ข้อมูล

จะคำนวณหรือรู้ได้อย่างไรโดยการทดลองเอนโทรปีของเอ็นไซม์หรือโปรตีน?

จะคำนวณหรือรู้ได้อย่างไรโดยการทดลองเอนโทรปีของเอ็นไซม์หรือโปรตีน?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

คุณคำนวณหรือทดลองหาเอนโทรปีของเอนไซม์หรือโปรตีนอย่างไร? โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ฉันสนใจโบลซ์มันน์และเอนโทรปีเชิงโครงสร้าง และพลังงานที่ปราศจากกิ๊บส์ ยินดีต้อนรับการอ้างอิงใด ๆ


ในทางปฏิบัติ เช่นเดียวกับการคำนวณพลังงาน เอนโทรปีเป็นตัวเลขสัมพัทธ์และหาได้ยาก เคมีเชิงคำนวณและชีวภาพได้แก้ไขปัญหานี้ด้วยความสำเร็จแบบผสมผสาน บทสรุปของสิ่งที่ฉันจะพูดในที่นี้คือเมื่อคุณพยายามคำนวณความแตกต่างของเอนโทรปี (หรือพลังงานสำหรับเรื่องนั้น) ความแตกต่างของ Gibbs Free Energy ในกระบวนการทางชีววิทยาส่วนใหญ่ เช่น การจับกับเอนไซม์/สารตั้งต้น โปรตีน/โปรตีน หรือ ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีน/ดีเอ็นเอ หรือการพับของโปรตีน ฯลฯ นั้นเล็กมากเมื่อเทียบกับข้อผิดพลาดในการคำนวณเหล่านี้ ซึ่งการคำนวณนั้นยากต่อการเชื่อ

ในที่สุดเอนโทรปีเป็นคำที่ใช้ในการคำนวณพลังงานอิสระของกิบบ์ ซึ่งจะบอกได้ว่ากระบวนการทางเคมีหรือโมเลกุลที่กำหนดจะเกิดขึ้นหรือไม่ จึงเป็นตัวเลขที่มีค่า Gibbs Free Energy (G) เท่ากับ Enthalpy (ความร้อน) ลบอุณหภูมิ (T) คูณการเปลี่ยนแปลงของเอนโทรปี

NS = H - T$Delta$S

คำศัพท์ Entropic $Delta$S อธิบายไว้ในระบบเคมีบ่อยครั้งว่าเป็นการเปลี่ยนแปลงในการเปลี่ยนแปลงแบบผสมผสานของระบบและการเปลี่ยนแปลงความจุความร้อนของระบบ ประการแรกสามารถอธิบายอย่างกว้าง ๆ ว่าเป็นคำ 'ผสม' เมื่อตัวทำละลายหรือตัวทำละลายและตัวถูกละลายมากกว่าหนึ่งตัวผสมกันอย่างสมบูรณ์ จำนวนสถานะที่เป็นไปได้จะเพิ่มขึ้นสูงสุด

ความจุความร้อนของระบบมักเป็นจุดสนใจของการคำนวณเอนโทรปีสำหรับโปรตีนและโมเลกุลทางชีววิทยา นี่เป็นเพราะว่าโครงสร้างของโมเลกุลทางชีววิทยา โดยเฉพาะอย่างยิ่งความอิสระที่จะเคลื่อนที่ไปรอบ ๆ นั้นคิดว่ามีส่วนทำให้เกิดส่วนเอนโทรปิกของ NS.

ดังนั้นจึงมีความพยายามในการประมาณค่าจาก NMR และผลึกศาสตร์ เช่นเดียวกับพลวัตของโมเลกุลว่าโดเมนและสายด้านข้างมีอิสระมากเพียงใดในการเคลื่อนที่ ขออภัย นี่เป็นเพียงพร็อกซีที่ไม่เพียงพอสำหรับเอนโทรปีทางชีวภาพ ผลงานที่สำคัญหากไม่มีอิทธิพลต่อ T$เดลต้า$S คำศัพท์มาจาก ตัวทำละลาย.

เป็นอย่างนี้ได้อย่างไร? โมเลกุลของน้ำสร้างโครงสร้างรอบๆ โปรตีนที่ไม่คงที่ แต่เกี่ยวข้องกับโมเลกุลของน้ำจำนวนมากโดยเฉลี่ยที่อาศัยอยู่ที่นั่นโดยเฉลี่ยเพื่อดูพวกมันในโครงสร้างผลึกและการทดลอง NMR ในขณะที่น้ำแต่ละชนิดมีการแลกเปลี่ยนกันอย่างรวดเร็ว น้ำจะไม่อยู่ในสถานะเอนโทรปิกในสารละลายน้ำเหมือนเมื่อสร้างเปลือกไฮเดรชั่นรอบโซ่ข้างที่มีกลิ่นหอมหรือมีประจุ

มีความพยายามในการกำหนดพารามิเตอร์เอนโทรปีตัวทำละลายโดยดูที่พื้นผิวไม่มีขั้วที่ฝังอยู่ในโปรตีนที่พับแล้ว โดยดูการเคลื่อนตัวของสายด้านข้างก่อนและหลังการพับ/ผูก แต่ตัวชี้วัดเหล่านี้ดูเหมือนจะมีการกำหนดค่าขึ้นอยู่กับจุดที่พวกมันทำไม่ได้ คำนวณเอนโทรปีของโปรตีนด้วยความพยายามเหล่านี้ อย่างน้อยก็ในตอนนี้

ตามอัตภาพ พลวัตของโมเลกุลจะพยายามคำนวณสิ่งนี้โดยล้อมรอบโปรตีนหรือโมเลกุลอื่นๆ ที่มีโมเลกุลของน้ำ และการประมาณเอนโทรปีโดยรวมบางส่วนจะคำนวณจากทั้งระบบ ปรากฎว่าความแตกต่างเล็ก ๆ น้อย ๆ ระหว่างแบบจำลองโมเลกุลของน้ำกับการทำให้เข้าใจง่ายในแบบจำลองน้ำที่มีศักยภาพของ ball and stick/hooke ที่เราทำขึ้นนั้นยังเป็นการประมาณปัญหาเมื่อมีโมเลกุลของน้ำหลายร้อยหรือหลายพันในการจำลอง


19.4: การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีในปฏิกิริยาเคมี

เราได้เห็นแล้วว่าพลังงานที่จ่าย (หรือดูดซับ) โดยปฏิกิริยา และตรวจสอบโดยสังเกตการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิของสภาพแวดล้อม สามารถใช้เพื่อกำหนดเอนทัลปีของปฏิกิริยา (เช่น โดยใช้เครื่องวัดความร้อน) น่าเศร้า ไม่มีวิธีง่ายๆ ใดที่เปรียบเทียบได้ในการทดลองวัดการเปลี่ยนแปลงของเอนโทรปีสำหรับปฏิกิริยา สมมติว่าเรารู้ว่าพลังงานกำลังเข้าสู่ระบบ (หรือออกมาจากระบบ) แต่เราไม่สังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ เกิดอะไรขึ้นในสถานการณ์เช่นนี้? การเปลี่ยนแปลงของพลังงานภายในที่ไม่ได้มาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ อาจสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงในเอนโทรปีของระบบ

ตัวอย่างเช่น พิจารณาน้ำที่ °0C ที่ความดัน 1 atm

  • นี่คือสภาวะอุณหภูมิและความดันที่เฟสของเหลวและของแข็งของน้ำอยู่ในสภาวะสมดุล (หรือที่เรียกว่าจุดหลอมเหลวของน้ำแข็ง)

"[ce label] ที่อุณหภูมิและความดันดังกล่าว เรามีสถานการณ์ (ตามคำจำกัดความ) ที่เรามีน้ำแข็งและน้ำของเหลวอยู่บ้าง หากป้อนพลังงานจำนวนเล็กน้อยเข้าสู่ระบบ สมดุลจะเลื่อนไปทางขวาเล็กน้อย (เช่น ให้อยู่ในสถานะของเหลว) ในทำนองเดียวกันหากดึงพลังงานออกจากระบบเพียงเล็กน้อย สมดุลจะเลื่อนไปทางซ้าย (น้ำแข็งมากขึ้น) อย่างไรก็ตาม ในทั้งสองสถานการณ์ข้างต้น การเปลี่ยนแปลงพลังงานไม่ได้มาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ (อุณหภูมิจะไม่เปลี่ยนแปลงจนกว่าเราจะไม่มีสภาวะสมดุลอีกต่อไป กล่าวคือ น้ำแข็งละลายหรือของเหลวทั้งหมดกลายเป็นน้ำแข็ง) เนื่องจากคำศัพท์เชิงปริมาณที่เกี่ยวข้องกับปริมาณพลังงานความร้อนที่ป้อนเข้าเทียบกับอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นคือความจุความร้อน ดูเหมือนว่าในทางใดทางหนึ่ง ข้อมูลเกี่ยวกับความจุความร้อน (และการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ) จะช่วยให้เราสามารถกำหนด การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีในระบบ อันที่จริง ค่าสำหรับ "standard molar entropy" ของสารมีหน่วยเป็น J/mol K ซึ่งเป็นหน่วยเดียวกับความจุความร้อนของโมลาร์ สไลด์โชว์

ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นผลิตภัณฑ์ที่เป็นพิษจากปฏิกิริยาเคมีหลายอย่างที่เกิดขึ้นในสิ่งมีชีวิต แม้ว่ามันจะถูกผลิตขึ้นในปริมาณเล็กน้อย แต่สิ่งมีชีวิตจะต้องล้างพิษสารประกอบนี้และสลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ให้เป็นน้ำและออกซิเจน ซึ่งเป็นโมเลกุลที่ไม่เป็นอันตรายสองโมเลกุล ออร์แกเนลล์ที่ทำหน้าที่ทำลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์คือเปอร์รอกซิโซมโดยใช้เอนไซม์คาตาเลส ทั้งพืชและสัตว์มีเปอร์รอกซิโซมกับคาตาเลส ตัวอย่าง catalase สำหรับห้องปฏิบัติการในวันนี้จะมาจากมันฝรั่ง


โครงสร้างของตัวเร่งปฏิกิริยาและเอนไซม์

NS ตัวเร่ง คือสารใดๆ ที่สามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญต่ออัตราการเกิดปฏิกิริยาเคมี ดังนั้นมันอาจเป็นองค์ประกอบบริสุทธิ์ เช่น นิกเกิลหรือแพลตตินัม สารประกอบบริสุทธิ์ เช่น ซิลิกา แมงกานีสไดออกไซด์ ไอออนที่ละลายได้ เช่น ไอออนของทองแดง หรือแม้แต่ส่วนผสม เช่น เหล็ก-โมลิบดีนัม ตัวเร่งปฏิกิริยาที่ใช้กันมากที่สุดคือกรดโปรตอนในปฏิกิริยาไฮโดรไลซิส ปฏิกิริยารีดอกซ์ถูกเร่งโดยโลหะทรานซิชันและแพลตตินั่มใช้สำหรับปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับไฮโดรเจน ตัวเร่งปฏิกิริยาบางชนิดเกิดขึ้นเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาล่วงหน้าและถูกแปลงเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาในระหว่างการเกิดปฏิกิริยา ตัวอย่างทั่วไปคือตัวเร่งปฏิกิริยาของ Wilkinson’s – RhCl(PPh .)3)3 ซึ่งสูญเสียลิแกนด์ไตรฟีนิลฟอสฟีนไปหนึ่งตัวขณะเร่งปฏิกิริยา

เอนไซม์ เป็นโปรตีนทรงกลมและสามารถประกอบด้วยกรดอะมิโน 62 (4-oxalocrotonate) ถึงขนาด 2,500 กรดอะมิโน (การสังเคราะห์กรดไขมัน) นอกจากนี้ยังมีเอนไซม์จาก RNA ที่เรียกว่า ไรโบไซม์. เอ็นไซม์เป็นสารตั้งต้นจำเพาะและมักจะมีขนาดใหญ่กว่าซับสเตรตตามลำดับ เอนไซม์ส่วนน้อยเท่านั้นที่มีส่วนร่วมในปฏิกิริยาของเอนไซม์ แอกทีฟไซต์เป็นที่ที่ซับสเตรตจับกับเอ็นไซม์เพื่ออำนวยความสะดวกในปฏิกิริยา ปัจจัยอื่นๆ เช่น ปัจจัยร่วม ผลิตภัณฑ์โดยตรง ฯลฯ ก็มีจุดจับกับเอนไซม์เช่นกัน เอ็นไซม์สร้างจากสายโซ่ยาวของกรดอะมิโนที่พับทับกันทำให้เกิดโครงสร้างทรงกลม ลำดับกรดอะมิโนทำให้เอ็นไซม์มีความจำเพาะของซับสเตรต ความร้อนและสารเคมีสามารถทำลายเอนไซม์ได้


มาตรการ

1. การออกแบบไพรเมอร์

การออกแบบไพรเมอร์ที่เหมาะสมมีความสำคัญต่อผลสำเร็จของการทดลอง PCR เมื่อออกแบบชุดไพรเมอร์ไปยังบริเวณเฉพาะของ DNA ที่ต้องการสำหรับการขยาย ไพรเมอร์หนึ่งตัวควรหลอมเข้ากับเกลียวบวก ซึ่งโดยแบบแผนจะเน้นในทิศทาง 5' → 3' (เรียกอีกอย่างว่าความรู้สึกหรือสายที่ไม่ใช่แม่แบบ) และไพรเมอร์อื่นควรเสริมให้เกลียวลบซึ่งอยู่ในทิศทาง 3' → 5' (แอนตีเซนส์หรือเกลียวแม่แบบ) มีปัญหาทั่วไปบางประการที่เกิดขึ้นเมื่อออกแบบไพรเมอร์: 1) การอบอ่อนด้วยตัวเองของไพรเมอร์ทำให้เกิดโครงสร้างทุติยภูมิ เช่น กิ๊บติดผม (รูปที่ 1a) 2) ไพรเมอร์หลอมซึ่งกันและกันแทนที่จะเป็นแม่แบบ DNA ทำให้เกิดไพรเมอร์ไดเมอร์ (รูปที่ 1b) 3) อุณหภูมิหลอมเหลวที่แตกต่างกันอย่างมาก (TNS) สำหรับไพรเมอร์แต่ละชนิด ทำให้ยากต่อการเลือกอุณหภูมิการอบอ่อน ซึ่งจะทำให้ไพรเมอร์ทั้งสองสามารถจับกับลำดับเป้าหมายได้อย่างมีประสิทธิภาพในระหว่างการหมุนเวียนความร้อน (รูปที่ 1c) (ดูส่วนการคำนวณอุณหภูมิหลอมเหลว (TNS) และการปรับเปลี่ยนเงื่อนไขการปั่นจักรยานสำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ TNSNS).

ด้านล่างนี้เป็นรายการคุณสมบัติที่ควรพิจารณาเมื่อออกแบบไพรเมอร์

ความยาวไพรเมอร์ควรเป็น 15-30 นิวคลีโอไทด์ตกค้าง (เบส)

เนื้อหา GC ที่เหมาะสมควรอยู่ระหว่าง 40-60%

ไพรเมอร์ที่ปลาย 3' ควรมี G หรือ C เพื่อยึดไพรเมอร์และป้องกันไม่ให้ "หายใจ" ที่ปลาย เพิ่มประสิทธิภาพการรองพื้น "การหายใจ" ของ DNA เกิดขึ้นเมื่อปลายไม่ถูกอบอ่อนแต่หลุดลุ่ยหรือแยกออกจากกัน พันธะไฮโดรเจนสามพันธะในคู่ GC ช่วยป้องกันการหายใจ แต่ยังเพิ่มอุณหภูมิหลอมเหลวของไพรเมอร์ด้วย

ปลาย 3' ของชุดไพรเมอร์ ซึ่งรวมถึงไพรเมอร์เกลียวบวกและไพรเมอร์ลบ ไม่ควรประกอบเข้าด้วยกัน และปลาย 3' ของไพรเมอร์เดี่ยวไม่สามารถประกอบกับลำดับอื่นๆ ในไพรเมอร์ได้ สถานการณ์ทั้งสองนี้ส่งผลให้เกิดการก่อตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์และโครงสร้างลูปกิ๊บตามลำดับ

อุณหภูมิหลอมเหลวที่เหมาะสมที่สุด (TNS) สำหรับไพรเมอร์อยู่ในช่วงระหว่าง 52-58 ଌ แม้ว่าช่วงสามารถขยายเป็น 45-65 ଌ ได้ สุดท้าย TNS สำหรับไพรเมอร์ทั้งสองควรต่างกันไม่เกิน 5 ଌ

ควรหลีกเลี่ยงการทำซ้ำได-นิวคลีโอไทด์ (เช่น GCGCGCGCGC หรือ ATATATATAT) หรือการรันเบสเดียว (เช่น AAAAA หรือ CCCCC) เนื่องจากอาจทำให้เกิดการลื่นไถลไปตามส่วนที่ไพรม์ของ DNA และหรือโครงสร้างลูปกิ๊บ หากหลีกเลี่ยงไม่ได้เนื่องจากลักษณะของเทมเพลต DNA ให้รวมเฉพาะการทำซ้ำหรือการรันเบสเดียวที่มีสูงสุด 4 เบส

หมายเหตุ:

มีโปรแกรมคอมพิวเตอร์มากมายที่ออกแบบมาเพื่อช่วยในการออกแบบไพรเมอร์คู่ เครื่องมือออกแบบ NCBI Primer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ และ Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ เป็นเว็บไซต์ที่แนะนำสำหรับจุดประสงค์นี้

เพื่อหลีกเลี่ยงการขยายสัญญาณของซูโดจีนีหรือโฮโมล็อกที่เกี่ยวข้อง อาจเป็นประโยชน์ในการเรียกใช้ NCBI เพื่อตรวจสอบความจำเพาะเป้าหมายของไพรเมอร์

2. วัสดุและรีเอเจนต์

เมื่อตั้งค่าการทดสอบ PCR สิ่งสำคัญคือต้องเตรียมพร้อม สวมถุงมือเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนสารผสมของปฏิกิริยาหรือสารทำปฏิกิริยา รวมการควบคุมเชิงลบและถ้าเป็นไปได้ให้ควบคุมในเชิงบวก

จัดเรียงรีเอเจนต์ทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการทดลอง PCR ในถังน้ำแข็งที่เติมใหม่และปล่อยให้ละลายจนหมดก่อนที่จะตั้งปฏิกิริยา (รูปที่ 2). เก็บรีเอเจนต์ไว้บนน้ำแข็งตลอดการทดลอง

รีเอเจนต์ PCR มาตรฐานรวมถึงชุดของไพรเมอร์ที่เหมาะสมสำหรับยีนเป้าหมายที่ต้องการหรือเซ็กเมนต์ DNA ที่ต้องการถูกขยาย, DNA พอลิเมอเรส, บัฟเฟอร์สำหรับ DNA พอลิเมอเรสจำเพาะ, ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ (dNTP), แม่แบบ DNA และน้ำปลอดเชื้อ

น้ำยาเพิ่มเติมอาจรวมถึงเกลือแมกนีเซียม Mg 2+ (ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 ถึง 5.0 mM), เกลือโพแทสเซียม K + (ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 35 ถึง 100 mM), ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1-10%) , ฟอร์มาไมด์ (ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1.25-10%), เซรั่มอัลบูมินจากวัว (ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 10-100 μg/มล.) และเบทาอีน (ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 โมลาร์ถึง 2.5 โมลาร์) มีการกล่าวถึงสารเติมแต่งเพิ่มเติมในส่วนการแก้ไขปัญหา

จัดระเบียบอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการบนโต๊ะทำงาน

วัสดุประกอบด้วยหลอดและฝาปิด PCR, ชั้นวางหลอด PCR, มาร์กเกอร์ที่ทนต่อเอทานอล และชุดไมโครไพเพตเตอร์ที่จ่ายระหว่าง 1 - 10 μl (P10), 2 - 20 μl (P20), 20 - 200 & #x003bcl (P200) และ 200 - 1,000 μl (P1000) เช่นเดียวกับตัวหมุนความร้อน

เมื่อตั้งค่าการทดลอง PCR หลายครั้งซึ่งทั้งหมดใช้รีเอเจนต์เดียวกัน สามารถปรับขนาดได้อย่างเหมาะสมและรวมเข้าด้วยกันในส่วนผสมหลัก (Master Mix) ขั้นตอนนี้สามารถทำได้ในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ 1.8 มล. ที่ปราศจากเชื้อ (ดูหมายเหตุ)

ในการวิเคราะห์แอมพลิคอนที่เกิดจากการทดลอง PCR จำเป็นต้องใช้รีเอเจนต์และอุปกรณ์สำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิสเจล agarose ในการประมาณขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR จำเป็นต้องมีมาตรฐานขนาดน้ำหนักโมเลกุลที่เหมาะสมและมีจำหน่ายในท้องตลาด

3. การตั้งค่าส่วนผสมของปฏิกิริยา

เริ่มต้นด้วยการทำตารางรีเอเจนต์ที่จะเติมลงในส่วนผสมของปฏิกิริยา (ดู ตารางที่ 1).

ถัดไป ติดฉลากหลอด PCR ด้วยเครื่องหมายที่ทนต่อเอทานอล

ปริมาณปฏิกิริยาจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของรีเอเจนต์สต็อก ความเข้มข้นสุดท้าย (CF) สำหรับปฏิกิริยา 50μl โดยทั่วไปมีดังนี้

X บัฟเฟอร์ (โดยปกติผู้ผลิต DNA polymerase อาจมี 15 mM MgCl2). เพิ่มบัฟเฟอร์ 10X 5 μl ต่อปฏิกิริยา

200μM dNTPs (50μM ของแต่ละนิวคลีโอไทด์สี่ตัว) เพิ่ม 1 & # x003bcl ของ 10 mM dNTP ต่อปฏิกิริยา (dATP, dCTP, dTTP และ dGTP อยู่ที่ 2.5 mM ต่อปฏิกิริยา)

1.5 mM มก. 2+ เพิ่มก็ต่อเมื่อไม่มีอยู่ในบัฟเฟอร์ 10X หรือตามความจำเป็นสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพ PCR ตัวอย่างเช่น เพื่อให้ได้ 4.0 mM Mg 2+ ที่จำเป็นสำหรับการผลิตแอมพลิคอนที่เหมาะสมที่สุดของเซ็กเมนต์ DNA 566 bp ที่อนุรักษ์ไว้ซึ่งพบใน Mycobacteriophage ที่ไม่มีลักษณะเฉพาะ ให้เพิ่ม 8 μl ของ 25 mM MgCl2 ต่อปฏิกิริยา (รูปที่ 3).

20 ถึง 50 pmol ของไพรเมอร์แต่ละตัว เพิ่มไพรเมอร์ 1 μl ของแต่ละ 20 μM ไพรเมอร์

เพิ่มเทมเพลต DNA 10 4 ถึง 10 7 โมเลกุล (หรือประมาณ 1 ถึง 1,000 ng) เพิ่ม 0.5 μl ของ 2ng/μl จีโนม Mycobacteriophage DNA

เพิ่ม DNA polymerase 0.5 ถึง 2.5 หน่วยต่อปฏิกิริยา 50 μl (ดูคำแนะนำของผู้ผลิต) ตัวอย่างเช่น เพิ่ม 0.5 μl ของ Sigma 0.5 Units/μl ตัก ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส

เพิ่ม Q.S. น้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อเพื่อให้ได้ปริมาตรสุดท้าย 50 μl ต่อปฏิกิริยาตามที่กำหนดไว้ล่วงหน้าในตารางรีเอเจนต์ (Q.S. เป็นตัวย่อภาษาละตินสำหรับ quantum satis หมายถึงปริมาณที่ต้องการ) ดังนั้น จำเป็นต้องใช้ 33μl ต่อปฏิกิริยาเพื่อให้ปริมาตรสูงถึง 50μl อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่ามีการเติมน้ำก่อน แต่ต้องมีการทำตารางของรีเอเจนต์ในขั้นต้นและกำหนดปริมาตรของรีเอเจนต์อื่นๆ ทั้งหมดที่เติมลงในปฏิกิริยา

4. โปรโตคอล PCR พื้นฐาน

วางจาน 96 หลุมลงในถังน้ำแข็งเพื่อใช้เป็นตัวยึดสำหรับท่อ PCR ผนังบาง 0.2 มล. การอนุญาตให้เติมสาร PCR ลงในหลอด PCR ผนังบางที่มีความเย็น 0.2 มล. จะช่วยป้องกันกิจกรรมของนิวคลีเอสและไพรเมอร์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง

ปิเปตรีเอเจนต์ PCR ต่อไปนี้ตามลำดับต่อไปนี้ลงในหลอด PCR ผนังบาง 0.2 มล. (รูปที่ 4): น้ำปราศจากเชื้อ, บัฟเฟอร์ PCR 10X, dNTPs, MgCl2, ไพรเมอร์ และ แม่แบบ DNA (ดู ตารางที่ 1). เนื่องจากการทดลองอย่างน้อยควรมีกลุ่มควบคุมเชิงลบ และอาจมีกลุ่มควบคุมเชิงบวก การติดตั้งมาสเตอร์มิกซ์ในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ 1.8 มล. จึงเป็นประโยชน์ (ดูคำอธิบายในหมายเหตุ)

ในหลอด PCR ผนังบาง 0.2 มล. แยกต่างหาก (รูปที่ 4) เพิ่มรีเอเจนต์ทั้งหมด ยกเว้นเทมเพลต DNA สำหรับตัวควบคุมเชิงลบ (เพิ่มน้ำเพื่อชดเชยปริมาตรที่ขาดหายไป) นอกจากนี้ ปฏิกิริยาอื่น (หากมีรีเอเจนต์) ควรมีการควบคุมเชิงบวกโดยใช้เทมเพลต DNA และหรือไพรเมอร์ที่รู้จักกันก่อนหน้านี้เพื่อขยายภายใต้สภาวะเดียวกันกับหลอด PCR ที่ทำการทดลอง

ตัก โดยทั่วไปแล้ว DNA polymerase จะถูกเก็บไว้ในสารละลายกลีเซอรอล 50% และสำหรับการกระจายอย่างสมบูรณ์ในส่วนผสมของปฏิกิริยา จำเป็นต้องมีการผสมสาร PCR อย่างอ่อนโยนโดยการปิเปตขึ้นและลงอย่างน้อย 20 ครั้ง ควรตั้งค่าไมโครไพเพตเตอร์ไว้ที่ประมาณครึ่งหนึ่งของปริมาตรปฏิกิริยาของส่วนผสมหลักขณะผสม และควรใช้ความระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้มีฟองเกิดขึ้น

วางฝาบนท่อ PCR แบบบางที่มีผนังบาง 0.2 มล. แล้วใส่ลงในวงจรระบายความร้อน (รูปที่ 5). เมื่อปิดฝาของวงจรระบายความร้อนอย่างแน่นหนาแล้ว ให้เริ่มโปรแกรม (ดู ตารางที่ 2).

เมื่อโปรแกรมเสร็จสิ้น หลอด PCR ผนังบาง 0.2 มล. อาจถูกถอดออกและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 ଌ ผลิตภัณฑ์ PCR สามารถตรวจพบได้โดยการใส่ส่วนลิคอตของแต่ละปฏิกิริยาลงในหลุมของเจลอากาโรส แล้วย้อม DNA ที่ย้ายเข้าไปในเจลหลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิสด้วยเอทิเดียม โบรไมด์ หากมีผลิตภัณฑ์ PCR เอทิเดียมโบรไมด์จะสอดแทรกระหว่างฐานของสาย DNA ทำให้มองเห็นแถบได้ด้วยเครื่องฉายแสงยูวี

หมายเหตุ:

เมื่อตั้งค่าการทดลอง PCR หลายๆ ครั้ง การรวมตัวของรีเอเจนต์ร่วมกับปฏิกิริยาทั้งหมดจะเป็นประโยชน์อย่างยิ่ง (เช่น มาสเตอร์มิกซ์) โดยปกติ ค็อกเทลจะมีสารละลายของ DNA polymerase, dNTPs, บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา และน้ำที่ประกอบเป็นหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ 1.8 มล. ปริมาณของรีเอเจนต์แต่ละตัวที่เติมลงในมาสเตอร์มิกซ์จะเท่ากับจำนวนปฏิกิริยาทั้งหมด บวก 10% ที่ปัดเศษขึ้นเป็นปฏิกิริยาทั้งหมดที่ใกล้ที่สุด ตัวอย่างเช่น หากมีปฏิกิริยา 10 x 0.1 = 1 ดังนั้น (10 + 1) x 5 μl 10X บัฟเฟอร์ จะเท่ากับ 55 μl ของบัฟเฟอร์ 10X สำหรับมาสเตอร์มิกซ์ รีเอเจนต์ใน Master Mix จะถูกผสมอย่างทั่วถึงโดยค่อยๆ ปั๊มลูกสูบของไมโครไพเพตเตอร์ขึ้นและลงประมาณ 20 ครั้งตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หลอด PCR แต่ละหลอดจะได้รับส่วนลิโควตของมาสเตอร์มิกซ์ซึ่งจะมีการเพิ่มเทมเพลตดีเอ็นเอ ไพรเมอร์ที่จำเป็น และรีเอเจนต์เฉพาะการทดลอง (ดู ตารางที่ 1 และ 7).

เว็บไซต์ต่อไปนี้มีเครื่องคำนวณสำหรับกำหนดจำนวนสำเนาของเทมเพลต DNA (http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html) จำนวนสำเนาของ DNA สายคู่ทั้งหมดสามารถคำนวณได้โดยใช้สมการต่อไปนี้: จำนวนสำเนา DNA = (จำนวน DNA (ng) x 6.022x10 23 ) / (ความยาวของ DNA x 1x10 9 ng/ml x 650 Daltons) การคำนวณจำนวนสำเนาของ DNA ใช้เพื่อกำหนดจำนวนเทมเพลตที่ต้องการต่อปฏิกิริยา

ผลบวกที่ผิดพลาดอาจเกิดขึ้นอันเป็นผลมาจากการส่งต่อจากปฏิกิริยา PCR อื่น ซึ่งจะถูกมองว่าเป็นผลิตภัณฑ์ที่ไม่ต้องการหลายรายการบนเจล agarose หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส ดังนั้นจึงควรระมัดระวังในการใช้เทคนิคที่เหมาะสม รวมถึงการควบคุมเชิงลบ (และการควบคุมเชิงบวกเมื่อเป็นไปได้)

แม้ว่าเอธิเดียมโบรไมด์จะเป็นคราบกรดนิวคลีอิกที่พบได้บ่อยที่สุด แต่ก็มีทางเลือกอื่นๆ ที่ปลอดภัยกว่าและเป็นพิษน้อยกว่า เว็บไซต์ต่อไปนี้อธิบายทางเลือกต่างๆ รวมถึง Methylene Blue, Crystal Violet, SYBR Safe และ Gel Red พร้อมด้วยคำอธิบายวิธีใช้และตรวจหาผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย (http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the- ทางเลือก/)

แม้ว่าเครื่อง PCR สมัยใหม่ส่วนใหญ่จะใช้หลอดขนาด 0.2 มล. แต่บางรุ่นอาจต้องใช้ปฏิกิริยาในหลอดขนาด 0.5 มล.ดูคู่มือนักปั่นความร้อนเพื่อกำหนดขนาดท่อที่เหมาะสม

5. การคำนวณอุณหภูมิหลอมเหลว (TNS)

รู้อุณหภูมิหลอมเหลว (TNS) ของไพรเมอร์มีความจำเป็นสำหรับการทดลอง PCR ที่ประสบความสำเร็จ แม้ว่าจะมีหลาย TNS เครื่องคิดเลขที่มีอยู่ เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องทราบว่าการคำนวณเหล่านี้เป็นค่าประมาณของ T . จริงNS เนื่องจากขาดข้อมูลเฉพาะเกี่ยวกับปฏิกิริยาและสมมติฐานเฉพาะที่ทำขึ้นในอัลกอริทึมสำหรับ TNS เครื่องคิดเลขเอง อย่างไรก็ตาม ควรใช้แบบจำลองทางอุณหพลศาสตร์ที่อยู่ใกล้ที่สุดมากกว่าการคำนวณแบบทั่วไป: TNS ≈ 4(G-C) + 2(A-T). อดีตจะให้แม่นยำยิ่งขึ้นTNS การประมาณค่าเพราะคำนึงถึงพลังงานซ้อนของคู่เบสใกล้เคียง อันหลังนี้ใช้บ่อยกว่าเพราะการคำนวณนั้นง่ายและสามารถทำได้ด้วยมืออย่างรวดเร็ว ดูหัวข้อการแก้ไขปัญหาสำหรับข้อมูลเกี่ยวกับผลกระทบจากสภาวะ PCR และสารเติมแต่งต่างๆ ที่ส่งผลต่ออุณหภูมิหลอมเหลว สำหรับการคำนวณ TNS ค่าตามแบบจำลองทางอุณหพลศาสตร์ที่ใกล้ที่สุด ขอแนะนำให้ใช้เครื่องคิดเลขตัวใดตัวหนึ่งต่อไปนี้: http://www6.applidbiosystems.com/support/techtools/calc/ http://www.cnr.berkeley.edu/

6. การตั้งค่าเงื่อนไขการปั่นจักรยานด้วยความร้อน

ตัวหมุนเวียนความร้อน PCR ให้ความร้อนและทำให้ส่วนผสมของปฏิกิริยาเย็นลงอย่างรวดเร็ว ทำให้เกิดการเปลี่ยนสภาพที่เกิดจากความร้อนของดีเอ็นเอดูเพล็กซ์ (การแยกเส้นใย) การหลอมของไพรเมอร์ไปยังเส้นใยบวกและลบของแม่แบบ DNA และการยืดตัวของผลิตภัณฑ์ PCR รอบเวลาคำนวณตามขนาดของเทมเพลตและเนื้อหา GC ของ DNA สูตรทั่วไปเริ่มต้นด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเริ่มต้นที่ 94 & # x000b0C ถึง 98 & # x000b0C โดยขึ้นอยู่กับอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการออกฤทธิ์ของ DNA โพลีเมอเรสและเนื้อหา GC ของแม่แบบ DNA ปฏิกิริยาทั่วไปจะเริ่มต้นด้วยการทำให้เสียสภาพหนึ่งนาทีที่ 94 ଌ นานกว่า 3 นาทีอาจทำให้ DNA polymerase หยุดทำงาน ทำลายการทำงานของเอนไซม์ วิธีหนึ่งที่เรียกว่า hot-start PCR ขยายเวลาการเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นอย่างมากจาก 3 นาทีเป็น 9 นาที ด้วย PCR แบบ hot-start DNA polymerase จะถูกเติมหลังจากขั้นตอนการดีเนเจอร์ที่เกินจริงในขั้นต้นเสร็จสิ้นลง การปรับเปลี่ยนโปรโตคอลนี้ช่วยหลีกเลี่ยงการหยุดการทำงานของเอนไซม์ DNA polymerase อ้างถึงส่วนการแก้ไขปัญหาของโปรโตคอลนี้สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ hot start PCR และวิธีการอื่น

ขั้นตอนต่อไปคือการตั้งค่า Thermal Cycler เพื่อเริ่มรอบแรกจาก 25 ถึง 35 รอบของรอบอุณหภูมิสามขั้นตอน (ตารางที่ 2). แม้ว่าการเพิ่มจำนวนรอบที่สูงกว่า 35 จะส่งผลให้มีผลิตภัณฑ์ PCR ในปริมาณที่มากขึ้น แต่บ่อยครั้งที่การออกรอบมากเกินไปจะส่งผลให้ผลิตภัณฑ์รองที่ไม่พึงประสงค์มีความอุดมสมบูรณ์ ขั้นตอนอุณหภูมิสามขั้นตอนในรอบเดียวบรรลุงานสามอย่าง: ขั้นตอนแรกทำให้แม่แบบเสียหาย (และในรอบต่อมาคือแอมพลิคอนด้วย) ขั้นตอนที่สองช่วยให้การหลอมไพรเมอร์เหมาะสมที่สุด และขั้นตอนที่สามอนุญาตให้ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสจับกับ แม่แบบ DNA และสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR ระยะเวลาและอุณหภูมิของแต่ละขั้นตอนภายในรอบอาจเปลี่ยนแปลงได้เพื่อให้การผลิตแอมพลิคอนที่ต้องการเหมาะสมที่สุด เวลาสำหรับขั้นตอนการทำให้เสียสภาพถูกเก็บไว้ให้สั้นที่สุด โดยปกติ 10 ถึง 60 วินาทีก็เพียงพอสำหรับเทมเพลต DNA ส่วนใหญ่ เวลาและอุณหภูมิการเปลี่ยนสภาพอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับเนื้อหา G-C ของ DNA แม่แบบ เช่นเดียวกับอัตราการลาด ซึ่งเป็นเวลาที่ตัววงจรความร้อนใช้ในการเปลี่ยนจากอุณหภูมิหนึ่งเป็นอุณหภูมิถัดไป อุณหภูมิสำหรับขั้นตอนนี้มักจะเหมือนกับอุณหภูมิที่ใช้สำหรับเฟสการทำให้เสียสภาพเริ่มต้น (ขั้นตอนที่ #1 ด้านบน เช่น 94 ଌ) ขั้นตอนการหลอม 30 วินาทีจะตามมาภายในวัฏจักรที่อุณหภูมิที่ตั้งไว้ประมาณ 5 ଌ ต่ำกว่า T ที่ปรากฏNS ของไพรเมอร์ (ควรอยู่ระหว่าง 52 ଌ ถึง 58 ଌ) วงจรปิดท้ายด้วยขั้นตอนการยืดตัว อุณหภูมิขึ้นอยู่กับ DNA polymerase ที่เลือกสำหรับการทดลอง ตัวอย่างเช่น, ตัก ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสมีอุณหภูมิการยืดที่เหมาะสมที่ 70 ଌ ถึง 80ଌ และต้องใช้เวลา 1 นาทีในการยืด 2 kb แรก จากนั้นต้องใช้เวลาเพิ่มอีกหนึ่งนาทีสำหรับการขยายเพิ่มเติมทุกๆ 1 kb Pfu DNA Polymerase เป็นเอนไซม์ที่ทนความร้อนได้อีกชนิดหนึ่งซึ่งมีอุณหภูมิการยืดตัวที่เหมาะสมที่ 75 ଌ Pfu DNA Polymerase ได้รับการแนะนำให้ใช้ใน PCR และปฏิกิริยาการต่อเติมของไพรเมอร์ที่ต้องการความเที่ยงตรงสูงและต้องใช้เวลา 2 นาทีสำหรับการขยายทุกๆ 1 kb ดูคำแนะนำจากผู้ผลิตสำหรับอุณหภูมิการยืดตัวที่แน่นอนและระยะเวลาการยืดตัวที่ระบุสำหรับ DNA polymerase แต่ละตัว

ขั้นตอนสุดท้ายของการหมุนเวียนความร้อนประกอบด้วยระยะเวลาการยืดที่ยาวขึ้น 5 นาทีหรือนานกว่านั้น ขั้นตอนสุดท้ายนี้ช่วยให้การสังเคราะห์แอมพลิคอนที่ยังไม่เสร็จสมบูรณ์จำนวนมากเสร็จสิ้นและในกรณีของ ตัก DNA polymerase อนุญาตให้เติมสารตกค้างของอะดีนีนที่ปลาย 3' ของผลิตภัณฑ์ PCR ทั้งหมด การปรับเปลี่ยนนี้เป็นสื่อกลางโดยกิจกรรมการถ่ายโอนปลายทางของ ตัก DNA polymerase และมีประโยชน์สำหรับขั้นตอนการโคลนโมเลกุลที่ตามมาซึ่งต้องใช้ระยะยื่น 3'

การสิ้นสุดของปฏิกิริยาทำได้โดยการทำให้ของผสมเย็นลงจนถึง 4 ଌ และ/หรือโดยการเติม EDTA ไปที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 10 มิลลิโมลาร์

7. ข้อควรพิจารณาที่สำคัญในการแก้ไขปัญหา PCR

หากเงื่อนไข PCR มาตรฐานไม่ให้แอมพลิคอนที่ต้องการ การปรับ PCR ให้เหมาะสมก็จำเป็นเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น ความเข้มงวดของปฏิกิริยาอาจถูกมอดูเลตในลักษณะที่ว่าความจำเพาะถูกปรับโดยการเปลี่ยนแปลงตัวแปร (เช่น ความเข้มข้นของรีเอเจนต์ สภาวะการวนรอบ) ที่ส่งผลต่อผลลัพธ์ของโปรไฟล์แอมพลิคอน ตัวอย่างเช่น หากปฏิกิริยาไม่เข้มงวดเพียงพอ แอมพลิคอนปลอมจำนวนมากจะถูกสร้างขึ้นโดยมีความยาวแปรผัน หากปฏิกิริยารุนแรงเกินไป จะไม่มีผลิตภัณฑ์เกิดขึ้น การแก้ไขปัญหาปฏิกิริยา PCR อาจเป็นความพยายามที่น่าผิดหวังในบางครั้ง อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์อย่างรอบคอบและความเข้าใจที่ดีเกี่ยวกับรีเอเจนต์ที่ใช้ในการทดลอง PCR สามารถลดระยะเวลาและการทดลองที่จำเป็นเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ต้องการ จากข้อพิจารณาทั้งหมดที่ส่งผลกระทบต่อความเข้มงวดของ PCR การไทเทรตของ Mg 2+ และ/หรือการจัดการอุณหภูมิการหลอมจะแก้ปัญหาส่วนใหญ่ได้ อย่างไรก็ตาม ก่อนที่จะเปลี่ยนแปลงสิ่งใด ตรวจสอบให้แน่ใจว่าผลลัพธ์ที่ผิดพลาดนั้นไม่ได้เกิดจากความผิดพลาดของมนุษย์ เริ่มต้นด้วยการยืนยันว่ารีเอเจนต์ทั้งหมดถูกเติมไปยังปฏิกิริยาที่กำหนดและรีเอเจนต์ไม่ถูกปนเปื้อน นอกจากนี้ ให้สังเกตผลลัพธ์ที่ผิดพลาด และถามคำถามต่อไปนี้: ไพรเมอร์หรี่มองเห็นได้บนเจลหลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส (สิ่งเหล่านี้ทำงานเป็นแถบขนาดเล็ก 𼄀 b ใกล้กับด้านล่างของเลน) หรือไม่ มีผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงหรือไม่ (แถบที่โยกย้ายในขนาดที่แตกต่างจากผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ)? มีสินค้าขาดหรือไม่? DNA เป้าหมายอยู่บนพลาสมิดหรือในสารสกัด DNA ของจีโนมหรือไม่? นอกจากนี้ ควรวิเคราะห์เนื้อหา G-C ของแอมพลิคอนที่ต้องการ

ขั้นแรกให้พิจารณาว่ารีเอเจนต์ PCR ใดเป็นหายนะต่อปฏิกิริยาของคุณ สิ่งนี้สามารถทำได้โดยการเตรียมรีเอเจนต์ใหม่ (เช่น สต็อคทำงานใหม่ การเจือจางใหม่) จากนั้นจึงเพิ่มรีเอเจนต์ใหม่ทีละตัวอย่างเป็นระบบให้กับของผสมที่ทำปฏิกิริยา กระบวนการนี้จะกำหนดว่าน้ำยาตัวใดเป็นตัวการสำหรับการทดสอบ PCR ที่ล้มเหลว ในกรณีของ DNA ที่เก่ามาก ซึ่งมักสะสมตัวยับยั้ง พบว่าการเพิ่ม albumin ในซีรัมของวัวอาจช่วยบรรเทาปัญหาได้

ไพรเมอร์ไดเมอร์สามารถก่อตัวขึ้นได้เมื่อไพรเมอร์ต้องการให้อบอ่อนหรืออบอ่อนด้วยตัวเองกับไพรเมอร์ตัวอื่นในปฏิกิริยา หากเป็นเช่นนี้ ผลิตภัณฑ์ขนาดเล็กที่น้อยกว่า 100 bp จะปรากฏบนเจล agarose เริ่มต้นด้วยการเปลี่ยนอัตราส่วนของเทมเพลตเป็นไพรเมอร์ หากความเข้มข้นของไพรเมอร์มากกว่าความเข้มข้นเทมเพลตมากเกินไป ไพรเมอร์จะมีแนวโน้มที่จะหลอมรวมตัวเองหรือกันและกันเหนือเทมเพลตดีเอ็นเอ การเพิ่ม DMSO และหรือการใช้วิธีการหมุนเวียนความร้อนแบบ hot start อาจช่วยแก้ปัญหาได้ ในที่สุดอาจจำเป็นต้องออกแบบไพรเมอร์ใหม่

ผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงจะผลิตขึ้นเมื่อความเข้มงวดของ PCR ต่ำเกินไปส่งผลให้มีแถบ PCR ที่ไม่เฉพาะเจาะจงที่มีความยาวผันแปรได้ สิ่งนี้สร้างเอฟเฟกต์บันไดบนเจลอากาโรส ดังนั้นจึงแนะนำให้เลือกเงื่อนไข PCR ที่เพิ่มความเข้มงวด รอยเปื้อนขนาดต่างๆ อาจเป็นผลมาจากไพรเมอร์ที่ออกแบบให้มีลำดับที่ซ้ำกันมากเมื่อขยายดีเอ็นเอของจีโนม อย่างไรก็ตาม ไพรเมอร์เดียวกันอาจขยายลำดับเป้าหมายบนพลาสมิดโดยไม่พบปัญหาเดียวกัน

การขาดผลิตภัณฑ์ PCR อาจเกิดจากสภาวะปฏิกิริยาที่เข้มงวดเกินไป ไพรเมอร์ไดเมอร์และโครงสร้างวงแหวนกิ๊บที่ก่อรูปด้วยไพรเมอร์หรือใน DNA แม่แบบที่แปลงสภาพแล้วยังอาจป้องกันการขยายผลิตภัณฑ์ PCR เนื่องจากโมเลกุลเหล่านี้อาจไม่สามารถจับคู่เบสกับคู่ของ DNA ที่ต้องการได้อีกต่อไป

หากยังไม่มีการวิเคราะห์เนื้อหา G-C ก็ถึงเวลาที่ต้องทำเช่นนั้น PCR ของภูมิภาคที่อุดมสมบูรณ์ของ G-C (เนื้อหา GC 㹠%) ก่อให้เกิดความท้าทายที่ยิ่งใหญ่ที่สุดบางประการสำหรับ PCR อย่างไรก็ตาม มีสารเติมแต่งมากมายที่ใช้เพื่อช่วยบรรเทาความท้าทาย

8. การจัดการรีเอเจนต์ PCR

การทำความเข้าใจเกี่ยวกับหน้าที่ของรีเอเจนต์ที่ใช้ใน PCR ทั่วไปเป็นสิ่งสำคัญในการตัดสินใจครั้งแรกว่าจะปรับเปลี่ยนสภาวะของปฏิกิริยาอย่างไรเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการได้ดีที่สุด ความสำเร็จอาจขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของMgCl2, KCl, dNTPs, ไพรเมอร์, แม่แบบ DNA หรือ DNA polymerase อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่ไม่ถูกต้องของรีเอเจนต์ดังกล่าวอาจนำไปสู่ผลลัพธ์ที่หลอกลวง ลดความเข้มงวดของปฏิกิริยาลง เมื่อแก้ไขปัญหา PCR ควรใช้รีเอเจนต์เพียงตัวเดียวในแต่ละครั้ง อย่างไรก็ตาม ควรใช้ความระมัดระวังในการไทเทรตรีเอเจนต์ที่ได้รับการจัดการ

เกลือแมกนีเซียม Mg 2+ (ความเข้มข้นของปฏิกิริยาสุดท้าย 0.5 ถึง 5.0 mM) โพลีเมอเรสของ DNA ที่ทนความร้อนได้จำเป็นต้องมีแมกนีเซียมเพื่อทำหน้าที่เป็นโคแฟกเตอร์ระหว่างกระบวนการปฏิกิริยา การเปลี่ยนความเข้มข้นของแมกนีเซียมเป็นหนึ่งในรีเอเจนต์ที่ง่ายที่สุดในการจัดการซึ่งอาจส่งผลกระทบมากที่สุดต่อความเข้มงวดของ PCR โดยทั่วไป ผลผลิตผลิตภัณฑ์ PCR จะเพิ่มขึ้นด้วยการเติมความเข้มข้นที่มากขึ้นของ Mg 2+ อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ Mg 2+ จะลดความจำเพาะและความเที่ยงตรงของ DNA polymerase ด้วย ผู้ผลิตส่วนใหญ่รวมสารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) พร้อมกับ DNA polymerase และสารละลายบัฟเฟอร์ 10X PCR สารละลายบัฟเฟอร์ PCR 10 X อาจมี 15 mM MgCl2ซึ่งเพียงพอสำหรับปฏิกิริยา PCR ทั่วไป หรืออาจถูกเติมแยกกันที่ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดสำหรับปฏิกิริยาเฉพาะ Mg 2+ ไม่ได้ถูกใช้จริงในปฏิกิริยา แต่ปฏิกิริยาไม่สามารถดำเนินต่อไปได้หากไม่มีอยู่ เมื่อมี Mg 2+ มากเกินไป อาจป้องกันไม่ให้แม่แบบ DNA เสื่อมสภาพโดยสมบูรณ์โดยทำให้สายดูเพล็กซ์มีเสถียรภาพ ปริมาณ Mg 2+ ที่มากเกินไปสามารถทำให้การหลอมไพรเมอร์ที่ปลอมแปลงมีเสถียรภาพไปยังไซต์เทมเพลตที่ไม่ถูกต้อง และลดความจำเพาะที่ส่งผลให้เกิดผลิตภัณฑ์ PCR ที่ไม่ต้องการ เมื่อมี Mg 2+ ไม่เพียงพอ ปฏิกิริยาจะไม่ดำเนินต่อไป ส่งผลให้ไม่มีผลิตภัณฑ์ PCR

เกลือโพแทสเซียม K + (ความเข้มข้นของปฏิกิริยาสุดท้ายที่ 35 ถึง 100 mM) ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ยาวขึ้น (10 ถึง 40 kb) จะได้รับประโยชน์จากการลดเกลือโพแทสเซียม (KCl) จากความเข้มข้นของปฏิกิริยาปกติ 50 mM ซึ่งมักใช้ร่วมกับการเติม DMSO และ/หรือ กลีเซอรอล หากแอมพลิคอนที่ต้องการต่ำกว่า 1,000 bp และเกิดผลิตภัณฑ์ที่ไม่จำเพาะเจาะจงแบบยาวขึ้น ความจำเพาะอาจดีขึ้นได้โดยการไทเทรต KCl โดยเพิ่มความเข้มข้นทีละ 10 mM เพิ่มขึ้นได้ถึง 100 mM การเพิ่มความเข้มข้นของเกลือทำให้โมเลกุล DNA สั้นลงสามารถแปลงสภาพไปเป็นโมเลกุล DNA ที่ยาวกว่าได้ดีกว่า

ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ 5'-ไตรฟอสเฟต (ความเข้มข้นของปฏิกิริยาสุดท้ายที่ 20 และ 200 μM ต่อตัว) ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ 5'-ไตรฟอสเฟต (dNTPs) อาจทำให้เกิดปัญหากับ PCR ได้ หากไม่มีความเข้มข้นเท่ากันที่เหมาะสม (เช่น [A] = [T] = [C] = [G]) และ/หรือเนื่องจากความไม่เสถียรจากการแช่แข็งและการละลายซ้ำหลายครั้ง ความเข้มข้นของ dNTP ปกติคือ 50 μM ของแต่ละ dNTP สี่ตัว อย่างไรก็ตาม PCR สามารถทนต่อความเข้มข้นระหว่าง 20 ถึง 200 μM แต่ละตัว ความเข้มข้นที่ต่ำกว่าของ dNTP อาจเพิ่มทั้งความจำเพาะและความเที่ยงตรงของปฏิกิริยา ในขณะที่ความเข้มข้นของ dNTP ที่มากเกินไปสามารถยับยั้ง PCR ได้จริง อย่างไรก็ตาม สำหรับชิ้นส่วน PCR ที่ยาวขึ้น อาจต้องใช้ความเข้มข้น dNTP ที่สูงขึ้น การเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของ dNTP ครั้งใหญ่อาจทำให้จำเป็นต้องเปลี่ยนความเข้มข้นของ Mg 2+ ที่สอดคล้องกัน

เอนไซม์ PCR DNA polymerase ที่มีความเสถียรทางความร้อนและบัฟเฟอร์ที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์เหล่านั้นมีมานานแล้วตั้งแต่เริ่มแรก ตัก DNA polymerase ถูกใช้ครั้งแรก ดังนั้น การเลือกเอ็นไซม์ที่เหมาะสมจึงมีประโยชน์ในการได้ผลิตภัณฑ์แอมพลิคอนที่ต้องการ ตัวอย่างเช่น การใช้ ตัก ดีเอ็นเอโพลีเมอร์อาจเป็นที่ต้องการมากกว่า Pfu DNA polymerase ถ้ากระบวนการและ/หรือการเติมสารตกค้างของอะดีนีนไปยังปลาย 3' ของผลิตภัณฑ์ PCR เป็นที่ต้องการ การเพิ่มอะดีนีน 3' กลายเป็นกลยุทธ์ที่มีประโยชน์สำหรับการโคลนผลิตภัณฑ์ PCR ลงในเวกเตอร์ TA โดยมีไทมีนยื่นออกมา 3 นิ้ว อย่างไรก็ตาม หากความเที่ยงตรงมีความสำคัญมากกว่า เอนไซม์เช่น Pfu อาจเป็นทางเลือกที่ดีกว่า ผู้ผลิตหลายรายมี DNA polymerase ที่ออกแบบมาเฉพาะสำหรับความต้องการเฉพาะทาง ดูสภาวะปฏิกิริยาและลักษณะของแอมพลิคอนที่ต้องการ จากนั้นจับคู่การทดลอง PCR กับ DNA polymerase ที่เหมาะสม ผู้ผลิตส่วนใหญ่มีตารางที่ช่วยในการเลือกดีเอ็นเอโพลีเมอเรสโดยระบุลักษณะต่างๆ เช่น ความเที่ยงตรง ผลผลิต ความเร็ว ความยาวเป้าหมายที่เหมาะสมที่สุด และไม่ว่าจะมีประโยชน์สำหรับการขยายพันธุ์แบบเข้มข้นของ G-C หรือ PCR แบบฮ็อตสตาร์ทหรือไม่

คุณภาพและความบริสุทธิ์ของ DNA แม่แบบ DNA จะมีผลอย่างมากต่อความเป็นไปได้ของการทดลอง PCR ที่ประสบความสำเร็จ ความเข้มข้นของ DNA และ RNA สามารถกำหนดได้โดยใช้การวัดความหนาแน่นเชิงแสงที่ 260 นาโนเมตร (OD260). มวลของกรดนิวคลีอิกที่ทำให้บริสุทธิ์ในสารละลายคำนวณที่ 50μg/ml ของ DNA สายคู่หรือ 40μg/ml สำหรับ RNA หรือ DNA สายเดี่ยวที่ OD260 =1.0. สารปนเปื้อนจากการสกัดดีเอ็นเอเป็นตัวยับยั้งทั่วไปใน PCR และควรหลีกเลี่ยงอย่างระมัดระวัง สารยับยั้งการสกัดดีเอ็นเอทั่วไปของ PCR ได้แก่ โปรตีน RNA ตัวทำละลายอินทรีย์และสารซักฟอก โดยใช้การดูดซึมสูงสุดของกรดนิวคลีอิก OD260 เมื่อเทียบกับโปรตีน OD280 (OD260/280) สามารถกำหนดค่าประมาณความบริสุทธิ์ของ DNA ที่สกัดได้ ตามหลักการแล้วอัตราส่วนของ OD260/280 อยู่ระหว่าง 1.8 ถึง 2.0 OD ที่ต่ำกว่า260/280 บ่งชี้ถึงการปนเปื้อนของโปรตีนและ/หรือตัวทำละลายซึ่งน่าจะเป็นปัญหาสำหรับ PCR นอกจากคุณภาพของเทมเพลต DNA แล้ว การเพิ่มประสิทธิภาพของปริมาณ DNA อาจเป็นประโยชน์อย่างมากต่อผลลัพธ์ของการทดลอง PCR แม้ว่าจะสะดวกที่จะกำหนดปริมาณใน ng/μl ซึ่งมักจะเป็นผลลัพธ์สำหรับนาโนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ทันสมัย ​​แต่หน่วยที่เกี่ยวข้องสำหรับการทดลอง PCR ที่ประสบความสำเร็จก็คือจำนวนโมเลกุล นั่นคือ สำเนาแม่แบบ DNA จำนวนเท่าใดที่มีลำดับที่ประกอบกับไพรเมอร์ PCR โมเลกุลเป้าหมายที่เหมาะสมที่สุดอยู่ระหว่าง 10 4 ถึง 10 7 โมเลกุล และอาจคำนวณได้ตามที่อธิบายไว้ในหมายเหตุข้างต้น

9. สารเติมแต่ง

สารเติมแต่งอาจให้ผลลัพธ์เมื่อสิ่งอื่นล้มเหลว การทำความเข้าใจรีเอเจนต์และสิ่งที่พวกเขาใช้สำหรับเป็นสิ่งสำคัญในการพิจารณาว่ารีเอเจนต์ใดอาจมีประสิทธิภาพสูงสุดในการได้มาซึ่งผลิตภัณฑ์ PCR ที่ต้องการ การเพิ่มรีเอเจนต์ในปฏิกิริยามีความซับซ้อนโดยข้อเท็จจริงที่ว่าการจัดการรีเอเจนต์หนึ่งอาจส่งผลต่อความเข้มข้นที่ใช้งานได้ของรีเอเจนต์อื่น นอกเหนือจากรีเอเจนต์ที่แสดงด้านล่างแล้ว สารเติมแต่งที่มีกรรมสิทธิ์ในเชิงพาณิชย์ยังมีให้จากบริษัทเทคโนโลยีชีวภาพหลายแห่ง

10. สารเติมแต่งที่เป็นประโยชน์ต่อเทมเพลต GC Rich

ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (ความเข้มข้นของปฏิกิริยาสุดท้ายที่ 1-10% DMSO) ในการทดลอง PCR โดยที่ DNA แม่แบบนั้นอุดมไปด้วย G-C โดยเฉพาะ (เนื้อหา GC 㹠%) การเพิ่ม DMSO อาจเพิ่มปฏิกิริยาโดยขัดขวางการจับคู่เบสและลด T อย่างมีประสิทธิภาพNS. บาง TNS เครื่องคิดเลขมีรายการตัวแปรสำหรับเพิ่มความเข้มข้นของ DMSO ที่ต้องการในการทดลอง PCR อย่างไรก็ตาม การเพิ่ม DMSO มากกว่า 2% อาจต้องเพิ่ม DNA polymerase มากขึ้น เนื่องจากได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถยับยั้ง ตัก ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส

ฟอร์มาไมด์ (ความเข้มข้นของปฏิกิริยาสุดท้ายที่ 1.25-10%) เช่นเดียวกับ DMSO ฟอร์มาไมด์ยังขัดขวางการจับคู่เบสในขณะที่เพิ่มความเข้มงวดของการหลอมไพรเมอร์ ซึ่งส่งผลให้ไพรเมอร์ไม่จำเพาะเจาะจงน้อยลงและเพิ่มประสิทธิภาพในการขยายเสียง นอกจากนี้ ฟอร์มาไมด์ยังได้รับการแสดงว่าเป็นตัวเสริมสำหรับเทมเพลตที่อุดมด้วย GC

7-deaza-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate (ความเข้มข้นของปฏิกิริยาสุดท้ายของ dc 7 GTP 3 dc 7 GTP:1 dGTP 50 μM) โดยใช้ 3 ส่วนหรือ 37.5 μM ของ guanosine base analog dc 7 GTP เมื่อใช้ร่วมกับ 1 ส่วนหรือ 12.5 μM dGTP จะทำให้การก่อตัวของโครงสร้างทุติยภูมิในผลิตภัณฑ์ไม่เสถียร เนื่องจากแอมพลิคอนหรือ DNA แม่แบบถูกทำให้เสียสภาพ มักจะสร้างโครงสร้างรอง เช่น กิ๊บติดผม การรวม dc 7 GTP เข้ากับแอมพลิคอนของ DNA จะห้ามการก่อตัวของโครงสร้างที่ผิดปกติเหล่านี้

dc 7 GTP จะลดทอนสัญญาณของการย้อมสีเอทิเดียมโบรไมด์ ซึ่งเป็นเหตุให้มีการใช้ในอัตราส่วน 3:1 กับ dGTP

เบทาอีน (ความเข้มข้นของปฏิกิริยาสุดท้ายที่ 0.5 ถึง 2.5 โมลาร์) เบทาอีน (N,N,N-ไตรเมทิลไกลซีน) เป็นแอนะล็อกของกรดอะมิโนที่มีสวิตเตอร์ไอออนที่ลดและอาจขจัดการพึ่งพาอุณหภูมิหลอมละลายของดีเอ็นเอในองค์ประกอบนิวคลีโอไทด์ ใช้เป็นสารเติมแต่งเพื่อช่วยในการขยาย PCR ของเป้าหมายที่อุดมไปด้วย GC เบทาอีนมักใช้ร่วมกับ DMSO และสามารถเพิ่มโอกาสในการขยาย DNA เป้าหมายที่มีเนื้อหา GC สูงได้อย่างมาก

11. สารเติมแต่งที่ช่วย PCR เมื่อมีสารยับยั้ง

สารซักฟอกที่ไม่ใช่ไอออนิกทำหน้าที่ยับยั้งการสร้างโครงสร้างทุติยภูมิและช่วยรักษาเสถียรภาพของ DNA polymerase ผงซักฟอกที่ไม่ใช่ไอออนิก เช่น Triton X-100, Tween 20 หรือ NP-40 อาจใช้ที่ความเข้มข้นของปฏิกิริยา 0.1 ถึง 1% เพื่อเพิ่มการผลิตแอมพลิคอน อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่สูงกว่า 1% อาจยับยั้ง PCR การมีผงซักฟอกที่ไม่ใช่ไอออนิกลดความเข้มงวดของ PCR ซึ่งอาจนำไปสู่การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ปลอม อย่างไรก็ตาม การใช้สารเหล่านี้จะทำให้ผลกระทบจากการยับยั้ง SDS เป็นกลาง ซึ่งเป็นสารปนเปื้อนในโปรโตคอลการสกัดดีเอ็นเอเป็นครั้งคราว

การเติมโปรตีนจำเพาะ เช่น Bovine serum albumin (BSA) ที่ใช้กับโปรตีน 400 ng/μl และ/หรือ T4 ยีน 32 ที่ 150 ng/μl aid PCR เมื่อมีสารยับยั้ง เช่น FeCl3, เฮมิน, กรดฟุลวิค, กรดฮิวมิก, กรดแทนนิก หรือสารสกัดจากอุจจาระ น้ำจืด และน้ำทะเล อย่างไรก็ตาม สารยับยั้ง PCR บางชนิด รวมถึงเกลือน้ำดี บิลิรูบิน EDTA NaCl SDS หรือ Triton X-100 จะไม่ได้รับการบรรเทาโดยการเพิ่มโปรตีน BSA หรือ T4 ยีน 32

12. การปรับเปลี่ยนสภาพการปั่นจักรยาน

การปรับอุณหภูมิการหลอมให้เหมาะสมจะช่วยเพิ่มปฏิกิริยา PCR และควรพิจารณาร่วมกับสารเติมแต่งอื่นๆ และ/หรือควบคู่ไปกับการปรับเปลี่ยนอื่นๆ ในสภาวะการปั่น ดังนั้น ในการคำนวณอุณหภูมิการหลอมที่เหมาะสม จะใช้สมการต่อไปนี้: NSNS OPT = 0.3 TNS ไพรเมอร์ + 0.7 TNS สินค้า -14.9 NSNS ไพรเมอร์คำนวณเป็น TNS ของคู่ที่เสถียรน้อยกว่าโดยใช้สมการ: NSNS ไพรเมอร์ = ((ΔH/(ΔS+R x ln(c/4)))-273.15 + 16.6 บันทึก[K + ] โดยที่ ΔH คือผลรวมของการเปลี่ยนแปลงเอนทาลปีเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดสำหรับลูกผสม ΔS คือผลรวมของการเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด R คือค่าคงที่แก๊ส (1.99 cal K-1 mol-1) C คือความเข้มข้นของไพรเมอร์และ [K + ] คือความเข้มข้นของโพแทสเซียม สมการหลังสามารถคำนวณได้โดยใช้หนึ่งใน TNS เครื่องคิดเลขที่ระบุไว้ในเว็บไซต์ต่อไปนี้: http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html TNS สินค้ามีการคำนวณดังนี้: TNS สินค้า = 0.41(%G-C) + 16.6 บันทึก [K + ] - 675/ความยาวผลิตภัณฑ์ สำหรับปฏิกิริยา PCR ส่วนใหญ่ ความเข้มข้นของโพแทสเซียม ([K + ]) จะเท่ากับ 50 mM

Hot start PCR เป็นการดัดแปลงอเนกประสงค์โดยที่เวลาการเสียสภาพเริ่มต้นเพิ่มขึ้นอย่างมาก (ตารางที่ 4). การปรับเปลี่ยนนี้สามารถรวมเข้าไว้ด้วยกันโดยมีหรือไม่มีการปรับเปลี่ยนอื่น ๆ กับสภาพการปั่นจักรยาน นอกจากนี้ยังมักใช้ร่วมกับสารเติมแต่งสำหรับการสร้างแอมพลิคอนเจ้าอารมณ์ อันที่จริง PCR แบบ hot start ถูกรวมเข้าไว้ในเงื่อนไขปกติของสภาพการปั่นจักรยานทั่วไปมากขึ้นเรื่อยๆ มีการสาธิตการสตาร์ทแบบร้อนเพื่อเพิ่มผลผลิตแอมพลิคอน ในขณะที่เพิ่มความจำเพาะและความเที่ยงตรงของปฏิกิริยา เหตุผลเบื้องหลัง hot start PCR คือการกำจัดไพรเมอร์-ไดเมอร์และไพรเมอร์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง ซึ่งอาจเป็นผลจากการตั้งค่าปฏิกิริยาที่ต่ำกว่า TNS. ดังนั้น ปฏิกิริยาการเริ่มร้อนโดยทั่วไปจะทำให้ตัวอย่างร้อนจนถึงอุณหภูมิที่สูงกว่า T . ที่เหมาะสมที่สุดNSอย่างน้อยถึง 60ଌ ก่อนการขยายสัญญาณใดๆ จะเกิดขึ้น โดยทั่วไป DNA polymerase จะถูกระงับจากปฏิกิริยาในช่วงเวลาเริ่มต้น ที่ยืดออก และทำให้เกิดการเสื่อมสภาพ แม้ว่าบางครั้งส่วนประกอบอื่นๆ ของปฏิกิริยาจะถูกละเว้นแทน DNA polymerase แต่เราจะเน้นที่ DNA polymerase ในที่นี้ มีหลายวิธีที่ช่วยให้ DNA polymerase ยังคงไม่ทำงานหรือถูกแยกออกจากกันทางกายภาพจนกว่าช่วงการเปลี่ยนสภาพเริ่มต้นจะเสร็จสิ้น ซึ่งรวมถึงการใช้ตัวกั้นแว็กซ์ที่เป็นของแข็ง แอนติบอดีต้าน DNA โพลีเมอเรส และโปรตีนเสริม อีกทางหนึ่ง ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสอาจถูกเติมเข้าไปในปฏิกิริยาหลังจากรอบการเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นเสร็จสมบูรณ์

PCR ทัชดาวน์ (TD-PCR) มีวัตถุประสงค์เพื่อนำการเดาออกจาก TNS ข้อจำกัดในการคำนวณโดยการถ่ายคร่อมอุณหภูมิการหลอมที่คำนวณได้ แนวคิดคือการออกแบบเงื่อนไขการปั่นจักรยานสองขั้นตอน (ตารางที่ 5). ระยะแรกใช้อุณหภูมิการหลอมที่ต่ำลงเรื่อยๆ ทุกรอบที่สอง (ตามธรรมเนียม 1.0 & # x000b0C ) เริ่มต้นที่ 10 & # x 000b0C ขึ้นไปและสิ้นสุดที่ T ที่คำนวณได้NS หรือด้านล่างเล็กน้อย ระยะที่ 2 ใช้เงื่อนไข 3 ขั้นตอนมาตรฐาน โดยตั้งอุณหภูมิการหลอมไว้ที่ 5 ଌ ต่ำกว่าค่า T ที่คำนวณได้NS อีก 20-25 รอบ หน้าที่ของระยะแรกควรบรรเทา mispriming โดยให้ข้อได้เปรียบ 4 เท่ากับผลิตภัณฑ์ที่ถูกต้อง ดังนั้น หลังจาก 10 รอบ ความได้เปรียบ 410 เท่าจะให้ผลผลิต 4096 สำเนาของผลิตภัณฑ์ที่ถูกต้องเหนือสีรองพื้นปลอมใดๆ

Stepdown PCR นั้นคล้ายกับ TD-PCR โดยจะเพิ่มขึ้นทีละน้อยในช่วงแรกของการลงสี ตัวอย่างเช่น เฟสแรกจะลดอุณหภูมิการหลอมทุกรอบที่สองลง 3 ଌ โดยเริ่มต้นที่ 10 ଌ ด้านบนและสิ้นสุดที่ 2 ଌ ต่ำกว่าค่า T ที่คำนวณได้NS. เช่นเดียวกับ TD-PCR ระยะที่สองใช้เงื่อนไข 3 ขั้นตอนมาตรฐานโดยตั้งอุณหภูมิการหลอมไว้ที่ 5 & # x000b0C ต่ำกว่า T ที่คำนวณได้NS อีก 20-25 รอบ ซึ่งจะทำให้ผลิตภัณฑ์ที่ถูกต้องมีความได้เปรียบมากกว่าผลิตภัณฑ์รองพื้นปลอมถึง 256 เท่า

PCR ที่ช้าลงเป็นเพียงการดัดแปลงของ TD-PCR และประสบความสำเร็จในการขยายลำดับ G-C ที่มีความเข้มข้นสูง (มากกว่า 83%) (ตารางที่ 6). แนวคิดนี้คำนึงถึงคุณลักษณะที่ค่อนข้างใหม่ที่เกี่ยวข้องกับวงจรระบายความร้อนสมัยใหม่ ซึ่งช่วยให้สามารถปรับความเร็วทางลาดและอัตราการระบายความร้อนได้ โปรโตคอลยังใช้ dc 7 GTP เพื่อลดการสร้างโครงสร้าง 2 ° ที่สามารถยับยั้งปฏิกิริยาได้ ความเร็วทางลาดลดลงเหลือ 2.5 ଌ s -1 โดยมีอัตราการทำความเย็น 1.5 ଌ s -1 สำหรับรอบการหลอม ระยะแรกเริ่มด้วยอุณหภูมิการหลอม 70 ଌ และลดอุณหภูมิการหลอมลง 1 ଌ ทุก 3 รอบ จนกระทั่งถึง 58 ଌ จากนั้น ระยะที่สองจะดำเนินต่อไปด้วยอุณหภูมิการหลอมที่ 58 ଌ เป็นเวลา 15 รอบเพิ่มเติม

Nested PCR เป็นเครื่องมืออันทรงพลังที่ใช้ในการกำจัดผลิตภัณฑ์ปลอม การใช้ไพรเมอร์ที่ซ้อนกันมีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อมียีนที่คล้ายคลึงกันหลายยีนในจีโนมเดียวหรือเมื่อมีจำนวนสำเนาต่ำของลำดับเป้าหมายภายในประชากรที่ต่างกันของลำดับออร์โธโลกัส ขั้นตอนพื้นฐานเกี่ยวข้องกับไพรเมอร์สองชุดที่ขยายขอบเขตของ DNA เดียว ไพรเมอร์ชั้นนอกคร่อมส่วนที่น่าสนใจและใช้เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์ PCR ที่มักจะไม่เฉพาะเจาะจงใน 20 ถึง 30 รอบ จากนั้นใช้ส่วนหารขนาดเล็กซึ่งปกติประมาณ 5 μl จากปฏิกิริยา 50μl แรก จากนั้นจึงใช้เป็นเทมเพลต DNA สำหรับการขยายอีก 20 ถึง 30 รอบโดยใช้ไพรเมอร์ชุดที่สองที่หลอมรวมเข้ากับตำแหน่งภายในที่สัมพันธ์กับอันแรก ชุด.

โปรโตคอล PCR อื่นๆ มีความเชี่ยวชาญมากกว่าและอยู่นอกเหนือขอบเขตของบทความนี้ ตัวอย่าง ได้แก่ RACE-PCR, Multiplex-PCR, Vectorette-PCR, Quantitative-PCR และ RT-PCR

13. ผลการเป็นตัวแทน

ผลลัพธ์ PCR ที่เป็นตัวแทนถูกสร้างขึ้นโดยทำตามโปรโตคอล PCR พื้นฐานที่อธิบายไว้ข้างต้น ผลลัพธ์ที่ได้รวมเอากลยุทธ์การแก้ปัญหาหลายอย่างเพื่อแสดงให้เห็นถึงผลกระทบของรีเอเจนต์และเงื่อนไขต่างๆ ต่อปฏิกิริยา ยีนจากยีสต์ที่กำลังออกดอก Saccharomyces cerevisiae และจาก Mycobacteriophage ที่ไม่เคยมีมาก่อนถูกขยายในการทดลองเหล่านี้ โปรโตคอล PCR แบบ 3 ขั้นตอนมาตรฐานที่สรุปไว้ในตารางที่ 2 ถูกใช้สำหรับการทดลองทั้งสามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

ก่อนทำการทดลอง PCR จีโนม DNA จากทั้งคู่ S. cerevisiae และ Mycobacteriophage ถูกหาปริมาณและเจือจางให้มีความเข้มข้นที่จะยอมให้โมเลกุลของ DNA ระหว่าง 10 4 ถึง 10 7 โมเลกุลต่อปฏิกิริยา ได้เตรียมวัตถุดิบดังนี้ การเตรียมดีเอ็นเอของยีสต์จีโนมให้ผลผลิต 10 4 ng/μl การเจือจางจนถึง 10 ng/μl ถูกสร้างขึ้นโดยการเติม 48 & #x003bcl ลงใน 452 & #x003bcl ของบัฟเฟอร์ TE pH 8.0 ตั้งแต่ S. cerevisiae จีโนมประมาณ 12.5 Mb 10 ng ประกอบด้วย 7.41 X 10 5 โมเลกุล สารเตรียม Mycobacteriophage DNA ที่มีจีโนมให้ผลผลิต 313 ng/μl การเจือจางจนถึง 2 ng/μl ถูกสร้างขึ้นโดยการเติม 6.4 & #x003bcl ลงใน 993.6 & #x003bcl ของบัฟเฟอร์ TE pH 8.0 DNA ของฟาจนี้มีขนาดประมาณ 67 Kb ดังนั้น 1 ng มีโมเลกุล 2.73 X 10 7 ซึ่งอยู่ที่ขีด จำกัด บนของ DNA โดยทั่วไปที่ใช้สำหรับ PCR จากนั้นจึงใช้สต็อคทำงานเพื่อสร้างโซลูชันมาสเตอร์มิกซ์ที่ระบุไว้ใน ตารางที่ 7. การทดลองมีสภาพการปั่นจักรยานที่หลากหลายตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

ใน รูปที่ 3a, จีโนม DNA จาก S. cerevisiae ถูกใช้เป็นแม่แบบเพื่อขยายยีน GAL3 ซึ่งเข้ารหัสโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญกาแลคโตส เป้าหมายสำหรับการทดลองนี้คือการกำหนดความเข้มข้น Mg 2+ ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับชุดสารทำปฏิกิริยานี้ ไม่มี MgCl2 มีอยู่ในบัฟเฟอร์ PCR ดั้งเดิมและต้องถูกเสริมที่ความเข้มข้นที่ระบุด้วยช่วงที่ทดสอบตั้งแต่ 0.0 mM ถึง 5.0 mM ดังแสดงในรูป ผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีขนาดที่คาดไว้ (2098 bp) ปรากฏขึ้นโดยเริ่มต้นที่ความเข้มข้น Mg 2+ ที่ 2.5 mM (เลน 6) โดยมีความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดที่ 4.0 mM (เลน 9) ความเข้มข้นที่แนะนำโดยผู้ผลิตคือ 1.5 มิลลิโมลาร์ ซึ่งเป็นปริมาณที่จัดให้มีไว้ในบัฟเฟอร์ PCR ทั่วไป อาจน่าแปลกใจที่ความเข้มข้นที่จำเป็นสำหรับการสร้างผลิตภัณฑ์ในการทดลองนี้เกินจำนวนนี้

มีการใช้แม่แบบ DNA ที่แตกต่างกันสำหรับการทดลองที่นำเสนอใน รูปที่ 3b. จีโนม DNA จาก Mycobacteriophage ถูกใช้เพื่อขยายเซ็กเมนต์ DNA 566 bp ที่อนุรักษ์ไว้ เช่นเดียวกับการทดลองก่อนหน้านี้ ต้องกำหนดความเข้มข้นของ Mg 2+ ที่เหมาะสมที่สุด ตามที่แสดงใน รูปที่ 3bการขยายผลิตภัณฑ์ PCR ที่ต้องการต้องใช้อย่างน้อย 2.0 mM Mg 2+ (เลน 5) ในขณะที่มีความแปรปรวนมากขึ้นในปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นที่ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของMgCl2, ผลิตภัณฑ์ PCR ส่วนใหญ่ถูกสังเกตพบที่ 4 มิลลิโมลาร์ Mg 2+ (เลน 9), ความเข้มข้นเดียวกันที่สังเกตพบสำหรับยีน GAL3 ของยีสต์

สังเกตว่าในการทดลองที่นำเสนอใน รูปที่ 3A และ 3Bได้แถบแบบไม่ต่อเนื่องโดยใช้สภาวะการปั่นที่คิดว่าเหมาะสมที่สุดโดยพิจารณาจากอุณหภูมิการอบอ่อนของไพรเมอร์ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง อุณหภูมิการเปลี่ยนสภาพคือ 95ଌ โดยมีอุณหภูมิการหลอมที่ 61ଌ และการขยายถูกดำเนินการเป็นเวลา 1 นาทีที่ 72ଌ เป็นเวลา 30 รอบ จากนั้นทำการขยายเวลา 5 นาทีสุดท้ายที่ 72 ଌ สำหรับการทดลองครั้งที่สามที่นำเสนอใน รูปที่ 3cมีการเปลี่ยนแปลงสามประการในสภาวะการปั่นจักรยานที่ใช้ในการขยายยีน GAL3 ของยีสต์ อย่างแรก อุณหภูมิการหลอมลดลงจนถึงอุณหภูมิที่เหมาะสมรองลงมาคือ 58 ଌ ประการที่สอง ขยายเวลาเป็น 1 นาที 30 วินาที สาม จำนวนรอบเพิ่มขึ้นจาก 30 เป็น 35 เท่า จุดประสงค์คือเพื่อแสดงให้เห็นถึงผลกระทบของสภาวะการขยายสัญญาณที่ต่ำกว่าปกติ (กล่าวคือ ลดความเข้มงวดของปฏิกิริยา) ต่อการทดลอง PCR ตามที่แสดงใน รูปที่ 3c, อะไรคือวงดนตรีที่ไม่ต่อเนื่องใน รูปที่ 3aกลายเป็นรอยเปื้อนของผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงภายใต้สภาวะการปั่นจักรยานที่ไม่เหมาะสมเหล่านี้ นอกจากนี้ ด้วยความเข้มงวดโดยรวมของปฏิกิริยาลดลง จึงต้องใช้ปริมาณ Mg 2+ ที่ต่ำกว่าเพื่อสร้างแอมพลิคอน

การทดลองทั้งสามแสดงให้เห็นว่าเมื่อความเข้มข้นของ Mg 2+ ต่ำเกินไป จะไม่มีการผลิตแอมพลิคอน ผลลัพธ์เหล่านี้ยังแสดงให้เห็นว่าเมื่อทั้งสภาวะการวนรอบได้รับการออกแบบอย่างถูกต้องและรีเอเจนต์อยู่ที่ความเข้มข้นที่เหมาะสม การทดลอง PCR จะสร้างแอมพลิคอนที่รอบคอบซึ่งสอดคล้องกับขนาดที่คาดไว้ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นถึงความสำคัญของการทำการทดลอง PCR ที่ความเข้มงวดสูงเพียงพอ (เช่น แถบที่รอบคอบและสเมียร์) นอกจากนี้ การทดลองยังระบุว่าการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์หนึ่งสามารถส่งผลต่อพารามิเตอร์อื่นได้ ซึ่งส่งผลต่อผลลัพธ์ของปฏิกิริยา

ตารางที่ 1. รีเอเจนต์ PCR ในลำดับที่ควรเติม

*หน่วยอาจแตกต่างกันระหว่างผู้ผลิต

** เพิ่มรีเอเจนต์ทั้งหมดลงในมาสเตอร์มิกซ์ ยกเว้นที่ต้องการการไทเทรตหรือที่อาจแปรผันตามปฏิกิริยา มาสเตอร์มิกซ์ที่แสดงไว้ในตารางด้านบนนี้คำนวณสำหรับปฏิกิริยา 11 ปฏิกิริยาบวก 2 ปฏิกิริยาเพิ่มเติมเพื่อรองรับการสูญเสียการถ่ายเทปิเปตเพื่อให้แน่ใจว่ามีปริมาณเพียงพอต่อการทำปฏิกิริยาแต่ละหลอด

 การปั่นจักรยาน PCR แบบมาตรฐาน 3 ขั้นตอน 
วงจรขั้นตอนอุณหภูมิเวลาจำนวนรอบ
การเปลี่ยนสภาพเบื้องต้น94 ଌ ถึง 98 ଌ1 นาที1
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ 5 ଌ ต่ำกว่า TNS 70 ଌ ถึง 80 ଌ 10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและดีเอ็นเอโพลีเมอเรส 25-35
ส่วนขยายสุดท้าย70 ଌ ถึง 80 ଌ5 นาที1
ถือ*4ଌ1

ตารางที่ 2 การปั่นจักรยาน PCR แบบมาตรฐาน 3 ขั้นตอน

* นักปั่นความร้อนส่วนใหญ่มีความสามารถในการหยุดชั่วคราวที่ 4ଌ อย่างไม่มีกำหนดเมื่อสิ้นสุดรอบ

 PCR Cycling แบบ 2 ขั้นตอน 
วงจรขั้นตอนอุณหภูมิเวลาจำนวนรอบ
การเปลี่ยนสภาพเบื้องต้น94 ଌ ถึง 98 ଌ1 นาที1
การเสื่อมสภาพ การอบอ่อน/การต่อเติม94 ଌ 70 ଌ ถึง 80 ଌ10 ถึง 60 วินาทีขึ้นอยู่กับ Amplicon และ DNA polymerase 25-35
ส่วนขยายสุดท้าย70 ଌ ถึง 80 ଌ5 นาที1

ตารางที่ 3 การปั่นจักรยาน PCR แบบ 2 ขั้นตอน

 Hot Start PCR Cycling 
วงจรขั้นตอนอุณหภูมิเวลารอบ
การเปลี่ยนสภาพเบื้องต้น60 ଌ ถึง 95 ଌ5 นาที จากนั้นเติม DNA polymerase1
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ 5 ଌ ต่ำกว่า TNS 70 ଌ ถึง 80 ଌ10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและดีเอ็นเอโพลีเมอเรส 25-35
ส่วนขยายสุดท้าย70 ଌ ถึง 80 ଌ5 นาที1

ตารางที่ 4 Hot Start PCR ปั่นจักรยาน.

 ทัชดาวน์ PCR Cycling 
วงจรขั้นตอนอุณหภูมิเวลารอบ
การเปลี่ยนสภาพเบื้องต้น94 ଌ ถึง 98 ଌ1 นาที1
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ X =10 ଌ เหนือ TNS 70 ଌ ถึง 80 ଌ10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและดีเอ็นเอโพลีเมอเรส 2
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ X-1 ଌ ลด 1 ଌ ทุกๆ รอบ 70 ଌ ถึง 80 ଌ10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและโพลีเมอเรส 28
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ 5 ଌ ต่ำกว่า TNS 70 ଌ ถึง 80 ଌ10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและดีเอ็นเอโพลีเมอเรส 20-25
ส่วนขยายสุดท้าย70 ଌ ถึง 80 ଌ5 นาที1

ตารางที่ 5. ขี่จักรยาน PCR ทัชดาวน์.

 การปั่นจักรยาน PCR ช้าลง 
วงจรขั้นตอนอุณหภูมิเวลารอบ
การเปลี่ยนสภาพเบื้องต้น94 ଌ ถึง 98 ଌ1 นาที1
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ X ଌ =10 ଌ เหนือ TNS 70 ଌ ถึง 80 ଌ10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและโพลีเมอเรส 2
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ X-1 ଌ ลด 1 ଌ ทุกรอบ 70 ଌ ถึง 80 ଌ*10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและโพลีเมอเรส 28
การเสื่อมสภาพ การหลอม ส่วนขยาย94 ଌ 5 ଌ ต่ำกว่า TNS 70 ଌ ถึง 80 ଌ10 ถึง 60 วินาที 30 วินาที ขึ้นอยู่กับแอมพลิคอนและโพลีเมอเรส 20-25
ส่วนขยายสุดท้าย70 ଌ ถึง 80 ଌ5 นาที1

ตารางที่ 6 การปั่นจักรยาน PCR ชะลอตัว

*สำหรับการชะลอตัว PCR ความเร็วของทางลาดจะลดลงเหลือ 2.5 & # x000b0C s -1 โดยมีอัตราการระบายความร้อน 1.5 & # x000b0C -1 สำหรับรอบการหลอม

ตารางที่ 7 การไทเทรตของ Mg 2+ ที่ใช้ใน รูปที่ 3.

รูปที่ 1. ปัญหาทั่วไปที่เกิดขึ้นกับไพรเมอร์และการขยาย PCR 3 ขั้นตอนของ DNA เป้าหมาย (a) การอบอ่อนด้วยตัวเองของไพรเมอร์ทำให้เกิดโครงสร้างวงปิ่นปักผมรอง โปรดทราบว่าไพรเมอร์ไม่ได้หลอมที่ปลายสุดเสมอและอาจสร้างโครงสร้างลูปที่เล็กกว่า (b) ไพรเมอร์หลอมซึ่งกันและกัน แทนที่จะเป็นเทมเพลตดีเอ็นเอ ทำให้เกิดไพรเมอร์ไดเมอร์ เมื่อไพรเมอร์หลอมรวมเข้าด้วยกัน ไพรเมอร์จะยืดออกไปจนถึงปลายไพรเมอร์ (c) รอบ PCR สร้างแอมพลิคอนเฉพาะ การวนรอบ PCR แบบ 3 ขั้นตอนมาตรฐานประกอบด้วยการทำให้ DNA แม่แบบเปลี่ยนสภาพ การหลอมของไพรเมอร์ และการขยาย DNA เป้าหมาย (แอมพลิคอน) ด้วย DNA polymerase

รูปที่ 2 ถังน้ำแข็งพร้อมรีเอเจนต์ ปิเปต และชั้นวางที่จำเป็นสำหรับ PCR (1.) ปิเปต P-200, (2.) ปิเปต P-1000, (3.) ปิเปต P-20, (4.) ปิเปต P-10, (5.) เพลต 96 หลุมและหลอด PCR ผนังบาง 0.2 มล. , (6.) รีเอเจนต์รวมถึง ตัก โพลีเมอเรส, บัฟเฟอร์ PCR 10X, MgCl2, น้ำปราศจากเชื้อ, dNTPs, ไพรเมอร์ และ DNA แม่แบบ (7) หลอดและชั้นวาง 1.8 มล.

รูปที่ 3 ตัวอย่างของการไทเทรต Mg 2+ ที่ใช้ในการเพิ่มประสิทธิภาพการทดลอง PCR โดยใช้โปรโตคอล PCR 3 ขั้นตอนมาตรฐาน (NS) S. cerevisiae จีโนม DNA ของยีสต์ถูกใช้เป็นแม่แบบเพื่อขยายยีน GAL3 2098 bp ในเลน 1 - 6 ซึ่งความเข้มข้นของ Mg 2+ ต่ำเกินไป จะไม่เกิดผลิตภัณฑ์ใดๆ (เลน 1-5) หรือมีผลิตภัณฑ์เกิดขึ้นน้อยมาก (เลน 6) เลน 7 - 11 แสดงถึงความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ Mg 2+ สำหรับการทดลอง PCR นี้ตามที่ระบุโดยผลิตภัณฑ์แอมพลิคอน 2098 bp (b) เทมเพลต DNA จีโนมของ mycobacteriophage ที่ไม่มีลักษณะเฉพาะถูกใช้เพื่อขยายแอมพลิคอน 566 bp เลน 1 - 4 ความเข้มข้นของ Mg 2+ ต่ำเกินไป ตามที่ระบุโดยการขาดผลิตภัณฑ์ เลน 5 - 11 แสดงถึงความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ Mg 2+ สำหรับ PCR นี้ตามที่ระบุโดยผลิตภัณฑ์แอมพลิคอนขนาด 566 kb (ค) . S. cerevisiae จีโนม DNA ของยีสต์ถูกใช้เป็นแม่แบบเพื่อขยายยีน GAL3 2098 bp ตามที่ระบุไว้ในแผง a อย่างไรก็ตาม อุณหภูมิในการหลอมลดลงจาก 61 ଌ เป็น 58ଌ ส่งผลให้เกิดแถบ PCR ที่ไม่จำเพาะที่มีความยาวผันแปรซึ่งทำให้เกิดรอยเปื้อนบนเจลอากาโรส เลน 1 - 4 ซึ่งความเข้มข้นของ Mg 2+ ต่ำเกินไป จะไม่เกิดผลิตภัณฑ์ขึ้น เลน 5 - 8 แสดงถึงความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ Mg 2+ สำหรับ PCR นี้ ซึ่งเห็นได้จากรอยเปื้อนและแถบคาดรอบขนาดผลิตภัณฑ์แอมพลิคอน 2098 kb เลน 9 - 11 บ่งบอกถึงสภาวะที่เข้มงวดเกินไปโดยไม่มีผลิตภัณฑ์เกิดขึ้น (a-c) เลน ​​12 เป็นตัวควบคุมเชิงลบที่ไม่มี DNA แม่แบบใด ๆ Lane M (เครื่องหมาย) ถูกโหลดด้วย NEB 1kb Ladder

รูปที่ 4 หลอดปลอดเชื้อใช้สำหรับ PCR (1.) หลอด 1.8 มล. (2.) หลอด PCR ผนังบาง 0.2 มล. (3.) หลอดและฝาปิด PCR ผนังบาง 0.2 มล.

รูปที่ 5 วงจรความร้อน ภาพด้านซ้ายของวงจรระบายความร้อนแบบปิด ภาพขวามีหลอด PCR ผนังบาง 0.2 มล. วางอยู่ในบล็อกความร้อนของวงจรระบายความร้อนแบบเปิด


7.6.3 อธิบายว่าเอ็นไซม์ลดพลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยาเคมีที่พวกมันเร่งปฏิกิริยา

ตัวทำปฏิกิริยาของปฏิกิริยาเคมีจำเป็นต้องได้รับพลังงานก่อนที่จะเกิดปฏิกิริยา พลังงานที่ต้องการนี้เรียกว่าพลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยา และจำเป็นต้องทำลายพันธะภายในสารตั้งต้น ในระยะต่อมาพลังงานปฏิกิริยาจะถูกปลดปล่อยออกมาเป็นพันธะใหม่ ปฏิกิริยาทางชีวภาพส่วนใหญ่เป็นแบบคายความร้อน ในปฏิกิริยาคายความร้อน พลังงานที่ปล่อยออกมาจากพันธะใหม่ที่เกิดขึ้นนั้นมีมากกว่าพลังงานกระตุ้น กล่าวอีกนัยหนึ่งปฏิกิริยาจะปล่อยพลังงาน เอ็นไซม์ทำให้ปฏิกิริยาเกิดขึ้นได้ง่ายขึ้นโดยการลดพลังงานกระตุ้นที่จำเป็นในปฏิกิริยาที่พวกมันเร่งปฏิกิริยา

รูปที่ 7.6.2 - พลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยาคายความร้อน


จะคำนวณหรือรู้ได้อย่างไรโดยการทดลองเอนโทรปีของเอ็นไซม์หรือโปรตีน? - ชีววิทยา

ต้องสมัครสมาชิก J o VE เพื่อดูเนื้อหานี้ คุณจะสามารถเห็นได้เพียง 20 วินาทีแรกเท่านั้น

เครื่องเล่นวิดีโอ JoVE เข้ากันได้กับ HTML5 และ Adobe Flash เบราว์เซอร์รุ่นเก่าที่ไม่รองรับ HTML5 และตัวแปลงสัญญาณวิดีโอ H.264 จะยังคงใช้โปรแกรมเล่นวิดีโอแบบ Flash เราแนะนำให้ดาวน์โหลด Flash เวอร์ชันใหม่ล่าสุดที่นี่ แต่เรารองรับเวอร์ชัน 10 ขึ้นไปทั้งหมด

หากไม่สามารถช่วยได้ โปรดแจ้งให้เราทราบ

การเปลี่ยนแปลงเอนทัลปีที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาเคมีสามารถวัดได้ด้วยเครื่องวัดความร้อน แต่ไม่สามารถวัดการเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาได้โดยตรง

เอนโทรปีเป็นฟังก์ชันสถานะ ซึ่งหมายความว่าการเปลี่ยนแปลงของเอนโทรปีขึ้นอยู่กับสถานะเริ่มต้นและขั้นสุดท้ายของระบบเท่านั้น ดังนั้น เช่นเดียวกับการเปลี่ยนแปลงเอนทาลปี การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีสามารถมาจากตารางอ้างอิงที่คำนวณได้ของเอนโทรปีกรามมาตรฐาน 

สำหรับปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นภายใต้สภาวะมาตรฐาน การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีที่เกี่ยวข้องถูกกำหนดโดยผลต่างระหว่างผลรวมของโมลาร์เอนโทรปีมาตรฐานของผลิตภัณฑ์คูณด้วยสัมประสิทธิ์ปริมาณสัมพันธ์ของพวกมัน และผลรวมของเอนโทรปีโมลาร์มาตรฐานของสารตั้งต้นคูณด้วยสัมประสิทธิ์ปริมาณสัมพันธ์ของพวกมัน

พิจารณาการเผาไหม้ของเอทิลีนภายใต้สภาวะมาตรฐาน โดยที่ก๊าซเอทิลีน 1 โมลทำปฏิกิริยากับก๊าซออกซิเจน 3 โมล เพื่อผลิตก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ 2 โมลและน้ำ 2 โมล

การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีมาตรฐานสำหรับปฏิกิริยาเท่ากับผลรวมของเอนโทรปีมาตรฐานของก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ 2 เท่า และเอนโทรปีมาตรฐานของน้ำ 2 เท่า ลบด้วยผลรวมของเอนโทรปีมาตรฐานของก๊าซเอทิลีน และ 3 เท่าของเอนโทรปีมาตรฐานของออกซิเจน 160

โปรดทราบว่าไม่เหมือนกับเอนทาลปีมาตรฐานของการก่อตัวขององค์ประกอบซึ่งเป็นศูนย์ เอนโทรปีของโมลาร์มาตรฐานของสารทั้งหมดมีค่ามากกว่าศูนย์ที่ 298 เค

การแทนที่ค่าสำหรับเอนโทรปีของโมลาร์ของสารตั้งต้นและผลิตภัณฑ์จากตารางอ้างอิงทำให้ได้ผลลัพธ์ [(2 × 213.8) + (2 × 70.0)] − [(219.5 + 3) × (205.3)] เอนโทรปีสุทธิของผลิตภัณฑ์เท่ากับ 567.6 J/K และเอนโทรปีสุทธิของสารตั้งต้นคือ 835.4 J/K

ความแตกต่างระหว่างผลิตภัณฑ์และสารตั้งต้นเท่ากับลบ 268 J/K สำหรับการเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีมาตรฐานของการเผาไหม้เอทิลีน ค่าลบแสดงว่าเอนโทรปีลดลง

แม้จะไม่ได้คำนวณการเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีที่แน่นอน การลดลงของเอนโทรปีก็สามารถทำนายได้โดยการตรวจสอบปฏิกิริยา จำไว้ว่าก๊าซมีความผิดปกติมากกว่าของเหลว

มีก๊าซในสารตั้งต้นมากกว่า ก๊าซ 4 โมล (มีเอทิลีน 1 โมลและออกซิเจน 3 โมล) เมื่อเทียบกับผลิตภัณฑ์ (ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์เพียง 2 โมล) ในขณะที่ผลิตภัณฑ์อื่นเป็นของเหลว

ดังนั้น ในปฏิกิริยานี้ สารตั้งต้นจะมีความผิดปกติมากกว่าผลิตภัณฑ์ ดังนั้นเอนโทรปีจะลดลงเมื่อปฏิกิริยาดำเนินไป

17.5: การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีมาตรฐานสำหรับปฏิกิริยา

เอนโทรปีเป็นฟังก์ชันของรัฐ ดังนั้น เอนโทรปีมาตรฐานจึงเปลี่ยนสำหรับปฏิกิริยาเคมี (ΔNS°rxn) สามารถคำนวณได้จากความแตกต่างของเอนโทรปีมาตรฐานระหว่างผลิตภัณฑ์กับสารตั้งต้น

ที่ไหน NSNS และ NSNS แทนค่าสัมประสิทธิ์ปริมาณสัมพันธ์ในสมการสมดุลของผลิตภัณฑ์และสารตั้งต้นตามลำดับ

ตัวอย่างเช่น ΔNS°rxn สำหรับปฏิกิริยาต่อไปนี้ที่อุณหภูมิห้อง

รายชื่อบางส่วนของเอนโทรปีมาตรฐานมีอยู่ในตาราง

สาร   ส° (เจ/โมล·K)  
ค (NSกราไฟท์) 5.740
  ค (NS, เพชร)   2.38
โคโลราโด (NS) 197.7
CO2 (NS) 213.8
CH4 (NS) 186.3
2ชม4 (NS) 219.5
2ชม6 (NS) 229.5
CH3โอ้ (l) 126.8
 C2ชม5โอ้ (l 160.7
ชม2 (NS) 130.57
ชม (NS) 114.6
ชม2โอ (NS) 188.71
ชม2โอ (l) 69.91
เอชซีไอ (NS) 186.8
ชม2NS (NS) 205.7
อู๋2 (NS) 205.03

ความมุ่งมั่นของ ΔNS°

พิจารณาการควบแน่นของน้ำซึ่งมีก๊าซH . 1 โมล2O เปลี่ยนเป็นของเหลว 1 โมลH2โอ.

การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีมาตรฐานสำหรับปฏิกิริยา ΔNS°rxn คำนวณโดยใช้เอนโทรปีของฟันกรามมาตรฐานและสัมประสิทธิ์ปริมาณสัมพันธ์

ค่าของ ΔNS°rxn เป็นลบ ตามที่คาดไว้สำหรับการเปลี่ยนเฟสนี้ (การควบแน่น)
ตัวอย่างที่สอง พิจารณาการเผาไหม้ของเมทานอล CH3โอ้:

ปฏิบัติตามขั้นตอนเดียวกันเพื่อคำนวณ การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีมาตรฐานของปฏิกิริยา:


รายงาน AP Lab 2 ปี 2544

บทนำ
เอนไซม์คือโปรตีนที่ผลิตโดยเซลล์ที่มีชีวิตซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา ซึ่งส่งผลต่ออัตราการเกิดปฏิกิริยาทางชีวเคมี พวกมันยอมให้ปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่ซับซ้อนเหล่านี้เกิดขึ้นที่อุณหภูมิค่อนข้างต่ำและใช้พลังงานน้อยลง

ในปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์ สารตั้งต้น สารที่จะกระทำการ จับกับบริเวณที่ทำงานบนเอนไซม์เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ แต่ละไซต์ที่ทำงานบนเอ็นไซม์มีลักษณะเฉพาะกับซับสเตรตที่มันจะจับกับทำให้แต่ละไซต์มีโครงสร้างสามมิติเป็นเอกเทศ ปฏิกิริยานี้สามารถย้อนกลับได้และแสดงดังต่อไปนี้:

เอ็นไซม์สามารถรีไซเคิลได้และไม่เปลี่ยนแปลงระหว่างการทำปฏิกิริยา แอคทีฟไซต์เป็นเพียงส่วนเดียวของเอ็นไซม์ที่ทำปฏิกิริยากับซับสเตรต อย่างไรก็ตาม โครงสร้างโปรตีนที่เป็นเอกลักษณ์ภายใต้สถานการณ์บางอย่างสามารถถูกทำให้เสียสภาพได้ง่าย ปัจจัยบางประการที่ส่งผลต่อปฏิกิริยาของเอนไซม์ ได้แก่ ความเข้มข้นของเกลือ ค่า pH อุณหภูมิ สารตั้งต้นและความเข้มข้นของผลิตภัณฑ์ สารกระตุ้นและสารยับยั้ง

เอ็นไซม์ต้องการสภาพแวดล้อมที่เฉพาะเจาะจงมากเพื่อให้เกิดอารมณ์ ความเข้มข้นของเกลือต้องอยู่ในความเข้มข้นปานกลาง หากความเข้มข้นของเกลือต่ำเกินไป สายด้านข้างของเอนไซม์จะดึงดูดกันและกันและก่อให้เกิดตะกอนที่ไม่ใช้งาน ในทำนองเดียวกัน ถ้าความเข้มข้นของเกลือสูงเกินไป ปฏิกิริยาของเอนไซม์จะถูกบล็อกโดยไอออนของเกลือ pH ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์จะเป็นกลาง (7 ในระดับ pH) ถ้า pH สูงขึ้นและกลายเป็นเบส เอ็นไซม์จะเริ่มสูญเสีย H+ ไอออน และถ้ามันเป็นกรดมากเกินไป เอ็นไซม์จะได้รับ H+ ไอออน เงื่อนไขทั้งสองนี้ทำให้เอ็นไซม์เสื่อมเสียและทำให้ไซต์แอคทีฟเปลี่ยนรูปร่าง

เอ็นไซม์ยังมีอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุด ซึ่งได้มาเมื่อเอ็นไซม์ทำงานเร็วที่สุด และหากเพิ่มสูงขึ้นอีก เอ็นไซม์จะเสื่อมสภาพ สำหรับความเข้มข้นของสารตั้งต้นและผลิตภัณฑ์ เอ็นไซม์ปฏิบัติตามกฎการกระทำของมวล ซึ่งบอกว่าทิศทางของปฏิกิริยาขึ้นอยู่กับความเข้มข้นโดยตรง ตัวกระตุ้นทำให้ไซต์แอคทีฟพอดีกับซับสเตรตทำให้อัตราการเกิดปฏิกิริยาเพิ่มขึ้น สารยับยั้งจะจับกับบริเวณแอคทีฟของเอนไซม์และปิดกั้นสารตั้งต้นจากการยึดเหนี่ยวทำให้เกิดปฏิกิริยาลดลง

เอนไซม์ในห้องปฏิบัติการนี้คือ catalase ซึ่งผลิตโดยสิ่งมีชีวิตเพื่อป้องกันการสะสมของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เป็นพิษ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์สลายตัวเป็นน้ำและออกซิเจนดังสมการต่อไปนี้

ปฏิกิริยานี้เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติโดยไม่มี catalase แต่เอนไซม์เร่งปฏิกิริยาได้มาก จุดประสงค์ของห้องปฏิบัติการนี้คือเพื่อพิสูจน์ว่า catalase เร่งการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และเพื่อกำหนดอัตราของปฏิกิริยานี้

สมมติฐาน
เอนไซม์คาตาเลสภายใต้สภาวะที่เหมาะสมจะเร่งการสลายตัวของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

วัสดุ
แบบฝึกหัดที่ 2A: การทดสอบกิจกรรม Catalase

ในส่วนที่ 1 วัสดุที่ใช้คือ 10 มล. ของ 1.5% H2O2, บีกเกอร์แก้ว 50 มล., แคตาเลส 1 มล. และปิเปตและปั๊มปิเปต 10 มล. 2 อัน ในส่วนที่ 2 วัสดุที่ใช้คือแคตาเลส 5 มล., อ่างน้ำเดือด, 1 หลอดทดลอง, ชั้นวางหลอดทดลอง, 10 มล. ของ 1.5% H2O2, บีกเกอร์ 50 มล. และปิเปตและปั๊มปิเปต 10 มล. 2 อัน ในส่วนที่ 3 วัสดุที่ใช้คือ 10 มล. ของ H2O2 1.5%, บีกเกอร์ 50 มล., ตับ และหลอดฉีดยา

แบบฝึกหัด 2B: การทดสอบพื้นฐาน

ส่วนนี้ของห้องปฏิบัติการต้องใช้ H2O2 1.5% 10 มล. H2O กลั่น 1 มล. H2SO4 10 มล. บีกเกอร์ 50 มล. 2 ใบกระดาษขาว 1 แผ่น KMnO4 5 มล. เข็มฉีดยา 5 มล. 2 อันและ 10 มล. 2 ใบ ปิเปตและปั๊ม

แบบฝึกหัดที่ 2C: อัตราการสลายตัวของ H2O2 แบบไม่เร่งปฏิกิริยา

วัสดุที่ใช้สำหรับส่วนนี้คือ 15 มล. H2O2 1.5%, H2O กลั่น 1 มล., H2SO4 10 มล., บีกเกอร์ 50 มล. 2 ใบ, กระดาษขาว 1 แผ่น, KMnO4 5 มล., เข็มฉีดยา 5 มล. 2 อัน และ 10 มล. 2 ใบ ปิเปตและปั๊ม

แบบฝึกหัด 2D: อัตราการสลายตัวของ H2O2 ที่กระตุ้นด้วยเอนไซม์

วัสดุที่จำเป็นสำหรับการออกกำลังกาย 2D คือ 70 มล. ของ 1.5% H2O2, 70 มล. ของ H2SO4, สารละลายคาตาเลส 6 มล., พลาสติก 13 ใบ, ถ้วยติดฉลาก, บีกเกอร์ 100 มล. 3 ชิ้น, บีกเกอร์ 50 มล. 1 ใบ, เข็มฉีดยา 10 มล. 1 ใบ, 1 เข็มฉีดยาขนาด 5 มล. เข็มฉีดยาขนาด 60 มล. 1 แผ่น กระดาษสีขาว ตัวจับเวลา และ KMnO4 30 มล.

วิธี
แบบฝึกหัดที่ 2A: การทดสอบกิจกรรม Catalase

ในส่วนที่ 1 10 มล. ของ 1.5% H2O2 ถูกถ่ายโอนไปยังบีกเกอร์ขนาด 50 มล. จากนั้น เติมสารละลายคาตาเลสสด 1 มล. และปฏิกิริยาถูกสังเกตพบและบันทึก ในส่วนที่ 2 คาตาเลส 5 มล. ถูกใส่ในหลอดทดลองและใส่ในอ่างน้ำเดือดเป็นเวลาห้านาที 10 มล. ของ 1.5% H2O2 ถูกถ่ายโอนไปยังบีกเกอร์ 50 มล. และ 1 มล. ของคาตาเลสที่ต้มแล้วถูกเติม สังเกตปฏิกิริยาและบันทึก ในส่วนที่ 3 10 มล. ของ 1.5% H2O2 ถูกถ่ายโอนไปยังบีกเกอร์ 50 มล. เติมตับ 1 ซม. 3 ลงในบีกเกอร์ และสังเกตและบันทึกปฏิกิริยา

แบบฝึกหัด 2B: การทดสอบพื้นฐาน

10 มล. ของ 1.5% H2O2 ถูกถ่ายโอนไปยังบีกเกอร์ 50 มล. H2O 1 มล. ถูกเติมแทนคาตาเลส และจากนั้น, 10 มล. ของ H2SO4 ถูกเติม หลังจากผสมให้เข้ากันแล้ว ตัวอย่างขนาด 5 มล. ถูกนำออกและวางบนกระดาษสีขาว ใช้กระบอกฉีดยาขนาด 5 มล. เพื่อเพิ่ม KMnO4 ครั้งละ 1 หยดจนได้สีน้ำตาลหรือสีชมพูถาวร สารละลายถูกหมุนวนหลังจากทุกหยด และผลลัพธ์ถูกสังเกตและบันทึก คำนวณการทดสอบพื้นฐานแล้ว

แบบฝึกหัดที่ 2C: อัตราการสลายตัวของ H2O2 แบบไม่เร่งปฏิกิริยา

H2O2 ปริมาณเล็กน้อยถูกใส่ลงในบีกเกอร์และเก็บไว้โดยเปิดทิ้งไว้ประมาณ 24 ชั่วโมง เพื่อกำหนดหาปริมาณของ H2O2 ที่เหลืออยู่ 10 มล. ของ 1.5% H2O2 ถูกถ่ายโอนไปยังบีกเกอร์ขนาด 50 มล. H2O 1 มล. ถูกเติมแทนคาตาเลส และจากนั้น, 10 มล. ของ H2SO4 ถูกเติม หลังจากผสมให้เข้ากันแล้ว ตัวอย่างขนาด 5 มล. ถูกนำออกและวางบนกระดาษสีขาว ใช้กระบอกฉีดยาขนาด 5 มล. เพื่อเพิ่ม KMnO4 ครั้งละ 1 หยดจนได้สีน้ำตาลหรือสีชมพูถาวร สารละลายถูกหมุนวนหลังจากทุกหยด และผลลัพธ์ถูกสังเกตและบันทึก เปอร์เซ็นต์ของ H2O2 ที่ย่อยสลายเองตามธรรมชาติถูกคำนวณ

แบบฝึกหัด 2D: อัตราการสลายตัวของ H2O2 ที่กระตุ้นด้วยเอนไซม์

การทดสอบพื้นฐานได้รับการสถาปนาขึ้นใหม่ตามคำแนะนำของแบบฝึกหัดที่ 2B ก่อนเริ่มการทดลองจริงจำเป็นต้องมีการเตรียมการจำนวนมาก ถ้วยที่มีฉลากหกใบถูกกำหนดไว้ตามเวลาของพวกมัน และเติม H2O2 10 มล. ในแต่ละถ้วย แคตาเลส 6 มล. ถูกใส่ในหลอดฉีดยา 10 มล. และ 60 มล. ของ H2SO4 ถูกใส่ในหลอดฉีดยา 60 มล. ในการเริ่มต้นห้องปฏิบัติการจริง ให้เติมคาตาเลส 1 มล. ลงในถ้วยแต่ละใบ พร้อมเริ่มจับเวลาพร้อมกัน ถ้วยแต่ละใบหมุนวน ที่ 10 วินาที, 10 มิลลิลิตรของ H2SO4 ถูกเติมเพื่อหยุดปฏิกิริยา ทำซ้ำขั้นตอนเดียวกันสำหรับถ้วย 30, 60, 120, 180 และ 360 วินาทีตามลำดับ

หลังจากนั้น ย้ายตัวอย่าง 5 มล. ห้าตัวอย่างของแต่ละถ้วยที่ใหญ่กว่าไปยังถ้วยขนาดเล็กที่มีป้ายกำกับที่สอดคล้องกัน แต่ละตัวอย่างถูกวิเคราะห์แยกกันโดยวางแต่ละตัวอย่างไว้บนกระดาษสีขาว ใช้กระบอกฉีดยาขนาด 5 มล. เพื่อเพิ่ม KMnO4 ครั้งละ 1 หยดจนได้สีน้ำตาลหรือสีชมพูถาวร สารละลายถูกหมุนวนหลังจากทุกหยด และผลลัพธ์ถูกสังเกตและบันทึก


อณูชีววิทยา 02: 'อุณหพลศาสตร์ของการพับโปรตีน'

ต่อจากการบรรยาย 01. ω เสมอ 0 หรือ +180°. หากคุณพลอต Φ และ Ψ คุณจะพบว่ามีคลัสเตอร์เพียงไม่กี่กลุ่มที่มีตัวแทนที่ดี: ช่วงของการรวม α-helix พื้นที่ β-ชีต และพื้นที่ที่หายากกว่าที่สาม (เรียกว่า Lα และเติมโดย α-helix ที่ถนัดซ้าย) ω มักพบใน ทรานส์ โครงสร้างเนื่องจากการกีดขวาง steric ของโซ่ด้านข้างที่ต่อเนื่องกัน อย่างไรก็ตาม โพรลีนเนื่องจากยึดกับกระดูกสันหลัง มีการบิดที่เป็นเอกลักษณ์ที่ช่วยให้ cis โครงสร้าง

โครงสร้างรอง

α-helices และ β-sheets เป็นสองวิธีในการยอมให้กลุ่ม NH และ C=O บนกระดูกสันหลังสร้างพันธะไฮโดรเจน α-เฮลิซมี 3.6 เรซิดิวต่อการหมุน หรือกล่าวอีกนัยหนึ่ง เรซิดิวแต่ละตัวครอบคลุมการหมุน 100° ขั้นต่อเนื่องกันของการหมุน α-เฮลิกส์ถูกคั่นด้วย 5.4Å α-เฮลิซคือ เกือบ เฉพาะคนถนัดขวาเท่านั้น ใน α-helix ที่ถนัดขวา คุณจะหมุนทวนเข็มนาฬิกาเมื่อคุณไป ขึ้น. ใน α-helix ที่ถนัดซ้าย คุณจะหมุนตามเข็มนาฬิกาเมื่อคุณขึ้นไป โซ่ด้านข้างชี้ออกไปด้านนอกจากเกลียว หากคุณวาดจุดที่มีสารตกค้างอยู่บนเกลียวโดยยึดตามกฎ 3.6 เรซิดิว/เลี้ยว คุณจะพบว่าเฮลิซแบบครึ่งฝังครึ่งแอมฟิพาติคมีเรซิดิวที่ไม่ชอบน้ำทั้งหมดอยู่ด้านหนึ่งและส่วนที่ชอบน้ำอยู่อีกด้านหนึ่ง เกลียวที่ถูกฝังอย่างสมบูรณ์จะเป็นเรซิดิวที่ไม่ชอบน้ำทั้งหมด และเกลียวที่เปิดเผยเต็มที่จะเป็นเรซิดิวที่ชอบน้ำทั้งหมด

ในแผ่น β พันธะ H ที่เป็นไปได้ทั้งหมดจะได้รับความพึงพอใจ ยกเว้นเส้นใย "ขนาบข้าง" ที่ปลายด้านใดด้านหนึ่งของแผ่นงาน ประมาณ 20% ของ β-ชีตที่พบในธรรมชาติเป็นแบบผสมขนานและต้านแบบขนาน อีก 80% เป็นกระดาษบริสุทธิ์อย่างใดอย่างหนึ่ง แผ่นบีตาไม่เรียบแต่เป็นจีบ

โครงสร้างตติยภูมิ

แผ่นเดียวหรือเกลียวไม่เสถียรในน้ำ โครงสร้างระดับตติยภูมิคือการบรรจุองค์ประกอบเหล่านี้เข้าด้วยกัน และวนลูปเชื่อมต่อเข้าด้วยกัน

อุณหพลศาสตร์ของการพับโปรตีน

มีปัญหาพื้นฐานสองประการในการพับโปรตีน:

  1. เราสามารถทำนายโครงสร้างของโปรตีนจากลำดับของมันได้หรือไม่? การสุ่มตัวอย่างรูปแบบที่เป็นไปได้ทั้งหมดของสายพอลิเปปไทด์เพื่อค้นหาสถานะพลังงานต่ำสุดจะใช้เวลาหลายล้านปีแทนที่จะเป็นไม่กี่วินาที แล้วโปรตีนจะพับอย่างรวดเร็วได้อย่างไร

ตัวอย่างเช่น ลองพิจารณาความแตกแยกของ metalloprotease ของ Notch เพื่อสร้างโดเมนภายในเซลล์ของ Notch (NICD) ซึ่งจะย้ายไปยังนิวเคลียสและส่งผลต่อการถอดรหัส เว็บไซต์สลายโปรตีนของ Notch ได้รับการคุ้มครองโดย Lin12/Notch ซ้ำซึ่งเชื่อมต่อกับการทำซ้ำ EGF ที่โต้ตอบกับลิแกนด์ของ Notch เชื่อกันว่าแกนด์จะใช้แรงที่แผ่ขยายบริเวณนี้ ทำให้เกิดความแตกแยก การกลายพันธุ์ซึ่งทำให้ส่วนพับนี้ไม่เสถียรและส่งผลให้เกิดการกระตุ้นที่เป็นส่วนประกอบทำให้เกิดเนื้องอก

อุณหพลศาสตร์สามารถอธิบายได้เท่านั้น ไม่ว่า ปฏิกิริยาเคมีจะเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติหรือไม่ ไม่สำคัญว่าจะเกิดขึ้นได้เร็วเพียงใด (ดูชีวเคมี 01)

พลังงานของระบบคือความสามารถในการทำงาน

โดยที่ U คือพลังงานภายใน q คือความร้อนและ w คืองาน

โดยที่ C คือความจุความร้อนและ f และฉันหมายถึงสุดท้ายและเริ่มต้น

โดยที่ F คือแรงและ Δx คือการกระจัดตามแนวแกน x

หากคุณละลายยูเรียในน้ำด้วยสารละลาย 4M ยูเรียจะละลายเองตามธรรมชาติและสารละลายจะเย็นลง (เช่นเดียวกับกวานิดีน ตามที่ฉันได้เรียนรู้ที่นี่)

พลังงานอิสระของกิบบ์ถูกกำหนดเป็น:

โดยที่ G, H, T และ S เป็นพลังงานอิสระของกิบบ์ เอนทาลปี อุณหภูมิ และเอนโทรปีตามลำดับ

ถ้า ΔG < 0 ปฏิกิริยาจะเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ

ในตัวอย่างยูเรีย ΔH > 0 เนื่องจากพลังงานจำเป็นต้องดึงออกจากโมเลกุลที่มีปฏิสัมพันธ์กันของยูเรีย โดยใช้ความร้อนจากน้ำ ทว่าปฏิกิริยายังคงเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติเพราะ ΔS > 0 โดยมาก - สารละลายยูเรียมีความเอนโทรปิกมากกว่ายูเรียและน้ำแยกจากกัน

สำหรับปฏิกิริยา A + B ↔ C + D เรากำหนด:

ATP เป็นโมเลกุลพิเศษ: การไฮโดรไลซิสของมันเป็น ADP เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติที่ความเข้มข้นทางสรีรวิทยาของสารตั้งต้นและผลิตภัณฑ์ เช่น ΔG < 0 สำหรับปฏิกิริยานี้:

หลักการของ Le Chatelier กล่าวว่าคุณสามารถขับเคลื่อนปฏิกิริยาย้อนกลับ ทำให้ ATP เกิดขึ้นได้เองโดยการเพิ่มความเข้มข้นของ procuts อย่างไรก็ตาม [Pผม] ไม่เคยสูงพอในเซลล์ที่ ATP จะเกิดขึ้นเองจาก ADP การผลิต ATP ที่ไม่เอื้ออำนวยจะถูกสร้างขึ้นผ่านปฏิกิริยาควบคู่ไปกับปฏิกิริยาที่น่าพอใจ เช่น การปล่อยโปรตอนข้ามเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (ดู ชีวเคมี 08)

เอนทัลปี

โดยที่ U, P และ V คือพลังงาน ความดัน และปริมาตรภายใน

ในสภาวะทางสรีรวิทยา การเปลี่ยนแปลงของความดันและปริมาตรนั้นแทบไม่มีความสำคัญเสมอ ดังนั้น H และ U จึงมีความเกี่ยวข้องกันอย่างใกล้ชิด กล่าวอีกนัยหนึ่ง ในระบบทางชีววิทยาส่วนใหญ่ เอนทาลปีมีค่าเท่ากับพลังงานภายใน

ผู้คนได้พัฒนาแบบจำลองพลวัตของโมเลกุลของแรงอะตอมพื้นฐานที่กำหนดเอนทัลปีของโปรตีน (มุมไดฮีดรัล ปฏิกิริยาแวนเดอร์วาลส์ ปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิต ฯลฯ) และพยายามลดพลังงานให้เหลือน้อยที่สุดเพื่อตรวจสอบการพับของโปรตีน แต่มีระดับความเป็นอิสระมากมายที่ค่าใช้จ่ายในการคำนวณห้ามไม่ให้ใช้การจำลองนานพอที่จะค้นหาสถานะพลังงานต่ำสุด ยังคงมีความพยายามเช่น [email protected], Foldit และ D.E. แอนตันของชอว์ แอนตันมีสถิติสำหรับการจำลองไดนามิกของโมเลกุลที่ยาวที่สุด - มันวิ่งมาเป็นระยะเวลานานนับไม่ถ้วน โดยคำนวณพลังงานที่โปรตีนจะมีในทุกเฟมโตวินาทีหรืออย่างอื่น เพื่อจำลองการเคลื่อนไหวของโปรตีน 1 มิลลิวินาที เห็นได้ชัดว่าเวลาที่ Anton ใช้ในการจำลองมิลลิวินาทีนั้นมากกว่ามิลลิวินาที

เอนโทรปี

ที่ไหน kNS คือค่าคงที่ของ Boltzmann และ W คือจำนวนไมโครสเตทที่ก่อให้เกิดสถานะมหภาคที่น่าสนใจ

คำอธิบายที่ฉันชอบเกี่ยวกับเรื่องนี้คือคำอธิบายของ Richard Feynman เมื่อฉันอ่าน ฉันเข้าใจเป็นครั้งแรกว่าเอนโทรปีทางกายภาพและเอนโทรปีข้อมูลเป็นแนวคิดเดียวกันอย่างไร:

ดังนั้นตอนนี้เราต้องพูดถึงสิ่งที่เราหมายถึงโดยความไม่เป็นระเบียบและสิ่งที่เราหมายถึงตามลำดับ … สมมติว่าเราแบ่งช่องว่างออกเป็นองค์ประกอบที่มีปริมาตรน้อย ถ้าเรามีโมเลกุลขาวดำ เราจะกระจายพวกมันระหว่างองค์ประกอบปริมาตรได้กี่วิธีเพื่อให้สีขาวอยู่ด้านหนึ่งและสีดำอยู่อีกด้านหนึ่ง ในทางกลับกัน เราจะแจกจ่ายได้อย่างไรโดยไม่มีข้อจำกัดว่าจะไปที่ไหน? เห็นได้ชัดว่ามีหลายวิธีในการจัดเรียงในกรณีหลัง เราวัด "ความผิดปกติ" ด้วยจำนวนวิธีจัดเรียงอวัยวะภายใน เพื่อให้ดูเหมือนกันจากภายนอก ลอการิทึมของจำนวนวิธีนั้นคือเอนโทรปี จำนวนวิธีในกรณีที่แยกจากกันนั้นน้อยลง ดังนั้นเอนโทรปีจึงน้อยลง หรือ “ความผิดปกติ” ก็น้อยลง

— Richard Feynman อ้างถึงที่นี่

ในทางชีววิทยา เอนโทรปีมักเป็นแรงผลักดัน เช่น การฝังโดเมนโปรตีนที่ไม่ชอบน้ำ ลองนึกภาพโมเลกุลของน้ำในจัตุรมุข จัตุรมุขมีสี่มุม และน้ำมีไฮโดรเจน 2 ตัว ดังนั้นคุณสามารถวางโมเลกุลใน 4 เลือกทิศทาง 2 = 6 หากคุณเพิ่มกลุ่มไม่มีขั้วของโมเลกุลข้างเคียงที่มุมหนึ่งของจัตุรมุข มีเพียงสามในหกสถานะเท่านั้นที่ยังคงดีอยู่ (โดยยังคงปล่อยให้เกิดพันธะไฮโดรเจน) ดังนั้น ΔSไม่ชอบน้ำ = kNSln(3) - kNSln(6) < 0 หมายความว่าเอนโทรปีลดลง

พิจารณาการผสมอีพ็อกซี่และสารเพิ่มความแข็งให้เป็นอีพ็อกซี่ที่บ่มแล้ว ปฏิกิริยานี้มี ΔS < 0 เนื่องจากของแข็งมีไมโครสเตทน้อยกว่าของเหลว ทว่าปฏิกิริยานั้นเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติที่อุณหภูมิห้อง ดังนั้นมันจะต้องเป็นความจริงที่ ΔH < 0 ความร้อนจึงถูกปลดปล่อยออกมา อันที่จริง ปฏิกิริยานั้นเป็นปฏิกิริยาคายความร้อนอย่างยิ่ง โจวัดอุณหภูมิของ “อีพ็อกซี่ 5 นาที” และเพิ่มขึ้นจาก 21°C เป็น >40°C ที่เครื่องหมาย 5 นาที

มุมมองที่ไม่ถูกต้องและเรียบง่ายของการพับโปรตีนมีดังนี้ โปรตีนที่กางออกมีเอนโทรปีที่มีการจัดโครงแบบสูงแต่ยังมีเอนทาลปีสูงด้วยเนื่องจากมีปฏิสัมพันธ์ที่เสถียรเพียงเล็กน้อย โปรตีนพับมีเอนโทรปีน้อยกว่ามาก แต่ก็มีเอนทาลปีน้อยกว่ามากมีการแลกเปลี่ยนระหว่าง H และ S ที่นี่ โปรดทราบว่าเนื่องจาก ΔG = ΔH - TΔS อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นจะทำให้ค่า S มีน้ำหนักมากขึ้น ซึ่งหมายความว่าอุณหภูมิที่สูงขึ้นจะเอื้อต่อการกางออก

คำอธิบายทั้งหมดนั้นพิจารณาเฉพาะพลังงานของโปรตีนเท่านั้น ไม่ใช่ของตัวทำละลาย อันที่จริง โดเมนที่ไม่ชอบน้ำของโปรตีนจำกัดการกำหนดค่าที่เป็นไปได้ของน้ำโดยรอบ (ดูคำอธิบายด้านบน) ดังนั้นการฝังเมื่อพับจะเพิ่มเอนโทรปีของน้ำ นอกจากนี้ ปรากฎว่าพันธะไฮโดรเจนของสารตกค้างขั้วและกระดูกสันหลังมีความพึงพอใจทั้งในสถานะที่กางออก (โดยน้ำ) และในสถานะพับ (โดยกันและกัน) ดังนั้นเอนทาลปีจึงเป็น "ผลรวมศูนย์" และการพับของโปรตีนถูกขับเคลื่อนโดยเอนโทรปีเกือบทั้งหมด

นี่คือคำอธิบายของเทคนิคที่เรียกว่าดิฟเฟอเรนเชียลสแกนคาโลริเมทรี คุณใช้ปริมาณความร้อนเท่ากันกับสารละลายสองชนิด สารละลายหนึ่งมีบัฟเฟอร์เท่านั้น อีกชุดหนึ่งใช้บัฟเฟอร์และโปรตีน และคุณวัดอุณหภูมิในแต่ละสารละลาย ในที่สุดโปรตีนถึงอุณหภูมิหลอมเหลว TNSโดยที่โปรตีนถูกพับ 50% และกางออก 50% และ ΔG = 0 ที่ TNSการละลายของโปรตีนจะดูดซับความร้อนจำนวนมาก ดังนั้นอุณหภูมิจะไม่เพิ่มขึ้นมากเท่ากับในสารละลายบัฟเฟอร์เท่านั้น

อีกเทคนิคหนึ่งในการวัดความคงตัวของโปรตีนคือแรงที่ต้องใช้ในการคลี่ออกโดยใช้กล้องจุลทรรศน์กำลังอะตอมเดี่ยว

สารลดสภาพทั่วไปคือยูเรียและกวานิดีนไฮโดรคลอไรด์ น่าแปลกที่เรายังไม่รู้ว่ามันทำงานอย่างไร คิดว่าพวกมันคงความเสถียรของส่วนประกอบทั้งหมดของโปรตีนที่คลี่ออก Guanidine อาจล้อมรอบโดเมนที่ไม่ชอบน้ำที่ไม่เอื้ออำนวยของโปรตีน แต่จากนั้นก็เปิดเผยด้านที่ชอบน้ำของตัวเองกับน้ำ เพื่อที่ว่าการเคลื่อนที่ของน้ำจะไม่ถูกจำกัด

เกี่ยวกับ Eric Vallabh Minikel

Eric Vallabh Minikel อยู่ในภารกิจตลอดชีวิตเพื่อป้องกันโรคพรีออน เขาเป็นนักวิทยาศาสตร์ที่ Broad Institute of MIT และ Harvard


การจำกัดการย่อยของเอนไซม์

การเตรียม DNA สำหรับวิธีการโคลนนิ่งแบบดั้งเดิมนั้นขึ้นอยู่กับการย่อยของเอ็นไซม์แบบจำกัดเพื่อสร้างปลายที่เข้ากันได้ซึ่งสามารถผูกมัดเข้าด้วยกันได้ DNA ที่จะถูกโคลนอาจแตกต่างกันอย่างมาก ตั้งแต่ DNA ของจีโนมที่สกัดจากวัฒนธรรมแบคทีเรียบริสุทธิ์หรือประชากรแบบผสม ไปจนถึงยีนที่โคลนก่อนหน้านี้ซึ่งจำเป็นต้องย้ายจากเวกเตอร์หนึ่งไปยังอีกเวกเตอร์หนึ่ง (การโคลนย่อย) เอ็นไซม์จำกัดยังสามารถใช้เพื่อสร้างปลายที่เข้ากันได้กับผลิตภัณฑ์ PCR ในทุกกรณี เอ็นไซม์จำกัดหนึ่งตัวหรือมากกว่าถูกใช้เพื่อย่อย DNA ส่งผลให้เกิดการแทรกซึมแบบไม่มีทิศทางหรือแบบไม่มีทิศทางเข้าไปในพลาสมิดที่เข้ากันได้

โดยทั่วไป DNA ของจีโนมไม่ว่าจะมาจากแหล่งใดก็ตาม จะถูกย่อยด้วยเอ็นไซม์จำกัดที่รับรู้เบสที่ต่อเนื่องกัน 6-8 เบส เนื่องจากตำแหน่งการรู้จำเหล่านี้พบได้น้อยกว่าในจีโนมมากกว่าไซต์ 4 เบส และส่งผลให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอมีขนาดใหญ่ขึ้น ขนาดเม็ดมีดที่ต้องการสำหรับคลังโคลนเป็นตัวกำหนดว่าเอ็นไซม์ใดถูกเลือก เช่นเดียวกับสภาวะการย่อย ส่วนใหญ่แล้ว การเจือจางแบบอนุกรมของเอ็นไซม์จำกัดที่เลือกจะถูกใช้เพื่อย่อยสารตั้งต้น และช่วงขนาดเม็ดมีดที่ต้องการจะถูกแยกออกโดยอิเล็กโตรโฟรีซิสตามด้วยการสกัดเจลของดีเอ็นเอ วิธีการเตรียมนี้ให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดที่ต้องการพร้อมปลายที่เข้ากันได้กับดีเอ็นเอของเวกเตอร์ที่เลือก

การโคลนย่อยต้องใช้เอนไซม์จำกัด 1-2 ตัวที่ตัดทันทีนอกชิ้นส่วนเม็ดมีดโดยไม่ต้องตัดภายในตัวเม็ดมีด เอ็นไซม์จำกัดที่มีตำแหน่งการจดจำภายในไซต์การโคลนหลายจุด (MCS) มักใช้เนื่องจากไม่ได้ตัดที่อื่นในดีเอ็นเอของเวกเตอร์และโดยทั่วไปจะสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่แยกออกได้ง่ายสองชิ้น ยีนที่สนใจโดยปกติมักถูกคัดลอกย่อยไปเป็นเวกเตอร์สำหรับการแสดงออกสำหรับการแสดงออกของโปรตีนที่ปรับปรุงให้ดีขึ้นและ/หรือการเติมแท็กการทำให้บริสุทธิ์ ในกรณีนี้ จำเป็นต้องแทรกยีนในทิศทางที่ถูกต้องและอยู่ในกรอบที่มีโปรโมเตอร์การถอดรหัส

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) มักใช้เพื่อขยายยีนหรือชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่น่าสนใจ จากแหล่งใดๆ ของ DNA เพื่อทำการโคลน เพื่อสร้างส่วนปลายที่เข้ากันได้ เป็นเรื่องปกติที่จะเพิ่มไซต์จำกัดที่ส่วนปลาย 5&rsquo ของไพรเมอร์ PCR ทั้งสอง เมื่อเพิ่มไซต์จำกัดลงในไพรเมอร์ PCR ขอแนะนำให้รวมฐาน 6 ระหว่างไซต์การจดจำและส่วนปลาย 5 & rsquo ของไพรเมอร์ เบสเพิ่มเติมเหล่านี้จัดให้มี DNA ที่เพียงพอสำหรับเอ็นไซม์จำกัดในการจับตำแหน่งการจดจำและตัดอย่างมีประสิทธิภาพ เมื่อเลือกไซต์การจำกัดที่จะเพิ่มลงในไพรเมอร์ เป็นสิ่งสำคัญในการพิจารณาว่าไซต์ใดจะเข้ากันได้กับเวกเตอร์ที่คุณเลือก ไม่ว่าจะเป็นการโคลนตามทิศทางที่ต้องการหรือไม่ และที่สำคัญที่สุด ยืนยันว่าไซต์การจดจำ ไม่เกิดขึ้นภายในยีนหรือชิ้นส่วนดีเอ็นเอ


การคำนวณเอนทาลปีและเอนโทรปีของการหลอมรวมของของแข็งที่ไม่รู้จัก

ปริมาตรโมลาร์ของของแข็งบางชนิดคือ 142.0 cm3/mol ที่ 1.00 atm และ 427.15 K ซึ่งเป็นอุณหภูมิหลอมเหลว
ปริมาตรโมลาร์ของของเหลวที่อุณหภูมิและความดันนี้คือ 152.6 ซม.3/โมล
ที่ 1.2 MPa อุณหภูมิหลอมเหลวจะเปลี่ยนเป็น 429.26 K. คำนวณเอนทาลปีและเอนโทรปีของการหลอมรวมของของแข็ง

1 คำตอบ

#DeltaS_"fus" = "5.52 J/mol K"#
#DeltaH_"fus" = "2.36 กิโลจูล/โมล"#

คำอธิบาย:

เครื่องมือที่คุณเลือกสำหรับปัญหานี้คือ สมการ Clapeyron ใช้ในรูปแบบ

ตอนนี้ คุณรู้ว่ามีความสัมพันธ์ต่อไปนี้ระหว่างการเปลี่ยนแปลงเอนทาลปีของการหลอมรวม #DeltaH_f# และการเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีของการหลอมรวม #DeltaS_f#

ซึ่งได้มาจาก Gibbds ฟรีพลังงานเปลี่ยน ที่สมดุล

เนื่องจากที่สมดุล #DeltaG = 0# มันตามที่คุณมี

#DeltaH = T * DeltaS หมายถึง DeltaS = (DeltaH)/T#

ในกรณีของคุณ #T# จะเป็นตัวแทนของ อุณหภูมิหลอมรวม. กฎทั่วไปที่ดีที่ควรทำในที่นี้คือ คุณสามารถใช้ ค่าเฉลี่ยของอุณหภูมิหลอมเหลวทั้งสองที่กำหนด

ตอนนี้คุณ ควร จัดเรียงสมการใหม่ #color(purple)((1))# เพื่อแก้ปัญหา #dT# แล้ว บูรณาการ, แต่คุณ สามารถ ข้ามขั้นตอนนั้นไปหากคุณไปโดยสมมุติว่าอุณหภูมิเปลี่ยนแปลง #dT# , is เล็กพอ.

คุณสามารถเลี่ยงการประมาณดังกล่าวได้เนื่องจากคุณกำลังใช้งานสายเฟสของแข็ง - ของเหลว ดังนั้นคุณจะต้องมีการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิเล็กน้อยในกรณีดังกล่าว

ถ้าใช้เส้นทางนี้บอกได้เลยว่า

ณ จุดนี้ คุณมีทุกสิ่งที่จำเป็นในการแก้ปัญหา #DeltaS_"fus"# โดยเฉพาะอย่างยิ่งคุณรู้ว่า

นี่คือส่วนที่ยุ่งยาก คุณต้องแปลง #DeltaV_"fus"# และ #DeltaP# เป็น ลูกบาศก์เมตรต่อโมล, #"m"^3"/mol",# และ ปาสกาล, #"ป่า"# - รู้ยังว่าทำไมในนาทีนี้!

#DeltaV_"fus" = V_2 - V_1 = "152.6 ซม."^3 - "142.0 ซม."^3 = "10.6 ซม."^3#

#10.6color(red)(ยกเลิก(color(black)("cm"^3)))/"mol" * "1 m"^3/(10^6color(red)(cancel(color(black)(" ซม."^3)))) = 10.6 * 10^(-6)"ม"^3"/โมล"#

#DeltaP = 1.2 * 10^6"Pa" - 1.01325 * 10^5"Pa" = 10.987 * 10^5"Pa"#

ดังนั้น เสียบค่าเหล่านี้และแก้หา #DeltaS_"fus"#

#DeltaS_"fus" = (DeltaP)/(DeltaT) * DeltaV_"fus"#

#DeltaS_"fus" = (10.987 * 10^5"Pa")/"2.11 K" * 10.6 * 10^(-6)"m"^3/"mol"#

แต่ #"ป่า" xx "m"^3 = "J"# ดังนั้นคำตอบจะเป็น

ตอนนี้ใช้สมการ #color(สีม่วง)((2))# เพื่อรับ

#DeltaH_"fus" = DeltaS_"fus" * T_"ค่าเฉลี่ย"#

#DeltaH_"fus" = 5.52"J"/("mol" * color(red)(ยกเลิก(color(black)("K")))) * 428.21color(red)(cancel(color(black)(" K"))) = 2363.72 "J"/"mol"#

ฉันจะปล่อยให้ค่านี้ปัดเศษเป็นสามซิกฟิกเช่นกัน แต่แสดงใน กิโลจูลต่อโมล