังนั้นดูเหมือนว่าจะไม่เข้ากันกับการตั้งค่าด้วยกล้องจุลทรรศน์ (โดยเฉพาะในเซลล์ที่มีชีวิตและสัตว์) ในขณะที่ไดอารีเลทีนที่ทำหน้าที่ได้นั้นมีขนาดใหญ่และโฟโตโครมิกซ์ช้า และด้วยเหตุนี้จึงใช้ได้เฉพาะกับเซลล์ตายตัวที่มีการฉายรังสีนาน (15 นาที) ด้วยเหตุผลเหล่านี้ เราจึงสังเคราะห์ pcHoechst ซึ่งเป็นคราบ DNA ที่ขังอยู่ในเซลล์โดยอาศัย Hoechst33342 ที่ไม่สามารถแยกส่วนได้ในการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์ด้วยแสง UV เป็นแสงสีน้ำเงิน (355–405 นาโนเมตร) ในเซลล์ที่มีชีวิต ให้คำปรึกษาโครงสร้างผลึกของ Hoechst33258 กับ DNA (PDB ID: 8BNA 17 ), 4-NS- หมู่เมทิลพิปาราซิโนแสดงโรทาเมอร์และถูกเปิดเผยเป็นบางส่วน (รูปที่ 1a) อย่างไรก็ตาม โดยใช้ o- กลุ่มปกป้องไนโตรเบนซิลเพื่อสร้างเกลือควอเทอร์นารีแอมโมเนียมทำให้โมเลกุลไม่สามารถเปิดการเรืองแสงเมื่อมี DNA สูงถึง 100 μM ในหลอดทดลอง. ในการทดสอบของเรา กลุ่มปกป้องไม่แสดงพฤติกรรมการดับของการเรืองแสงพื้นหลังของบิสเบนซิไมด์ แม้ว่าเราไม่สามารถแยกการรวม pcHoechst กับ DNA ในการอ่านข้อมูลของเราได้ แต่เราอาศัยการเรืองแสงแบบเปิดและไม่มีการผูกมัดทางกายภาพในการทดลองของเรา ทำให้การตรวจสอบเพิ่มเติมของกลไกที่แน่นอนนั้นไม่สำคัญ ในขณะที่โมเลกุลอื่นๆ เช่น สีย้อมและยามักจะได้รับการปกป้องด้วยกรงในกลุ่มการทำงาน เช่น คาร์บอกซิเลตและคาร์บาเมต เพื่อปลดปล่อยกรดและเอมีน ตามลำดับ เกลือแอมโมเนียม 21 ควอเทอร์นารีถูกอธิบายก่อนหน้านี้ว่า "สามารถถ่ายภาพได้" เช่นในการศึกษาที่ใช้กรงขัง นิโคติน 29 pcHoechst เพิ่มในรายงานนี้ในเกณฑ์ดี ซึ่งเราแสดงให้เห็นว่าเอมีนในระดับอุดมศึกษาจะคล้อยตามกลุ่มการถ่ายภาพอื่นๆ อย่างไรก็ตาม เราไม่สามารถเปิดกรง pcHoechst ในเชิงปริมาณได้ ในหลอดทดลอง แต่สังเกตผลิตภัณฑ์ออกซิเดชันเพิ่มเติมเมื่อได้รับแสงเป็นเวลานาน สิ่งนี้ยังสะท้อนให้เห็นใน uncaging ที่ไม่ใช่เชิงปริมาณ ในร่างกายตามที่ได้มาจากการประเมินความเป็นพิษของเรา (อินฟราเรด).

การแกะ pcHoechst ในระบบชีวภาพเพื่อทำเครื่องหมาย DNA ได้ดำเนินการครั้งแรกในเซลล์ HeLa ที่มีชีวิตบนกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล โดยสังเกตการเรืองแสงที่เพิ่มขึ้น (10 μM pcHoechst, 4 ชั่วโมงก่อนฟักไข่) หลังจากการให้แสงยูวี หลังจากได้ภาพแรกมา การทำ Uncaging ทำได้ 1 เฟรมด้วยกำลังแสงเลเซอร์ที่สูงกว่าก่อนที่จะถ่ายภาพถัดไป ซึ่งทำให้นิวเคลียสมีรอยเปื้อนไปทั่วโลก การทดลองเริ่มต้นเหล่านี้เน้นให้เห็นถึงความกว้างของการใช้งานที่เป็นไปได้ด้วย pcHoechst และเป็นตัวอย่างแรกของสีย้อมที่ไม่เข้ารหัสทางพันธุกรรมที่สามารถย้อมพื้นที่เป้าหมายภายในองค์กรนิวเคลียร์ตามความรู้ที่ดีที่สุดของเรา ที่น่าสนใจคือ นิวเคลียสถูกย้อมสีต่างกันในช่วงเริ่มต้น โดยมีสัญญาณเกิดขึ้นจากโซนนิวเคลียร์ด้านนอกก่อนที่จะกลายเป็นเนื้อเดียวกันหลังจากได้รับสารเป็นเวลานาน เราพิจารณาแล้วว่าโฟโตโปรดักส์สะสมอยู่ในระบบไลโซโซม ส่วนใหญ่คงเป็นเพราะผลผลิตควอนตัมที่เพิ่มขึ้นในสภาพแวดล้อมที่เป็นกรด โดยมีคราบสีแดงและสีแดงไกลคือ LysoTracker สีแดงและ mCLING ตามลำดับ การทดลองควบคุมเหล่านี้ยืนยันเพิ่มเติมว่าการใช้ความยาวคลื่นที่ยาวขึ้นร่วมกับ pcHoechst นั้นเป็นไปได้ ซึ่งช่วยให้สามารถใช้กล้องจุลทรรศน์สองสีได้

ข้อพิจารณาทั่วไปคือความเป็นพิษของสารยึดเกาะดีเอ็นเอโมเลกุลขนาดเล็ก โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อควรใช้ในเซลล์ที่มีชีวิตเป็นเวลานานหลายชั่วโมง 30, 31 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง pcHoechst ไม่เป็นพิษถึง 10 และ 100 μM สำหรับเซลล์ HeLa และตัวอ่อนและตัวอ่อนของ zebrafish ตามลำดับ ในขณะที่ความเข้มข้นของ Hoechst33342 เท่ากันนั้นเป็นอันตรายถึงชีวิต (สังเกตสัญญาณแรกของความเป็นพิษที่ 0.1 และ 10 μM ในเซลล์และในปลา ตามลำดับ) สิ่งนี้โต้แย้งว่าไม่มีหรือมีเพียงการจับ DNA ที่อ่อนแอของ pcHoechst และแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นที่แอคทีฟหลังจากการ uncaging ในเซลลูโล และ ในร่างกาย ต่ำกว่า 0.1 และ 10 μM ตามลำดับ นอกจากนี้ เรายังระบุความเป็นพิษของการฉายรังสี UV โดยการกะพริบเซลล์ HeLa เป็นเวลา 0, 4 และ 10 วินาทีด้วย UV LED บนกล้องจุลทรรศน์แบบมุมกว้าง epifluorescence แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ที่ชัดเจนของเวลาและความเป็นพิษ ดังนั้น จึงจำเป็นต้องพิจารณาถึงความเป็นพิษต่อแสงของดีเอ็นเอที่เกิดจากแสงยูวี 32 เช่น โฟโตไลซิสและการเชื่อมขวาง (สีย้อม) อย่างไรก็ตาม เซลล์เดี่ยวที่ pcHoechst ไม่ได้ถูกขังด้วยแสงยูวียังคงสามารถแบ่งเซลล์และแบ่งตัวได้อย่างสมบูรณ์

pcHoechst ถูกจับโดยเซลล์ปลาในลักษณะเดียวกับ Hoechst33342 และทั้งคู่ดูเหมือนจะ จำกัด อยู่ที่ชั้นเซลล์ผิวเผิน ในร่างกาย. เมื่อไม่มีกรง pcHoechst จะแสดงนิวเคลียส H2B-mRFP ที่ปนเปื้อน H2B-mRFP ในร่างกาย ด้วยสัญญาณเรืองแสงที่แข็งแกร่งและยังคงตรวจจับได้เป็นเวลาหลายชั่วโมง ด้วยโปรโตคอลการส่องสว่างในปัจจุบันของเราสำหรับตัวอ่อน zebrafish เซลล์เดี่ยวสามารถติดฉลากและติดตามได้เมื่อเวลาผ่านไป อย่างไรก็ตาม ยังคงพบความเสียหายของเนื้อเยื่อที่เกิดจากรังสียูวีที่หลงเหลืออยู่บางส่วนที่ไซต์เป้าหมายของการแกะ pcHoechst ที่ประสบความสำเร็จ ขณะนี้อาจจำกัดการใช้งาน ในร่างกายการปรับความเข้มและระยะเวลาในการฉายรังสีให้เหมาะสมยิ่งขึ้น หรือการเปลี่ยนไปใช้การกระตุ้นด้วยสองโฟตอน 24 อาจลดความเสียหายที่เกิดกับเนื้อเยื่อม้าลายและ DNA และเพิ่มความจำเพาะของการย้อมสีเป้าหมาย ด้วยการใช้โมดูลจุดฟอกขาว เราสามารถเลือกจุดสีนิวเคลียสที่เป็นเป้าหมายด้วยกำลังแสงเลเซอร์สูง หรือบริเวณใต้นิวเคลียร์ที่มีกำลังแสงเลเซอร์ลดลง ในการทดลองครั้งแรก เราสังเกตจุดมืดในพื้นที่เป้าหมาย ซึ่งเราระบุว่าเป็นการฟอกสีย้อม และแน่นอน การควบคุมพบว่า Hoechst33342 ถูกฟอกในทำนองเดียวกันในเซลล์ HeLa ที่มีชีวิต ในการทดลองที่สอง เราเน้นการย้อมสีใต้นิวเคลียร์ ด้วยการเลือกที่ใกล้กับการกระจายแสงที่ใช้ โดยใช้ความเข้มของเลเซอร์ต่ำ นอกจากนี้เรายังพบว่า uncaging เป็นไปได้โดยใช้เอฟเฟกต์สองโฟตอนที่ λ=720 นาโนเมตรในเซลล์ HeLa แบบสดที่มีกำลังสูงโดยใช้จุดฟอกขาว ในการตั้งค่านี้ เราสังเกตเห็นรอยเปื้อนที่บริเวณขอบของจุดฟอกขาวซึ่งแตกต่างจากการหลุดลอกแบบโฟตอนเดียว ซึ่งเป็นการเปิดช่องทางให้โฟตอน 1 ตัวแตกตัวด้วยชีพจรของ UV สู่แสงสีน้ำเงิน และการถ่ายภาพต่อไปด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอน ซึ่งช่วยให้สภาพการถ่ายภาพมีความนุ่มนวลขึ้น แม้ว่าความเสียหายของเซลล์และดีเอ็นเอจากกลไกต่างๆ จะไม่สามารถตัดออกได้ แต่สิ่งสำคัญคือต้องยอมรับว่าผลการทดลองด้วยสีย้อม Hoechst และการฉายรังสี UV-A และความเป็นพิษต่อแสงดังกล่าว อาจแตกต่างกันระหว่างการตั้งค่าด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ต้องได้รับการประเมินในแต่ละกรณี 30, 31, 33 สำหรับการปรับแต่งเพิ่มเติม พื้นที่ทางเคมีช่วยให้สามารถติดตั้งโฟโตเคจที่แตกต่างกันโดยมีคุณสมบัติโฟโตฟิสิคัลต่างกันบน piperazine, 21, 34, 35 ในขณะที่การผสานกับสีย้อมเรืองแสงบนฟีนอลมีความเป็นไปได้ในอนาคตสำหรับการเปลี่ยนแปลงของ Bathochromic สำหรับการถ่ายภาพ 22, 25, 26 สุดท้ายนี้ จากประสบการณ์ของเรา pcHoechst สามารถจัดการ pcHoechst ในห้องที่มีแสงสว่างและถ่ายภาพด้วยเลเซอร์ยูวีที่ใช้พลังงานต่ำโดยไม่ต้องเปิดใช้งานพื้นหลังโดยไม่ได้ตั้งใจ ด้วยเหตุนี้ เราจึงเน้นที่ pcHoechst เป็นเครื่องมือทางชีววิทยาเคมีที่ตรงไปตรงมา ซึ่งใช้ในการย้อม DNA ที่กระตุ้นด้วยแสงในเซลล์ที่มีชีวิตและปลาม้าลาย

เครื่องมือใหม่มีความจำเป็นในช่วงเวลาที่กล้องจุลทรรศน์และนาโนสโคปอยู่ในระดับแนวหน้าเพื่ออธิบายโครงสร้างให้ชัดเจนถึงระดับนาโนเมตร 36 pcHoechst เปิดใช้งานการติดฉลาก DNA แบบเซลล์เดียวและใต้นิวเคลียสทั่วโลกในลักษณะ spatiotemporal


Hoechst สเปกตรัมสีแดงและสีน้ำเงิน - การปล่อยสีแดงบอกอะไรเรา? - ชีววิทยา

การดูดกลืนแสงและการแผ่รังสีซ้ำในภายหลังโดยตัวอย่างอินทรีย์และอนินทรีย์มักเป็นผลจากปรากฏการณ์ทางกายภาพที่เป็นที่ยอมรับซึ่งอธิบายว่าเป็นอย่างใดอย่างหนึ่ง เรืองแสง หรือ เรืองแสง. การปล่อยแสงผ่านกระบวนการเรืองแสงเกือบจะพร้อมกันกับการดูดกลืนแสงที่กระตุ้นเนื่องจากการหน่วงเวลาค่อนข้างสั้นระหว่างการดูดกลืนโฟตอนและการปล่อย ซึ่งมักจะน้อยกว่าไมโครวินาทีในระยะเวลา เมื่อการปล่อยแสงยังคงมีอยู่นานขึ้นหลังจากที่แสงกระตุ้นถูกดับลง ปรากฏการณ์นี้เรียกว่าการเรืองแสง

รูปที่ 1 - กล้องจุลทรรศน์ Epi-Fluorescence

นักวิทยาศาสตร์ชาวอังกฤษ เซอร์ จอร์จ จี. สโตกส์ อธิบายการเรืองแสงครั้งแรกในปี ค.ศ. 1852 และมีหน้าที่รับผิดชอบในการสร้างคำศัพท์ดังกล่าว เมื่อเขาสังเกตเห็นว่าแร่ฟลูออร์สปาร์ปล่อยแสงสีแดงเมื่อเรืองแสงด้วยการกระตุ้นด้วยรังสีอัลตราไวโอเลต สโตกส์ตั้งข้อสังเกตว่าการเปล่งแสงฟลูออเรสเซนต์มักเกิดขึ้นที่ความยาวคลื่นที่ยาวกว่าแสงกระตุ้นเสมอ การตรวจสอบในช่วงต้นศตวรรษที่ 19 แสดงให้เห็นว่าตัวอย่างจำนวนมาก (รวมถึงแร่ธาตุ คริสตัล เรซิน ยาดิบ เนย คลอโรฟิลล์ วิตามิน และสารประกอบอนินทรีย์) เรืองแสงเมื่อฉายรังสีอัลตราไวโอเลต อย่างไรก็ตาม จนกระทั่งช่วงทศวรรษ 1930 การใช้ฟลูออโรโครมได้เริ่มต้นขึ้นในการตรวจสอบทางชีววิทยาเพื่อย้อมส่วนประกอบของเนื้อเยื่อ แบคทีเรีย และเชื้อโรคอื่นๆ คราบเหล่านี้จำนวนมากมีความเฉพาะเจาะจงสูงและกระตุ้นการพัฒนาของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

เทคนิคของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงได้กลายเป็นเครื่องมือสำคัญในชีววิทยาและวิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์ เช่นเดียวกับในวัสดุศาสตร์เนื่องจากคุณลักษณะที่ไม่พร้อมใช้งานในโหมดความคมชัดอื่น ๆ ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบดั้งเดิม การประยุกต์ใช้อาร์เรย์ของฟลูออโรโครมทำให้สามารถระบุเซลล์และส่วนประกอบเซลล์ย่อยด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่มีความจำเพาะสูงท่ามกลางวัสดุที่ไม่เรืองแสงได้ ในความเป็นจริง กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสามารถเผยให้เห็นการมีอยู่ของโมเลกุลเดี่ยว ด้วยการใช้การติดฉลากเรืองแสงหลายอัน หัววัดที่แตกต่างกันสามารถระบุโมเลกุลเป้าหมายหลายตัวพร้อมกันได้พร้อมกัน แม้ว่ากล้องจุลทรรศน์เรืองแสงจะไม่สามารถให้ความละเอียดเชิงพื้นที่ต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบนของลักษณะเฉพาะของชิ้นงานทดสอบได้ แต่การตรวจจับโมเลกุลเรืองแสงที่อยู่ต่ำกว่าขีดจำกัดดังกล่าวก็สามารถทำได้อย่างรวดเร็ว

ตัวอย่างที่หลากหลายแสดงการเรืองแสงอัตโนมัติ (โดยไม่ใช้ฟลูออโรโครม) เมื่อฉายรังสี ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ที่มีการใช้ประโยชน์อย่างทั่วถึงในด้านพฤกษศาสตร์ มาตรวิทยา และอุตสาหกรรมเซมิคอนดักเตอร์ ในทางตรงกันข้าม การศึกษาเนื้อเยื่อสัตว์และเชื้อโรคมักจะมีความซับซ้อนด้วยการเรืองแสงอัตโนมัติที่ไม่เฉพาะเจาะจงหรือจางมาก ฟลูออโรโครมที่มีคุณค่ามากกว่ามากสำหรับการศึกษาหลังนี้ (เรียกอีกอย่างว่า ฟลูออโรฟอร์) ซึ่งตื่นเต้นโดยความยาวคลื่นเฉพาะของแสงที่ฉายรังสีและปล่อยแสงที่มีความเข้มที่กำหนดไว้และมีประโยชน์ ฟลูออโรโครมเป็นคราบที่เกาะติดตัวเองกับโครงสร้างที่มองเห็นได้หรือมองเห็นได้ย่อย มักมีความเฉพาะเจาะจงสูงในการกำหนดเป้าหมายสิ่งที่แนบมา และมีผลผลิตควอนตัมอย่างมีนัยสำคัญ (อัตราส่วนของการดูดกลืนโฟตอนต่อการปล่อยมลพิษ) การเติบโตอย่างแพร่หลายของการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงมีการเชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับการพัฒนาฟลูออโรฟอร์สังเคราะห์และเกิดขึ้นตามธรรมชาติใหม่ โดยมีโปรไฟล์ความเข้มข้นของการกระตุ้นและการปล่อยก๊าซเรือนกระจกที่เป็นที่รู้จัก ควบคู่ไปกับเป้าหมายทางชีววิทยาที่เข้าใจกันดี

พื้นฐานของการกระตุ้นและการปล่อยมลพิษ

ฟังก์ชันพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงคือการฉายรังสีตัวอย่างด้วยแถบความยาวคลื่นที่ต้องการและเฉพาะเจาะจง จากนั้นจึงแยกแสงเรืองแสงที่ปล่อยออกมาที่อ่อนกว่ามากออกจากแสงกระตุ้น ในกล้องจุลทรรศน์ที่กำหนดค่าอย่างเหมาะสม มีเพียงแสงที่ปล่อยออกมาเท่านั้นที่ควรไปถึงตาหรือเครื่องตรวจจับ เพื่อให้โครงสร้างเรืองแสงที่ได้นั้นถูกซ้อนทับด้วยคอนทราสต์สูงกับพื้นหลังที่มืดมาก (หรือสีดำ) โดยทั่วไป ขีดจำกัดของการตรวจจับจะควบคุมโดยความมืดของแบ็คกราวด์ และโดยปกติแล้วแสงที่กระตุ้นจะสว่างกว่าการเรืองแสงที่เปล่งออกมาหลายแสนเท่าถึงหนึ่งล้านเท่า

ภาพประกอบใน รูปที่ 1 เป็นแผนภาพตัดขวางของกล้องจุลทรรศน์แบบ epi-fluorescence microscopy ที่ทันสมัยซึ่งติดตั้งไว้สำหรับกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบส่องผ่านและแบบสะท้อนแสง ไฟส่องแนวตั้งที่กึ่งกลางของแผนภาพมีแหล่งกำเนิดแสงอยู่ที่ปลายด้านหนึ่ง (ติดป้ายโคมไฟแบบมีสังฆราช) และปราการลูกบาศก์ตัวกรองที่ปลายอีกด้านหนึ่ง การออกแบบประกอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงสะท้อนพื้นฐานซึ่งความยาวคลื่นของแสงสะท้อนจะยาวกว่าการกระตุ้น Johan S. Ploem ได้รับการยกย่องว่าเป็นผู้พัฒนาเครื่องฉายแสงแนวตั้งสำหรับกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสะท้อนแสง ในเครื่องเรืองแสงแนวตั้งเรืองแสง แสงที่มีความยาวคลื่นจำเพาะ (หรือแถบความยาวคลื่นที่กำหนด) มักจะอยู่ในบริเวณอัลตราไวโอเลต สีฟ้าหรือสีเขียวของสเปกตรัมที่มองเห็นได้ เกิดจากการส่งแสงหลายสเปกตรัมจากหลอดปล่อยอาร์คหรือแหล่งอื่นผ่าน เลือกความยาวคลื่น กระตุ้น กรอง. ความยาวคลื่นที่ผ่านตัวกรองการกระตุ้นสะท้อนจากพื้นผิวของ a ไดโครมาติก (เรียกอีกอย่างว่า ไดโครอิก) กระจกหรือตัวแยกลำแสง ผ่านกล้องจุลทรรศน์เพื่ออาบตัวอย่างด้วยแสงจ้า ถ้าชิ้นงานทดสอบเรืองแสง แสงที่ปล่อยออกมาจากวัตถุนั้นจะส่งผ่านกลับเข้าไปในกระจกไดโครมาติกและกรองในภายหลังโดย อุปสรรค (หรือ การปล่อยมลพิษ) ตัวกรองซึ่งบล็อกความยาวคลื่นกระตุ้นที่ไม่ต้องการ สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าการเรืองแสงเป็นโหมดเดียวในกล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัลซึ่งชิ้นงานทดสอบจะสร้างแสงขึ้นเองภายหลังการกระตุ้น แสงที่ปล่อยออกมาจะแผ่รังสีอีกครั้งเป็นทรงกลมในทุกทิศทาง โดยไม่คำนึงถึงทิศทางของแหล่งกำเนิดแสงที่กระตุ้น

การส่องสว่างแบบ Epi-fluorescence เป็นทางเลือกที่ท่วมท้นของเทคนิคต่างๆ ในกล้องจุลทรรศน์สมัยใหม่ และไฟส่องแนวตั้งแบบสะท้อนแสงจะสอดแทรกระหว่างท่อสำหรับการสังเกตการณ์และส่วนปลายจมูกซึ่งเป็นที่อยู่ของวัตถุประสงค์ ไฟส่องสว่างได้รับการออกแบบมาเพื่อให้แสงส่องตรงไปยังชิ้นงานทดสอบโดยการส่งผ่านแสงกระตุ้นผ่านวัตถุประสงค์ของกล้องจุลทรรศน์ในขั้นแรก (ซึ่งในโครงร่างนี้ จะทำหน้าที่เป็น คอนเดนเซอร์) ระหว่างทางไปยังชิ้นงานทดสอบ จากนั้นใช้วัตถุประสงค์เดียวกันนั้นเพื่อจับแสงเรืองแสงที่ปล่อยออกมา ไฟส่องประเภทนี้มีข้อดีหลายประการ วัตถุประสงค์ของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงทำหน้าที่แรกในฐานะคอนเดนเซอร์ที่มีการแก้ไขอย่างดี และประการที่สองคือการรวบรวมแสงที่สร้างภาพ เนื่องจากเป็นส่วนประกอบเดียว วัตถุประสงค์/คอนเดนเซอร์จึงอยู่ในตำแหน่งที่สมบูรณ์แบบเสมอ แสงกระตุ้นส่วนใหญ่ที่ไปถึงชิ้นงานทดสอบจะทะลุผ่านโดยไม่มีปฏิกิริยาโต้ตอบและเคลื่อนออกจากวัตถุ และพื้นที่ที่ส่องสว่างจะถูกจำกัดให้อยู่ที่แสงที่สังเกตได้ผ่านเลนส์ใกล้ตา (ในกรณีส่วนใหญ่) ต่างจากสถานการณ์ในเทคนิคการเพิ่มคอนทราสต์บางอย่าง รูรับแสงที่เป็นตัวเลขทั้งหมดของวัตถุจะพร้อมใช้งานเมื่อกล้องจุลทรรศน์ได้รับการกำหนดค่าอย่างเหมาะสมสำหรับการส่องสว่างของ Köhler สุดท้ายนี้ เป็นไปได้ที่จะรวมหรือสลับกันระหว่างการเรืองแสงของแสงสะท้อนและการสังเกตแสงที่ส่องผ่านและการถ่ายภาพดิจิทัล

รูปที่ 2 - ฟิลเตอร์เรืองแสง

ตามที่นำเสนอใน รูปที่ 1ไฟส่องแนวตั้งแบบสะท้อนแสงประกอบด้วยโคมปล่อยอาร์คที่ส่วนท้าย (โดยปกติคือหัวเผาปรอทหรือซีนอน) แสงที่กระตุ้นจะเคลื่อนที่ไปตามตัวเรืองแสงในแนวตั้งฉากกับแกนออปติคอลของกล้องจุลทรรศน์ ผ่านเลนส์ตัวรวบรวมและไดอะแฟรมรูรับแสงที่ปรับได้ซึ่งกำหนดตำแหน่งได้ตรงกลาง จากนั้นจึงผ่านไดอะแฟรมภาคสนามที่ปรับให้อยู่ตรงกลางได้ (ดู รูปที่ 1). จากนั้นแสงจะกระทบกับตัวกรองการกระตุ้นซึ่งเกิดการเลือกแถบที่ต้องการและการอุดตันของความยาวคลื่นที่ไม่ต้องการ ความยาวคลื่นที่เลือกหลังจากผ่านตัวกรองการกระตุ้นแล้ว จะไปถึงกระจกแยกลำแสงแบบไดโครมาติก ซึ่งเป็นตัวกรองการรบกวนแบบพิเศษที่สะท้อนแสงที่มีความยาวคลื่นสั้นกว่าได้อย่างมีประสิทธิภาพและผ่านแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกว่าได้อย่างมีประสิทธิภาพ ตัวแยกลำแสงแบบไดโครมาติกเอียงทำมุม 45 องศาเมื่อเทียบกับแสงกระตุ้นที่เข้ามา และสะท้อนแสงนี้ในมุม 90 องศาโดยตรงผ่านระบบออปติคัลเป้าหมายและบนชิ้นงานทดสอบ วัตถุที่เปล่งแสงเรืองแสงนั้นถูกรวบรวมโดยวัตถุ ซึ่งขณะนี้ทำหน้าที่สร้างภาพตามปกติ เนื่องจากแสงที่ปล่อยออกมาประกอบด้วยความยาวคลื่นที่ยาวกว่าแสงกระตุ้น จึงสามารถผ่านกระจกไดโครมาติกและขึ้นไปบนท่อสังเกตการณ์หรือเครื่องตรวจจับอิเล็กทรอนิกส์ได้

แสงกระตุ้นที่กระจัดกระจายไปยังกระจกไดโครมาติกส่วนใหญ่จะสะท้อนกลับไปยังแหล่งกำเนิดแสง แม้ว่าปริมาณหนึ่งนาทีมักจะผ่านไปและถูกดูดซับโดยการเคลือบภายในของบล็อกกระจก ก่อนที่แสงเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจะไปถึงเลนส์ใกล้ตาหรือเครื่องตรวจจับ จะต้องผ่านอุปสรรคหรือตัวกรองการปราบปรามก่อนตัวกรองนี้จะบล็อก (ยับยั้ง) แสงกระตุ้นที่ตกค้างและผ่านความยาวคลื่นที่ยาวกว่าที่ต้องการ ในไฟสะท้อนแสงส่วนใหญ่ ฟิลเตอร์กระตุ้น กระจกไดโครมาติก และฟิลเตอร์กั้นจะรวมอยู่ในบล็อกออปติคัล (มักเรียกว่า ลูกบาศก์) ตามที่แสดงใน รูปที่ 2. กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสมัยใหม่สามารถรองรับลูกบาศก์เรืองแสงได้สี่ถึงหกก้อน (โดยปกติอยู่บนป้อมปืนหมุนหรือผ่านกลไกตัวเลื่อนดู รูปที่ 1) และอนุญาตให้ผู้ใช้ติดตั้งตัวกรองกระตุ้นหลังการขายและตัวกรองสิ่งกีดขวาง ตลอดจนกระจกไดโครมาติกได้อย่างง่ายดาย

การออกแบบไฟส่องแนวตั้งควรให้ผู้ใช้ปรับกล้องจุลทรรศน์สำหรับการส่องสว่างของโคห์เลอร์ โดยให้รูรับแสงที่สว่างและสว่างเท่ากันทั่วทั้งช่องรับภาพ เลนส์ควบแน่นที่แก้ไขแล้วของระบบออปติคัลควรตรวจสอบให้แน่ใจว่าภาพของไดอะแฟรมรูรับแสงตรงกลางนั้นคอนจูเกตกับรูรับแสงด้านหลังของวัตถุที่โฟกัส ในไฟส่องสว่างสมัยใหม่ ภาพของไดอะแฟรมสนามที่ปรับโฟกัสไว้ล่วงหน้าและอยู่ตรงกลางจะถูกผสานเข้ากับชิ้นงานที่โฟกัสและระนาบของไดอะแฟรมเลนส์ตาแบบอยู่กับที่

หลอดไฟให้แสงสว่างมักจะประกอบด้วยตัวกรองการปราบปรามแสงอินฟราเรด ตัวโคมไม่ควรรั่วไหลของความยาวคลื่นอัลตราไวโอเลตที่เป็นอันตราย และควรรวมสวิตช์เพื่อปิดหลอดไฟโดยอัตโนมัติหากตัวเรือนถูกเปิดโดยไม่ได้ตั้งใจระหว่างการทำงาน ตะเกียงควรแข็งแรงพอที่จะทนต่อการระเบิดของหัวเผา (หลอดปล่อยอาร์ค) ที่อาจเกิดขึ้นได้ระหว่างการใช้งาน ในโคมระย้าสมัยใหม่ ซ็อกเก็ตหลอดไฟมีปุ่มปรับเพื่อให้ภาพโคมโค้งอยู่ตรงกลางภายในรูรับแสงด้านหลังของวัตถุ (ในการส่องสว่างของโคห์เลอร์ เครื่องบินเหล่านี้เป็นคอนจูเกต) ที่ไหนสักแห่งในเส้นทางแสง ซึ่งมักจะใกล้กับโคมไฟและอยู่หน้าตัวกรองการกระตุ้น ขอแนะนำให้ใช้ชัตเตอร์เพื่อปิดกั้นแสงกระตุ้นโดยสมบูรณ์เมื่อไม่ได้ดูหรือถ่ายภาพชิ้นงานทดสอบด้วยเครื่องตรวจจับ นอกจากนี้ ควรมีการเตรียมการสำหรับตัวกรองความหนาแน่นเป็นกลาง (ไม่ว่าจะอยู่บนล้อ ป้อมปืน หรือตัวเลื่อน) เพื่อให้ผู้ใช้ลดความเข้มของแสงกระตุ้นได้

สโต๊คส์ ชิฟต์

พลังงานสั่นสะเทือนจะหายไปเมื่ออิเล็กตรอนคลายตัวจากสถานะตื่นเต้นกลับสู่สถานะพื้นดิน อันเป็นผลมาจากการสูญเสียพลังงาน สเปกตรัมการแผ่รังสีของฟลูออโรฟอร์ที่ตื่นเต้นมักจะเปลี่ยนเป็นความยาวคลื่นที่ยาวกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับสเปกตรัมการดูดกลืนหรือการกระตุ้น (โปรดทราบว่าความยาวคลื่นแปรผกผันกับพลังงานรังสี) ปรากฏการณ์ที่ได้รับการบันทึกไว้เป็นอย่างดีนี้เรียกว่า กฎของสโตกส์ หรือ การเปลี่ยนแปลงของสโตกส์. เมื่อค่าชิฟต์ของสโตกส์เพิ่มขึ้น การแยกการกระตุ้นออกจากแสงที่ปล่อยออกมาก็จะง่ายขึ้นโดยใช้การผสมผสานฟิลเตอร์เรืองแสง

พีคของความเข้มของการปล่อยฟลูออโรฟอร์ (หรือการดูดกลืน) มักจะมีความยาวคลื่นและขนาดต่ำกว่าที่แสดงโดยพีคของการกระตุ้น และโปรไฟล์สเปกตรัมการแผ่รังสี (เส้นโค้ง) มักจะเป็นภาพสะท้อนในกระจก (หรือใกล้เคียงกัน) ของเส้นโค้งการกระตุ้น แต่เปลี่ยนไปเป็น ความยาวคลื่นที่ยาวขึ้นดังแสดงใน รูปที่ 3 สำหรับ Alexa Fluor 555 ซึ่งเป็นโพรบที่มีประโยชน์ซึ่งดูดซับแสงในบริเวณสีเหลืองอมเขียวและปล่อยแสงสีเหลืองส้ม เพื่อให้ได้ความเข้มแสงฟลูออเรสเซนต์สูงสุด ฟลูออโรฟอร์ (มักเรียกว่า a ย้อม) มักจะตื่นเต้นที่ความยาวคลื่นใกล้หรือที่จุดสูงสุดของเส้นโค้งกระตุ้น และเลือกช่วงความยาวคลื่นการแผ่รังสีที่กว้างที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ซึ่งรวมถึงจุดสูงสุดของการปล่อยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าเพื่อการตรวจจับ การเลือกความยาวคลื่นของการกระตุ้นและการปล่อยจะขึ้นอยู่กับตัวกรองสัญญาณรบกวน (รูปที่ 2). นอกจากนี้ การตอบสนองทางสเปกตรัมของระบบออปติคัลของกล้องจุลทรรศน์จะขึ้นอยู่กับปัจจัยต่างๆ เช่น ประสิทธิภาพการส่งผ่านของแก้ว (เนื่องจากการเคลือบป้องกันแสงสะท้อน) จำนวนชิ้นเลนส์และกระจกเงา และการตอบสนองของระบบตรวจจับ

รูปที่ 3 - โปรไฟล์การดูดซึมและการปล่อยฟลูออโรฟอร์

การแยกและการตรวจจับความยาวคลื่นของการกระตุ้นและการปล่อยอย่างมีประสิทธิผลทำได้ในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงผ่านการเลือกตัวกรองที่เหมาะสมเพื่อบล็อกหรือส่งผ่านแถบความยาวคลื่นเฉพาะในบริเวณสเปกตรัมอัลตราไวโอเลต ที่มองเห็นได้ และใกล้อินฟราเรด ไฟส่องแนวตั้งเรืองแสงได้รับการออกแบบโดยมีวัตถุประสงค์เพื่อควบคุมแสงกระตุ้นผ่านการใช้ตัวกรองที่เปลี่ยนได้ (ความหนาแน่นเป็นกลางและตัวกระตุ้นสมดุลการรบกวน) การแทรกเข้าไปในเส้นทางแสงระหว่างทางไปยังชิ้นงานทดสอบ และอีกครั้งในเส้นทางระหว่างชิ้นงานทดสอบกับ ท่อสังเกตการณ์หรือระบบตรวจจับกล้อง เกณฑ์ที่สำคัญที่สุด ในมุมมองของความเข้มของการเปล่งแสงฟลูออเรสเซนต์ที่ค่อนข้างต่ำ (ดูการสนทนาด้านบน) ก็คือแหล่งกำเนิดแสงที่ใช้ในการกระตุ้นต้องมีความสว่างเพียงพอเพื่อให้แสงที่เปล่งออกมาอ่อนสามารถขยายได้สูงสุด และฟลูออโรโครมมีคุณสมบัติการดูดกลืนที่เพียงพอ และผลผลิตควอนตัมการปล่อย

ประสิทธิภาพที่ฟลูออโรฟอร์เฉพาะดูดซับโฟตอนของแสงกระตุ้นนั้นเป็นหน้าที่ของหน้าตัดของโมเลกุล และความน่าจะเป็นของการดูดซับเรียกว่า ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์. ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ที่มากขึ้นบ่งชี้ว่าการดูดกลืนโฟตอน (หรือควอนตัม) ในบริเวณความยาวคลื่นที่กำหนดมีโอกาสมากกว่า ผลผลิตควอนตัมแสดงถึงอัตราส่วนของจำนวนควอนตัมที่ปล่อยออกมาเมื่อเทียบกับสิ่งที่ดูดซับ (และมักจะเป็นค่าระหว่าง 0.1 ถึง 1.0) ค่าควอนตัมควอนตัมที่ต่ำกว่า 1 เป็นผลมาจากการสูญเสียพลังงานผ่านวิถีทางที่ไม่แผ่รังสี เช่น ความร้อนหรือปฏิกิริยาเคมีเชิงแสง แทนที่จะเป็นวิถีการแผ่รังสีซ้ำของการเรืองแสง ค่าสัมประสิทธิ์การดับ ผลผลิตควอนตัม ความเข้มการส่องสว่างเฉลี่ยของแหล่งกำเนิดแสง และอายุการเรืองแสงเป็นปัจจัยสำคัญทั้งหมดที่ส่งผลต่อความเข้มและประโยชน์ของการปล่อยแสงเรืองแสง

ซีดจาง ดับ และฟอกขาว

สภาวะที่หลากหลายมักเข้ามามีบทบาทซึ่งท้ายที่สุดแล้วส่งผลต่อการแผ่รังสีซ้ำของการเปล่งแสงฟลูออเรสเซนซ์ และทำให้ความเข้มลดลง ระยะทั่วไปสำหรับการลดความเข้มของการปล่อยแสงเรืองแสงคือ จางลง, หมวดหมู่ที่จับทั้งหมดซึ่งมักจะแบ่งย่อยเพิ่มเติมเป็น ดับ และ การฟอกสี ปรากฏการณ์เพื่อคำอธิบายที่แม่นยำยิ่งขึ้น Photobleaching คือการสลายตัวที่ไม่สามารถย้อนกลับได้ของโมเลกุลเรืองแสงในสภาวะตื่นเต้น เนื่องจากปฏิกิริยาของพวกมันกับโมเลกุลออกซิเจนก่อนการปลดปล่อย การเกิด photobleaching ถูกนำมาใช้ในเทคนิคที่เรียกว่า fluorescence recovery หลังจาก photobleaching (FRAP) ซึ่งเป็นกลไกที่มีประโยชน์มากในการตรวจสอบการแพร่กระจายและการเคลื่อนที่ของโมเลกุลขนาดใหญ่ทางชีววิทยา วิธีการนี้ใช้การฟอกสีในบริเวณที่กำหนดไว้อย่างแหลมคมของชิ้นงานทดสอบด้วยแสงเลเซอร์ที่ระเบิดออกมาอย่างแรง ควบคู่ไปกับการสังเกตอัตราและรูปแบบการคืนตัวของแสงฟลูออเรสเซนส์ในบริเวณที่มีการฟอกสีในภายหลัง เทคนิคที่เกี่ยวข้องเรียกว่าการสูญเสียการเรืองแสงใน photobleaching (พลิก) ใช้เพื่อติดตามการลดลงของการเรืองแสงในบริเวณที่กำหนดซึ่งอยู่ติดกับพื้นที่ที่โฟโตฟอกขาว คล้ายกับ FRAP เทคนิคหลังนี้มีประโยชน์ในการตรวจสอบการเคลื่อนที่ของโมเลกุลและการเปลี่ยนแปลงในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต

รูปที่ 4 - อัตราการฟอกขาวในตัวอย่างที่ย้อมทวีคูณ

นำเสนอใน รูปที่ 4 เป็นตัวอย่างทั่วไปของ photobleaching (การซีดจาง) ที่สังเกตได้จากชุดของภาพดิจิทัลที่ถ่าย ณ จุดเวลาที่ต่างกันสำหรับวัฒนธรรมการย้อมแบบทวีคูณของเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของ Indian Muntjac deer epidermis นิวเคลียสถูกย้อมด้วยอนุพันธ์ bis-benzimidazole (Hoechst 33258 blue fluorescence) ในขณะที่ mitochondria และ actin cytoskeleton ถูกย้อมด้วย MitoTracker Red CMXRos (red fluorescence) และอนุพันธ์ phalloidin conjugated กับ Alexa Fluor 488 (เรืองแสงสีเขียว) ตามลำดับ จุดเวลาถูกถ่ายในช่วงเวลาสองนาทีโดยใช้ตัวกรองแสงฟลูออเรสเซนส์ร่วมกับแบนด์วิดท์ที่ปรับแต่งเพื่อกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ทั้งสามพร้อมกันในขณะเดียวกันก็บันทึกสัญญาณการปล่อยมลพิษที่รวมกัน โปรดทราบว่าฟลูออโรฟอร์ทั้งสามมีความเข้มข้นค่อนข้างสูงใน รูปที่ 4(ก)แต่ความเข้มของฟลูออโรฟอร์ (สีน้ำเงิน) ของ Hoechst เริ่มลดลงอย่างรวดเร็วในสองนาที และหายไปเกือบหมดในเวลา 6-8 นาที คราบไมโตคอนเดรียและแอคตินมีความทนทานต่อการฟอกสีด้วยแสงมากกว่า แต่ความเข้มของทั้งสองลดลงอย่างมากในช่วงเวลาที่กำหนด (10 นาที)

กระบวนการผ่อนคลายสภาวะตื่นเต้นของการดับส่งผลให้ความเข้มของการเรืองแสงลดลงผ่านกลไกต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการสูญเสียพลังงานที่ไม่ผ่านการแผ่รังสี และมักเกิดขึ้นจากผลของสารออกซิไดซ์ หรือการมีอยู่ของเกลือหรือโลหะหนักหรือสารประกอบฮาโลเจน ในบางกรณี การดับเป็นผลมาจากการถ่ายโอนพลังงานไปยังอีกโมเลกุลหนึ่ง (เรียกว่า ตัวรับ) ซึ่งอยู่ใกล้ร่างกายกับฟลูออโรฟอร์ที่ตื่นเต้น ( ผู้บริจาค) ปรากฏการณ์ที่เรียกว่าการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (เฟรต). กลไกเฉพาะนี้ได้กลายเป็นพื้นฐานสำหรับเทคนิคที่มีประโยชน์ซึ่งเกี่ยวข้องกับการศึกษาปฏิสัมพันธ์และความสัมพันธ์ของโมเลกุลในระยะทางที่ต่ำกว่าความละเอียดด้านข้างของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงมาก

แหล่งกำเนิดแสงเรืองแสง

ผลที่ตามมาของระดับการปล่อยมลพิษต่ำในแอปพลิเคชั่นกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงส่วนใหญ่ก็คือจำนวนโฟตอนที่ไปถึงตัวตรวจจับตาหรือกล้องก็ต่ำมากเช่นกัน ในกรณีส่วนใหญ่ ประสิทธิภาพการรวบรวมของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงจะน้อยกว่า 30 เปอร์เซ็นต์ และความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์จำนวนมากในช่วงเส้นทางแสงในบริเวณไมโครโมลาร์หรือนาโนโมลาร์ เพื่อสร้างความเข้มของแสงกระตุ้นที่เพียงพอในการผลิตการเปล่งแสงที่ตรวจจับได้ จำเป็นต้องใช้แหล่งกำเนิดแสงขนาดกะทัดรัดอันทรงพลัง เช่น หลอดปล่อยอาร์คสั้นที่มีพลังงานสูง หลอดไฟที่พบบ่อยที่สุดคือหัวเผาปรอทซึ่งมีกำลังไฟตั้งแต่ 50 ถึง 200 วัตต์ และหัวเผาซีนอนที่มีขนาดตั้งแต่ 75 ถึง 150 วัตต์ (ดู รูปที่ 5). แหล่งกำเนิดแสงเหล่านี้มักจะใช้พลังงานจากแหล่งจ่ายกระแสตรงจากภายนอก ซึ่งให้พลังงานในการเริ่มต้นเพียงพอเพื่อจุดไฟให้กับเตาผ่านการไอออไนเซชันของไอก๊าซ และเพื่อให้การเผาไหม้มีแสงวูบวาบน้อยที่สุด

แหล่งจ่ายไฟภายนอกของหลอดไฟอาร์คของกล้องจุลทรรศน์มักจะติดตั้งตัวจับเวลาเพื่อติดตามจำนวนชั่วโมงที่หัวเผาทำงาน หลอดอาร์คสูญเสียประสิทธิภาพและมีแนวโน้มที่จะแตกหากใช้เกินอายุการใช้งานที่กำหนด (200-300 ชั่วโมง) หัวเผาปรอทไม่ให้ความเข้มแม้แต่ในช่วงสเปกตรัมตั้งแต่รังสีอัลตราไวโอเลตไปจนถึงอินฟราเรด และความเข้มของหลอดไฟส่วนใหญ่ถูกใช้ไปในรังสีอัลตราไวโอเลตที่อยู่ใกล้ จุดสูงสุดของความรุนแรงเกิดขึ้นที่ 313, 334, 365, 406, 435, 546 และ 578 นาโนเมตร ที่ความยาวคลื่นอื่นๆ ในบริเวณแสงที่มองเห็นได้ ความเข้มจะคงที่แม้ว่าจะไม่ได้เกือบสว่างมากนัก (แต่ยังคงใช้ได้ในการใช้งานส่วนใหญ่) ในการพิจารณาประสิทธิภาพการส่องสว่าง การใช้กำลังไฟของหลอดไฟเพียงอย่างเดียวไม่ใช่ปัจจัยหลักในการพิจารณา ในทางกลับกัน พารามิเตอร์ที่สำคัญคือต้องพิจารณาความส่องสว่างเฉลี่ย โดยคำนึงถึงความสว่างของแหล่งกำเนิด เรขาคณิตของส่วนโค้ง และการแพร่กระจายเชิงมุมของการแผ่รังสี

รูปที่ 5 - หลอดฟลูออเรสเซนต์อาร์คดิสชาร์จ

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา กล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัลมีประสบการณ์ในการใช้งานแหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์เพิ่มขึ้น โดยเฉพาะเลเซอร์อาร์กอน-ไอออนและอาร์กอน-คริปทอน (ไอออน) เลเซอร์เหล่านี้มีคุณสมบัติของแหล่งกำเนิดแสงขนาดเล็ก ความแตกต่างต่ำ ใกล้สีเดียว และความสว่างเฉลี่ยสูง สิ่งเหล่านี้กลายเป็นสิ่งสำคัญในการสแกนด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ซึ่งเป็นเทคนิคที่พิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการแสดงภาพเรืองแสงที่คมชัดมากผ่านการปฏิเสธแสงที่ไม่ได้โฟกัสที่นำออกจากระนาบโฟกัสของชิ้นงานทดสอบ ไมโครสโคปแบบคอนโฟคอลทำงานนี้ให้สำเร็จผ่านการสแกนแบบจุดหรือเส้นด้วยการถ่ายภาพโดยบังเอิญผ่านรูรับแสงคอนจูเกต ส่วนออปติคัลของตัวอย่างสามารถเก็บไว้ในคอมพิวเตอร์โฮสต์และสร้างใหม่เป็นภาพสุดท้ายซึ่งจะแสดงบนจอภาพ

กรองคำศัพท์

คำศัพท์ทั่วไปที่ใช้กับตัวกรองกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงทำให้เกิดความสับสนอันเป็นผลมาจากชื่อย่อและรหัสต่างๆ ที่ใช้โดยผู้ผลิตหลายรายเพื่อระบุตัวกรอง โดยทั่วไป ตัวกรองมีสามประเภทหลัก: การกระตุ้น (มักเรียกว่า สารกระตุ้น), สิ่งกีดขวาง (การปล่อยมลพิษ) และตัวแยกลำแสงแบบไดโครมาติก (หรือกระจกเงาแบบไดโครอิก) ตัวกรองฟลูออเรสเซนซ์เดิมสร้างจากแก้วย้อมหรือเจลาตินเกือบทั้งหมดโดยประกบอยู่ระหว่างแผ่นแก้วสองแผ่น อย่างไรก็ตาม แนวโน้มปัจจุบันคือการผลิตฟิลเตอร์ความละเอียดสูงพร้อมเลนส์รบกวนสำหรับฟิลเตอร์กระตุ้นเพื่อส่งผ่านหรือปฏิเสธความยาวคลื่นของแสงที่มีความจำเพาะสูงและการส่งผ่านสูง ตัวแยกลำแสงแบบไดโครมาติกเป็นตัวกรองสัญญาณรบกวนแบบพิเศษที่ออกแบบมาเพื่อสะท้อนหรือส่งผ่านแสงที่มีความยาวคลื่นเฉพาะเมื่อวางในเส้นทางแสงที่มุม 45 องศา (ดู รูปที่ 1 และ 2). ตัวกรองสิ่งกีดขวางถูกประดิษฐ์ขึ้นด้วยกระจกสีหรือสารเคลือบรบกวน (หรือทั้งสองอย่างรวมกัน)

ตัวย่อที่ใช้โดยผู้ผลิตเพื่อระบุคุณสมบัติของตัวกรองกระตุ้น ได้แก่: UG (แก้วอัลตราไวโอเลต) และ บีจี (แก้วสีฟ้า). ตัวกรองชอร์ตพาสมักแสดงเป็น KP(K เป็นตัวย่อของ kurz ซึ่งแปลว่า "สั้น" ในภาษาเยอรมัน) หรือเพียงแค่ as SP. ขณะนี้ผู้ผลิตหลายรายติดฉลากตัวกรองสัญญาณรบกวนด้วยการกำหนด ถ้า. ตัวกรองสัญญาณรบกวนจากการกระตุ้นด้วยคลื่นความถี่แคบจะเป็นประโยชน์อย่างยิ่งหากกะของสโต๊คมีขนาดเล็ก

ตัวย่อหรือตัวย่อสำหรับตัวกรองสิ่งกีดขวางรวมถึง: LP หรือ หลี่ สำหรับตัวกรองทางยาว Y หรือ GG สำหรับแก้วสีเหลืองหรือเจลบ์ (เยอรมัน) NS หรือ RG สำหรับแก้วสีแดง OG หรือ อู๋ สำหรับแก้วสีส้ม K สำหรับ kante ศัพท์ภาษาเยอรมันสำหรับ edge (ตัวกรอง) และ BA สำหรับตัวกรองสิ่งกีดขวาง เมื่อประเภทตัวกรองเชื่อมโยงกับตัวเลขด้วย เช่น BA515การกำหนดนั้นหมายถึงความยาวคลื่น (เป็นนาโนเมตร) ที่ 50 เปอร์เซ็นต์ของการส่งผ่านสูงสุด

ตัวแยกลำแสงไดรโครมาติกยังอธิบายโดยตัวย่อจำนวนมากรวมถึง ซีบีเอส สำหรับตัวแยกลำแสงสี DM สำหรับกระจกไดโครอิก TK สำหรับ "teiler kante" ภาษาเยอรมันสำหรับตัวแยกขอบ FT สำหรับ "farb teiler" (ภาษาเยอรมันสำหรับตัวแยกสี) และ RKP สำหรับการสะท้อนผ่านระยะสั้น ข้อกำหนดทั้งหมดเหล่านี้ควรพิจารณาใช้แทนกันได้ และตัวแยกลำแสงแบบไดโครมาติกสมัยใหม่มักผลิตขึ้นด้วยการเคลือบแบบรบกวนบนกระจกออปติคัล (ตรงข้ามกับสีย้อมอินทรีย์หรือสีโลหะ) ฟิล์มบางที่มีสัญญาณรบกวนได้รับการออกแบบมาเพื่อสร้างการสะท้อนแสงสูงสำหรับความยาวคลื่นที่สั้นกว่าและการส่งผ่านสูงสำหรับความยาวคลื่นที่ยาวกว่า ตัวแยกลำแสงแบบไดโครมาติกถูกจัดวางที่มุม 45 องศากับเส้นทางของแสงกระตุ้นที่เข้าสู่บล็อกออปติคัลผ่านตัวเรืองแสงเรืองแสงที่สะท้อนแสง หน้าที่หลักของพวกมันคือกำหนดทิศทางความยาวคลื่นกระตุ้นที่เลือก (สั้นกว่า) ใหม่ผ่านวัตถุประสงค์และไปยังชิ้นงานทดสอบ ตัวกรองพิเศษเหล่านี้ยังมีฟังก์ชันเพิ่มเติมในการส่งการเปล่งแสงฟลูออเรสเซนส์ความยาวคลื่นที่ยาวกว่าไปยังตัวกรองกั้น และสะท้อนแสงกระตุ้นที่กระจัดกระจายกลับไปในทิศทางของโคมไฟ

รูปที่ 6 - Nikon B-2E (ตัวกระตุ้นสีน้ำเงินแถบกลาง)

นำเสนอใน รูปที่ 6 เป็นโปรไฟล์การส่งผ่านสำหรับชุดฟิลเตอร์เรืองแสงทั่วไปที่ใช้ในกล้องจุลทรรศน์สมัยใหม่ สเปกตรัมตัวกรองกระตุ้น (เส้นโค้งสีแดง) แสดงการส่งผ่านระดับสูง (ประมาณ 75 เปอร์เซ็นต์) ระหว่าง 450 ถึง 490 นาโนเมตรที่มีความยาวคลื่นตรงกลาง (CWL) 470 นาโนเมตร กระจกไดโครมาติก (เส้นโค้งสีเหลือง) สะท้อนความยาวคลื่นในบริเวณสเปกตรัมกระตุ้น ในขณะที่ส่งผ่านความยาวคลื่นที่สูงขึ้นและต่ำลงอย่างมีประสิทธิภาพค่อนข้างสูง โปรดทราบว่าการส่งผ่านศูนย์บนเส้นโค้งกระจกไดโครมาติกสอดคล้องกับการสะท้อน 100 เปอร์เซ็นต์ การจุ่มลงอย่างเด่นชัดในโปรไฟล์การส่งผ่านระหว่าง 450 ถึง 500 นาโนเมตร ซึ่งแสดงถึงการสะท้อนแสงสูงสุด ทำหน้าที่สะท้อนแถบความยาวคลื่นที่ส่งผ่านจากตัวกรองการกระตุ้นที่มุม 90 องศาและไปยังชิ้นงานทดสอบ องค์ประกอบสุดท้ายในรถไฟออปติคัล ตัวกรองการแผ่รังสีหรือตัวกรองสิ่งกีดขวาง (เส้นโค้งสีขาว) จะส่งความยาวคลื่นในบริเวณแสงสีเขียวที่มองเห็นได้ ในช่วงระหว่าง 520 ถึง 560 นาโนเมตร ขอบเขตระหว่างแถบความยาวคลื่นที่ส่งและสะท้อนของสเปกตรัมซ้อนทับต่างๆ ได้รับการออกแบบให้สูงชันที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ เพื่อให้มั่นใจว่าแยกความยาวคลื่นที่สะท้อนและความยาวคลื่นที่ส่งผ่านได้เกือบสมบูรณ์ รูปแบบของเดือยที่เพิ่มขึ้นและลดลงแบบไซน์ซึ่งปรากฏในสเปกตรัมกระจกไดโครมาติกเป็นผลปกติของกระบวนการสะสมฟิล์มบางที่เรียกว่า เสียงเรียกเข้า. ประสิทธิภาพของการผสมผสานฟิลเตอร์นี้มีความโดดเด่นและเป็นการแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงความก้าวหน้าอย่างรวดเร็วที่เกิดขึ้นในเทคโนโลยีตัวกรองการรบกวนแบบฟิล์มบาง

ระบบการตั้งชื่อตัวกรองที่ใช้โดย Nikon มาจากคำต่างๆ ผสมกันตั้งแต่ช่วงต้นทศวรรษ 1990 ในเวลานั้น ชุดฟิลเตอร์เสริมของ Nikon ทั้งหมดถูกสร้างขึ้นโดยใช้ เสื้อคลุมแข็ง เทคนิคการสปัตเตอร์ แต่ตัวกรองที่มีอยู่ในปัจจุบันจำนวนมากใช้ประโยชน์จากวิธีการเคลือบที่นุ่มนวลกว่าที่ใหม่กว่า แม้ว่าการเคลือบแบบอ่อนจะอ่อนไหวต่อความชื้นและการเสื่อมสภาพจากความร้อนมากกว่า และต้องได้รับการจัดการอย่างระมัดระวังมากกว่าฟิลเตอร์เคลือบแข็ง พวกเขามีค่าการปิดกั้นที่สูงกว่าค่าความหนาแน่นของแสงและช่วยให้ปรับแถบความยาวคลื่นเฉพาะได้ง่ายขึ้น การทำความเข้าใจระบบการตั้งชื่อรหัสผสมตัวกรองของ Nikon ทำให้เกิดกลไกในการพิจารณาอย่างรวดเร็วว่าชุดใดชุดหนึ่งจะมีประสิทธิภาพเพียงพอสำหรับฟลูออโรฟอร์เฉพาะหรือไม่

อักษรตัวแรกในรหัสการกำหนดตัวกรองตัวอักษรและตัวเลขที่เป็นกรรมสิทธิ์ของ Nikon ระบุพื้นที่สเปกตรัมกระตุ้นความยาวคลื่น (เช่น ยูวี, วี, NS, และ NSซึ่งเป็นตัวย่ออย่างง่ายสำหรับรังสีอัลตราไวโอเลต ไวโอเลต น้ำเงิน และเขียว ตามลำดับ) ตัวเลขที่ตามหลังโค้ดกระตุ้นเกี่ยวข้องกับความกว้าง passband ของตัวกรองการกระตุ้น: 1 สำหรับการกระตุ้นวงแคบ 2สำหรับการกระตุ้นวงกลางและกว้างและ 3 สำหรับการกระตุ้นวงกว้างมาก สุดท้าย ตัวอักษรอย่างน้อย 1 ตัวที่ตามหลังหมายเลขขนาดแบนด์พาสที่กระตุ้นจะระบุลักษณะของตัวกรองสิ่งกีดขวาง อักษรรหัส NS บ่งชี้ถึงตัวกรองอุปสรรคทางยาวมาตรฐานที่มีความยาวคลื่นตัดต่ำสุดในขณะที่ NS กำหนดค่าความยาวคลื่นตัดที่สูงกว่าสำหรับตัวกรองการปล่อยสัญญาณทางยาวผ่าน ตัวกรองการปล่อย Bandpass ระบุด้วยตัวอักษร อี (หมายถึงคำว่า "ปรับปรุง") เพื่อบ่งบอกถึงประสิทธิภาพที่เหนือกว่าของพวกเขาในเรื่องการขจัดครอสโอเวอร์ NS อี/ซี ฟิลเตอร์คือชุดค่าผสมของการแทรกสอดของโค้ตแบบนิ่มที่ออกแบบมาเพื่อประสิทธิภาพสูงสุดกับโพรบเฉพาะ เช่น DAPI, FITC, TRITC และ Texas Red

งบประมาณแสงเรืองแสง

การประมาณค่าฟลักซ์ของแสงในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ทั่วไปมีประโยชน์ในการสรุปข้อจำกัดที่จะเกิดขึ้นในการผลิตภาพดิจิทัลหรือในระหว่างการสังเกตตัวอย่างด้วยสายตา สำหรับแบบฝึกหัดนี้ สมมติว่าแหล่งกำเนิดการกระตุ้นเป็นหลอดไฟซีนอนอาร์คขนาด 75 วัตต์มาตรฐานซึ่งมีความหนาแน่นของฟลักซ์การส่องสว่างเฉลี่ยอยู่ที่ประมาณ 400 แคนเดลาต่อตารางมิลลิเมตร (สำหรับแหล่งข้อมูลอื่น โปรดดูที่ ตารางที่ 1).เมื่อรวบรวมเอาเอาท์พุตของหลอดไฟและควบคุมผ่านตัวกรองสัญญาณรบกวน 490 นาโนเมตร (มีแบนด์วิดท์ 10 นาโนเมตรและการส่งผ่าน 75 เปอร์เซ็นต์) แสงจะส่องผ่านประมาณ 2 มิลลิวัตต์ หลังจากการสะท้อนด้วยกระจกไดโครมาติกที่มีประสิทธิภาพ 90 เปอร์เซ็นต์ ฟลักซ์แสง 1.8 มิลลิวัตต์จะเข้าสู่รูรับแสงด้านหลังของวัตถุประสงค์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เป็นลำแสงกระตุ้น

ด้วยวัตถุประสงค์ 100x ที่มีรูรับแสงเป็นตัวเลข 1.4 พื้นที่ของชิ้นงานที่ส่องสว่างจะเป็น 12 x 10 × E(-6) ตารางเซนติเมตร สมมติว่ามีระยะการมองเห็นเป็นวงกลมเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 40 ไมโครเมตร ฟลักซ์แสงบนชิ้นงานทดสอบจะอยู่ที่ประมาณ 150 วัตต์ต่อตารางเซนติเมตร ซึ่งสอดคล้องกับความหนาแน่นของฟลักซ์ที่ 3.6 x 10 × E(20) โฟตอนต่อตารางเซนติเมตร ดังนั้น ความเข้มแสงของชิ้นงานทดสอบจึงสูงกว่าเหตุการณ์นั้นบนพื้นผิวโลกประมาณ 1,000 เท่าในวันที่มีแดดจ้า

การเปล่งแสงเรืองแสงที่เกิดจากฟลักซ์แสงที่กล่าวถึงข้างต้นขึ้นอยู่กับลักษณะการดูดกลืนและการปล่อยของฟลูออโรฟอร์ ความเข้มข้นในตัวอย่าง และความยาวเส้นทางแสงของชิ้นงานทดสอบ ในทางคณิตศาสตร์ การเรืองแสงเกิดขึ้น (NS) ถูกกำหนดโดยสมการ:

สูตร 1 - ผลิตเรืองแสง

ที่ไหน σ คือภาคตัดขวางการดูดกลืนโมเลกุล NS คือผลผลิตควอนตัมและ ผม คือฟลักซ์แสงตกกระทบ (ตามที่คำนวณข้างต้น) สมมติว่าฟลูออเรสซีนเป็นฟลูออโรฟอร์ ส่วนตัดขวางการดูดกลืน (σ) คือ 3 x 10 × E(-16) ตารางเซนติเมตรต่อโมเลกุล NS เท่ากับ 0.99 ส่งผลให้มีค่า NS 100,000 โฟตอนต่อวินาทีต่อโมเลกุล ถ้าความเข้มข้นของสีย้อมอยู่ที่ 1 ไมโครโมลต่อลิตร และกระจายอย่างสม่ำเสมอในจานขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 40 ไมโครเมตรที่มีความหนา 10 ไมโครเมตร (ปริมาตรเท่ากับ 12 พิโคลิตร) จะมีโมลของสีย้อมหรือสีย้อมประมาณ 1.2 x 10 × E(-17) หรือ 7.2 ล้านโมเลกุลในเส้นทางแสง หากโมเลกุลทั้งหมดถูกกระตุ้นพร้อมกัน อัตราการปล่อยแสงจะเท่ากับ 7.2 x 10 × E (11) โฟตอนต่อวินาที (พิจารณาจากผลคูณของ NS และจำนวนโมเลกุลของสีย้อม) คำถามที่น่าสนใจคือจะตรวจจับโฟตอนที่ปล่อยออกมาได้จำนวนเท่าใดและอัตราการปล่อยก๊าซนี้จะดำเนินต่อไปอีกนานเท่าใด

ตารางที่ 1 - ความหนาแน่นของการส่องสว่างของแหล่งกำเนิดแสงที่เลือก

โคมไฟหมุนเวียน
(แอมแปร์)
ฟลักซ์ส่องสว่าง
(ลูเมน)
หมายถึงส่องสว่าง
ความหนาแน่น (cd/mm2)
ขนาดอาร์ค
(สูง x กว้าง)
(มิลลิเมตร)
Mercury Arc
(100 วัตต์)
5220017000.25 x 0.25
Xenon Arc
(75 วัตต์)
5.48504000.25 x 0.50
Xenon Arc
(500 วัตต์)
30900035000.30 x 0.30 น
ทังสเตน
ฮาโลเจน
82800454.2 x 2.3

ประสิทธิภาพของการตรวจจับเป็นหน้าที่ของประสิทธิภาพการรวบรวมแสงและประสิทธิภาพควอนตัมของเครื่องตรวจจับ วัตถุประสงค์รูรับแสง 1.4 ตัวเลขพร้อมการส่งผ่าน 100 เปอร์เซ็นต์ (เงื่อนไขที่ไม่สมจริง) มีประสิทธิภาพการรวบรวมสูงสุด โดยจำกัดมุมการยอมรับประมาณ 30 เปอร์เซ็นต์ ประสิทธิภาพการส่งผ่านของกระจกไดโครมาติกคือ 85 เปอร์เซ็นต์ และประสิทธิภาพของตัวกรองกั้นคือ 80 เปอร์เซ็นต์ ประสิทธิภาพการรวบรวมโดยรวมอยู่ที่ประมาณ 20 เปอร์เซ็นต์หรือ 140 พันล้านโฟตอนต่อวินาที หากเครื่องตรวจจับเป็นอุปกรณ์ชาร์จแบบธรรมดา (CCD) ประสิทธิภาพควอนตัมอยู่ที่ประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์สำหรับการปล่อยฟลูออเรสซีนสีเขียว (ที่ 525 นาโนเมตร) ดังนั้นสัญญาณที่ตรวจพบจะเป็น 70 พันล้านโฟตอนต่อวินาทีหรือประมาณ 10 เปอร์เซ็นต์ของการเรืองแสงที่ปล่อยออกมา แม้จะมีเครื่องตรวจจับที่สมบูรณ์แบบ (ประสิทธิภาพควอนตัม 100 เปอร์เซ็นต์) ก็สามารถตรวจพบโฟตอนการปล่อยฟลูออเรสเซนต์เพียงประมาณ 20 เปอร์เซ็นต์เท่านั้น

ระยะเวลาของการปล่อยแสงเรืองแสงขึ้นอยู่กับอัตราการทำลายฟลูออโรฟอร์อันเป็นผลมาจากการฟอกสีด้วยแสง สำหรับฟลูออเรสซีนในน้ำเกลือที่มีออกซิเจน การวัดแสดงให้เห็นว่าแต่ละโมเลกุลสามารถปล่อยโฟตอนได้ประมาณ 36,000 โฟตอนก่อนที่จะถูกทำลาย ในสภาพแวดล้อมที่ปราศจากออกซิเจน อัตราการทำลายด้วยแสงจะลดลงประมาณสิบเท่า ดังนั้น 360,000 โฟตอนจึงถูกผลิตขึ้นต่อโมเลกุลของฟลูออเรสซีน สระย้อมทั้งหมดในตัวอย่างนี้ (7.2 ล้านโมเลกุล) จะสามารถผลิตโฟตอนขั้นต่ำ 2.6 x 10 × E (11) และสูงสุด 2.6 x 10 × E (12) โฟตอน สมมติว่ามีอัตราการปลดปล่อย 100,000 โฟตอนต่อวินาทีต่อโมเลกุลที่คำนวณไว้ข้างต้น การเรืองแสงสามารถดำเนินต่อไปได้เพียง 0.3 ถึง 3 วินาทีก่อนการทำลายด้วยแสง ในกรณีที่ตรวจพบโฟตอนฟลักซ์ 10 เปอร์เซ็นต์ จะได้รับสัญญาณอิเล็กตรอน 7.2 x 10 × E (10) ต่อวินาที

ตามข้อโต้แย้งของตัวอย่างนี้ หากเครื่องตรวจจับเป็นกล้อง CCD ขนาด 1000 x 1000 พิกเซล สัญญาณนี้จะถูกกระจายไปยังเซนเซอร์กว่าล้านตัว โดยมีอิเล็กตรอนประมาณ 72,000 ตัวต่อเซนเซอร์ สำหรับ CCD เกรดวิทยาศาสตร์ที่มีเซ็นเซอร์สี่เหลี่ยมจัตุรัสขนาด 9 ไมโครเมตร ความจุในการจัดเก็บเต็มหลุมจะอยู่ที่ประมาณ 80,000 อิเล็กตรอนและสัญญาณรบกวนที่อ่านออกจะน้อยกว่า 10 อิเล็กตรอน อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนจะถูกกำหนดโดยส่วนใหญ่โดยสัญญาณรบกวนทางสถิติของโฟตอนเท่ากับรากที่สองของสัญญาณ ประมาณ 268 ในเกือบทุกกรณี ระดับสัญญาณที่สูงนี้สามารถดำเนินต่อไปได้ในช่วงเวลาสั้น ๆ เท่านั้นก่อนที่จะเกิดการทำลายด้วยแสง . การประนีประนอมที่นักกล้องจุลทรรศน์ส่วนใหญ่ใช้เพื่อยืดระยะเวลาการสังเกตคือการลดความเข้มของฟลักซ์แสงที่ตกกระทบลง ดังนั้นเพียงเศษเสี้ยวของโมเลกุลฟลูออโรฟอร์ในสระย้อมจะตื่นเต้นและอยู่ภายใต้การทำลายด้วยแสง ดังนั้น อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนแทบจะไม่เท่ากับค่าสูงสุดตามทฤษฎี และโดยทั่วไปแล้วจะอยู่ในช่วงระหว่าง 10 ถึง 20 ในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

การตรวจจับโมเลกุลเดี่ยว

ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม มักจะเป็นไปได้ที่จะตรวจจับการเปล่งแสงเรืองแสงจากโมเลกุลเดี่ยว โดยมีเงื่อนไขว่าพื้นหลังของแสงและสัญญาณรบกวนของเครื่องตรวจจับต่ำเพียงพอ ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น โมเลกุลฟลูออเรสซีนเพียงโมเลกุลเดียวสามารถปล่อยโฟตอนได้มากถึง 300,000 โฟตอน ก่อนที่มันจะถูกทำลายโดยการฟอกสีด้วยแสง สมมติว่าประสิทธิภาพการรวบรวมและการตรวจจับ 20 เปอร์เซ็นต์ จะตรวจพบโฟตอนประมาณ 60,000 โฟตอน การใช้โฟโตไดโอดหิมะถล่มหรือเครื่องตรวจจับ CCD แบบทวีคูณอิเล็กตรอนสำหรับการทดลองเหล่านี้ ผู้วิจัยสามารถตรวจสอบพฤติกรรมของโมเลกุลเดี่ยวเป็นเวลาหลายวินาทีหรือหลายนาที ปัญหาหลักคือการปราบปรามเสียงพื้นหลังออปติคัลอย่างเพียงพอ เนื่องจากวัสดุจำนวนมากที่ใช้ในการสร้างเลนส์และฟิลเตอร์ไมโครสโคปแสดงระดับการเรืองแสงอัตโนมัติในระดับหนึ่ง ความพยายามจึงมุ่งไปที่การผลิตส่วนประกอบเรืองแสงที่ต่ำมากในขั้นต้น อย่างไรก็ตาม ในไม่ช้าก็เห็นได้ชัดว่าเทคนิคกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่ใช้การสะท้อนภายในทั้งหมด (TIR) ให้การผสมผสานที่ต้องการของพื้นหลังต่ำและฟลักซ์แสงกระตุ้นสูง

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสะท้อนภายในทั้งหมด (TIRFM) ใช้ประโยชน์จากคลื่นที่ปล่อยออกมาซึ่งพัฒนาขึ้นเมื่อแสงสะท้อนภายในโดยสิ้นเชิงที่ส่วนต่อประสานระหว่างตัวกลางสองตัวที่มีดัชนีการหักเหของแสงต่างกัน หลักการใช้แหล่งกำเนิดแสงภายนอกแสดงไว้ใน รูปที่ 7(ก). ในเทคนิคนี้ ลำแสง (โดยปกติคือลำแสงเลเซอร์แบบขยาย) จะถูกส่งผ่านปริซึมที่มีค่าดัชนีการหักเหของแสงสูง เช่น แก้วหรือแซฟไฟร์ ซึ่งติดกับตัวกลางดัชนีการหักเหของแสงที่ต่ำกว่าของแก้วหรือสารละลายที่เป็นน้ำ หากแสงส่องเข้าสู่ปริซึมที่สูงกว่ามุมวิกฤต ลำแสงจะสะท้อนภายในโดยสิ้นเชิงที่ส่วนต่อประสาน ปรากฏการณ์สะท้อนสะท้อนจะพัฒนาคลื่นลามที่ส่วนต่อประสานโดยการสร้างสนามแม่เหล็กไฟฟ้าที่แทรกซึมเข้าไปประมาณ 200 นาโนเมตรหรือน้อยกว่าเข้าไปในพื้นที่ดัชนีการหักเหของแสงที่ต่ำกว่า ความเข้มของแสงในคลื่นที่ระเหยออกไปนั้นสูงเพียงพอที่จะกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ที่อยู่ภายใน แต่เนื่องจากความลึกที่ตื้น ปริมาตรที่ตื่นเต้นจึงมีขนาดเล็กมาก ผลลัพธ์ที่ได้คือพื้นหลังระดับต่ำมาก เนื่องจากมีตัวอย่างเพียงเล็กน้อยเท่านั้นที่ได้รับแสงกระตุ้น (เฉพาะส่วนนั้นภายในระยะห่าง 200 นาโนเมตรของอินเทอร์เฟซ)

รูปที่ 7 - การกำหนดค่า TIRFM ของกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสะท้อนภายในทั้งหมดยังสามารถดำเนินการได้โดยการปรับเปลี่ยนการส่องสว่างของอีพิที่นำมาใช้ในเทคนิคไวด์ฟิลด์ (ดังแสดงใน รูปที่ 7(ข)). วิธีนี้ต้องใช้รูรับแสงที่เป็นตัวเลขที่สูงมาก (อย่างน้อย 1.4 แต่ควรเป็น 1.45 ถึง 1.6) และการส่องสว่างบางส่วนของสนามกล้องจุลทรรศน์จากด้านหนึ่งด้วยกีฬาขนาดเล็กหรือการส่องสว่างที่สม่ำเสมอกว่าด้วยวงแหวนบาง Nikon นำเสนอวัตถุประสงค์ TIRF 60x และ 100x พร้อมรูรับแสงที่เป็นตัวเลข 1.49 ต้องใช้สื่อกลางในการแช่เลนส์ดัชนีการหักเหของแสงสูงและกระจกครอบกล้องจุลทรรศน์เพื่อให้ได้มุมการส่องสว่างซึ่งส่งผลให้มีการสะท้อนภายในทั้งหมด ตามที่นำเสนอใน รูปที่ 7(ข), รังสีของแสงที่ออกจากชิ้นเลนส์ด้านหน้าวัตถุในมุมที่น้อยกว่ามุมวิกฤต (แสดงเป็น เอ(1)) ใน รูปที่ 7(b)) จะถูกส่งออกจากกล้องจุลทรรศน์ เมื่อมุมเพิ่มขึ้นถึงหรือเกินมุมวิกฤต (ระบุมุม เอ(2) ใน รูปที่ 7(ข)) ผลการสะท้อนกลับภายในทั้งหมด

เทคนิคการเรืองแสงขั้นสูงอื่นๆ ที่ได้รับความนิยม เช่น การถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (เฟรต) และการกู้คืนเรืองแสงหลังการฟอกสี (FRAP) เช่นเดียวกับสเปกโทรสโกปี มักจะรวมกับการสะท้อนกลับภายในทั้งหมดเพื่อให้ได้ข้อมูลเพิ่มเติม เช่นเดียวกับระบบไฟส่องสว่างโมดูลาร์ Nikon Ti2-LAPP ผลที่ได้คือเครื่องมือที่ทรงพลังมากสำหรับการศึกษาฟลูออโรฟอร์แต่ละตัวและโมเลกุลที่ติดฉลากเรืองแสง ข้อดีที่เกิดจากการศึกษาคุณสมบัติของโมเลกุลเดี่ยวกำลังเริ่มเป็นที่ชื่นชม ดังนั้นช่วงปัจจุบันของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงจึงขยายจากโมเลกุลเดี่ยวไปยังสัตว์ทั้งหมด

บทสรุป

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่ทันสมัยผสมผสานพลังของส่วนประกอบออปติคัลที่มีประสิทธิภาพสูงเข้ากับการควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์ของเครื่องมือและการได้มาซึ่งภาพดิจิทัล เพื่อให้ได้ระดับความซับซ้อนที่เหนือชั้นกว่าการสังเกตง่ายๆ ด้วยตามนุษย์ กล้องจุลทรรศน์ตอนนี้อาศัยการถ่ายภาพอิเล็กทรอนิกส์เป็นอย่างมากเพื่อรับข้อมูลอย่างรวดเร็วที่ระดับแสงน้อยหรือที่ความยาวคลื่นที่มองไม่เห็นด้วยตาเปล่า การปรับปรุงทางเทคนิคเหล่านี้ไม่ได้เป็นเพียงการตกแต่งหน้าต่าง แต่เป็นส่วนประกอบสำคัญของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงในฐานะระบบ

ยุคสมัยที่กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเป็นเครื่องมือเชิงพรรณนาล้วนๆ หรือของเล่นทางปัญญาได้ผ่านไปแล้ว ในปัจจุบัน การสร้างภาพด้วยแสงเป็นเพียงก้าวแรกสู่การวิเคราะห์ข้อมูล กล้องจุลทรรศน์บรรลุขั้นตอนแรกนี้ร่วมกับเครื่องตรวจจับอิเล็กทรอนิกส์ โปรเซสเซอร์ภาพ และอุปกรณ์แสดงผลที่สามารถดูได้ว่าเป็นส่วนขยายของระบบภาพ การควบคุมโฟกัสด้วยคอมพิวเตอร์ ตำแหน่งบนเวที ส่วนประกอบออปติคัล บานประตูหน้าต่าง ฟิลเตอร์ และเครื่องตรวจจับมีการใช้งานอย่างแพร่หลาย และช่วยให้สามารถทำการทดลองที่ไม่สามารถทำได้โดยมนุษย์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกลไก การประยุกต์ใช้ electro-optics ที่เพิ่มขึ้นในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงได้นำไปสู่การพัฒนาแหนบแสงที่สามารถจัดการกับโครงสร้างหรืออนุภาคย่อยของเซลล์การถ่ายภาพของโมเลกุลเดี่ยวและการใช้งานทางสเปกโตรสโกปีที่ซับซ้อนมากมาย

ผู้เขียนร่วม

Kenneth R. Spring - ที่ปรึกษาด้านวิทยาศาสตร์, ลัสบี, แมริแลนด์, 20657

Michael W. Davidson - ห้องปฏิบัติการสนามแม่เหล็กสูงแห่งชาติ, 1800 East Paul Dirac Dr., มหาวิทยาลัยแห่งรัฐฟลอริดา, แทลลาแฮสซี, ฟลอริดา, 32310

ผลิตภัณฑ์ Nikon ที่เกี่ยวข้อง

การกระตุ้นด้วยแสง & TIRF

โมดูลไฟส่องสว่างสำหรับเพิ่มความสามารถในการกระตุ้นภาพถ่าย (การแปลง/การเปิดใช้งาน) FRAP และ TIRF ให้กับระบบภาพ Nikon

แหล่งกำเนิดแสง

Nikon นำเสนอแหล่งกำเนิดแสงสำหรับความต้องการด้านการถ่ายภาพที่หลากหลาย ตั้งแต่ระบบโคแอกเซียลสำหรับสเตอริโอไมโครสโคปีไปจนถึงไฟส่องสว่างแบบ LED สำหรับการใช้งานอีพิ-ฟลูออเรสเซนส์ และหน่วยเลเซอร์อันทรงพลังสำหรับการใช้งานด้านภาพขั้นสูง โซลูชันระบบแสงจำนวนมากของเรามีการใช้งานที่ไม่เหมือนใครและสามารถเรียกให้ควบคุมด้วยความเร็วสูงได้


Hoechst สเปกตรัมสีแดงและสีน้ำเงิน - การปล่อยสีแดงบอกอะไรเรา? - ชีววิทยา

สเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจนปรมาณู

หน้านี้แนะนำสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจนของอะตอม ซึ่งแสดงให้เห็นว่าเกิดขึ้นจากการเคลื่อนที่ของอิเล็กตรอนระหว่างระดับพลังงานภายในอะตอมได้อย่างไร นอกจากนี้ยังพิจารณาว่าสเปกตรัมสามารถใช้เพื่อค้นหาพลังงานไอออไนเซชันของไฮโดรเจนได้อย่างไร

สเปกตรัมการปล่อยคืออะไร?

การสังเกตสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจน

ท่อระบายไฮโดรเจนเป็นท่อบางที่มีก๊าซไฮโดรเจนที่ความดันต่ำโดยมีขั้วไฟฟ้าอยู่ที่ปลายแต่ละด้าน หากคุณใส่ไฟฟ้าแรงสูงข้ามสิ่งนี้ (เช่น 5,000 โวลต์) หลอดจะสว่างขึ้นด้วยแสงสีชมพูสดใส

หากแสงส่องผ่านปริซึมหรือตะแกรงเลี้ยวเบนแสง แสงจะถูกแบ่งออกเป็นสีต่างๆ สิ่งที่คุณจะเห็นคือส่วนเล็กๆ ของสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจน สเปกตรัมส่วนใหญ่มองไม่เห็นด้วยตาเพราะอยู่ในอินฟราเรดหรืออัลตราไวโอเลต

ภาพถ่ายแสดงส่วนหนึ่งของหลอดปล่อยไฮโดรเจนทางด้านซ้าย และเส้นสามเส้นที่เห็นได้ง่ายที่สุดในส่วนที่มองเห็นได้ของสเปกตรัมทางด้านขวา (ไม่ต้องสนใจเครื่องหมาย "smearing" - โดยเฉพาะทางด้านซ้ายของเส้นสีแดง ซึ่งเกิดจากข้อบกพร่องในวิธีถ่ายภาพ ดูหมายเหตุด้านล่าง)

บันทึก: ภาพถ่ายนี้ได้รับความอนุเคราะห์จาก Dr. Rod Nave จาก Department of Physics and Astronomy at Georgia State University, Atlanta ภาพถ่ายมาจากบันทึกเกี่ยวกับสเปกตรัมไฮโดรเจนในหน้า HyperPhysics ในเว็บไซต์ของมหาวิทยาลัย หากคุณสนใจมากกว่าการดูเบื้องต้นเกี่ยวกับเรื่องนั้น ก็เป็นสถานที่ที่ดีที่จะไป

ภาพควรแสดงเส้นสเปกตรัมที่ชัดเจนสามเส้น ได้แก่ สีน้ำเงินเข้ม สีฟ้า และสีแดง รอยเปื้อนสีแดงที่ปรากฏทางด้านซ้ายของเส้นสีแดง และรอยเปื้อนอื่นๆ ที่คล้ายกัน (มองเห็นยากกว่ามาก) ทางด้านซ้ายของอีกสองบรรทัดที่เหลือ อาจมาจากการสะท้อนที่หลงทางในการตั้งค่า หรือ อาจมาจากข้อบกพร่องในตะแกรงเลี้ยวเบน ฉันเลือกใช้ภาพนี้เพราะ ก) ฉันคิดว่ามันเป็นภาพที่น่าทึ่ง และ b) เป็นภาพเดียวที่ฉันเคยเจอ ซึ่งรวมถึงท่อระบายไฮโดรเจนและสเปกตรัมของมันในภาพเดียวกัน

การขยายสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจนสู่ UV และ IR

สเปกตรัมของไฮโดรเจนมีมากกว่าเส้นสามเส้นที่คุณเห็นด้วยตาเปล่า เป็นไปได้ที่จะตรวจจับรูปแบบของเส้นทั้งในบริเวณอัลตราไวโอเลตและอินฟราเรดของสเปกตรัมเช่นกัน

สิ่งเหล่านี้อยู่ใน "series" หลายบรรทัดที่ตั้งชื่อตามบุคคลที่ค้นพบ แผนภาพด้านล่างแสดงชุดข้อมูลสามชุด แต่มีชุดอื่นๆ ในอินฟราเรดทางด้านซ้ายของชุด Paschen ที่แสดงในแผนภาพ

ไดอะแกรมค่อนข้างซับซ้อน ดังนั้นเราจะดูทีละนิด ดูซีรี่ส์ Lyman ทางด้านขวาของแผนภาพก่อน - นี่คือชุดที่แผ่กว้างที่สุดและง่ายที่สุดในการดูว่าเกิดอะไรขึ้น

บันทึก: มาตราส่วนความถี่ถูกทำเครื่องหมายเป็น PHz นั่นคือ petaHertz คุณคุ้นเคยกับคำนำหน้า เช่น กิโล (หมายถึงพันหรือ 10 3 ครั้ง) และเมกะ (หมายถึงล้านหรือ 10 6 ครั้ง) Peta หมายถึง 10 15 ครั้ง ค่าเช่น 3 PHz เท่ากับ 3 x 10 15 Hz หากคุณกังวลเกี่ยวกับ "Hertz" ก็หมายความว่า "รอบต่อวินาที"

ซีรี่ส์ Lyman คือชุดของเส้นในรังสีอัลตราไวโอเลต สังเกตว่าเส้นจะชิดกันมากขึ้นเมื่อความถี่เพิ่มขึ้น ในที่สุดพวกเขาก็เข้ามาใกล้กันจนเป็นไปไม่ได้ที่จะเห็นพวกมันเป็นอย่างอื่นนอกจากสเปกตรัมที่ต่อเนื่อง นั่นคือสิ่งที่แรเงาทางด้านขวามือของซีรีส์แนะนำ

แล้ว ณ จุดหนึ่งเรียกว่า ขีดจำกัดของซีรีส์, ซีรีส์หยุด

หากตอนนี้คุณดูที่ชุด Balmer หรือชุด Paschen คุณจะเห็นว่ารูปแบบเหมือนกัน แต่ชุดมีขนาดกะทัดรัดมากขึ้น ในชุด Balmer ให้สังเกตตำแหน่งของเส้นที่มองเห็นได้สามเส้นจากภาพถ่ายที่อยู่ไกลออกไปบนหน้า

ซับซ้อนทุกอย่าง - ความถี่และความยาวคลื่น

คุณมักจะพบสเปกตรัมไฮโดรเจนที่วาดโดยใช้ความยาวคลื่นของแสงมากกว่าความถี่ น่าเสียดาย เนื่องจากความสัมพันธ์ทางคณิตศาสตร์ระหว่างความถี่ของแสงกับความยาวคลื่นของแสง คุณจะได้มุมมองที่แตกต่างกันสองประการของสเปกตรัม ถ้าคุณพล็อตมันเทียบกับความถี่หรือกับความยาวคลื่น

ความสัมพันธ์ระหว่างความถี่และความยาวคลื่น

ความสัมพันธ์ทางคณิตศาสตร์คือ:

การจัดเรียงใหม่จะทำให้ได้สมการความยาวคลื่นหรือความถี่อย่างใดอย่างหนึ่ง

สิ่งนี้หมายความว่ามีความสัมพันธ์ผกผันระหว่างทั้งสอง - ความถี่สูงหมายถึงความยาวคลื่นต่ำและในทางกลับกัน

บันทึก: บางครั้งคุณจะพบความถี่ที่กำหนดสัญลักษณ์ที่ชัดเจนมากขึ้น f

การวาดสเปกตรัมไฮโดรเจนในแง่ของความยาวคลื่น

นี่คือลักษณะที่สเปกตรัมจะดูเหมือนถ้าคุณวาดมันในแง่ของความยาวคลื่นแทนที่จะเป็นความถี่:

. . . และเพียงเพื่อเตือนคุณว่าสเปกตรัมในแง่ของความถี่เป็นอย่างไร:

มันน่าสับสนไหม? ฉันพบว่ามันสับสนมาก! แล้วคุณจะทำอย่างไรกับมัน?

สำหรับส่วนที่เหลือของหน้านี้ ฉันจะ เท่านั้น ดูที่สเปกตรัมที่วางแผนเทียบกับความถี่ เพราะมันง่ายกว่ามากที่จะเชื่อมโยงมันกับสิ่งที่เกิดขึ้นในอะตอม โปรดทราบว่าสเปกตรัมจะดูแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับวิธีการวางแผน แต่นอกเหนือจากนั้น ให้เพิกเฉยต่อเวอร์ชันความยาวคลื่น เว้นแต่จะชัดเจนว่าผู้ตรวจสอบของคุณต้องการ หากคุณพยายามเรียนรู้ทั้งสองเวอร์ชัน คุณจะทำให้มันสับสนเท่านั้น!

บันทึก: หลักสูตรอาจจะไม่ช่วยอะไรมากเกี่ยวกับเรื่องนี้ คุณต้องดูเอกสารที่ผ่านมาและโครงร่างการทำเครื่องหมาย

หากคุณกำลังเตรียมสอบในสหราชอาณาจักรและไม่มีสิ่งเหล่านี้ คุณสามารถดูวิธีดำเนินการสอบได้โดยไปที่หน้าหลักสูตร

อธิบายสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจน

สมการ Balmer และ Rydberg

ด้วยความเข้าใจเชิงลึกทางคณิตศาสตร์ที่น่าทึ่ง ในปี 1885 Balmer ได้คิดค้นสูตรง่ายๆ สำหรับการทำนายความยาวคลื่นของเส้นใดๆ ในสิ่งที่เราตอนนี้รู้จักในชื่อชุด Balmer สามปีต่อมา Rydberg ได้สรุปเรื่องนี้เพื่อให้สามารถหาความยาวคลื่นของเส้นใด ๆ ในสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจนได้

สิ่งที่ Rydberg คิดขึ้นมาคือ:

NSชม เป็นค่าคงที่ที่เรียกว่า ค่าคงที่ริดเบิร์ก.

NS1 และ n2 เป็นจำนวนเต็ม (จำนวนเต็ม) NS2 ต้องมากกว่า n1. กล่าวอีกนัยหนึ่งถ้า n1 คือ, พูด, 2 แล้วก็ n2 สามารถเป็นจำนวนเต็มใดๆ ระหว่าง 3 ถึงอนันต์

การผสมตัวเลขแบบต่างๆ ที่คุณสามารถใส่ลงในสูตรนี้ทำให้คุณสามารถคำนวณความยาวคลื่นของเส้นใดๆ ในสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจนได้ และมีข้อตกลงที่ใกล้เคียงกันระหว่างความยาวคลื่นที่คุณได้รับโดยใช้สูตรนี้กับความยาวคลื่นที่ค้นพบโดยการวิเคราะห์สเปกตรัมจริง .

บันทึก: หากคุณเจอสมการดั้งเดิมของ Balmer มันจะไม่เป็นแบบนี้ ในสมการของบัลเมอร์ n1 เป็น 2 เสมอ - เพราะนั่นทำให้ความยาวคลื่นของเส้นตรงในส่วนที่มองเห็นได้ของสเปกตรัมซึ่งเป็นสิ่งที่เขาสนใจ สมการดั้งเดิมของเขาถูกจัดระเบียบต่างกันด้วย รุ่นที่ทันสมัยแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนมากขึ้นว่าเกิดอะไรขึ้น

คุณยังสามารถใช้สมการ Rydberg เวอร์ชันที่แก้ไขแล้วเพื่อคำนวณความถี่ของแต่ละบรรทัดได้ คุณสามารถคำนวณเวอร์ชันนี้จากสมการก่อนหน้าและสูตรที่เกี่ยวข้องกับความยาวคลื่นและความถี่เพิ่มเติมในหน้า

บันทึก: คุณอาจเจอสมการ Rydberg เวอร์ชันที่ n1 และ n2 เป็นอย่างอื่นหรืออาจเปลี่ยนเป็นตัวอักษรเช่น m และ n ไม่ว่าคุณจะใช้เวอร์ชันใด ตัวเลขที่มากกว่าจะต้องอยู่ด้านล่างสุดของคำศัพท์ทางขวามือเสมอ - ตัวเลขที่คุณใช้ไปหากคุณทำการคำนวณผิด จะเห็นได้ทันทีว่าคุณเริ่มคำนวณ เพราะคุณจะลงเอยด้วยคำตอบเชิงลบ!

ที่มาของสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจน

เส้นในสเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจนมีรูปแบบปกติและสามารถแทนด้วยสมการอย่างง่าย (ค่อนข้าง) แต่ละบรรทัดสามารถคำนวณได้จากการรวมจำนวนเต็มอย่างง่าย

เหตุใดไฮโดรเจนจึงเปล่งแสงเมื่อถูกกระตุ้นโดยไฟฟ้าแรงสูง และจำนวนเต็มเหล่านั้นมีความสำคัญอย่างไร

เมื่อไม่มีอะไรน่าตื่นเต้น อิเล็กตรอนของไฮโดรเจนจะอยู่ในระดับพลังงานแรก ซึ่งเป็นระดับที่ใกล้กับนิวเคลียสมากที่สุด แต่ถ้าคุณจ่ายพลังงานให้กับอะตอม อิเล็กตรอนจะถูกกระตุ้นไปสู่ระดับพลังงานที่สูงขึ้น หรือกระทั่งถูกขับออกจากอะตอมโดยสิ้นเชิง

ไฟฟ้าแรงสูงในท่อระบายให้พลังงานนั้น โมเลกุลของไฮโดรเจนจะแตกตัวเป็นอะตอมไฮโดรเจนก่อน (ด้วยเหตุนี้ อะตอม สเปกตรัมการปล่อยไฮโดรเจน) และอิเล็กตรอนจะได้รับการส่งเสริมให้มีระดับพลังงานที่สูงขึ้น

สมมติว่าอิเล็กตรอนตัวใดตัวหนึ่งตื่นเต้นในระดับพลังงานที่สาม นี้มักจะสูญเสียพลังงานอีกครั้งโดยถอยกลับไปสู่ระดับที่ต่ำกว่า มันสามารถทำได้สองวิธี

มันสามารถถอยกลับลงไปที่ระดับแรกอีกครั้ง หรืออาจถอยกลับไปที่ระดับที่สอง - จากนั้น ในการกระโดดครั้งที่สอง ลงไปที่ระดับแรก

การผูกอิเล็กตรอนเฉพาะเจาะจงจะกระโดดไปยังแต่ละเส้นในสเปกตรัม

หากอิเล็กตรอนตกจากระดับ 3 ไปเป็น 2 ระดับ จะต้องสูญเสียพลังงานจำนวนหนึ่งเหมือนกับช่องว่างพลังงานระหว่างสองระดับนั้น พลังงานที่อิเล็กตรอนสูญเสียไปนั้นเป็นแสง (โดยที่ "light" รวมถึง UV และ IR ที่มองเห็นได้)

แต่ละความถี่ของแสงสัมพันธ์กับพลังงานเฉพาะโดยสมการ:

ยิ่งความถี่สูงเท่าใด พลังงานของแสงก็จะยิ่งสูงขึ้นเท่านั้น

หากอิเล็กตรอนตกจากระดับ 3 ไปที่ระดับ 2 จะมองเห็นแสงสีแดง นี่คือที่มาของเส้นสีแดงในสเปกตรัมไฮโดรเจน ด้วยการวัดความถี่ของแสงสีแดง คุณสามารถคำนวณพลังงานของมันได้ พลังงานนั้นจะต้องเท่ากันทุกประการกับช่องว่างพลังงานระหว่างระดับ 3 และระดับ 2 ในอะตอมไฮโดรเจน

สมการสุดท้ายสามารถเขียนใหม่ได้เพื่อวัดช่องว่างพลังงานระหว่างสองระดับอิเล็กตรอน

พลังงานที่ลดลงมากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้จะสร้างเส้นความถี่สูงสุดในสเปกตรัม การล้มที่ยิ่งใหญ่ที่สุดจะมาจากระดับอินฟินิตี้ถึงระดับที่ 1 (ความสำคัญของระดับอินฟินิตี้จะชัดเจนในภายหลัง)

แผนภาพต่อไปนี้จะแบ่งออกเป็นสองส่วน - โดยมีระดับพลังงานอยู่ด้านบนและด้านล่างเป็นสเปกตรัม

หากอิเล็กตรอนตกลงมาจากระดับ 6 การตกจะน้อยลงเล็กน้อย ดังนั้นความถี่จะลดลงเล็กน้อย (เนื่องจากขนาดของแผนภาพ มันเป็นไปไม่ได้ที่จะวาดการกระโดดทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับทุกระดับระหว่าง 7 ถึงอินฟินิตี้!)

. . . และในขณะที่คุณพยายามข้ามการข้ามไปยังระดับ 1 ที่เป็นไปได้อื่น ๆ คุณได้พิจารณาถึงซีรี่ส์ Lyman ทั้งหมดแล้ว ระยะห่างระหว่างเส้นในสเปกตรัมสะท้อนให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงของระยะห่างระหว่างระดับพลังงาน

หากคุณทำสิ่งเดียวกันเพื่อกระโดดลงไปที่ 2 ระดับ คุณจะจบลงด้วยประโยคในชุด Balmer ช่องว่างพลังงานเหล่านี้มีขนาดเล็กกว่าในซีรีส์ Lyman มาก ดังนั้นความถี่ที่ผลิตได้ก็ต่ำกว่ามากเช่นกัน

ซีรีส์ Paschen จะถูกสร้างขึ้นโดยการกระโดดลงไปที่ 3 ระดับ แต่แผนภาพจะยุ่งเหยิงมากถ้าฉันรวมสิ่งเหล่านี้ด้วย - ไม่ต้องพูดถึงซีรีย์อื่น ๆ ทั้งหมดด้วยการกระโดดลงไปที่ระดับ 4, 5- ระดับและอื่น ๆ

ความสำคัญของตัวเลขในสมการ Rydberg

NS1 และ n2 ในสมการ Rydberg เป็นเพียงระดับพลังงานที่ปลายทั้งสองของการกระโดดที่สร้างเส้นเฉพาะในสเปกตรัม

ตัวอย่างเช่น ในซีรีส์ Lyman n1 เสมอ 1 อิเล็กตรอนจะตกลงไปที่ระดับ 1 เพื่อผลิตเส้นในซีรีย์ Lyman สำหรับซีรี่ส์ Balmer n1 เป็น 2 เสมอ เพราะอิเลคตรอนตกลงสู่ระดับ 2

NS2 คือระดับที่กระโดดจาก เราได้กล่าวไปแล้วว่าเส้นสีแดงเกิดจากอิเล็กตรอนที่ตกจากระดับ 3 ไปเป็น 2 ระดับ ในกรณีนี้ n2 เท่ากับ 3

ความสำคัญของระดับอนันต์

ระดับอนันต์แสดงถึงพลังงานสูงสุดที่อิเล็กตรอนสามารถมีได้ในฐานะส่วนหนึ่งของอะตอมไฮโดรเจน จะเกิดอะไรขึ้นถ้าอิเล็กตรอนมีพลังงานเกินกว่านั้นแม้เพียงเล็กน้อย?

อิเล็กตรอนไม่ได้เป็นส่วนหนึ่งของอะตอมอีกต่อไป ระดับอินฟินิตี้แสดงถึงจุดที่ไอออไนเซชันของอะตอมเกิดขึ้นเพื่อสร้างไอออนที่มีประจุบวก

การใช้สเปกตรัมเพื่อหาพลังงานไอออไนเซชันของไฮโดรเจน

เมื่อไม่มีพลังงานเพิ่มเติมจะพบอิเล็กตรอนของไฮโดรเจนที่ระดับ 1 สิ่งนี้เรียกว่าสถานะพื้นดิน หากคุณจัดหาพลังงานเพียงพอที่จะเคลื่อนอิเล็กตรอนขึ้นไปถึงระดับอินฟินิตี้ แสดงว่าคุณได้ทำให้ไฮโดรเจนแตกตัวเป็นไอออนแล้ว

พลังงานไอออไนซ์ ต่ออิเล็กตรอน จึงเป็นการวัดระยะห่างระหว่างระดับ 1 ถึงระดับอนันต์ หากคุณมองย้อนกลับไปที่ไดอะแกรมสองสามภาพสุดท้าย คุณจะพบว่าการกระโดดของพลังงานนั้นสร้างขีดจำกัดของอนุกรมของซีรีส์ Lyman

บันทึก: จนถึงตอนนี้ เราได้พูดถึงพลังงานที่ปล่อยออกมาเมื่ออิเล็กตรอนตกจากที่สูงไปสู่ระดับที่ต่ำกว่า แน่นอนถ้าพลังงานจำนวนหนึ่งคือ การเผยแพร่ เมื่ออิเล็กตรอนตกจากระดับอนันต์ถึงระดับ 1 จะมีปริมาณเท่ากัน จำเป็น เพื่อผลักอิเล็กตรอนจากระดับ 1 ขึ้นไปถึงระดับอินฟินิตี้

หากคุณสามารถกำหนดความถี่ของลิมิตอนุกรม Lyman ได้ คุณสามารถใช้เพื่อคำนวณพลังงานที่จำเป็นในการย้ายอิเล็กตรอนในอะตอมหนึ่งจากระดับ 1 ไปสู่จุดที่เกิดการแตกตัวเป็นไอออนได้ จากนั้น คุณสามารถคำนวณพลังงานไอออไนเซชันต่อโมลของอะตอมได้

ปัญหาคือความถี่ของขีด จำกัด อนุกรมนั้นค่อนข้างยากที่จะหาอย่างแม่นยำจากสเปกตรัมเพราะเส้นนั้นอยู่ใกล้กันมากในบริเวณนั้นจนสเปกตรัมดูต่อเนื่อง

การหาความถี่ของการจำกัดอนุกรมแบบกราฟิก

ต่อไปนี้คือรายการความถี่ของเส้นที่เว้นระยะห่างกันมากที่สุดเจ็ดบรรทัดในซีรีส์ Lyman ร่วมกับความถี่ที่เพิ่มขึ้นเมื่อคุณเปลี่ยนจากบรรทัดหนึ่งไปอีกบรรทัดถัดไป

เมื่อเส้นชิดกันมากขึ้น ความถี่ที่เพิ่มขึ้นก็จะลดลงอย่างเห็นได้ชัด ที่ขีดจำกัดของอนุกรม ช่องว่างระหว่างบรรทัดจะเป็นศูนย์อย่างแท้จริง

นั่นหมายความว่า หากคุณต้องพลอตความถี่ที่เพิ่มขึ้นเทียบกับความถี่จริง คุณสามารถอนุมาน (ต่อ) เส้นโค้งจนถึงจุดที่การเพิ่มขึ้นกลายเป็นศูนย์ได้ นั่นจะเป็นความถี่ของขีด จำกัด ของซีรีส์

ที่จริงแล้ว คุณสามารถพล็อตกราฟสองกราฟจากข้อมูลในตารางด้านบนได้ ความถี่ ความแตกต่าง เกี่ยวข้องกับสองความถี่ ตัวอย่างเช่น ค่า 0.457 หาได้จากการเอา 2.467 ออกจาก 2.924 คุณควรพล็อตค่า 0.457 เทียบกับค่าใดในสองค่านี้

ไม่สำคัญหรอก ตราบใดที่คุณยังสม่ำเสมออยู่เสมอ - กล่าวอีกนัยหนึ่ง ตราบใดที่คุณ เสมอ พล็อตความแตกต่างกับตัวเลขที่สูงกว่าหรือต่ำกว่า ณ จุดที่คุณสนใจ (โดยที่ผลต่างกลายเป็นศูนย์) ตัวเลขความถี่ทั้งสองจะเหมือนกัน

ดังที่คุณจะเห็นจากกราฟด้านล่าง โดยการพล็อตเส้นโค้งที่เป็นไปได้ทั้งสองเส้นบนกราฟเดียวกัน จะทำให้ง่ายต่อการตัดสินใจอย่างแน่ชัดว่าจะสรุปเส้นโค้งอย่างไร เนื่องจากสิ่งเหล่านี้เป็นเส้นโค้ง มันจึงยากต่อการคาดการณ์มากกว่าถ้าเป็นเส้นตรง

ทั้งสองบรรทัดชี้ไปที่ขีดจำกัดอนุกรมที่ประมาณ 3.28 x 10 15 Hz

บันทึก: โปรดจำไว้ว่า 3.28 PHz เหมือนกับ 3.28 x 10 15 Hz คุณสามารถใช้สมการ Rydberg เพื่อคำนวณขีดจำกัดของอนุกรม Lyman เพื่อตรวจสอบตัวเลขนี้: n1 = 1 สำหรับซีรี่ส์ Lyman และ n2 = อินฟินิตี้สำหรับขีดจำกัดของซีรีส์ 1/(อนันต์) 2 = ศูนย์ ที่ให้ค่าความถี่ 3.29 x 10 15 Hz - กล่าวอีกนัยหนึ่งค่าทั้งสองตกลงภายใน 0.3%

ดังนั้น . . . ตอนนี้เราสามารถคำนวณพลังงานที่จำเป็นในการกำจัดอิเล็กตรอนตัวเดียวออกจากอะตอมไฮโดรเจน จำสมการจากข้างบนขึ้นไปบนหน้า:

เราสามารถหาช่องว่างพลังงานระหว่างสถานะพื้นกับจุดที่อิเล็กตรอนออกจากอะตอมได้โดยการแทนที่ค่าความถี่ที่เรามี และหาค่าคงที่ของพลังค์จากสมุดข้อมูล

ที่ให้พลังงานไอออไนซ์แก่คุณสำหรับอะตอมเดี่ยว ในการหาพลังงานไอออไนเซชันตามปกติ เราต้องคูณสิ่งนี้ด้วยจำนวนอะตอมในโมลของอะตอมไฮโดรเจน (ค่าคงที่อะโวกาโดร) แล้วหารด้วย 1,000 เพื่อแปลงเป็นกิโลจูล

บันทึก: เป็นการผิดที่จะยกสิ่งนี้ไปเป็นตัวเลขที่มีนัยสำคัญมากกว่า 3 ตัว ค่าความถี่ที่ได้จากกราฟเป็นเพียงค่าความถูกต้องเท่านั้น

ซึ่งเปรียบเทียบได้ดีกับค่าปกติของพลังงานไอออไนเซชันของไฮโดรเจนที่ 1312 kJ mol -1

คำถามเพื่อทดสอบความเข้าใจของคุณ

หากนี่เป็นคำถามชุดแรกของคุณ โปรดอ่านหน้าแนะนำตัวก่อนที่จะเริ่ม คุณจะต้องใช้ปุ่มย้อนกลับบนเบราว์เซอร์ของคุณเพื่อกลับมาที่นี่ในภายหลัง


Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) กล้องจุลทรรศน์

ตำแหน่งที่แม่นยำและลักษณะของปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลบางชนิดในเซลล์ที่มีชีวิตเป็นที่สนใจอย่างมากในหลาย ๆ ด้านของการวิจัยทางชีววิทยา แต่การสืบสวนมักถูกขัดขวางโดยความละเอียดที่จำกัดของเครื่องมือที่ใช้ในการตรวจสอบปรากฏการณ์เหล่านี้ กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบไวด์ฟิลด์แบบธรรมดาช่วยให้สามารถระบุตำแหน่งของโมเลกุลที่ติดฉลากเรืองแสงได้ภายในขีดจำกัดความละเอียดเชิงพื้นที่เชิงแสงที่กำหนดโดยเกณฑ์ Rayleigh ประมาณ 200 นาโนเมตร (0.2 ไมโครเมตร) อย่างไรก็ตาม เพื่อให้เข้าใจปฏิกิริยาทางกายภาพระหว่างพันธมิตรโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีวโมเลกุลทั่วไป ความใกล้ชิดสัมพัทธ์ของโมเลกุลจะต้องถูกกำหนดได้อย่างแม่นยำมากกว่าวิธีการถ่ายภาพด้วยแสงแบบดั้งเดิมที่จำกัดการเลี้ยวเบนที่อนุญาต เทคนิคของ การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (มักเรียกกันโดยตัวย่อ เฟรต) เมื่อนำไปใช้กับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง อนุญาตให้กำหนดวิธีการระหว่างสองโมเลกุลภายในหลายนาโนเมตร (ดูรูปที่ 1) ซึ่งเป็นระยะห่างที่ใกล้เพียงพอสำหรับปฏิกิริยาของโมเลกุลที่จะเกิดขึ้น

เทคนิคกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงโดยทั่วไปอาศัยการดูดกลืนโดยฟลูออโรฟอร์ของแสงที่ความยาวคลื่นหนึ่ง (การกระตุ้น) ตามด้วยการปล่อยฟลูออเรสเซนซ์ทุติยภูมิที่ความยาวคลื่นที่ยาวกว่า ความยาวคลื่นที่กระตุ้นและปล่อยมักจะแยกออกจากกันตั้งแต่สิบถึงหลายร้อยนาโนเมตร การติดฉลากส่วนประกอบเซลล์ เช่น นิวเคลียส ไมโตคอนเดรีย โครงร่างโครงร่าง อุปกรณ์ Golgi และเยื่อหุ้มเซลล์ ด้วยฟลูออโรฟอร์จำเพาะช่วยให้สามารถระบุตำแหน่งได้ภายในการเตรียมการตายตัวและการเตรียมการมีชีวิต โดยการติดฉลากโครงสร้างย่อยหลายเซลล์พร้อมกันด้วยฟลูออโรฟอร์แต่ละตัวที่มีสเปกตรัมการกระตุ้นและการปล่อยรังสีที่แยกจากกัน สามารถใช้ตัวกรองฟลูออเรสเซนซ์แบบพิเศษเพื่อตรวจสอบความใกล้เคียงของโมเลกุลที่ติดฉลากภายในเซลล์เดียวหรือส่วนเนื้อเยื่อ ด้วยเทคนิคนี้ โมเลกุลที่อยู่ชิดกันมากกว่าขีดจำกัดความละเอียดทางแสงดูเหมือนจะเกิดขึ้นพร้อมกัน และความใกล้ชิดเชิงพื้นที่ที่เห็นได้ชัดนี้บอกเป็นนัยว่าการเชื่อมโยงของโมเลกุลเป็นไปได้ อย่างไรก็ตาม ในกรณีส่วนใหญ่ ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่จำกัดการเลี้ยวเบนปกตินั้นไม่เพียงพอต่อการพิจารณาว่าปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุลทางชีวเคมีเกิดขึ้นจริงหรือไม่ การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงเป็นกระบวนการที่การถ่ายโอนพลังงานแบบไม่มีรังสีเกิดขึ้นจากสถานะฟลูออโรฟอร์ที่ตื่นเต้นไปยังโครโมฟอร์ที่สองในบริเวณใกล้เคียง เนื่องจากช่วงที่การถ่ายโอนพลังงานสามารถเกิดขึ้นได้จำกัดอยู่ที่ประมาณ 10 นาโนเมตร (100 อังสตรอม) และประสิทธิภาพการถ่ายโอนมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อระยะห่างระหว่างฟลูออโรฟอร์ การวัดการถ่ายโอนพลังงานด้วยเรโซแนนซ์จึงเป็นเครื่องมืออันมีค่าสำหรับการตรวจสอบปฏิกิริยาของโมเลกุล .

กลไกของการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงเกี่ยวข้องกับa ผู้บริจาค ฟลูออโรฟอร์ในสถานะอิเล็กทรอนิกส์ที่ตื่นเต้น ซึ่งอาจส่งพลังงานกระตุ้นไปยังบริเวณใกล้เคียง ตัวรับ โครโมฟอร์ในลักษณะที่ไม่แผ่รังสีผ่านอันตรกิริยาระหว่างไดโพลกับไดโพลระยะยาว ทฤษฎีที่สนับสนุนการถ่ายเทพลังงานมีพื้นฐานอยู่บนแนวคิดของการบำบัดฟลูออโรฟอร์ที่ตื่นเต้นเป็นไดโพลแบบสั่นที่สามารถรับการแลกเปลี่ยนพลังงานกับไดโพลที่สองที่มีความถี่เรโซแนนซ์ใกล้เคียงกัน ในเรื่องนี้ การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์จะคล้ายคลึงกับพฤติกรรมของออสซิลเลเตอร์คู่ เช่น ส้อมเสียงคู่หนึ่งสั่นที่ความถี่เดียวกัน ในทางตรงกันข้าม การถ่ายเทพลังงานรังสีจำเป็นต้องมีการปล่อยและการดูดกลับของโฟตอน และขึ้นอยู่กับขนาดทางกายภาพและคุณสมบัติทางแสงของชิ้นงานทดสอบ ตลอดจนรูปทรงของภาชนะและทางเดินของคลื่น ซึ่งแตกต่างจากกลไกการแผ่รังสี การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์สามารถให้ข้อมูลโครงสร้างจำนวนมากเกี่ยวกับคู่ผู้บริจาค-ผู้รับ

การถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์ไม่ไวต่อเปลือกตัวทำละลายโดยรอบของฟลูออโรฟอร์ และด้วยเหตุนี้ ทำให้เกิดข้อมูลระดับโมเลกุลที่ไม่ซ้ำกับที่เปิดเผยโดยเหตุการณ์ที่ขึ้นกับตัวทำละลาย เช่น การดับการเรืองแสง ปฏิกิริยาในสภาวะตื่นเต้น การคลายตัวของตัวทำละลาย หรือการวัดแบบแอนไอโซทรอปิก ผลกระทบของตัวทำละลายที่สำคัญต่อฟลูออโรฟอร์ที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์คือผลกระทบต่อสมบัติทางสเปกตรัมของผู้ให้และตัวรับ การถ่ายเทพลังงานที่ไม่แผ่รังสีจะเกิดขึ้นในระยะทางที่ไกลกว่าผลกระทบของตัวทำละลายระยะสั้นมาก และธรรมชาติของไดอิเล็กตริกขององค์ประกอบ (โมเลกุลของตัวทำละลายและโมเลกุลของโฮสต์) ที่อยู่ระหว่างฟลูออโรฟอร์ที่เกี่ยวข้องมีอิทธิพลน้อยมากต่อประสิทธิภาพของการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ ซึ่งขึ้นอยู่กับ ระยะห่างระหว่างผู้บริจาคและผู้รับฟลูออโรฟอร์

ปรากฏการณ์ของการถ่ายโอนพลังงานด้วยเรโซแนนซ์เรืองแสงไม่ได้อาศัยการปลดปล่อยโฟตอนเป็นสื่อกลาง และยิ่งกว่านั้น ไม่ต้องการแม้แต่โครโมฟอร์ของตัวรับที่จะเป็นฟลูออเรสเซนต์ด้วยซ้ำ อย่างไรก็ตาม ในการใช้งานส่วนใหญ่ ทั้งผู้บริจาคและผู้รับเป็นฟลูออเรสเซนต์ และการเกิดการถ่ายโอนพลังงานปรากฏขึ้นผ่านการดับการเรืองแสงของผู้บริจาคและการลดอายุการเรืองแสง ควบคู่ไปกับการเพิ่มขึ้นของการเปล่งแสงเรืองแสงของตัวรับด้วย ประสิทธิภาพของกระบวนการถ่ายเทพลังงานแตกต่างกันไปตามสัดส่วนกำลังไฟฟ้าที่หกแบบผกผันของระยะทางที่แยกโมเลกุลผู้ให้และตัวรับ ดังนั้น การวัด FRET จึงสามารถนำไปใช้ได้อย่างมีประสิทธิผล ไม้บรรทัดโมเลกุล สำหรับกำหนดระยะทางระหว่างสารชีวโมเลกุลที่ติดฉลากด้วยฟลูออโรโครมผู้ให้และตัวรับที่เหมาะสมเมื่ออยู่ภายในระยะ 10 นาโนเมตรจากกันและกัน

ตัวอย่างสมมุติฐานของการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรโซแนนซ์เรืองแสงระหว่างฟลูออโรโครมสองตัวที่ติดอยู่กับปลายด้านตรงข้ามของโปรตีนโมเลกุลขนาดใหญ่เดียวกันแสดงไว้ในรูปที่ 1 ในรูปแบบดั้งเดิม (รูปที่ 1 (a)) ฟลูออโรฟอร์ทั้งสองจะถูกคั่นด้วยระยะห่างประมาณ 12 นาโนเมตร ไกลเกินไปสำหรับการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ภายในโมเลกุลระหว่างฟลูออโรโครมที่จะเกิดขึ้น อย่างไรก็ตาม เมื่อโปรตีนถูกกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง (รูปที่ 1(b)) ฟลูออโรโครมทั้งสองจะถูกนำเข้ามาใกล้กันมากขึ้น และตอนนี้สามารถมีส่วนร่วมในปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุลของ FRET ในรูป การกระตุ้นของฟลูออโรโครมผู้บริจาคจะแสดงด้วยแสงสีน้ำเงินรอบๆ โมเลกุลอะโรมาติกไตรนิวเคลียร์สีเหลือง ในขณะที่การปล่อยตัวรับที่สอดคล้องกัน (รูปที่ 1(b)) จะแสดงด้วยแสงสีเขียวรอบๆ ฟลูออโรโครมเฮเทอโรไซคลิกที่สองทางด้านขวา - ด้านมือของโปรตีน การวัดการถ่ายเทพลังงานมักใช้เพื่อประมาณระยะห่างระหว่างไซต์กับโมเลกุลขนาดใหญ่และผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างต่อระยะทางเหล่านี้ ในการทดลองประเภทนี้ ระดับการถ่ายเทพลังงานจะใช้ในการคำนวณระยะห่างระหว่างผู้ให้และตัวรับ และรับข้อมูลโครงสร้างเกี่ยวกับโมเลกุลขนาดใหญ่

แม้ว่าการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงมักถูกใช้เพื่อตรวจสอบการดัดแปลงโครงสร้างและการทำงานของโมเลกุลและภายในโมเลกุลในโปรตีนและไขมัน อุปสรรคสำคัญในการนำเทคนิคกล้องจุลทรรศน์ FRET ไปใช้ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตก็คือการขาดวิธีการที่เหมาะสมในการติดฉลากโปรตีนภายในเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงด้วยฟลูออโรฟอร์ที่เหมาะสม . การโคลนแมงกะพรุน โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) และการแสดงออกของมันในเซลล์หลากหลายชนิดได้กลายเป็นกุญแจสำคัญในการพัฒนาเครื่องหมายสำหรับการแสดงออกของยีนและการแปลโปรตีนเชิงโครงสร้างในเซลล์ที่มีชีวิต มีการพัฒนาแวเรียนต์การกลายพันธุ์ที่แตกต่างกันทางสเปกตรัมหลายอย่าง ซึ่งรวมถึงโปรตีนเรืองแสงที่ปล่อยแสงสีน้ำเงิน (โปรตีนเรืองแสงสีฟ้า, BFP). ทั้งสเปกตรัมกระตุ้นและการปล่อยของ GFP และ BFP กลายพันธุ์นั้นแยกจากกันอย่างเพียงพอในความยาวคลื่นเพื่อให้เข้ากันได้กับแนวทาง FRET รูปที่ 2 แสดงตัวอย่างกลยุทธ์สำหรับการตรวจหาปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนโดยใช้การถ่ายโอนพลังงานด้วยเรโซแนนซ์เรืองแสงและโปรตีนฟลูออเรสเซนต์ชนิดกลายพันธุ์ หากโปรตีนสองชนิด ตัวหนึ่งติดฉลากด้วย BFP (ผู้ให้) และอีกตัวหนึ่งมี GFP (ตัวรับ) โต้ตอบกันทางกายภาพ จากนั้นความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นที่ระดับการปล่อยสูงสุดของตัวรับ (510 นาโนเมตร) จะถูกสังเกตเมื่อสารเชิงซ้อนตื่นเต้นที่ความยาวคลื่นการดูดกลืนแสงสูงสุด (380 นาโนเมตร) ของผู้บริจาค ความล้มเหลวของโปรตีนในการสร้างสารเชิงซ้อนส่งผลให้เกิดการเปล่งแสงเรืองแสงที่ไม่มีตัวรับ (GFP)

ควบคู่ไปกับความก้าวหน้าในเลเซอร์พัลซิ่ง เลนส์กล้องจุลทรรศน์ และเทคโนโลยีการถ่ายภาพด้วยคอมพิวเตอร์ การพัฒนาเทคนิคการติดฉลากซึ่งฟลูออโรฟอร์ผู้บริจาคและผู้รับเป็นส่วนหนึ่งของโมเลกุลชีวภาพเองได้ทำให้เกิดภาพปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนแบบไดนามิกภายในเซลล์ที่มีชีวิต นอกเหนือจากการตรวจสอบปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนแล้ว การใช้งานล่าสุดของการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงยังรวมถึงการศึกษากิจกรรมโปรตีเอส การเปลี่ยนแปลงศักย์ไฟฟ้าของเมมเบรน เมแทบอลิซึมของแคลเซียม และการนำการทดสอบการคัดกรองปริมาณงานสูง เช่น การหาปริมาณการแสดงออกของยีนใน เซลล์ที่มีชีวิตเดียว

หลักการของการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง

กระบวนการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์ (RET) สามารถเกิดขึ้นได้เมื่อฟลูออโรฟอร์ผู้บริจาคในสถานะตื่นเต้นทางอิเล็กทรอนิกส์ถ่ายโอนพลังงานกระตุ้นไปยังโครโมฟอร์ใกล้เคียง ซึ่งเป็นตัวรับ โดยหลักการแล้ว หากสเปกตรัมการเปล่งแสงเรืองแสงของโมเลกุลผู้บริจาคคาบเกี่ยวกับสเปกตรัมการดูดกลืนของโมเลกุลตัวรับ และทั้งสองอยู่ภายในรัศมีเชิงพื้นที่ที่น้อยที่สุด ผู้บริจาคสามารถถ่ายโอนพลังงานกระตุ้นโดยตรงไปยังตัวรับผ่านระหว่างโมเลกุลไดโพล-ไดโพลระยะยาว การมีเพศสัมพันธ์ ทฤษฎีที่เสนอโดยธีโอดอร์ เฟิร์สเตอร์ในช่วงปลายทศวรรษ 1940 เบื้องต้นได้อธิบายปฏิสัมพันธ์ของโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ และฟอร์สเตอร์ยังได้พัฒนาสมการที่เป็นทางการซึ่งกำหนดความสัมพันธ์ระหว่างอัตราการถ่ายโอน ระยะห่างระหว่างโครโมฟอร์ และคุณสมบัติทางสเปกตรัมของโครโมฟอร์ที่เกี่ยวข้อง

การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เป็นกระบวนการทางกลของควอนตัมที่ไม่แผ่รังสีซึ่งไม่จำเป็นต้องเกิดการชนกันและไม่เกี่ยวข้องกับการผลิตความร้อน เมื่อเกิดการถ่ายเทพลังงาน โมเลกุลตัวรับจะดับการเรืองแสงของโมเลกุลผู้ให้ และถ้าตัวรับเป็นฟลูออโรโครมเอง จะเพิ่มขึ้นหรือ แพ้ง่าย สังเกตการแผ่รังสีเรืองแสง (ดูรูปที่ 3)ปรากฏการณ์นี้สามารถสังเกตได้โดยตัวอย่างที่น่าตื่นเต้นซึ่งมีทั้งโมเลกุลผู้ให้และตัวรับที่มีแสงของความยาวคลื่นที่สัมพันธ์กับการดูดกลืนสูงสุดของฟลูออโรฟอร์ผู้ให้ และการตรวจจับแสงที่ปล่อยออกมาที่ความยาวคลื่นที่อยู่ตรงกลางใกล้กับค่าสูงสุดของการแผ่รังสีของตัวรับ วิธีการตรวจหาทางเลือกที่ได้รับความนิยมเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วคือการวัดอายุการเรืองแสงของผู้ให้ฟลูออโรฟอร์ทั้งที่มีและไม่มีตัวรับ

นำเสนอในรูปที่ 3 เป็นไดอะแกรม Jablonski ที่แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องระหว่างการปล่อยผู้บริจาคและการดูดซับของตัวรับในการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง การเปลี่ยนการดูดกลืนและการปล่อยก๊าซจะแสดงด้วยลูกศรแนวตั้งตรง (สีเขียวและสีแดงตามลำดับ) ในขณะที่การคลายตัวของแรงสั่นสะเทือนจะแสดงด้วยลูกศรสีเหลืองเป็นคลื่น ทรานซิชันที่จับคู่กันจะถูกวาดด้วยเส้นประที่แนะนำตำแหน่งที่ถูกต้องในไดอะแกรม Jablonski หากเกิดขึ้นจากทรานสิชันอิเล็กทรอนิกส์ที่อาศัยโฟตอน ในการปรากฏตัวของตัวรับที่เหมาะสม ฟลูออโรฟอร์ผู้ให้สามารถถ่ายโอนพลังงานสถานะตื่นเต้นโดยตรงไปยังตัวรับโดยไม่ปล่อยโฟตอน (แสดงโดยลูกศรสีน้ำเงินในรูปที่ 3) ผลลัพธ์ของการเปล่งแสงเรืองแสงไวนั้นมีลักษณะคล้ายคลึงกับสเปกตรัมการแผ่รังสีของตัวรับ

ต้องเป็นไปตามเกณฑ์หลายประการเพื่อให้การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เกิดขึ้น นอกเหนือจากสเปกตรัมการแผ่รังสีและการดูดซึมที่ทับซ้อนกันของโมเลกุลผู้บริจาคและตัวรับแล้ว ฟลูออโรฟอร์ที่เกี่ยวข้องทั้งสองต้องอยู่ในตำแหน่งภายในช่วง 1 ถึง 10 นาโนเมตรของกันและกัน ตามที่อธิบายไว้ในสมการที่ได้จากFörster (และอธิบายไว้ด้านล่าง) ประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงานระหว่างโมเลกุลผู้ให้และตัวรับจะลดลงเมื่อกำลังที่หกของระยะทางที่แยกทั้งสองออกจากกัน ดังนั้น ความสามารถของฟลูออโรฟอร์ผู้บริจาคในการถ่ายโอนพลังงานกระตุ้นไปยังตัวรับโดยปฏิกิริยาที่ไม่ใช่การแผ่รังสีลดลงอย่างรวดเร็วเมื่อระยะห่างระหว่างโมเลกุลเพิ่มขึ้น ซึ่งจำกัดปรากฏการณ์ FRET ไว้ที่รัศมีการแยกตัวรับและตัวรับสูงสุดประมาณ 10 นาโนเมตร ที่ระยะทางน้อยกว่า 1 นาโนเมตร สามารถใช้โหมดอื่นๆ ของพลังงานและ/หรือการถ่ายโอนอิเล็กตรอนได้ การพึ่งพาระยะทางของกระบวนการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์เป็นพื้นฐานเบื้องต้นสำหรับการใช้ประโยชน์ในการตรวจสอบปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุล ในการศึกษาเซลล์ที่มีชีวิตซึ่งเกี่ยวข้องกับโมเลกุลที่ติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์ของผู้บริจาคและตัวรับ การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์จะเกิดขึ้นระหว่างโมเลกุลที่อยู่ใกล้กันมากพอที่จะโต้ตอบกันทางชีววิทยาเท่านั้น

ข้อกำหนดเพิ่มเติมสำหรับการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์คืออายุการใช้งานการเรืองแสงของโมเลกุลผู้ให้ต้องมีระยะเวลาเพียงพอเพื่อให้เกิดเหตุการณ์ขึ้น ทั้งอัตรา (เค(ที)) และประสิทธิภาพ (อี(ที)) ของการถ่ายโอนพลังงานเกี่ยวข้องโดยตรงกับอายุของผู้บริจาคฟลูออโรฟอร์ทั้งที่มีและไม่มีตัวรับ ตามทฤษฎีของFörsterและได้รับการยืนยันจากการทดลอง อัตราการถ่ายโอนพลังงานถูกกำหนดโดยสมการ:

ที่ไหน อาร์(0) คือ ระยะวิกฤตข้างหน้า, τ(ด) คืออายุผู้บริจาคในกรณีที่ไม่มีผู้รับและ NS คือระยะห่างระหว่างโครโมฟอร์ผู้ให้และผู้รับ ระยะวิกฤต Forster (อาร์(0)) ถูกกำหนดให้เป็นรัศมีการแยกตัวรับ - ผู้บริจาคซึ่งอัตราการถ่ายโอนเท่ากับอัตราการสลายตัวของผู้บริจาค (de-excitation) ในกรณีที่ไม่มีตัวรับ กล่าวอีกนัยหนึ่งเมื่อรัศมีผู้บริจาคและผู้รับ (NS) เท่ากับระยะทางFörster จากนั้นประสิทธิภาพการถ่ายโอนคือ 50 เปอร์เซ็นต์ ที่รัศมีการแยกนี้ ครึ่งหนึ่งของพลังงานกระตุ้นของผู้บริจาคจะถูกถ่ายโอนไปยังตัวรับผ่านการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ ในขณะที่อีกครึ่งหนึ่งจะกระจายไปตามกระบวนการอื่นๆ ที่มีอยู่ทั้งหมด รวมทั้งการแผ่รังสีเรืองแสง

ตามแนวคิด ระยะวิกฤตของFörsterคือความยาวการแยกสูงสุดระหว่างโมเลกุลผู้ให้และตัวรับซึ่งการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์จะยังคงเกิดขึ้น ค่าระยะทางวิกฤตมักจะอยู่ในช่วง 2 ถึง 6 นาโนเมตร ซึ่งบังเอิญอยู่ในลำดับของมิติโมเลกุลโปรตีนหลายขนาด นอกจากนี้ ช่วงระยะห่างวิกฤตยังสอดคล้องกับมิติที่มีนัยสำคัญทางชีวภาพอื่นๆ เช่น ความหนาของเยื่อหุ้มเซลล์และตำแหน่งแยกระยะห่างบนโปรตีนที่มีหน่วยย่อยหลายหน่วย คุณค่าของ อาร์(0) (เป็นนาโนเมตร) อาจคำนวณได้จากนิพจน์ต่อไปนี้:

ซึ่งใน κ-กำลังสอง เป็นปัจจัยที่อธิบายการวางแนวสัมพัทธ์ในช่องว่างระหว่างไดโพลการเปลี่ยนแปลงของผู้บริจาคและผู้รับ เจ(λ) เป็นอินทิกรัลทับซ้อนในบริเวณสเปกตรัมการดูดกลืนของผู้บริจาคและสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของตัวรับ (โดยมีความยาวคลื่นแสดงเป็นนาโนเมตร) η แทนดัชนีการหักเหของแสงของตัวกลาง และ ถาม (D) คือผลผลิตควอนตัมของผู้บริจาค

ประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงาน อี(ที), คือการวัดเศษส่วนของโฟตอนที่ดูดซับโดยผู้บริจาคที่ถ่ายโอนไปยังตัวรับ และสัมพันธ์กับระยะการแยกตัวรับและตัวรับ NSโดยสมการ:

และ อี(ที) ได้รับการประเมินเป็น:

ที่ไหน τ(ดา) คืออายุของผู้บริจาคต่อหน้าผู้รับและ τ(ด) คืออายุผู้บริจาคในกรณีที่ไม่มีผู้รับ ดังนั้นโดยการวัดอายุการเรืองแสงของผู้บริจาคโดยมีและไม่มีตัวรับ (ซึ่งบ่งชี้ถึงขอบเขตของการดับผู้บริจาคเนื่องจากตัวรับ) จึงสามารถกำหนดระยะห่างระหว่างผู้บริจาคและโมเลกุลของตัวรับได้ ในเทคนิคต่างๆ ที่ใช้กันทั่วไป ประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงานถูกกำหนดโดยการวัดสภาวะคงตัวของความเข้มแสงเรืองแสงเฉลี่ยของผู้ให้สัมพัทธ์ในการมีอยู่และไม่มีตัวรับ (ไม่ใช่โดยการวัดอายุขัย)

โดยสรุป อัตราการถ่ายโอนพลังงานขึ้นอยู่กับขอบเขตของสเปกตรัมคาบเกี่ยวกันระหว่างสเปกตรัมการดูดกลืนของผู้บริจาคและสเปกตรัมการดูดกลืนของตัวรับ (ดูรูปที่ 4) ผลผลิตควอนตัมของผู้บริจาค การวางแนวสัมพัทธ์ของโมเมนต์ไดโพลการเปลี่ยนแปลงของผู้บริจาคและผู้รับ และ ระยะห่างระหว่างโมเลกุลผู้ให้และตัวรับ เหตุการณ์หรือกระบวนการใดๆ ที่ส่งผลต่อระยะห่างระหว่างผู้บริจาคและผู้รับจะส่งผลต่ออัตราการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์ ซึ่งจะทำให้ปรากฏการณ์นั้นสามารถหาปริมาณได้ โดยที่สิ่งประดิษฐ์นั้นสามารถควบคุมหรือกำจัดได้

นำเสนอในรูปที่ 4 คือสเปกตรัมการดูดกลืนและการปล่อยของโปรตีนเรืองแสงสีฟ้า (CFPผู้บริจาค) และโปรตีนเรืองแสงสีแดง (RFP หรือ DsRedตัวรับ) เมื่อเทียบกับศักยภาพของการประยุกต์ใช้เป็นคู่ถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรโซแนนซ์ สเปกตรัมการดูดกลืนสำหรับเปปไทด์ชีวภาพทั้งสองจะแสดงเป็นเส้นโค้งสีแดง ในขณะที่สเปกตรัมการแผ่รังสีจะแสดงเป็นเส้นโค้งสีน้ำเงิน บริเวณที่ทับซ้อนกันระหว่างสเปกตรัมการปล่อยผู้บริจาคและสเปกตรัมการดูดกลืนของตัวรับจะแสดงด้วยพื้นที่สีเทาใกล้กับฐานของเส้นโค้ง เมื่อใดก็ตามที่สเปกตรัมคาบเกี่ยวกันของโมเลกุลเพิ่มขึ้นมากเกินไป ปรากฏการณ์ที่เรียกว่า เลือดออกทางสเปกตรัม หรือ ครอสโอเวอร์ เกิดขึ้นโดยที่สัญญาณจากตัวรับที่ตื่นเต้น (เกิดจากการให้แสงสว่างจากการกระตุ้นของผู้บริจาค) และการตรวจจับการปล่อยผู้บริจาคในช่องสัญญาณการปล่อยตัวรับ ผลที่ได้คือสัญญาณพื้นหลังที่สูงซึ่งต้องถูกดึงออกมาจากการแผ่รังสีของตัวรับแสงที่อ่อนแอ

ทฤษฎีพื้นฐานของการถ่ายโอนพลังงานที่ไม่ใช่การแผ่รังสีใช้โดยตรงกับคู่ผู้บริจาค-ผู้รับที่คั่นด้วยระยะทางคงที่ ซึ่งในกรณีนี้ อัตราการถ่ายโอนพลังงานจะเป็นฟังก์ชันของระยะทางFörster อาร์(0)ซึ่งจะขึ้นอยู่กับ κ-กำลังสอง เจ(λ), η, และ ถาม (D). หากทราบปัจจัยเหล่านี้ ระยะห่างระหว่างผู้บริจาคและผู้รับสามารถคำนวณได้ ต้องใช้สูตรที่ซับซ้อนมากขึ้นในการอธิบายสถานการณ์ต่างๆ เช่น โครโมฟอร์ตัวรับหลายตัวและการกระจายระยะทาง แสดงในตารางที่ 1 เป็นชุดของระยะทางวิกฤตของFörsterที่วัดโดยการทดลอง ซึ่งตรวจสอบได้จากสเปกตรัมคาบเกี่ยวกันของคู่ฟลูออโรฟอร์ที่รับบริจาคซึ่งเป็นที่นิยมหลายคู่ เนื่องจากตัวแปรรวมถึงผลผลิตควอนตัมของผู้บริจาคและระดับของสเปกตรัมคาบเกี่ยวกัน ซึ่งทั้งสองอย่างนี้ขึ้นอยู่กับสภาวะแวดล้อมที่มีการแปล ค่าระยะทางFörsterควรถูกกำหนดภายใต้เงื่อนไขการทดลองที่เหมือนกันกับที่ใช้เพื่อตรวจสอบการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์

โดยทั่วไปแล้วจะทราบดัชนีการหักเหของแสงของตัวกลางสำหรับถ่ายเทพลังงานจากองค์ประกอบตัวทำละลาย หรือสามารถประมาณค่าได้สำหรับโมเลกุลขนาดใหญ่ที่เฉพาะ และโดยทั่วไปแล้วจะอยู่ที่ 1.4 ในสารละลายที่เป็นน้ำ ผลผลิตควอนตัมของผู้บริจาคถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบกับฟลูออโรฟอร์มาตรฐานที่มีผลผลิตควอนตัมที่ทราบ เพราะ ถาม (D) ปรากฏเป็นรากที่หกในการคำนวณของ อาร์(0)ข้อผิดพลาดเล็กน้อยหรือความไม่แน่นอนในมูลค่าของ ถาม (D) ไม่มีผลกระทบอย่างมากต่อการคำนวณระยะทางของFörster นอกจากนี้เนื่องจากการพึ่งพารากที่หก อาร์(0) ไม่ได้รับผลกระทบมากนักจากความผันแปรใน เจ(λ)แต่ยังคงต้องประเมินอินทิกรัลทับซ้อนสำหรับคู่ผู้บริจาค-ผู้รับแต่ละคู่ โดยทั่วไป ระดับการเหลื่อมกันที่สูงขึ้นระหว่างสเปกตรัมการแผ่รังสีของผู้บริจาคและสเปกตรัมการดูดกลืนของตัวรับจะทำให้ค่าระยะวิกฤตของ Forster มากขึ้น

Forster Critical Distance สำหรับคู่ผู้บริจาคและผู้รับ RET ทั่วไป
ผู้บริจาค ตัวรับ Forster ระยะทาง (นาโนเมตร)
ทริปโตเฟน แดนซิล 2.1
เอเอดานส์ (1) ป.ป.ช. (2) 2.5 - 2.9
BFP DsRFP 3.1 - 3.3
แดนซิล FITC 3.3 - 4.1
แดนซิล Octadecylrhodamine 4.3
CFP GFP 4.7 - 4.9
ซีเอฟ (3) เท็กซัส เรด 5.1
Fluorescein เตตระเมทิลโรดามีน 4.9 - 5.5
Cy3 Cy5 >5.0
GFP YFP 5.5 - 5.7
ชั้นบอดี้ (4) ชั้นบอดี้ (4) 5.7
โรดามีน 6G มาลาไคต์ กรีน 6.1
FITC อีโอซิน ไธโอเซมิคาร์บาไซด์ 6.1 - 6.4
บี-ไฟโคอีริทริน Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 >8.0

(1) 5-(2-ไอโอโดอะเซทิลอะมิโนเอทิล)อะมิโนแนพทาลีน-1-กรดซัลโฟนิก
(2) N-(4-ไดเมทิลอะมิโน-3,5-ไดไนโตรฟีนิล)มาเลอิไมด์
(3) คาร์บอกซีฟลูออเรสซีน ซัคซินิมิดิล เอสเตอร์
(4) 4,4-ไดฟลูออโร-4-โบรา-3a,4a-ไดซา-เอส-อินดาซีน

ตารางที่ 1

ความไม่แน่นอนในการประเมินปัจจัยการวางแนว (κ-squared) ได้รับการกล่าวถึงอย่างกว้างขวางในวรรณคดี และทั้งๆ ที่มีหลักฐานการทดลองว่าทฤษฎีFörsterถูกต้องและใช้ได้กับการวัดระยะทาง ตัวแปรนี้ยังคงมีข้อโต้แย้งอยู่บ้าง สิ่งสำคัญคือต้องตระหนักว่า ระยะทางFörster มักจะได้รับสำหรับค่าสมมติของ κ-squared โดยทั่วไปแล้วค่าเฉลี่ยแบบไดนามิกที่ 2/3 (0.67) ค่าสมมตินี้เป็นผลมาจากการสุ่มตัวอย่างของผู้บริจาคและการวางแนวตัวรับโดยการกระจายแบบหมุนก่อนที่จะถ่ายโอนพลังงาน ปัจจัยการวางแนวขึ้นอยู่กับทิศทางสัมพัทธ์ในช่องว่างของไดโพลการปล่อยผู้บริจาคและไดโพลการดูดกลืนของตัวรับ และสามารถอยู่ในช่วงตั้งแต่ศูนย์ถึง 4 ค่า 1 สอดคล้องกับไดโพลการเปลี่ยนแปลงแบบขนาน ในขณะที่ค่า 4 เป็นผลมาจากไดโพลที่มีทั้งคู่ ขนานและ collinear

เนื่องจากความสัมพันธ์ของรากที่หกกับระยะทางFörster ความผันแปรในปัจจัยการวางแนวจาก 1 ถึง 4 ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเพียง 26 เปอร์เซ็นต์ในระยะทางที่คำนวณได้ และข้อผิดพลาดสูงสุด 35 เปอร์เซ็นต์จึงเป็นไปได้เมื่อค่าสมมติปกติที่ 0.67 คือ สมัครแล้ว. ข้อผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นอย่างร้ายแรงที่สุดจะส่งผลให้เกิดหากไดโพลถูกจัดวางในแนวตั้งฉากซึ่งกันและกันและสอดคล้องกัน κ-ค่ากำลังสองจะกลายเป็นศูนย์ มีการใช้เทคนิคหลายอย่างในการจัดการกับความไม่แน่นอน รวมถึงการสันนิษฐานว่ามีการกำหนดทิศทางแบบคงที่ช่วงหนึ่งและไม่เปลี่ยนแปลงในช่วงอายุของสภาวะตื่นเต้นของฟลูออโรฟอร์ การวัดค่าแอนไอโซโทรปีเรืองแสงสำหรับผู้ให้และตัวรับสามารถอนุญาตให้กำหนดขีดจำกัดสำหรับ κ- รูปแบบสี่เหลี่ยมจัตุรัส นอกจากนี้ การใช้ฟลูออโรฟอร์ที่มีโพลาไรซ์การเรืองแสงต่ำ (เนื่องจากการแผ่รังสีจากการเปลี่ยนภาพซ้อนทับกันหลายครั้ง) จะช่วยลดความไม่แน่นอนในปัจจัยการวางแนว ข้อจำกัดของค่าที่เป็นไปได้ของ κ-squared ในลักษณะนี้ช่วยลดข้อผิดพลาดในการคำนวณระยะทางที่อาจเกิดขึ้นได้ถึง 10 เปอร์เซ็นต์

ในหลายกรณี ปัจจัยการปฐมนิเทศเป็นเรื่องยาก หากไม่เป็นไปไม่ได้ ในการกำหนดและค่าที่แน่นอนของตัวแปรมักถูกมองว่าเป็นปัญหาที่ผ่านไม่ได้ อย่างไรก็ตาม หลักฐานบางอย่างบ่งชี้ถึงข้อจำกัดของความสำคัญของปัจจัยในการคำนวณการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์ การเปรียบเทียบระยะทางของผู้บริจาคและตัวรับโดยใช้เรโซแนนซ์เรโซแนนซ์พลังงานถ่ายโอนสเปกโตรสโคปีและเทคนิคการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ส่วนใหญ่สนับสนุนความถูกต้องของการสมมติค่า 0.67 สำหรับปัจจัย (ตามที่เสนอโดยทฤษฎีเฟิร์สเตอร์) อย่างน้อยสำหรับเปปไทด์และโปรตีนขนาดเล็ก มีความไม่แน่นอนมากขึ้นสำหรับโปรตีนที่ใหญ่กว่า การใช้ค่านี้สำหรับปัจจัยการวางแนวนั้นใช้ได้ภายใต้สมมติฐานที่ว่าทั้งโพรบผู้ให้และตัวรับมีอิสระที่จะรับการเคลื่อนที่แบบไอโซโทรปิกที่ไม่จำกัด การให้เหตุผลเพิ่มเติมได้จากหลักฐานการทดลองที่ว่าสำหรับฟลูออโรฟอร์ที่ถูกยึดติดด้วยพันธะเดี่ยวหรือพันธะคู่กับโมเลกุลขนาดใหญ่ การเคลื่อนที่แบบแบ่งส่วนของผู้ให้และตัวรับมีแนวโน้มที่จะส่งผลให้เกิดการวางแนวแบบสุ่มแบบไดนามิก

สำหรับฟลูออโรโครมที่มีพันธะหลวมๆ การเคลื่อนที่แบบหมุนอิสระรอบพันธะเดี่ยวควรเปิดใช้งานค่าการวางแนวเฉลี่ย แต่การเคลื่อนที่แบบไม่จำกัดของโมเลกุลที่ถูกผูกไว้ผ่านจุดเชื่อมโยงหลายจุดอาจไม่เกิดขึ้น ในทางกลับกัน ค่าสุดขีดของศูนย์และ 4 สำหรับ κ-กำลังสองต้องการโพลาไรซ์เรืองแสงที่สมบูรณ์ของผู้บริจาคและผู้รับ ซึ่งเป็นเงื่อนไขที่ไม่น่าจะเกิดขึ้นได้ การคำนวณทางสถิติถูกนำเสนอโดยผู้วิจัยบางคนที่โต้แย้งระยะการกระจายตัวผู้บริจาค-ผู้รับ และการวางแนวกำหนดระยะทางเฉลี่ยที่สังเกตได้ โดยมีเงื่อนไขว่าจะมีการกระจายตัวในระยะทางที่สังเกตได้ (และสิ่งนี้ไม่ได้ถูกจำกัดโดยผู้บริจาคและผู้รับที่ใกล้ชิดเกินไปเมื่อเทียบกับ อาร์(0)) สามารถหาระยะห่างเฉลี่ยระหว่างฟลูออโรฟอร์ได้อย่างน่าเชื่อถือและประเมินความไม่แน่นอนจากปัจจัยการวางแนว

การพึ่งพาปัจจัยการวางแนว (κ- กำลังสอง) บนทิศทางสัมพัทธ์ของไดโพลการปล่อยผู้บริจาคและไดโพลการดูดซับของตัวรับ (ดังแสดงในรูปที่ 5) ถูกกำหนดโดยสมการ:

2 = (cos θT - 3cos θDcos θA)2 = (บาป θD บาป θAcos Φ - 2cos θDcos θA)2

ที่ไหน θ(ท) คือมุมระหว่างไดโพลการเปลี่ยนการแผ่รังสีของผู้บริจาคและไดโพลการเปลี่ยนการดูดกลืนของตัวรับ θ(D) และ θ(A) คือมุมระหว่างไดโพลเหล่านี้กับเวกเตอร์ที่เชื่อมระหว่างผู้ให้และตัวรับ และ Φ คือมุมระหว่างระนาบที่มีไดโพลทรานซิชันสองไดโพล

ประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงานมีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงระยะทางมากที่สุดเมื่อความยาวการแยกตัวรับและตัวรับเข้าใกล้ระยะFörster (อาร์(0)) สำหรับทั้งสองโมเลกุล รูปที่ 6 แสดงความสัมพันธ์แบบทวีคูณระหว่างประสิทธิภาพการถ่ายโอนและระยะทางที่แยกผู้บริจาคและผู้รับ ประสิทธิภาพเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วถึง 100 เปอร์เซ็นต์เมื่อระยะการแยกลดลงด้านล่าง อาร์(0)และในทางกลับกัน ลดลงเป็นศูนย์เมื่อ NS มีค่ามากกว่า อาร์(0). เนื่องจากการพึ่งพาอาศัยกันอย่างมากของประสิทธิภาพการถ่ายโอนบนระยะทาง การวัดระยะการแยกระหว่างผู้บริจาค-ผู้รับจึงเชื่อถือได้ก็ต่อเมื่อรัศมีผู้ให้และตัวรับอยู่ภายในระยะFörster คูณสอง เมื่อไหร่ NS เป็นประมาณร้อยละ 50 ของ อาร์(0)ประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์อยู่ใกล้สูงสุดและระยะทางสั้นกว่านั้นไม่สามารถกำหนดได้อย่างน่าเชื่อถือ เมื่อระยะทางผู้บริจาคเกิน อาร์(0) ค่า 50 เปอร์เซ็นต์ ความชันของเส้นโค้งตื้นมากจนไม่สามารถระบุระยะห่างที่ยาวกว่าได้

ความสำคัญในทางปฏิบัติของการรู้ระยะทางวิกฤตของFörsterคือค่านี้เป็นแนวทางสำหรับระยะการแยกที่ FRET สามารถกำหนดได้สำหรับโพรบคู่หนึ่งที่ระบุ (ดูตารางที่ 1) เนื่องจากการวัดการถ่ายเทพลังงานมีความไวต่อความแปรผันของระยะทางมากเมื่อระยะทางของผู้บริจาค-ตัวรับอยู่ใกล้กับระยะทางของFörster ขนาดโดยประมาณของปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุลเป้าหมายจึงเป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดในการเลือกคู่สีย้อมเรืองแสง ปัจจัยอื่นๆ ที่ควรพิจารณา ขึ้นอยู่กับว่ากำลังดำเนินการวัดในสภาวะคงตัวหรือแบบระบุเวลาหรือไม่ รวมถึงความเสถียรทางเคมี ผลผลิตควอนตัม และอายุการใช้งานการสลายตัวของฟลูออโรฟอร์ เนื่องจากไม่มีการอ้างอิงระยะทางภายในสำหรับเทคนิคการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงทั่วไป ระยะทางที่คำนวณโดยการวัดประสิทธิภาพการถ่ายโอนจะสัมพันธ์กับระยะทางFörster ซึ่งได้มาจากข้อมูลทางสเปกโตรสโกปีที่วัดบนคู่ผู้บริจาค-ผู้รับ

ปรากฏการณ์ของการถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์โดยกลไกของฟอร์สเตอร์นั้นซับซ้อนในบางแง่มุม แต่ผลลัพธ์ที่เกิดขึ้นนั้นเรียบง่ายและเชื่อถือได้ ระยะทางของเฟิร์สเตอร์สามารถคาดการณ์ได้อย่างแม่นยำจากสมบัติทางสเปกตรัมของผู้ให้และผู้รับ และเนื่องจากยังไม่มีการระบุข้อยกเว้นสำหรับทฤษฎีนี้ การถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์สามารถสันนิษฐานได้ว่าจะเกิดขึ้นภายใต้สภาวะใดๆ ที่ทำให้คู่โมเลกุลของตัวรับ-ตัวรับอยู่ใกล้กัน ความซับซ้อนในทฤษฎีที่อธิบายการถ่ายโอนไดโพลเกิดขึ้น ไม่ใช่เพราะกลไกการถ่ายโอนเอง แต่เนื่องจากการเกิดการกระจายระยะทาง (รวมถึงการแจกแจงแบบไม่สุ่ม) และการแพร่กระจายของโมเลกุลผู้ให้และตัวรับ เมื่อทำตามขั้นตอนต่างๆ เพื่อหาค่าเฉลี่ยระยะห่างของการถ่ายเทพลังงานในช่วงของรูปทรงและกรอบเวลา FRET เป็นเทคนิคที่เชื่อถือได้สำหรับการศึกษาการกระจายเชิงพื้นที่ระหว่างโมเลกุลที่มีปฏิสัมพันธ์

การประยุกต์ใช้เทคนิค FRET ในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

พารามิเตอร์คอนฟิกูเรชันของกล้องจุลทรรศน์สำหรับการตรวจสอบการถ่ายโอนพลังงานด้วยเรโซแนนซ์เรืองแสงจะแตกต่างกันไปตามข้อกำหนดของฟลูออโรฟอร์ ชิ้นงานทดสอบ และโหมดการถ่ายภาพ แต่แทบทุกกล้องจุลทรรศน์แบบตั้งตรงหรือแบบกลับด้านสามารถติดตั้งเพิ่มเติมสำหรับกล้องจุลทรรศน์ FRET ได้ (ดูรูปที่ 7) โดยทั่วไป ไมโครสโคปควรติดตั้งระบบกล้อง CCD ที่มีการระบายความร้อนและเข้มข้นสูง (12 บิต) ควบคู่ไปกับตัวกรองสัญญาณรบกวนที่มีคุณภาพซึ่งมีระดับการรบกวนต่ำ (ระดับการบล็อกขั้นต่ำ) และบริเวณแบนด์พาสที่สัมพันธ์กับสเปกตรัมฟลูออโรฟอร์อย่างใกล้ชิด ความไวของเครื่องตรวจจับจะกำหนดว่าแบนด์วิดท์ของตัวกรองจะแคบเพียงใดและยังคงเปิดใช้งานการเก็บข้อมูลเพื่อดำเนินการที่ความเร็วที่ยอมรับได้โดยมีสัญญาณรบกวนจากสเปกตรัมที่ตกกระทบน้อยที่สุด ในกรณีส่วนใหญ่ ควรใช้กระจกไดโครมาติกเดี่ยวร่วมกับล้อหรือตัวเลื่อนฟิลเตอร์กระตุ้นและปล่อยแสง เพื่อให้ได้ภาพเพื่อลดหรือขจัดการเลื่อนของภาพ

กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบไวด์ฟิลด์ทนทุกข์ทรมานจากการปล่อยฟลูออโรฟอร์ที่เกิดขึ้นด้านบนและด้านล่างระนาบโฟกัสเพื่อให้ได้ภาพที่มีสัญญาณหลุดโฟกัสอย่างมาก ซึ่งจะช่วยลดคอนทราสต์และทำให้ภาพเสื่อมคุณภาพ ปัญหานี้รวมอยู่ในกล้องจุลทรรศน์ FRET เนื่องจากระดับสัญญาณต่ำโดยเนื้อแท้ที่เกิดจากการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ เทคนิคการถอดรหัสดิจิทัลสามารถใช้ร่วมกับการแบ่งส่วนแสงเพื่อลดหรือขจัดสัญญาณออกจากระนาบโฟกัส แต่กระบวนการนี้ต้องใช้การคำนวณอย่างเข้มข้นและอาจไม่เร็วพอสำหรับการทดลองสร้างภาพ FRET แบบไดนามิกจำนวนมาก เทคนิคการสแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอลสามารถใช้กับกล้องจุลทรรศน์ FRET เพื่อเพิ่มความละเอียดด้านข้างได้อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะเดียวกันก็ช่วยให้สามารถรวบรวมส่วนออปติคัลแบบอนุกรมในช่วงเวลาต่างๆ ที่ใกล้ถึงแบบเรียลไทม์ข้อเสียเปรียบที่สำคัญของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลคือการจำกัดความยาวคลื่นที่กระตุ้นกับเส้นเลเซอร์มาตรฐานที่มีให้สำหรับระบบเฉพาะ ซึ่งจำกัดการเลือกคู่ผู้ให้ฟลูออโรฟอร์และตัวรับในการทดลองการถ่ายโอนพลังงานด้วยเรโซแนนซ์ นอกจากนี้ยังสามารถใช้การกระตุ้นด้วยมัลติโฟตอนร่วมกับเทคนิค FRET และทำลายเซลล์น้อยลงเนื่องจากความยาวคลื่นของการกระตุ้นที่ยาวขึ้นที่เกี่ยวข้อง นอกจากนี้ สิ่งประดิษฐ์ออโตฟลูออเรสเซนส์และการฟอกสีด้วยแสงของชิ้นงานทดสอบมีโอกาสน้อยที่จะเกิดขึ้นภายในคุณลักษณะปริมาตรการกระตุ้นที่จำกัดของการกระตุ้นด้วยมัลติโฟตอน

โครงแบบกล้องจุลทรรศน์ทั่วไปที่สามารถสังเกตเซลล์ที่มีชีวิตในวัฒนธรรมด้วยรูปแบบการถ่ายภาพการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรโซแนนซ์หลายแบบได้แสดงไว้ในรูปที่ 7 กล้องจุลทรรศน์การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อกลับหัวมีหลอดไฟทังสเตน-ฮาโลเจนมาตรฐานบนเสาเพื่อตรวจสอบและบันทึกเซลล์ โดยใช้ช่องสว่างมาตรฐาน คอนทราสต์เฟส หรือคอนทราสต์การรบกวนส่วนต่าง (DIC) การส่องสว่าง โปรดทราบว่าสามารถใช้เทคนิคการเพิ่มคอนทราสต์สองแบบหลังร่วมกับการเรืองแสงเพื่อแสดงตำแหน่งเชิงพื้นที่ของฟลูออโรฟอร์ภายในสถาปัตยกรรมเซลลูลาร์ ระบบกล้อง CCD ที่ระบายความร้อนด้วย Peltier มาตรฐานติดอยู่กับหัวกล้องสามตาของกล้องจุลทรรศน์สำหรับการเรืองแสงในมุมกว้างและการจับภาพในที่สว่าง

การทดลองถ่ายเทพลังงานด้วยเรโซแนนซ์จะดำเนินการกับมัลติสเปกตรัมโดยใช้การส่องสว่างแบบมุมกว้าง (หลอดปล่อยอาร์ค) หรืออุปกรณ์แนบคอนโฟคอลการสแกนแบบเรียลไทม์ที่ติดตั้งระบบดิสก์ Nipkow ความเร็วสูง ขั้นแรก ลำแสงเลเซอร์อาร์กอน-คริปทอนจะถูกกรองผ่านอุปกรณ์ความยาวคลื่นที่ปรับคลื่นได้แบบอะคูสติกออปติก เพื่อเลือกความยาวคลื่นการกระตุ้นเฉพาะก่อนที่จะส่งผ่านไปยังหัวสแกนคอนโฟคอล ภาพจะถูกรวบรวมโดยใช้กล้อง CCD ที่มีการระบายความร้อนด้วยความละเอียดสูง Gen III สองตัวที่อ่านช่องสัญญาณแยกกันและจัดเก็บไว้ในคอมพิวเตอร์โฮสต์ การสแกนชิ้นงานทดสอบด้านข้าง (NS และ y) และแนวแกน (z) ระนาบช่วยให้สามารถรวบรวมส่วนออปติคัลสำหรับการสร้างภาพสามมิติขึ้นใหม่ โปรแกรมซอฟต์แวร์ประมวลผลภาพต่างๆ เข้ากันได้กับการกำหนดค่าไมโครสโคปที่แสดงไว้

ตามหลักการพื้นฐานของปรากฏการณ์ ควรพิจารณาจุดสำคัญทางปฏิบัติจำนวนหนึ่งเมื่อดำเนินการวัดการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัล:

  • ความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์ผู้ให้และตัวรับต้องได้รับการควบคุมอย่างใกล้ชิด ความน่าจะเป็นสูงสุดทางสถิติในการบรรลุการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงเกิดขึ้นเมื่อโมเลกุลตัวรับจำนวนหนึ่งล้อมรอบโมเลกุลผู้บริจาคเพียงตัวเดียว
  • การฟอกสีด้วยแสงจะต้องถูกกำจัดออกไป เนื่องจากสิ่งประดิษฐ์นี้สามารถเปลี่ยนแปลงอัตราส่วนโมเลกุลของผู้บริจาคต่อตัวรับ และด้วยเหตุนี้ ค่าที่วัดได้ของกระบวนการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์
  • สเปกตรัมการเปล่งแสงเรืองแสงของผู้บริจาคและสเปกตรัมการดูดกลืนของตัวรับควรมีพื้นที่คาบเกี่ยวกันอย่างมาก
  • ควรมีการกระตุ้นโดยตรงน้อยที่สุดของตัวรับในบริเวณความยาวคลื่นที่ใช้กระตุ้นผู้บริจาค สาเหตุของข้อผิดพลาดทั่วไปในการวัดด้วยกล้องจุลทรรศน์ FRET ในสภาวะคงตัวคือการตรวจจับการปล่อยผู้บริจาคด้วยชุดตัวกรองตัวรับ
  • ความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมาของทั้งผู้บริจาคและผู้รับต้องตรงกับช่วงความไวสูงสุดของเครื่องตรวจจับ
  • สเปกตรัมการดูดกลืนและการปล่อยของผู้บริจาคควรมีการเหลื่อมกันน้อยที่สุดเพื่อลดความเป็นไปได้ของการถ่ายโอนตัวเองจากผู้บริจาคสู่ผู้บริจาค
  • โมเลกุลของผู้บริจาคจะต้องเป็นฟลูออเรสเซนต์และมีอายุการใช้งานยาวนานเพียงพอจึงจะสามารถถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์ได้
  • ผู้บริจาคควรมีแอนไอโซโทรปีโพลาไรซ์ต่ำเพื่อลดความไม่แน่นอนในค่าของปัจจัยการวางแนว (-กำลังสอง) ข้อกำหนดนี้เป็นที่พอใจของผู้บริจาคซึ่งการปล่อยมลพิษเป็นผลมาจากการเปลี่ยนผ่านการกระตุ้นที่ทับซ้อนกันหลายครั้ง
  • เมื่อใช้เทคนิคการติดฉลากแอนติบอดี รีเอเจนต์ที่คอนจูเกตกับฟลูออโรโครมของผู้ให้และตัวรับไม่ควรเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมทางชีวภาพของพวกมัน กิจกรรมที่ลดลงจะส่งผลอย่างมากต่อความถูกต้องของการวัดการถ่ายโอนพลังงานด้วยเรโซแนนซ์
  • เนื่องจากการถ่ายโอนพลังงานด้วยเรโซแนนซ์เรืองแสงต้องการให้โมเลกุลของผู้บริจาคและตัวรับมีการจัดตำแหน่งไดโพลที่เหมาะสมและอยู่ในตำแหน่งภายใน 10 นาโนเมตรจากกันและกัน จึงต้องพิจารณาโครงสร้างระดับอุดมศึกษาของรีเอเจนต์ที่ติดโมเลกุลไว้ด้วย ตัวอย่างเช่น เมื่อโมเลกุลตัวรับ-ผู้บริจาคสามารถยึดติดกับตำแหน่งโครงสร้างที่แตกต่างกัน (เช่น ปลายคาร์บอกซีหรือปลายอะมิโน) บนโปรตีน เป็นไปได้ที่ FRET จะไม่ถูกสังเกตแม้ว่าโปรตีนจะมีปฏิสัมพันธ์กัน เนื่องจากโมเลกุลของผู้ให้และตัวรับ ตั้งอยู่บนปลายด้านตรงข้ามของโมเลกุลที่มีปฏิสัมพันธ์
  • เซลล์ที่มีชีวิตที่ติดฉลากด้วยการกลายพันธุ์ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียวสำหรับการตรวจสอบ FRET ควรได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เทคนิคอิมมูโนฮิสโตเคมีแบบดั้งเดิมเพื่อตรวจสอบว่าโปรตีนที่ติดแท็กใช้ที่อยู่อาศัยและคุณสมบัติภายในเซลล์เดียวกันกับเซลล์ต้นกำเนิด

เพื่อให้ปรากฏการณ์การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรโซแนนซ์เรืองแสงให้ข้อมูลที่มีความหมายเป็นเครื่องมือในกล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัล จะต้องปรับพารามิเตอร์การเตรียมตัวอย่างและการสร้างภาพให้เหมาะสมที่สุด การเลือกโพรบผู้บริจาคและตัวรับที่เหมาะสมและลักษณะการใช้งานเป็นฉลากระดับโมเลกุลถือเป็นความท้าทายที่สำคัญ นอกจากนี้ เมื่อมีการอธิบายกลยุทธ์การติดฉลากที่อนุญาตให้ถ่ายโอนพลังงานได้ชัดเจนแล้ว อาจใช้เทคนิคที่หลากหลายในการวัดด้วยตัวมันเอง การตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเชิงปริมาณส่วนใหญ่ดำเนินการโดยการวัดความเข้มของการปล่อยแสงเรืองแสง การตรวจจับ FRET ตามความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนต์โดยทั่วไปทำได้โดยการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในปริมาณสัมพัทธ์ของความเข้มของการปล่อยก๊าซที่ความยาวคลื่นสองช่วงที่สอดคล้องกับโครโมฟอร์ผู้ให้และตัวรับ เมื่อสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงเกิดขึ้น การปล่อยตัวรับเพิ่มขึ้น (ฉัน(เอ)) มาพร้อมกับการลดลงของการปล่อยผู้บริจาคพร้อมกัน (NS)) ความเข้ม

แม้ว่าการเปลี่ยนแปลงในความเข้มของการปล่อยก๊าซสัมพัทธ์ของผู้บริจาคหรือผู้รับสามารถนำมาเป็นตัวบ่งชี้การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ แนวทางปกติคือการใช้อัตราส่วนของทั้งสองค่า ฉัน(A)/ฉัน(D), เป็นหน่วยวัดของ FRET. ค่าของอัตราส่วนขึ้นอยู่กับระยะห่างเฉลี่ยระหว่างคู่ผู้บริจาค-ผู้รับ และไม่ไวต่อความแตกต่างในความยาวเส้นทางและปริมาตรที่ลำแสงอันน่าตื่นเต้นเข้าถึงได้ สภาวะของชิ้นงานทดสอบใดๆ ที่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในระยะห่างสัมพัทธ์ระหว่างคู่โมเลกุลทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในอัตราส่วนของการปล่อยผู้ให้และตัวรับ ดังนั้น FRET สามารถสังเกตได้ในกล้องจุลทรรศน์โดยการกระตุ้นพิเศษของฟลูออโรฟอร์ผู้บริจาคและการตรวจจับการปล่อยที่เพิ่มขึ้นของฟลูออโรฟอร์ตัวรับแบบมีปฏิสัมพันธ์ ควบคู่ไปกับการลดลงของการเรืองแสงของผู้บริจาคที่เกิดจากการดับเนื่องจากการถ่ายเทพลังงาน การวัด FRET โดยใช้วิธีการตรวจสอบความเข้มข้นเรียกว่า สภาวะคงตัว การถ่ายภาพถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์เรโซแนนซ์เรืองแสง

โพรบผู้บริจาคและตัวรับที่เหมาะสมจะถูกเลือกโดยพิจารณาจากลักษณะสเปกตรัมการดูดกลืนและการปล่อย สำหรับการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์สูงสุด สเปกตรัมการแผ่รังสีของผู้บริจาคควรทับซ้อนอย่างมากกับสเปกตรัมการดูดกลืนของตัวรับ นอกจากนี้ ควรมีการกระตุ้นโดยตรงน้อยที่สุดของตัวรับฟลูออโรฟอร์ที่การกระตุ้นสูงสุดของผู้บริจาค และไม่ควรมีการทับซ้อนกันของการปล่อยอย่างมีนัยสำคัญระหว่างผู้ให้และตัวรับในบริเวณความยาวคลื่นที่เกิดการปล่อยตัวรับ ในทางปฏิบัติ อาจเป็นเรื่องยากที่จะระบุคู่ผู้บริจาค-ผู้รับที่ตรงตามข้อกำหนดเหล่านี้ สถานการณ์มักจะซับซ้อนโดยข้อเท็จจริงที่ว่าชุดฟิลเตอร์เรืองแสงที่มีจำหน่ายทั่วไปนั้นไม่ได้ผลอย่างสมบูรณ์ในการส่งผ่านความยาวคลื่นที่ต้องการเท่านั้น และอาจส่งแสงเพียงเล็กน้อยนอกพาสแบนด์ของการออกแบบ เว้นแต่จะใช้ระบบการแสดงออกที่มีลักษณะเฉพาะและควบคุมได้ดีมาก ความเข้มข้นที่แม่นยำของฟลูออโรฟอร์ผู้ให้และตัวรับอาจกำหนดได้ยาก อาจจำเป็นต้องมีการแก้ไขเพิ่มเติมสำหรับการเรืองแสงอัตโนมัติ การฟอกสี และการเรืองแสงพื้นหลัง

การตรวจสอบโดยทั่วไปของความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนและโปรตีนภายในเซลล์ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่มีชีวิตนั้นแสดงไว้ในรูปที่ 8 สำหรับเหตุการณ์ที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ ซึ่งเป็นกระบวนการทางสรีรวิทยาของการตายของเซลล์ซึ่งเป็นผลมาจากการโต้ตอบแบบต่อเนื่องที่สลับซับซ้อน ผลิตภัณฑ์ยีนที่เกี่ยวข้องโดยตรงในห่วงโซ่ของเหตุการณ์สามารถติดฉลากได้โดยการหลอมรวมกับสมาชิกที่เหมาะสมของตระกูลโปรตีนเรืองแสง (ในกรณีนี้คือ BFP และ GFP) สำหรับการแสดงออกร่วมในเซลล์เดียวกันเพื่อตรวจสอบการเชื่อมโยงที่เฉพาะเจาะจงโดย FRET โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์อะพอพโทซิสมีปฏิสัมพันธ์ภายในไมโตคอนเดรียและแสดงการผูกมัดที่ลดลงอย่างค่อยเป็นค่อยไปเมื่อการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ ดังนั้น รูปภาพของการปล่อยผู้บริจาค (รูปที่ 8(a)) มีเพียงการเรืองแสงจากโปรตีนที่ติดฉลาก BFP ในขณะที่โปรไฟล์การปล่อยตัวรับที่สอดคล้องกัน (รูปที่ 9(b)) แสดงสัญญาณเนื่องจากโปรตีนที่ติดฉลากด้วย GFP (และบางส่วนมีส่วนร่วมจาก การปล่อยผู้บริจาค) ตัวกรอง FRET (รูปที่ 8(c)) ตามที่อธิบายด้านล่าง เผยให้เห็นการเรืองแสงที่ได้มาจากการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ระหว่างโปรตีนทั้งสอง

ในบรรดาปัจจัยที่อาจส่งผลต่อความแม่นยำของการวัดการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงโดยทั่วไป ปัจจัยหลายอย่างมีความเฉพาะเจาะจงสูงสำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง เป้าหมายหลักในการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์คือการได้ภาพที่มีความละเอียดสูง และสิ่งนี้ต้องให้ความสนใจเป็นพิเศษกับคุณภาพและประสิทธิภาพของฟิลเตอร์ออปติคัลที่ใช้ในการแยกแยะสเปกตรัมระหว่างความยาวคลื่นดูดกลืนและปล่อยของผู้บริจาคและผู้รับ เพื่อเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนให้สูงสุด (โดยไม่ส่งผลเสียต่อชิ้นงานทดสอบหรือกระบวนการที่กำลังตรวจสอบ) จำเป็นต้องปรับสมดุลความเข้มและเวลาในการสัมผัสกับแสงกระตุ้นอย่างระมัดระวังด้วยความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์ผู้ให้และตัวรับและเครื่องตรวจจับ ประสิทธิภาพ. หากความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์ตัวรับผู้บริจาคมากเกินไป อาจเกิดการดับตัวเองได้ ซึ่งส่งผลต่อความแม่นยำในการวัด FRET การฟอกสีด้วยแสงเป็นปัญหากับฟลูออโรฟอร์ทั้งหมด และอาจส่งผลต่ออัตราส่วนผู้บริจาค-ผู้รับ ซึ่งเป็นการเปลี่ยนแปลงการวัดการเรืองแสง ความเข้มของแสงที่มากเกินไปอาจสร้างความเสียหายต่อตัวอย่าง โดยเฉพาะอย่างยิ่งสิ่งส่งตรวจที่มีเซลล์หรือเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิต

เทคนิคที่เรียกว่า ผู้บริจาค photobleaching เรืองแสงเรโซแนนซ์การถ่ายโอนพลังงาน (pbFRET) ซึ่งใช้ประโยชน์จากกระบวนการ photobleaching เพื่อวัด FRET มักถูกนำไปใช้ในการศึกษาตัวอย่างคงที่ จากการวิเคราะห์แบบพิกเซลต่อพิกเซล วิธีการนี้ได้ถูกนำมาใช้เพื่อวัดความสัมพันธ์ที่ใกล้เคียงกันระหว่างโปรตีนที่ผิวเซลล์ที่ติดฉลากด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่คอนจูเกตด้วยฟลูออโรฟอร์ Photobleaching FRET ก่อตั้งขึ้นบนทฤษฎีที่ว่าฟลูออโรฟอร์มีความไวต่อความเสียหายจากแสงก็ต่อเมื่อถูกยกระดับเป็นสถานะตื่นเต้น ตามสถิติ มีโมเลกุลเพียงเล็กน้อยเท่านั้นที่อยู่ในสถานะตื่นเต้น ณ เวลาใดเวลาหนึ่ง ดังนั้นฟลูออโรฟอร์ที่มีอายุการเรืองแสงยาวนานกว่าจึงมีโอกาสเกิดความเสียหายจากแสงสูงขึ้นและมีอัตราการฟอกสีด้วยแสงที่สูงขึ้น

หลักฐานจากการทดลองที่สนับสนุนแนวคิดนี้ได้แสดงให้เห็นว่าเวลาในการฟอกสีของฟลูออโรฟอร์จะแปรผกผันกับช่วงอายุที่ตื่นเต้น การถ่ายเทพลังงานเรโซแนนซ์จะลดอายุการเรืองแสงของโมเลกุลผู้บริจาค ปกป้องจากการฟอกขาวอย่างมีประสิทธิภาพ การคำนวณ pbFRET ขึ้นอยู่กับอัตราการฟอกสีของผู้บริจาคที่ลดลงเมื่อเทียบกับการวัดที่ผู้บริจาคในกรณีที่ไม่มีการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ การวัด photobleaching ในการศึกษา FRET ต้องใช้ระยะเวลาค่อนข้างนาน ดังนั้นจึงเหมาะสำหรับตัวอย่างเซลล์ตายตัวซึ่งข้อมูลชั่วคราวไม่สำคัญ และผลกระทบต่อการทำงานของเซลล์จากการฟอกสีด้วยแสงไม่เป็นปัญหา ในบางแง่มุม เทคนิคการฟอกสีด้วยแสงของผู้บริจาคนั้นซับซ้อนน้อยกว่าการวัดการปล่อยสารไวแสง ถึงแม้ว่าการปรับค่าคงที่ของเวลาให้เข้ากับเส้นโค้งการฟอกสีด้วยแสงที่มีส่วนประกอบหลายส่วนทำให้เกิดปัญหาเพิ่มเติม

ประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงานยังสามารถกำหนดได้โดย ตัวรับ photobleaching เทคนิค ซึ่งการเปลี่ยนแปลงในการดับการปล่อยผู้บริจาคถูกวัดโดยการเปรียบเทียบค่าก่อนและหลังการเลือกโฟโตฟอกขาวของโมเลกุลตัวรับ การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงความเข้มของการเรืองแสงของผู้ให้ในบริเวณตัวอย่างเดียวกัน ก่อนและหลังการกำจัดตัวรับ มีข้อดีคือต้องมีการเตรียมตัวอย่างเดียวเท่านั้น และเกี่ยวข้องโดยตรงกับประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงานกับทั้งการเรืองแสงของผู้ให้และตัวรับ

การวัดการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรโซแนนซ์เรืองแสงอย่างแม่นยำในกล้องจุลทรรศน์จำเป็นต้องได้รับการชดเชยสำหรับแหล่งกำเนิดข้อผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นทั้งหมด เทคนิคที่ตรงไปตรงมาในการแก้ไขการตรวจจับการเรืองแสงของผู้บริจาคด้วยตัวกรองการปล่อยตัวรับและการเรืองแสงของตัวรับด้วยตัวกรองการปล่อยผู้บริจาค (เนื่องจากครอสโอเวอร์หรือสเปกตรัมเลือดออก) ได้รับการพัฒนา วิธีการนี้ยังแก้ไขการพึ่งพา FRET กับความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์ผู้ให้และตัวรับ กลยุทธ์การวัดซึ่งต้องการข้อมูลสเปกตรัมขั้นต่ำ ใช้ชุดตัวกรองสามชุดร่วมกันและสามารถนำไปใช้ได้ทันที ชุดผู้บริจาค FRET และตัวรับออกแบบมาเพื่อแยกและเพิ่มสัญญาณเฉพาะสามสัญญาณ: การเรืองแสงของผู้บริจาค การเรืองแสงของตัวรับที่มาจาก FRET และการเรืองแสงของตัวรับที่กระตุ้นโดยตรงตามลำดับ ในทางปฏิบัติ มีการตรวจสอบตัวอย่างที่แตกต่างกันสามตัวอย่าง มีเพียงผู้บริจาค ผู้รับเพียง และทั้งผู้บริจาคและผู้รับจะถูกตรวจสอบด้วยชุดตัวกรองแต่ละชุด และข้อมูลที่เป็นผลลัพธ์จะถูกจัดการทางคณิตศาสตร์เพื่อแก้ไขครอสโอเวอร์และสำหรับการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของผู้บริจาค-ผู้รับที่ควบคุมไม่ได้

นำเสนอในรูปที่ 9 เป็นแผนผังของครอสโอเวอร์ (สเปกตรัมตกเลือด) และครอสทอล์คของตัวกรอง ซึ่งเป็นปัญหาสำคัญสองประการที่ต้องเอาชนะเพื่อให้ได้ผลลัพธ์เชิงปริมาณในการทดลองถ่ายเทพลังงานด้วยเรโซแนนซ์เรืองแสง ครอสโอเวอร์หรือการตกเลือดปรากฏขึ้นจากการทับซ้อนกันของสเปกตรัมการเปล่งแสงเรืองแสงของผู้บริจาคกับบริเวณแบนด์พาสของตัวกรองสัญญาณรบกวนการปล่อยตัวรับในรูปที่ 9 ส่งผลให้สัญญาณการปล่อยผู้บริจาค (ความยาวคลื่นที่ไม่ต้องการ) ถูกส่งผ่านตัวกรองการปล่อย ในทางตรงกันข้าม ตัวกรองครอสทอล์คอธิบายระดับการลดทอนขั้นต่ำ (การปิดกั้น) ในช่วงเฉพาะของตัวกรองสองตัวที่วางอยู่ด้วยกันเป็นชุด และมีข้อกังวลเมื่อจับคู่ตัวกรองการกระตุ้นและตัวกรองการปล่อยสำหรับชุดเรืองแสง กระจกไดโครมาติกมักถูกรวมไว้ในการประเมินครอสทอล์คของชุดฟิลเตอร์เรืองแสง แม้ว่าตัวกรองการแผ่รังสีสองตัวจะไม่ค่อยถูกวางไว้ในเส้นทางแสงในเวลาเดียวกัน แต่สเปกตรัมจะถูกวาดเข้าด้วยกันในรูปที่ 9 เพื่อแสดงแนวคิดทั้งสองพร้อมกัน โปรดทราบว่าสเปกตรัมของตัวกรองทั้งสอง (เส้นโค้งสีน้ำเงินและสีแดง) แสดงถึงการส่องผ่านของแสงโดยตัวกรองสัญญาณรบกวน ในขณะที่เส้นโค้งการแผ่รังสีของผู้บริจาค (สีเขียว) เป็นแผนภาพของความเข้มเทียบกับความยาวคลื่น

ปัจจัยเพิ่มเติม ซึ่งอาจทำให้เกิดข้อผิดพลาดที่สำคัญ ยังต้องมีการแก้ไขเมื่อใช้เทคนิคการวัด FRET ในสภาวะคงตัว นอกจากนี้ ควรควบคุมความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์ผู้ให้และตัวรับอย่างระมัดระวัง การวัดความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์สามารถหลีกเลี่ยงได้บางส่วนโดยใช้ หมดเวลาแล้ว การวัดค่าการเรืองแสง ซึ่งให้วิธีการรับอายุขัยเฉลี่ยโดยปราศจากความรู้ที่แม่นยำเกี่ยวกับความเข้มข้นของผู้บริจาค เทคนิคนี้ช่วยให้สามารถกำหนดระยะการแยกตัวระหว่างผู้บริจาคและผู้รับในเชิงปริมาณได้ และอิงตามการวัดอายุของผู้บริจาคทั้งที่มีและไม่มีตัวรับ การวัดการสลายตัวของความเข้มของแสงเรืองแสงเป็นฟังก์ชันของเวลาที่อธิบายไดนามิกของการแผ่รังสีของโมเลกุลที่สถานะตื่นเต้น และด้วยเหตุนี้ จึงอาจได้ข้อมูลรายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับธรรมชาติของปฏิกิริยาระหว่างผู้รับและผู้รับบริจาค แผนภาพแสดงการสลายตัวของความเข้มแบบกราฟิกแสดงรายละเอียดเวลาเฉลี่ยของกระบวนการสลายตัวของแสงฟลูออเรสเซนต์ (ดูรูปที่ 10 (a)) ซึ่งไม่ได้รับการแก้ไขเมื่อใช้เทคนิคสภาวะคงตัว การวัดที่ระบุค่าเดียวกันสำหรับอายุขัยเฉลี่ย เมื่อบันทึกเป็นความเข้มของสภาวะคงตัวที่ปรับให้เป็นมาตรฐานจนถึงการดูดกลืน อาจสอดคล้องกับรูปร่างโค้งของการสลายตัวที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในแผนภาพข้อมูลที่แก้ไขด้วยเวลา ซึ่งบ่งชี้ถึงความแตกต่างในกระบวนการระหว่างโมเลกุลที่เกี่ยวข้อง

อายุการใช้งานเรืองแสง (τ) ของฟลูออโรฟอร์คือเวลาที่มีลักษณะเฉพาะที่โมเลกุลมีอยู่ในสถานะตื่นเต้นก่อนที่จะกลับสู่สถานะพื้นดิน แสดงถึงการสลายตัวของการเรืองแสงในรูปแบบเอกซ์โพเนนเชียลเดี่ยวอย่างง่ายตามจังหวะของแสงกระตุ้นสั้นๆ ความเข้มของการเรืองแสงเป็นฟังก์ชันของเวลา (NS) ถูกกำหนดโดยสมการ:

ที่ไหน ฉัน(0) คือความเข้มของการเปล่งแสงเรืองแสงเริ่มต้นทันทีหลังจากชีพจรแสงกระตุ้นและ มัน) คือ ความเข้มของการเรืองแสงที่วัดได้ ณ เวลานั้น NS. อายุการใช้งานเรืองแสง (τ) ถูกกำหนดเป็นเวลาที่จำเป็นสำหรับความเข้มที่จะสลายไปที่ 1/อี ของมูลค่าเริ่มต้น (ประมาณ 37 เปอร์เซ็นต์ของ ฉัน(0) รูปที่ 10(a)) และเป็นส่วนกลับของอัตราคงที่สำหรับการสลายตัวของเรืองแสงจากสถานะที่ถูกกระตุ้นไปยังสถานะพื้นดิน

ข้อได้เปรียบหลักโดยรวมของการวัด FRET ที่แก้ไขเวลากับสภาวะคงตัวคือ ระยะห่างระหว่างตัวรับและตัวรับสามารถจับคู่ได้อย่างแม่นยำในเชิงปริมาณมากขึ้น ส่วนหนึ่งเป็นผลเนื่องจากอายุการใช้งานของหลอดฟลูออเรสเซนต์ไม่ได้ขึ้นอยู่กับความเข้มหรือความเข้มข้นในท้องถิ่น และส่วนใหญ่ไม่ได้รับผลกระทบจากการฟอกสีด้วยแสงของฟลูออโรฟอร์ อย่างไรก็ตาม อายุการเรืองแสงมีความไวสูงต่อสภาพแวดล้อมของฟลูออโรฟอร์ และแม้แต่โมเลกุลที่มีสเปกตรัมใกล้เคียงกันก็อาจแสดงอายุการใช้งานที่แตกต่างกันภายใต้สภาวะแวดล้อมที่แตกต่างกัน เนื่องจากการกระเจิงไม่ส่งผลต่ออายุการใช้งานของฟลูออโรฟอร์ การวัดความแปรผันของอายุการใช้งานสามารถให้ข้อมูลที่เกี่ยวข้องโดยเฉพาะกับกระบวนการระดับโมเลกุลในท้องถิ่น

อายุการใช้งานของฟลูออโรฟอร์ขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนแปลงโดยตัวแปรจำนวนมากในสภาพแวดล้อมจุลภาคในท้องถิ่น รวมถึงปัจจัยต่างๆ เช่น ความไม่ชอบน้ำ ความเข้มข้นของออกซิเจน ความเข้มข้นของไอออนิกของส่วนประกอบสื่ออื่นๆ การจับกับโมเลกุลขนาดใหญ่ และความใกล้ชิดกับโมเลกุลของตัวรับที่สามารถทำให้สถานะตื่นเต้นหมดไปโดย การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ เป็นข้อได้เปรียบในทางปฏิบัติที่สำคัญที่การตรวจวัดตลอดอายุการใช้งานสามารถใช้เป็นตัวบ่งชี้สัมบูรณ์ของปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุล และไม่ขึ้นกับความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์

เทคนิคทั่วไปสองวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการวัดอายุการใช้งานของหลอดฟลูออเรสเซนต์แบ่งออกเป็น โดเมนเวลา (ชีพจรดูรูปที่ 10(a)) และ โดเมนความถี่ (เรียกอีกอย่างว่า เฟสแก้ไข รูปที่ 10(b)) วิธีการ การวัดอายุการใช้งานของโดเมนเวลาใช้แหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นแบบพัลซิ่ง และอายุการใช้งานของหลอดฟลูออเรสเซนต์ได้มาจากการวัดสัญญาณการแผ่รังสีโดยตรงหรือโดยการตรวจจับการนับโฟตอน วิธีการโดเมนความถี่ใช้การปรับไซน์ของแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้น (ได้มาจากระบบเลเซอร์แบบพัลซิ่งหรือมอดูเลต) และอายุการใช้งานจะถูกกำหนดจากการเลื่อนเฟสและความลึกของการแยกสัญญาณของสัญญาณการเปล่งแสงเรืองแสงวิธีการเหล่านี้แต่ละวิธีในการถ่ายภาพตลอดอายุการเรืองแสงมีข้อดีและข้อเสียที่เฉพาะเจาะจง และทั้งสองวิธีได้รับการนำไปใช้อย่างกว้างขวางในกล้องจุลทรรศน์แบบมุมกว้าง คอนโฟคอล และมัลติโฟตอนทั่วไป

ภาพประกอบในรูปที่ 10 เป็นแผนผังที่แสดงโดเมนเวลาและเทคนิคโดเมนความถี่สำหรับการกำหนดอายุการใช้งานเรืองแสง ในแนวทางโดเมนเวลา (รูปที่ 10 (a)) ชิ้นงานทดสอบจะถูกกระตุ้นโดยพัลส์แสงเลเซอร์สั้นๆ ซึ่งมีระยะเวลาสั้นกว่าอายุขัยของสปีชีส์ที่ถูกกระตุ้นอย่างมาก และโปรไฟล์การสลายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลจะถูกวัดตามฟังก์ชันของเวลา การสลายตัวของฟลูออเรสเซนซ์มักจะเป็นฟังก์ชันเอกซ์โพเนนเชียลสำหรับฟลูออโรฟอร์เดี่ยว แต่สามารถแสดงลักษณะที่ซับซ้อนกว่าได้มาก หากสภาวะที่ตื่นเต้นมีวิถีการผ่อนคลายจำนวนมากที่มีอยู่ในสิ่งแวดล้อม แสงมอดูเลตแบบไซนัสจากเลเซอร์คลื่นต่อเนื่องที่เชื่อมต่อกับโมดูเลเตอร์อะคูสติกออปติคัลถูกใช้เพื่อกระตุ้นฟลูออโรฟอร์ในการทดลองโดเมนความถี่ (รูปที่ 10(b)) การปล่อยแสงฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นผลลัพธ์จะถูกมอดูเลตแบบไซน์ที่ความถี่เดียวกับการกระตุ้น แต่มาพร้อมกับการเปลี่ยนเฟสและการลดความลึกของการปรับ ในกรณีของการสลายแบบเอกซ์โปเนนเชียลเดียว อายุการใช้งานการเรืองแสงสามารถคำนวณได้โดยการกำหนดระดับของการเปลี่ยนเฟส (ฟาย) หรืออัตราส่วนมอดูเลต (NS) โดยใช้สมการที่แสดงในรูปที่ 10(b) ถ้าค่าทั้งสองมีค่าเท่ากัน การสลายตัวของฟลูออเรสเซนซ์จะประกอบด้วยฟังก์ชันเลขชี้กำลังเพียงตัวเดียว เมื่อมีสปีชีส์เรืองแสงมากกว่าหนึ่งสปีชีส์ (หรือฟลูออโรฟอร์เดียวประสบกับสภาพแวดล้อมที่ซับซ้อน) ควรประเมินอายุการเลื่อนเฟสและมอดูเลตตามความถี่ที่หลากหลาย

เทคนิคโดเมนเวลาสำหรับการวัดอายุการเรืองแสงต้องอาศัยการนับโฟตอนเดี่ยวเป็นหลัก และต้องใช้ระบบการตรวจจับที่มีความละเอียดชั่วขณะเพียงพอที่จะรวบรวมเกือบ 100 เปอร์เซ็นต์ของโฟตอนที่เกิดจากพัลส์กระตุ้นแต่ละครั้ง แม้ว่าเทคนิคการแก้ปัญหาเฟสจะค่อนข้างต้องการการดำเนินการน้อยกว่า แต่โดยทั่วไปแล้วจะไม่มีความละเอียดอ่อนเท่ากับวิธีการนับโฟตอน เมื่อใช้มอดูเลตเฟสเพื่อแก้ไขอายุการใช้งานมัลติฟลูออโรฟอร์ที่ซับซ้อน เวลาเปิดรับแสงนานเพื่อสร้างแสงกระตุ้นที่สร้างความเสียหายสามารถพิสูจน์ได้ว่ามากเกินไปสำหรับตัวอย่างบางตัว และยังอาจให้ความละเอียดชั่วคราวไม่เพียงพอสำหรับกระบวนการเซลล์ที่มีชีวิต เทคนิคที่ต้องการขึ้นอยู่กับทั้งข้อมูลที่ต้องการจากการตรวจสอบและชนิดของตัวอย่างที่ศึกษา

การวัดอายุการเรืองแสงได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นตัวบ่งชี้ที่มีความละเอียดอ่อนของ FRET และมีข้อได้เปรียบเฉพาะในการศึกษาเซลล์ที่มีชีวิต เนื่องจากความเป็นอิสระของการวัดตลอดอายุการใช้งานตามปัจจัยต่างๆ เช่น ความเข้มข้นและความยาวของเส้นทางแสง ซึ่งยากต่อการควบคุมในตัวอย่างที่มีชีวิต ข้อได้เปรียบหลักของการดำเนินการศึกษา FRET โดยการวัดอายุการเรืองแสงคือสามารถแยกแยะการถ่ายเทพลังงานได้แม้ระหว่างคู่ผู้บริจาค-ผู้รับที่มีสเปกตรัมการแผ่รังสีที่คล้ายคลึงกัน เมื่อวัดอายุการเรืองแสงโดยตรง (ตรงกันข้ามกับการใช้ค่าสถานะคงตัว) การกำหนด FRET จะทำได้โดยไม่มีการทำลายด้วยแสงของผู้บริจาคหรือฟลูออโรฟอร์ตัวรับ เนื่องจาก FRET ช่วยลดอายุการเรืองแสงของโมเลกุลผู้บริจาคผ่านการถ่ายเทพลังงานไปยังตัวรับ การเปรียบเทียบโดยตรงของอายุการใช้งานของผู้บริจาคต่อหน้าตัวรับ (τ(ดา)) ในกรณีที่ไม่มีตัวรับ (τ(ด)) ช่วยให้สามารถคำนวณค่าประสิทธิภาพ FRET (อี(ที)) สำหรับแต่ละพิกเซลของภาพ

ขึ้นอยู่กับเทคนิค การวัดอายุการเรืองแสงต้องการให้ชิ้นงานทดสอบสัมผัสกับพัลส์ความถี่สูงซ้ำๆ ของแสงกระตุ้น หรือแสงที่มอดูเลตแบบไซน์อย่างต่อเนื่อง ในการศึกษากับเซลล์ที่มีชีวิต ต้องประเมินผลของการส่องสว่างที่มีความเข้มสูงเสมอ โดยไม่คำนึงถึงวิธีการ อายุการใช้งานอ้างอิงของผู้บริจาคที่ไม่มีตัวรับต้องถูกกำหนดภายใต้สภาวะการทดลองที่เหมือนกันกับการวัดของผู้บริจาค-ผู้รับ วิธีหนึ่งในการทำสิ่งนี้ให้สำเร็จด้วยตัวอย่างเพียงชิ้นเดียวคือการวัดอายุของผู้บริจาคเท่านั้นหลังจากการทำลายสารฟอกขาวของตัวรับหลังจากการทดลองถ่ายเทพลังงาน

ในการตรวจสอบทางชีววิทยา การใช้งานทั่วไปของการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงคือการวัดระยะทางระหว่างสองตำแหน่งบนโมเลกุลขนาดใหญ่ (โดยปกติคือโปรตีนหรือกรดนิวคลีอิก) หรือการตรวจสอบ ในร่างกาย ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอนทิตีชีวโมเลกุล โปรตีนสามารถติดฉลากด้วยฟลูออโรโครมสังเคราะห์หรือฟลูออโรฟลูออเรสเซนต์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เพื่อทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคและผู้รับ แต่ความก้าวหน้าในพันธุศาสตร์โปรตีนเรืองแสงทำให้นักวิจัยสามารถระบุโปรตีนเป้าหมายเฉพาะด้วยฟลูออโรฟอร์ทางชีวภาพที่หลากหลายซึ่งมีลักษณะสเปกตรัมต่างกัน ในหลายกรณี กรดอะมิโนทริปโตเฟนถูกใช้เป็นฟลูออโรฟอร์ผู้ให้ที่แท้จริง ซึ่งสามารถใช้ร่วมกับโพรบภายนอกจำนวนเท่าใดก็ได้ที่ทำหน้าที่เป็นตัวรับ

หากโมเลกุลขนาดใหญ่มีชื่อผู้บริจาคและตัวรับเพียงตัวเดียว และระยะห่างระหว่างฟลูออโรโครมทั้งสองไม่เปลี่ยนแปลงในช่วงอายุที่ตื่นเต้นของผู้ให้ ระยะห่างระหว่างโพรบสามารถกำหนดได้จากประสิทธิภาพการถ่ายเทพลังงานผ่านการวัดในสภาวะคงตัว ตามที่กล่าวไว้ ข้างต้น. ในกรณีที่ระยะห่างระหว่างผู้บริจาคและตัวรับผันผวนรอบเส้นโค้งการกระจาย เช่น ส่วนประกอบโปรตีน เยื่อหุ้ม กรดนิวคลีอิกสายเดี่ยว หรือโปรตีนที่คลี่ออก (ดูสถานการณ์จำลองที่แสดงในรูปที่ 11) FRET ยังสามารถนำมาใช้เพื่อศึกษา ปรากฎการณ์ แต่แนะนำให้ใช้การวัดอายุการใช้งานแบบระบุเวลา การใช้งานทางชีววิทยาหลายอย่างที่ตกอยู่ในทั้งสองกรณีถูกแสดงตัวอย่างไว้ในรูปที่ 11 ซึ่งรวมถึงการเปลี่ยนแปลงเชิงโครงสร้าง การแยกตัวหรือการไฮโดรไลซิส การหลอมรวมของถุงลิปิดลิปิดที่เหมือนเมมเบรน และอันตรกิริยาของลิแกนด์-รีเซพเตอร์

แม้ว่าจะมีวิธีการต่างๆ มากมายสำหรับการวัดการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงในกล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัล แต่ไม่มีวิธีใดที่จะไม่มีข้อเสียได้อย่างสมบูรณ์ เทคนิคบางอย่างต้องใช้เครื่องมือที่ซับซ้อนและมีราคาแพงกว่า ในขณะที่บางเทคนิคใช้สมมติฐานที่ต้องได้รับการตรวจสอบอย่างรอบคอบ วิธีการบางอย่างเหมาะสมสำหรับสิ่งส่งตรวจแบบตายตัว แต่ไม่สามารถนำไปใช้กับระบบเซลล์ที่มีชีวิตได้ ในขณะที่วิธีอื่นๆ จะต้องรวมการคำนวณแก้ไขที่สำคัญหรืออัลกอริธึมการวิเคราะห์ข้อมูลด้วย อย่างไรก็ตาม เป็นที่แน่นอนแล้วว่าการวิเคราะห์ FRET แสดงให้เห็นสัญญาที่ดีสำหรับการพัฒนาเพิ่มเติมในด้านอรรถประโยชน์และขอบเขตของการประยุกต์ใช้ทางชีวภาพ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีการปรับปรุงอย่างมากในด้านเครื่องมือวัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งในส่วนที่เกี่ยวกับเทคนิคที่มีการแก้ไขเวลา

การวัดอายุการใช้งานของหลอดฟลูออเรสเซนส์ที่ทำได้เฉพาะเมื่อในอดีตทำได้ยากมากเท่านั้น ปัจจุบันได้รับความช่วยเหลือจากเทคโนโลยี picosecond และ nanosecond ที่เจริญเต็มที่แล้ว ความก้าวหน้าในการพัฒนาโพรบเรืองแสงได้ผลิตโมเลกุลที่มีขนาดเล็กลงและมีเสถียรภาพมากขึ้นด้วยกลไกใหม่ของการยึดติดกับเป้าหมายทางชีววิทยา นอกจากนี้ ฟลูออโรฟอร์ยังได้รับการพัฒนาด้วยช่วงชีวิตที่ตื่นเต้นจากภายในที่หลากหลาย และมีความพยายามอย่างมากในการพัฒนาความหลากหลายที่มากขึ้นในการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมของโปรตีนเรืองแสง วัสดุฟลูออเรสเซนต์ชนิดใหม่ทั้งหมด ซึ่งหลายชนิดมีขนาดเล็กกว่าฟลูออโรฟอร์รุ่นก่อนๆ และช่วยให้ประเมินปฏิกิริยาของโมเลกุลที่ระยะการแยกที่ต่ำกว่า สัญญาว่าจะปรับปรุงความเก่งกาจของการติดฉลากและนำไปสู่การประยุกต์ใช้เทคนิค FRET แบบใหม่

ผู้เขียนร่วม

Brian Herman และ Victoria E. Centonze Frohlich - Department of Cellular and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 7703 Floyd Curl Drive, ซานอันโตนิโอ, เท็กซัส 78229

โจเซฟ อาร์. ลาโควิช - Center for Fluorescence Spectroscopy, Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland and University of Maryland Biotechnology Institute (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers และ Michael W. Davidson - ห้องปฏิบัติการสนามแม่เหล็กสูงแห่งชาติ, 1800 East Paul Dirac Dr., มหาวิทยาลัยแห่งรัฐฟลอริดา, แทลลาแฮสซี, ฟลอริดา, 32310


Hoechst สเปกตรัมสีแดงและสีน้ำเงิน - การปล่อยสีแดงบอกอะไรเรา? - ชีววิทยา

เรียกดูตามแอปพลิเคชัน

เรียกดูโดย Fluorophore

พื้นหลัง

การเรืองแสงเป็นรูปแบบของการเรืองแสงคือการเปล่งแสงที่เกิดจากสารที่ดูดซับแสงหรือรังสีแม่เหล็กไฟฟ้า โมเลกุลเรืองแสงจะปล่อยแสงออกมาอีกครั้งที่ความยาวคลื่นที่ยาวกว่าและพลังงานต่ำกว่าเพื่อตอบสนองต่อรังสีที่ถูกดูดกลืน เนื่องจากคุณสมบัติของเทคโนโลยีเรืองแสงจึงถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการถ่ายภาพเรืองแสงและสเปกโทรสโกปี โดยใช้โพรบฟลูออเรสเซนต์ สีย้อม และสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพอื่นๆ

ฟลูออโรฟอร์เป็นสารประกอบเรืองแสงที่ใช้เพียงอย่างเดียวหรือยึดติดกับโมเลกุลเพื่อสร้างโพรบเรืองแสง โดยทั่วไปฟลูออโรฟอร์แบ่งออกเป็นสี่ประเภท: สีย้อมอินทรีย์ โปรตีนเรืองแสง จุดควอนตัม (นาโนคริสตัลเรืองแสง) และโครงสร้างทางชีวภาพที่เหมาะสมสำหรับการถ่ายภาพที่ไม่มีฉลาก ฟลูออโรฟอร์ส่วนใหญ่เป็นสีย้อมโมเลกุลเล็กที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ (0.2-1 kDa) และบางชนิดก็เป็นโปรตีนที่ค่อนข้างใหญ่ เช่น GFP (สีเขียว) YFP (สีเหลือง) และ RFP (สีแดง) ฟลูออโรฟอร์ที่เลือกสรรมาอย่างหลากหลายนำเสนอการใช้งานที่หลากหลายในวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิตและการวิจัยพื้นฐาน ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติทางกายภาพของฟลูออเรสเซนต์ เช่น ขนาด ความเข้ากันได้ทางชีวภาพ ความยาวคลื่นของการกระตุ้นและการปล่อย ความเข้ม ผลผลิตควอนตัม อายุการเรืองแสง และปฏิกิริยากับสาร

รูปที่ 1. เซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวที่ติดฉลากด้วยโมเลกุลเรืองแสง

โพรบฟลูออเรสเซนต์คือฟลูออโรฟอร์เดี่ยวหรือฟลูออโรฟอร์ที่คอนจูเกตแบบโควาเลนต์กับโมเลกุลทางชีววิทยา มีหลอดฟลูออเรสเซนต์หลายประเภทในเว็บไซต์ BOC Sciences ดังนี้:

คราบเซลล์และออร์แกเนลล์: การเรืองแสงทำให้เกิดแนวทางใหม่ในการแสดงภาพเซลล์และโครงสร้างออร์แกเนลล์ ตลอดจนการติดตามเซลล์ โปรตีนเรืองแสงสีเขียว ซึ่งเป็นโปรตีนกรด 238 อะมิโน ถูกแยกออกจากแมงกะพรุน Aequorea Victoria เป็นครั้งแรกในปี 2504 โดยส่งเสริมการใช้โปรตีนเรืองแสงในชีววิทยาของเซลล์ หลังจากนั้นไม่นาน มีการค้นพบและแยกโปรตีนเรืองแสงเพิ่มเติมจากสายพันธุ์อื่น จากการพัฒนาอย่างรวดเร็วของเทคโนโลยีโปรตีนเรืองแสง การใช้ฟลูออโรฟอร์ที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมเพื่อการใช้งานที่หลากหลายนอกเหนือจากการติดตามอย่างง่ายของชีวโมเลกุลที่ติดแท็กในเซลล์ที่มีชีวิตเพิ่งได้รับการชื่นชมอย่างเต็มที่

โพรบเรืองแสงอื่น ๆ ที่ไม่ใช่โปรตีนสามารถย้อมเมมเบรน ออร์แกเนลล์ กรดนิวคลีอิก และโปรตีนในเซลล์ที่มีชีวิตหรือเซลล์ตายตัวสำหรับการตรวจสอบเซลล์และส่วนประกอบของเซลล์ เทคนิคการย้อมสีเซลล์ถูกนำมาใช้ในกล้องจุลทรรศน์ โฟลว์ไซโตเมตรี และการประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัยโรคได้ก้าวหน้าขึ้นเรื่อยๆ ตั้งแต่มะเร็งไปจนถึงการติดเชื้อแบคทีเรีย Epicocconone ซึ่งเป็นสีย้อมเรืองแสงแบบกะของสโต๊คยาวที่เผาผลาญจากเชื้อรา Epicoccum nigrum ได้รับการรายงานสำหรับการย้อมในสายเซลล์มะเร็งลำไส้ของมนุษย์ HCT-116 ซึ่งแสดงค่าสูงสุดของการปล่อยก๊าซเรือนกระจกสูงสุดที่ 590 นาโนเมตร Epicocconone เหมาะสำหรับการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิต เนื่องจากไม่ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ความเข้มข้นใกล้เคียงกับที่ใช้สำหรับการย้อมสี

คราบดีเอ็นเอ: คราบดีเอ็นเอเป็นสีย้อมที่ละเอียดอ่อนช่วยให้นักวิจัยสามารถมองเห็นชิ้นส่วนและปริมาณของดีเอ็นเอได้ สีย้อมไซยานีน ฟีแนนทรีดีนและอะคริดีน อินโดลและอิมิดาโซล และสีย้อมกรดนิวคลีอิกอื่นๆ โดยทั่วไปจะรวมอยู่ในคราบดีเอ็นเอ ในโฟลว์ไซโตเมทรีและจุลทรรศน์ Cy3 และ Cy5 เป็นสีย้อมไซยานีนที่ได้รับความนิยมมากที่สุดโดยทั่วไปโดยมีกลุ่มปฏิกิริยา N-hydroxysuccinimidyl ester (NHS-ester) ติดอยู่สำหรับการติดฉลาก DNA นอกจากนี้ ตระกูล TOTO, ตระกูล TO-PRO, ตระกูล SYTO และสีย้อมในตระกูล SYBR ยังเป็นสีย้อมไซยานีนที่ปรับให้เหมาะกับวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกัน SYBR Green I จับอย่างพึงประสงค์กับ DNA ที่มีเกลียวคู่เพื่อสร้างสารเชิงซ้อนที่เปล่งแสงเรืองแสงมากกว่า 1,000 เท่า SYBR Green I ถูกนำมาใช้ในการตรวจหา DNA ใน PCR, gel electrophoresis, flow cytometry และ microscopy

สีย้อม Hoechst เป็นบิสเบนซิไมด์ที่ตื่นเต้นด้วยแสงยูวีที่ 350 นาโนเมตรและเรืองแสงสีน้ำเงินที่ 460 นาโนเมตร การเปลี่ยนแปลงของ Stokes ที่ค่อนข้างใหญ่ทำให้สีย้อม Hoechst เหมาะสำหรับการทดลองการติดฉลากหลายสี สีย้อม Hoechst ย้อม DNA ผ่านการผูกมัดอย่างเลือกสรรกับร่องเล็ก ๆ ของ DNA แบบสองสายที่อุดมด้วย AT Hoechst 33258, Hoechst 33342 และ Hoechst 34580 เป็นคราบที่เกี่ยวข้องในตระกูลนี้

สารตั้งต้นของเอนไซม์เรืองแสง: สารตั้งต้นที่มีฟลูออโรเจนิกสำหรับเอนไซม์หลายชนิดถูกใช้ในการทดสอบกิจกรรมของเอนไซม์ โดยทั่วไปประกอบด้วยสารประกอบเรืองแสงและสารตั้งต้นของเอนไซม์จำเพาะ บนความแตกแยกของเอนไซม์ ซับสเตรตฟลูออเรสเซนต์จะปลดปล่อยมอยอิตีเรืองแสงและให้ผลการเรืองแสง ซึ่งอัตราส่วนหรือความเข้มสามารถใช้เพื่อหาปริมาณแอคทิวิตีของเอนไซม์ สารตั้งต้นบางชนิดได้รับการพัฒนาสำหรับการทดสอบเอนไซม์ในเซลล์ที่มีชีวิต ทำให้สามารถตรวจสอบการทำงานทางสรีรวิทยาของเอนไซม์ต่างๆ ในแหล่งกำเนิดได้

ตัวบ่งชี้และเซ็นเซอร์ไอออน: ความเข้มข้นของแคลเซียม โซเดียม โพแทสเซียม สังกะสี และไอออนของโลหะอื่นๆ ในมนุษย์ควรคงไว้ภายในช่วงที่เหมาะสมเพื่อรับประกันการทำงานทางชีวภาพตามปกติ ตัวบ่งชี้ไอออนมีอยู่ทั่วไปทั้งในรูปแบบเกลือที่ไม่มีเมมเบรนและรูปแบบ AM เอสเทอร์ที่ซึมผ่านเมมเบรน เมื่อเข้าสู่เซลล์ ตัวบ่งชี้ไอออนจะถูกปล่อยออกมาผ่านการไฮโดรไลซิส และจับกับไอออน ตัวบ่งชี้แคลเซียมจัดเป็นตัวบ่งชี้ทางเคมีและตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม ตัวชี้วัดทางเคมีคือฟลูออโรฟอร์ควบคู่กับโครงสร้างแคลเซียมคีเลเตอร์ BAPTA เช่น indo-1, fura-2, fluo-3, fluo-4 ผลผลิตควอนตัมเรืองแสง ความยาวคลื่นของการกระตุ้น/การปล่อย และการเปลี่ยนสเปกตรัมที่เกิดจากการจับของแคลเซียมไอออน ใช้สำหรับการหาปริมาณ ตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมคือโปรตีนเรืองแสงที่ได้มาจากโปรตีนเรืองแสงสีเขียว

สารคล้ายคลึง Porphyrin ได้รับการออกแบบให้เป็นไอออนของโลหะหรือตัวตรวจจับเคมีที่มีประจุลบสำหรับการตรวจจับระบบสิ่งแวดล้อมและกระบวนการทางชีววิทยา เฟรมเวิร์กของเซนเซอร์สามารถจำแนกได้เป็น 2 ประเภท คือ ประเภทที่ 1 ประกอบด้วยนักข่าวและหน่วยรับรู้ เมื่อรวมหน่วยการรู้จำเพื่อโต้ตอบกับตัววิเคราะห์เป้าหมายแล้ว จะมีการรายงานสัญญาณโฟโตฟิสิกส์จากนักข่าว ประเภทที่ 2 ประกอบด้วยองค์ประกอบเดียวเท่านั้น ทำหน้าที่เป็นการรับรู้และหน่วยการรายงานพร้อมกัน เคมีบำบัดชนิดต่าง ๆ ได้รับการพัฒนาขึ้นอยู่กับกระบวนการทางแสงที่หลากหลาย

ตัวบ่งชี้ค่า pH: ค่า pH ภายในเซลล์มีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับกิจกรรมของเซลล์ เนื้อเยื่อ และเอนไซม์ และค่า pH ที่ผิดปกติมักเกี่ยวข้องกับการทำงานและการเจริญเติบโตของเซลล์ที่ไม่เหมาะสม ซึ่งสามารถสังเกตพบได้ในโรคบางชนิด เช่น มะเร็ง การวัดค่า pH ภายในเซลล์ให้ข้อมูลที่สำคัญสำหรับการศึกษากระบวนการทางสรีรวิทยาในเซลล์ เนื่องจากการวัดเชิงคุณภาพได้รับอิทธิพลอย่างง่ายดายจากความยาวเส้นทางแสง อุณหภูมิ ความเข้มของการกระตุ้นที่เปลี่ยนแปลง และประสิทธิภาพการรวบรวมการปล่อยที่หลากหลาย สเปกโตรสโคปีแบบอัตราส่วนจึงถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับ pH วิธีการวัดต้องใช้โพรบฟลูออเรสเซนต์ที่มีความไวต่อสารที่วิเคราะห์แตกต่างกันอย่างน้อยสองช่วงความยาวคลื่นของการกระตุ้นหรือการปล่อย BCECF เป็นตัวบ่งชี้ pH แบบกระตุ้นตามอัตราส่วนที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดในเซลล์ที่มีชีวิต


ความคิดเห็น

ข้อมูลพื้นฐาน

การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกของ Ki-67 ถูกอธิบายเพื่อกำหนดส่วนการเจริญเติบโตของสายพันธุ์ของเซลล์มะเร็งต่อมน้ำเหลือง (Schwarting et al., 1986) และนำไปใช้เพิ่มเติมกับการวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์และการเพิ่มจำนวนเซลล์ในเซลล์มะเร็งจำนวนมากและเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด Pyronin Y ถูกสังเคราะห์ขึ้นครั้งแรกในปี พ.ศ. 2432 และใช้เป็นสีย้อมเนื้อเยื่อ/เซลล์เคมีที่สะดวกในการย้อมอาร์เอ็นเอร่วมกับเมทิลกรีน (สำหรับการย้อมดีเอ็นเอ) ต่อมา การย้อมสีสองครั้งของ Pyronin Y และ Hoechst 33342 ได้รับการพัฒนาสำหรับการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกเพื่อประเมินเนื้อหา DNA และ RNA ในเซลล์ที่ไม่บุบสลาย (Shapiro, 1981) วิธีการเหล่านี้มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิเคราะห์สถานะวัฏจักรของเซลล์

ร่วมกับเทคนิคเหล่านี้ จลนพลศาสตร์ของสถานะวัฏจักรเซลล์สามารถประเมินได้โดยการสอบวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนเซลล์ตามการวัดปริมาณดีเอ็นเอที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่และพารามิเตอร์การเผาผลาญของเซลล์ สำหรับการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของการเพิ่มจำนวนเซลล์ จีโนม DNA ในเซลล์ที่จำลองแบบสามารถติดฉลากได้โดยการเปิดเผยเซลล์ไปยังไทมิดีนแอนะล็อก 5'-โบรโม-2'-ดีออกซียูริดีน (BrdU) ในระหว่างเฟส S ของวัฏจักรเซลล์ Incorporated BrdU ถูกย้อมเพิ่มเติมด้วยแอนติบอดีต่อต้าน BrdU ที่เรืองแสงและสีย้อม DNA เรืองแสง (เช่น โพรพิเดียมไอโอไดด์, PI 7-Aminoactinomycin D, 7-AAD) เพื่อแยกเซลล์ตามวัฏจักรเซลล์ของแต่ละเฟส (เช่น G1, S, ระยะ G2/M) (Rothaeusler และ Baumgarth, 2007) ข้อเสียของวิธีการรวมตัวของ BrdU คือจำเป็นต้องมีทั้งการซึมผ่านของเมมเบรนและกระบวนการเปลี่ยนสภาพดีเอ็นเอที่รุนแรงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเจาะแอนติบอดีไปยัง BrdU ที่รวมเข้าด้วยกัน เป็นทางเลือกของ BrdU 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ได้รับการพัฒนาเพื่อเอาชนะข้อ จำกัด ของวิธี BrdU (Cappella et al., 2008 Cavanagh et al., 2011 Salic and Mitchison, 2008) หลังจากการบำบัดด้วย EdU ระหว่างการเพิ่มจำนวนเซลล์ ต่อมาสามารถตรวจพบการรวมตัวของ EdU โดยโมเลกุลเอไซด์เรืองแสงผ่านปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาทองแดง (I) ซึ่งส่งผลให้เกิดการสร้างวงแหวนไตรอะโซลที่เสถียรระหว่าง EdU และสีย้อมเรืองแสง (เรียกว่า "ปฏิกิริยาคลิก") เนื่องจากสีย้อมเรืองแสงขนาดเล็กสามารถแทรกซึมเข้าไปในเซลล์ได้ง่าย และมันทำปฏิกิริยากับ EdU ได้ง่ายแม้ในสาย DNA สองสายที่ไม่บุบสลาย วิธี EdU จึงมีความไวสูงและเร็วกว่าวิธีการรวม BrdU แบบดั้งเดิมมาก นอกจากนี้ การทดสอบการรวม EdU ยังสามารถใช้ร่วมกับการย้อมพื้นผิวเซลล์มัลติเพล็กซ์/การย้อมสีภายในเซลล์ ซึ่งมีประโยชน์มากสำหรับการใช้งานจำนวนมาก (Cappella et al., 2008 Diermeier-Daucher และ Brockhoff, 2010) เวอร์ชันดั้งเดิมของปฏิกิริยา Click ไม่สามารถใช้สำหรับการตรวจจับมัลติเพล็กซ์ของฟลูออโรฟอร์บางชนิด เช่น GFP และ R-PE ซึ่งได้รับความเสียหายได้ง่ายจากทองแดงที่มีความเข้มข้นสูงและชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา เมื่อเร็วๆ นี้ การดัดแปลงทางเคมีของปฏิกิริยา Click ช่วยให้สามารถคงการเรืองแสงของ GFP และ R-PE และรับสัญญาณ EdU ที่สว่างได้ ซึ่งขยายให้ครอบคลุมฟลูออโรฟอร์ที่แตกต่างกันอย่างน้อยสามชนิด (Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 647 และ Pacific Blue™ ดูแหล่งข้อมูลทางอินเทอร์เน็ตด้านล่าง)

ในปัจจุบัน การทดสอบการเจือจางของสีย้อมโดยใช้สีย้อมเรืองแสงที่ซึมผ่านเมมเบรนได้ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินการเพิ่มจำนวนเซลล์เช่นกัน Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE หรือ CFDA-SE, carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) เป็นหนึ่งในสีย้อมเรืองแสงที่ใช้กันอย่างแพร่หลายซึ่งเข้าสู่ไซโตพลาสซึมและจับคู่กับกรดอะมิโนภายในเซลล์ (Lyons, 2000 Lyons et al., 2013) เนื่องจากปฏิกิริยานี้ส่งผลให้เกิดการกักเก็บสีย้อมเรืองแสงไว้ภายในเซลล์เดิมเป็นเวลานานมาก จึงถูกนำมาใช้เพื่อติดตามเซลล์ภูมิคุ้มกัน สมมติว่าเซลล์มีขนาดเซลล์ที่เป็นเนื้อเดียวกันและได้รับการแบ่งส่วนแบบสมมาตร เซลล์ลูกสาวแต่ละเซลล์จะมีปริมาตรเซลล์ต้นกำเนิดและส่วนประกอบของเซลล์ครึ่งหนึ่ง ตลอดจนสีย้อม CFSE ที่ติดฉลาก ดังนั้น การติดฉลาก CFSE สามารถนำไปใช้ในการประมาณจำนวนการสร้างหลังจากการเพิ่มจำนวนเซลล์อย่างรวดเร็ว โดยปกติ สีย้อม CFSE อาจถูกติดตามผ่าน 6-8 รุ่นโดยโฟลว์ไซโตเมทรี คล้ายกับสีย้อม CFSE ฟลูออโรฟอร์อื่นๆ สำหรับการทดสอบการเพิ่มจำนวนการเจือจางของสีย้อมได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อครอบคลุมสเปกตรัมการกระตุ้น/การปล่อยมลพิษในวงกว้าง ( ตารางที่ 2 )สีย้อมเรืองแสงเหล่านี้เหมาะกว่าสำหรับการใช้งานหลายสีซึ่งใช้อนุพันธ์ GFP หรือ FITC หรือแอนติบอดีคอนจูเกตเรืองแสงที่คล้ายกัน นอกจากนี้ สีย้อมเจือจางบางชนิดจะปล่อยออกมาในช่องที่เซลล์มีการเรืองแสงอัตโนมัติตามธรรมชาติน้อยกว่าที่สามารถตรวจพบได้ถึง 10 รุ่นระหว่างการเพิ่มจำนวนเซลล์

ตารางที่ 2

รายการฟลูออโรฟอร์สำหรับการทดสอบการเพิ่มจำนวนการเจือจางของสีย้อม

ชื่อทางการค้าอดีตmaxเอมmaxอดีต. เลเซอร์ผู้ผลิต
CFSE495519488 นาโนเมตรหลากหลาย
CellTrace TM สีม่วง405450405 นาโนเมตรเทคโนโลยีชีวิต
BD HorizonTM ไวโอเล็ตเซลล์
สีย้อมขยายพันธุ์ (VPD450)
404448405 นาโนเมตรBD Biosciences
สารเติมแต่งการงอกขยายเซลล์ eFluor򮑐405450405 นาโนเมตรeBioscience
CytoTrack TM สีฟ้า403454405 นาโนเมตรBIO-RAD
Oregon Green 488 กรดคาร์บอกซิลิก
ไดอะซิเตท, SE (คาร์บอกซี-DFFDA SE)
496524488 นาโนเมตรเทคโนโลยีชีวิต
SNARF-1 กรดคาร์บอกซิลิก, อะซิเตท, SE514586488 นาโนเมตรเทคโนโลยีชีวิต
CytoTrack TM สีเขียว511525488 นาโนเมตรBIO-RAD
CytoTrack TM สีเหลือง542556532 นาโนเมตรBIO-RAD
CellTrace TM สีแดงเข้ม DDAO-SE647657633 นาโนเมตรเทคโนโลยีชีวิต
สารเติมแต่งการงอกขยายเซลล์ eFluor򮙰647670633 นาโนเมตรeBioscience
CytoTrack TM สีแดง628643633 นาโนเมตรหรือ 640 นาโนเมตรBIO-RAD

พารามิเตอร์ที่สำคัญ

ความหนาแน่นของเซลล์ที่เหมาะสม

ความหนาแน่นของเซลล์ควรได้รับการปรับให้เหมาะสมเนื่องจากการเพาะเลี้ยงที่ไหลมารวมกันอาจทำให้เกิดการหยุดการเจริญเติบโตโดยการยับยั้งการสัมผัส ซึ่งนำไปสู่การจับกุม G0/G1 ของวัฏจักรเซลล์ การบรรจบกันที่มากเกินไปยังส่งผลต่อความพร้อมของสารอาหารและความเป็นกรดของสื่อ ซึ่งอาจบิดเบือนผลการทดลอง โดยทั่วไป เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยวในช่วงเวลาที่มีการเติบโตแบบทวีคูณ (โดยปกติคือ 50

การไทเทรตของแอนติบอดีและความเข้มข้นของสีย้อมดีเอ็นเอเรืองแสง

สำหรับการใช้งานครั้งแรก แอนติบอดีต่อ Ki-67 หรือแอนติเจนบนพื้นผิวจำเป็นต้องได้รับการไทเทรต (โดยปกติคือ 1:500-1:50 สำหรับโฟลว์ไซโตเมทรี) เพื่อเพิ่มการตรวจจับประชากรที่เป็นสัญญาณบวก ความเข้มข้นของสีย้อม DNA แบบเรืองแสงอาจแตกต่างกันไปตามสายพันธุ์ของเซลล์และ/หรือสภาวะจำเพาะ ซึ่งต้องถูกกำหนดหาโดยสังเกตจากประสบการณ์

การหาความเข้มข้นของไพโรนิน Y

ความเข้มข้นของ PY ที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ ความเข้มข้นของ PY ต่ำไม่ได้รับรองความสัมพันธ์เชิงปริมาณสัมพันธ์ระหว่างระดับ RNA จริงและการเรืองแสงของ PY ความเข้มข้นของ PY ที่สูงยังส่งผลให้เกิดการควบแน่น (การตกตะกอน) ของสารเชิงซ้อนของกรดนิวคลีอิก PY ซึ่งขัดขวางการเรืองแสงของ PY ดังนั้น ความเข้มข้นของ PY ที่เหมาะสมจะแปรผันตามสายพันธุ์ของเซลล์ ความหนาแน่นของเซลล์ และสภาวะ โดยทั่วไป จำเป็นต้องมีการไทเทรตสำหรับการใช้งานครั้งแรก (เริ่มตั้งแต่ 1 μg/ml ถึง 5 μg/ml)

การวิเคราะห์โปรตีนเรืองแสง

ในการใช้ BASIC PROTOCOL 1 หรือ 2 ร่วมกับโปรตีนเรืองแสง เช่น GFP และ RFP ควรใช้ ALTERNATIVE PROTOCOL 1 ในการตรึง PFA ตามด้วยซาโปนินซึมผ่านช่วยรักษาโครงสร้างของโปรตีนเหล่านี้ อาจจำเป็นต้องทำการเปลี่ยนแปลงในโปรโตคอลพื้นฐาน 1 เนื่องจากสเปกตรัม GFP และ FITC เหลื่อมกัน ดังนั้น ให้พิจารณาโพรบที่ไม่ทับซ้อนกันอีกตัวสำหรับการตรวจจับ Ki-67 อนุพันธ์ RFP บางตัวยังคาบเกี่ยวกันกับ PI และในบางกรณี ควรใช้โพรบดีเอ็นเอทางเลือก

การแก้ไขปัญหา

สัญญาณบวกไม่ดีหรือการเรืองแสงพื้นหลังสูง

ตรวจสอบการรวมเลเซอร์และตัวกรองที่เหมาะสม ปรับความเข้มข้นและเวลาฟักตัวของแอนติบอดีและสีย้อม DNA/RNA เรืองแสง สำหรับการเรืองแสงพื้นหลังสูง ให้เพิ่มความเข้มข้นของ FBS/BSA ในบัฟเฟอร์ FACS ในบางกรณี (เช่น., โปรโตคอลทางเลือก 1) อาจจำเป็นต้องปรับความเข้มข้นของ PFA และเวลาฟักตัวเพื่อลดสัญญาณพื้นหลัง ในกรณีที่สัญญาณไม่ดีหรือไม่มีอยู่จริงเกี่ยวกับการย้อมสีพื้นผิว ให้ตรวจสอบคำแนะนำของผู้ผลิตว่าคอนจูเกตแอนติบอดีมีความไวต่อการตรึงหรือไม่ (เช่น การได้รับพาราฟอร์มัลดีไฮด์เป็นเวลานานส่งผลต่อสเปกตรัมการเปล่งแสงของฟลูออโรฟอร์บางชนิด เช่น APC-Cy𡈧, PE -Cy𡈧).

การจับตัวเป็นก้อนของเซลล์และการสูญเสียเซลล์จำนวนมากระหว่างกระบวนการตรึง/ล้าง

ขั้นตอนการตรึงที่ไม่เหมาะสมอาจส่งผลให้เกิดการรวมตัวของเซลล์และการสูญเสียเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหานี้ ให้ฉีดสารแขวนลอยของเซลล์ลงในเอธานอลเย็นโดยตรงโดยใช้ปิเปตปาสเตอร์และผสมให้เข้ากันทันที อีกทางหนึ่ง ใช้สารตรึงที่ไม่มีแอลกอฮอล์ เช่น พาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% (ดู ALTERNATIVE PROTOCOL 1) ตัวอย่างที่เปื้อนควรถูกส่งผ่านตัวกรองเซลล์ก่อนทำการวิเคราะห์

ค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันสูง (CV) หรือค่าพีคกว้างสำหรับโพรบวัฏจักรเซลล์ดีเอ็นเอ

ตรวจสอบให้แน่ใจว่ามีการรันตัวอย่างในการตั้งค่าแรงดันตัวอย่างต่ำสุดที่เป็นไปได้เพื่อให้สามารถสอบสวนตัวอย่างได้ดีที่สุด การหาตัวอย่างในการตั้งค่าเชิงเส้น/ช่วงของโฟลว์ไซโตมิเตอร์ก็มีความสำคัญเช่นกัน นอกจากนี้ ความเข้มข้นของเซลล์และสีย้อมที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญสำหรับฮิสโทแกรมที่สอดคล้องกันซึ่งให้ CV ที่ดีขึ้นและการแปรผันระหว่างตัวอย่างลดลง

ผลลัพธ์ที่คาดหวัง

บนพื้นฐานของความแตกต่างในระดับการแสดงออก Ki-67 ( รูปที่ 1A ) และเนื้อหา RNA ( รูปที่ 1B ) ของเซลล์ G0 โปรโตคอลพื้นฐาน 1 และ 2 อนุญาตให้มีการเลือกปฏิบัติของประชากรที่อยู่นิ่ง/สงบ (G0) จากเซลล์ที่เพิ่มจำนวนอื่นๆ (G1, S, ระยะ G2/M) โดยทั่วไป เซลล์ G0 มีระดับ Ki-67 และ RNA ที่ต่ำกว่า ดังนั้นเซลล์เหล่านี้อาจแยกแยะได้จากเซลล์ที่เพิ่มจำนวนอื่นๆ ในการหาปริมาณการกระจายรอบเซลล์ของเซลล์ที่เพิ่มจำนวนได้อย่างแม่นยำ คุณสามารถใช้ซอฟต์แวร์ที่เหมาะสม เช่น ModFit LT (Verity Software) และ MultiCycle AV (Pheonix Flow Systems) (Darzynkiewicz and Huang, 2004)

วิเคราะห์สถานะวัฏจักรของเซลล์โดยการย้อมดิฟเฟอเรนเชียลของ Ki-67/DNA และ DNA/RNA เซลล์ HeLa ได้รับการแก้ไขและต่อมาถูกย้อมด้วย Ki-67-FITC และ PI (A) หรือ Hoechst 33342 และ Pyronin Y (B) ตามโปรโตคอลพื้นฐาน 1 และ 2

การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ส่วนเล็กๆ แสดงระดับ Ki-67 ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ G2/M (รูปที่ 1A, เครื่องหมายดอกจัน) (Landberg et al., 1990) เซลล์เหล่านี้ถูกมองว่าเป็นเซลล์ไมโทติคในระยะเริ่มแรก แต่ยังไม่ได้รับการสร้างอย่างแน่นหนา ในการแยกเซลล์เฟส M ออกไป จำเป็นต้องมีการรวมตัวทำเครื่องหมายอื่นๆ เช่น Cyclins, MPM-2 และ phospho-Ser10-histone H3 (เพื่อตรวจจับเฟส M) (Juan และ Darzynkiewicz, 2001 Landberg et al., 1990 Vignon et al., 2556).

การพิจารณาเวลา

การเตรียมและการย้อมสี Ki-67 และการย้อมสี DNA เรืองแสงควรใช้เวลา 4 ชั่วโมง การย้อมสีของ Pyronin Y และ Hoechst 33342 จะใช้เวลา 3 ชั่วโมง การวิเคราะห์ตัวอย่างผ่านโฟลว์ไซโตเมทรีจะใช้เวลาตั้งแต่ 1 ถึง 10 นาทีต่อตัวอย่าง ขึ้นอยู่กับความเข้มข้น เวลาทั้งหมดขึ้นอยู่กับจำนวนตัวอย่างทั้งหมด


ดูวิดีโอ: Physicist Proves White Holes Are Stronger than Black Holes (สิงหาคม 2022).