ข้อมูล

Luciferase โปรโมเตอร์เวกเตอร์บน p-AcGFP1-C1 vector

Luciferase โปรโมเตอร์เวกเตอร์บน p-AcGFP1-C1 vector


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

เวกเตอร์ AcGFP1 สามารถเปล่งแสงได้ด้วยตัวเองในขณะที่เวกเตอร์ Luc จำเป็นต้องมีสารตั้งต้นสำหรับปฏิกิริยา อย่างไรก็ตาม ลัคได้รับการกล่าวขานว่าเจาะจงหรือดีกว่า AcGFP1 ทำไมถึงเรียกแบบนี้? ข้อดีของเวกเตอร์ Luc เหนือ AcGFP1 คืออะไร


คุณกำลังสับสนการเรืองแสงและการเรืองแสง GFP ไม่ปล่อยแสง ตัวย่อย่อมาจาก Green Fluorescent Protein คุณต้องส่องแสงแหล่งกำเนิดแสงสีน้ำเงินและมันจะเรืองแสงเป็นสีเขียว ปัญหาคือสิ่งมีชีวิตจำนวนมากมีพื้นหลังเรืองแสง เซลล์ที่ไม่มี GFP ใด ๆ มักจะมีการเรืองแสงเพียงเล็กน้อยหรือประกอบด้วยเม็ดสีที่ปิดบังสัญญาณ

การทดสอบลูซิเฟอเรสขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาเคมีที่ออกซิไดซ์โมเลกุล (ลูซิเฟอรินในกรณีของลูซิเฟอเรสหิ่งห้อย) และโฟตอนจะถูกปล่อยออกมา สิ่งนี้มีความละเอียดอ่อนมากกว่าการเรืองแสงมาก แต่ก็มีราคาแพงกว่ามากและโดยปกติ (แต่ไม่เสมอไป) จำเป็นต้องมีการสลายเซลล์ เป็นเรื่องยากมากที่เซลล์จะเปล่งแสงด้วยตัวเอง ดังนั้นแบ็คกราวด์จึงต่ำลงมาก ทำให้คุณเห็นความแตกต่างที่น้อยลง

มีเหตุผลมากมายที่จะเลือกข้อใดข้อหนึ่งมากกว่ากันในการทดสอบ หากคุณให้รายละเอียดเพิ่มเติมว่าคุณตั้งใจจะใช้ผู้รายงานอย่างไร คุณจะได้รับคำตอบที่มีรายละเอียดมากขึ้น


เวกเตอร์ที่ใช้จะขึ้นอยู่กับสิ่งที่คุณต้องการทำ

ปัญหาที่เป็นไปได้กับ GFP คือ:

  • การสูญเสียหน้าที่ของฟิวชันโปรตีน (ถ้าคุณเติมกรดอะมิโน 238 ชนิดลงในโปรตีน นั่นเป็นการเปลี่ยนแปลงที่ค่อนข้างใหญ่!) มีเวกเตอร์ที่ยอมให้ฟิวชั่นใน C หรือ N-ter ของโปรตีนของคุณเพื่อพยายามหลีกเลี่ยงสิ่งนั้น

  • GFP อาจแยกออกจากฟิวชันโปรตีน ทำให้การสังเกตหรือการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันไม่มีประโยชน์

  • ด้วยเวกเตอร์การแสดงออกสูง คุณอาจมีความอิ่มตัวของการเรืองแสงในเซลล์ของคุณ ดังนั้นการหาปริมาณจึงเป็นเรื่องยาก

ด้วยการทดสอบลูซิเฟอเรส คุณจะเพิ่มสารตั้งต้นเพื่อให้สามารถหาปริมาณได้ทันทีที่ปฏิกิริยาเริ่มต้นและลูมิโนมิเตอร์มีความไวมากพอที่จะตรวจจับกิจกรรมของ Luc ที่ต่ำมากหรือใช้เซลล์เพียงเล็กน้อย

แต่

เวกเตอร์ GFP ช่วยให้คุณทำการทดสอบในร่างกายได้ (การหาปริมาณ การโลคัลไลเซชันภายในเซลล์ การเรียงลำดับเซลล์… ) ในขณะที่การทดสอบ Luc ต้องการการแยกเซลล์ของคุณ ดังนั้น ขึ้นอยู่กับเป้าหมายของคุณ จะดีกว่าถ้าใช้ระบบใดระบบหนึ่ง


การพัฒนาโปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำด้วยรังสีที่มีความสำคัญในการรักษา

การบำบัดด้วยรังสีพันธุกรรมเป็นการผสมผสานระหว่างการฉายรังสีและยีนบำบัดที่อาจแก้ปัญหาบางอย่างที่เกี่ยวข้องกับการฉายรังสีแบบเดิมได้ โปรโมเตอร์ที่ตอบสนองต่อรังสีได้มาจากคลังโปรโมเตอร์ที่ประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นโดยการเชื่อมโยงสัญญาณกล่องทาทากับลำดับการจับรวมแบบสุ่มของปัจจัยการถอดรหัสซึ่งทำปฏิกิริยากับรังสี โปรโมเตอร์แต่ละตัวที่เชื่อมต่อกับยีน luciferase ได้รับการประเมินโดยการเพิ่มประสิทธิภาพการแสดงออกของ luciferase ในเซลล์ที่ถ่ายหลังจากฉายรังสีเอกซ์ ปฏิกิริยาของโปรโมเตอร์ที่ดีที่สุดได้รับการปรับปรุงโดยการแนะนำแบบสุ่มของการกลายพันธุ์แบบจุด และโปรโมเตอร์ที่เป็นผลลัพธ์แสดงให้เห็นการเพิ่มประสิทธิภาพมากกว่า 20 เท่าของการแสดงออกของลูซิเฟอเรสหลังจากการฉายรังสีเอกซ์ที่ 10 Gy การแสดงออกของยีนดาวน์สตรีมยังได้รับการปรับปรุงในเซลล์ที่ถ่ายเทได้อย่างเสถียร ไม่เพียงแต่ด้วยรังสีเอกซ์ แต่ยังรวมถึงการฉายรังสีโปรตอนด้วย และการเพิ่มประสิทธิภาพอย่างใดอย่างหนึ่งก็ลดลงเมื่อเติมสารต่อต้านอนุมูลอิสระ ดังนั้นจึงบ่งชี้ถึงการมีส่วนร่วมของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในการกระตุ้นโปรโมเตอร์ โปรโมเตอร์ที่สร้างขึ้นยังถูกกระตุ้นในเนื้องอกที่โตในหนู นอกจากนี้ การฆ่าเซลล์ด้วยยีน fcy::fur (ยีนฆ่าตัวตายที่เปลี่ยน 5-fluorocytosin เป็น 5-fluorouracil ที่เป็นพิษสูง) เพิ่มขึ้นตามขนาดยาด้วย 5-fluorocytosin หลังจากการฉายรังสีเอกซ์ในหลอดทดลองเท่านั้น ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโปรโมเตอร์ที่ได้รับผ่านวิธีนี้สามารถใช้สำหรับการใช้งานทางคลินิกที่เป็นไปได้


วิศวกรรมจีโนม

แม้ว่าการแสดงออกมากเกินไปหรือทำให้ยีนล้มลงสามารถบอกคุณได้มากเกี่ยวกับหน้าที่และ/หรือเปลี่ยนแปลงกิจกรรมของเซลล์ในลักษณะที่น่าสนใจจากมุมมองที่ประยุกต์ใช้ แต่บางครั้งก็เป็นการดีที่สุดที่จะลบยีนออกจากหรือแนะนำยีนและการกลายพันธุ์ใหม่ให้กับจีโนมของแบคทีเรียเอง การจัดการกับจีโนมโดยตรงจะทำให้คุณสามารถควบคุมการแสดงออกของโปรตีนและกิจกรรมต่างๆ ได้อย่างละเอียดยิ่งขึ้น ด้วยเหตุนี้จึงจำกัดการใช้ทรัพยากรของเซลล์ที่จำเป็นสำหรับการผลิตโปรตีนจำนวนมากหรือพลาสมิดที่มีสำเนาสูง ไม่ว่าคุณจะกำลังศึกษาชีววิทยาพื้นฐานของยีนแบคทีเรียหรือเปลี่ยนเส้นทางเมตาบอลิซึมเพื่อผลิตสารประกอบที่ใช้รักษาโรค มีหลายวิธีในการเปลี่ยนแปลงจีโนมของแบคทีเรีย ตั้งแต่การรวมตัวใหม่ไปจนถึง CRISPR คอลเล็กชันนี้มีเครื่องมือมากมายที่จะช่วยคุณควบคุมจีโนมของแบคทีเรียสำหรับการวิจัยของคุณ

พลาสมิด NS เทคนิค PI วัตถุประสงค์
pCas9 42876 CRISPR ลูเซียโน่ มาร์ราฟฟินี การแสดงออกของแบคทีเรียของ Cas9 nuclease gRNA สำหรับรายการที่ครอบคลุมมากขึ้นของพลาสมิด CRISPR ของแบคทีเรียของเรา โปรดดูที่นี่
pwtCas9-แบคทีเรีย 44250 CRISPR สแตนลีย์ ฉี Anhydrotetracycline inducible expression ของ Cas9 ชนิด wild จาก S. pyogenes เพื่อกระตุ้นให้เกิดการแตกเป็นเกลียวคู่ สำหรับรายการที่ครอบคลุมมากขึ้นของพลาสมิด CRISPR ของแบคทีเรียของเรา โปรดดูที่นี่
pgRNA-แบคทีเรีย 44251 CRISPR สแตนลีย์ ฉี การแสดงออกของ RNA ไกด์ที่ปรับแต่งได้ (gRNA) สำหรับการหยุดชะงักของยีนแบคทีเรียหรือการทำให้ล้มลง สำหรับรายการที่ครอบคลุมมากขึ้นของพลาสมิด CRISPR ของแบคทีเรียของเรา โปรดดูที่นี่
pGRG ซีรีส์ พลาสมิดต่างๆ Tn7 การขนย้าย Nancy Craig ยีนที่น่าสนใจที่ถูกโคลนเข้าไปในพลาสมิดตัวใดตัวหนึ่งสามารถถูกถ่ายโอนไปยังไซต์สิ่งที่แนบมาของ attTn7 ที่พบในจีโนมของแบคทีเรียในลำไส้จำนวนมาก แบคทีเรียที่สนใจจะถูกแปลงสภาพด้วยโครงสร้างที่เหมาะสม ซึ่งเติบโตที่อุณหภูมิยอมให้ (32°C) เพื่อให้ย้ายได้ และจากนั้นโครงสร้างจะรักษาให้หายขาดโดยการเติบโตที่อุณหภูมิที่ไม่อนุญาต (42°C) การขนย้ายมีประสิทธิภาพเพียงพอที่ไม่จำเป็นต้องเลือก
สัตว์เลี้ยงของเขา-Sangamo 40786 ทาเลน กังเปา การโคลนเกตเวย์และการแสดงออกของ N-terminally His-tagged TALEN ที่หลอมรวมกับ an อี. โคไล codon เพิ่มประสิทธิภาพโดเมน FokI endonuclease
PET-Sangamo-His 40787 ทาเลน กังเปา การโคลนเกตเวย์และการแสดงออกของ C-terminally His-tagged TALEN ที่หลอมรวมกับ an อี. โคไล codon เพิ่มประสิทธิภาพโดเมน FokI endonuclease

การวัดการแสดงออกของลูซิเฟอเรสโดยใช้ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter Assay Kit

การใช้ยีนรายงานเช่น luciferase ช่วยให้สามารถตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่มีความไวสูงและแบบไม่ทำลาย Firefly luciferase ซึ่งเป็นโปรตีนโมโนเมอร์ขนาด 61 kD เป็นที่น่าสนใจอย่างยิ่งสำหรับนักวิจัยหลายคน เนื่องจากมีความไวสูง ช่วงการตรวจจับเชิงเส้นที่กว้าง และพื้นหลังที่ต่ำมากเนื่องจากไม่มีกิจกรรมการเรืองแสงภายในเซลล์ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม สำหรับการทดสอบที่ได้รับความนิยมมากขึ้นเรื่อยๆ โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทแบบเรืองแสง การทดสอบ "เรืองแสง" ที่เข้ากันได้กับปริมาณงานสูงมักเป็นที่ต้องการสำหรับการประมวลผลแบบกลุ่มของเพลตหลายแผ่น ในเอกสารการใช้งานนี้ เราสาธิตการวัดการแสดงออกของลูซิเฟอเรสในเซลล์ CHO-K1 โดยใช้ SpectraMax ® Glo Steady-Luc™ Reporter Assay Kit ซึ่งให้สัญญาณการเรืองแสงที่ยาวนาน ชุดทดสอบนี้เหมาะสำหรับเครื่องอ่านไมโครเพลทมัลติโหมด SpectraMax ® i3x พร้อมโปรโตคอลที่กำหนดค่าไว้ล่วงหน้าในซอฟต์แวร์ SoftMax ® Pro เพื่อการวิเคราะห์ข้อมูลอย่างรวดเร็ว

วัสดุ

  • SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter Assay Kit, อุปกรณ์ระดับโมเลกุล (Explorer kit #R8352 หรือ Bulk kit #R8353)
  • ชุดแข่งขัน: Steady-Glo Luciferase Assay System, Promega (Cat# E2510)
  • เครื่องอ่านไมโครเพลท SpectraMax i3x, อุปกรณ์ระดับโมเลกุล (Cat# i3X)
  • แผ่นพื้นใสผนังสีขาว 96 หลุม Costar (Cat# 3903)
  • ลูซิเฟอเรสบริสุทธิ์ Promega (Cat# E1701)
  • จานขาวทึบ 384 หลุม Greiner (Cat# 655075)
  • เซลล์ CHO-K1, ATCC (Cat# CCL-61)
  • สื่อการเติบโตที่สมบูรณ์
    • Ham's F12 Medium, Life Technologies (Cat# 11765-54)
    • Fetal Bovine Serum ราศีเมถุน (Cat# 100-106)
    • เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน, ไลฟ์ เทคโนโลยี (Cat# 15070-063)

    วิธีการ

    การทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter มีขั้นตอนการทำงานที่ง่ายขึ้น สารละลายการทำงานถูกผสมในอัตราส่วน 1:1 กับสื่อในแต่ละหลุมของไมโครเพลท โดยที่เซลล์ที่แสดงลูซิเฟอเรสจะถูกชุบ จากนั้นจึงปิดเพลตและผสมเพื่อให้สามารถสลายเซลล์ได้อย่างสมบูรณ์ก่อนที่จะอ่านสัญญาณเรืองแสงบนเครื่องอ่านไมโครเพลทมัลติโหมด SpectraMax i3x (รูปที่ 1) การรับและวิเคราะห์ข้อมูลจะคล่องตัวขึ้นอย่างง่ายดายเมื่อใช้โปรโตคอลที่กำหนดค่าไว้ล่วงหน้าในซอฟต์แวร์ Softmax Pro

    รูปที่ 1 เวิร์กโฟลว์ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter Assay Kit

    เส้นโค้งมาตรฐานลูซิเฟอเรส

    เพื่อระบุช่วงการตรวจจับเชิงเส้นของการทดสอบนี้ เส้นโค้งมาตรฐานถูกสร้างขึ้นเพื่อวัด RLU เป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นของลูซิเฟอเรส ส่วนประกอบทั้งหมดของ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter Assay Kit ได้รับอนุญาตให้ปรับสมดุลเป็นอุณหภูมิห้องก่อน โซลูชันการทำงานของ SpectraMax Glo Steady-Luc ถูกสร้างขึ้นโดยการเพิ่ม D-Luciferin ลงในบัฟเฟอร์ Steady-Luc Assay ในอัตราส่วน 1 มก. ถึง 4 มล. การเจือจางแบบอนุกรมสิบเท่าของลูซิเฟอเรสที่ทำให้บริสุทธิ์ใน PBS ที่มี BSA 0.01% เริ่มต้นที่ความเข้มข้น 1 x 10 6 fg/หลุม ถูกเตรียมขึ้น และ 25 ไมโครลิตรของความเข้มข้นแต่ละอย่างถูกเติมในสามสามเท่าไปยังเพลตสีขาวที่เป็นของแข็ง 384 หลุม หลังจากนั้น สารละลายการทำงานของ SpectraMax Glo Steady-Luc 25 ไมโครลิตรถูกเติมลงในหลุมที่มีลูซิเฟอเรสและส่วนควบคุม จานถูกเขย่าและฟักในที่มืดเป็นเวลา 10 นาที การใช้เครื่องอ่าน SpectraMax i3x โปรโตคอลการทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter ที่กำหนดค่าไว้ล่วงหน้าในซอฟต์แวร์ SoftMax Pro ถูกนำมาใช้เพื่อวัดการเรืองแสง หลังจากการตรวจจับ โปรโตคอลจะสร้างเส้นโค้งของข้อมูลโดยอัตโนมัติ

    การทดสอบการเปลี่ยนถ่ายและการเจือจางเซลล์

    ส่วนหนึ่งของการพัฒนาการทดสอบสำหรับการทดสอบยีนของผู้รายงานคือการเพิ่มประสิทธิภาพจำนวนเซลล์และปริมาณของพลาสมิดที่จำเป็นในการให้สัญญาณที่แข็งแกร่งสำหรับการตรวจคัดกรอง การสอบวิเคราะห์การเจือจางของเซลล์ถูกดำเนินการด้วยปริมาณที่ต่างกันสองปริมาณของ pGL4.13 หิ่งห้อย ลูซิเฟอเรสที่เริ่มต้นในเพลต 6 หลุม เซลล์ CHO-K1 ถูกทรานส์เฟกชั่วคราวด้วย 1.7 ไมโครกรัมหรือ 0.8 ไมโครกรัมต่อหลุมของเวกเตอร์ pGL4.13 [luc2/SV40] ซึ่งเข้ารหัสยีนลูซิเฟอเรส luc2 ภายใต้การควบคุมของเอนแฮนเซอร์/โปรโมเตอร์ระยะแรก SV40 หรือเวกเตอร์ pGL3-Basic (ตัวควบคุม) ซึ่งไม่มีลำดับโปรโมเตอร์และเอนแฮนเซอร์ หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกทริปซิไนซ์และเพาะที่ 100 ไมโครลิตร/หลุมในจาน 96 หลุมซึ่งเริ่มต้นที่ 30,000 เซลล์/หลุมด้วยการเจือจาง 2 เท่าที่ตามมา สารละลายการทำงาน Steady-Luc 100 ไมโครลิตร/หลุมถูกเติมลงในหลุม แผ่นปิดเพื่อป้องกันรีเอเจนต์จากแสงและผสมโดยใช้เครื่องเขย่าแบบออร์บิทัล หลังจากผ่านไป 10 นาที การเรืองแสงจะถูกวัดและบันทึกบนเครื่องอ่าน SpectraMax i3x โดยใช้โปรโตคอลการทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter ที่กำหนดค่าไว้ล่วงหน้า พบโปรโตคอลที่กำหนดค่าไว้ล่วงหน้าในส่วน Reporter Assays ใต้แท็บ Protocol Library หรือบนเว็บไซต์แชร์โปรโตคอล SoftMax Pro Software (www.softmaxpro.org)

    คัดกรองแอพพลิเคชั่น

    หน้าจอการทดสอบยีนของนักข่าวถูกจำลองโดยการอ่านค่าเซลล์ที่ทรานส์เฟก pGl4 firefly luciferase หลายครั้งโดยใช้ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter Assay Kit เซลล์ถูกทรานส์เฟกตามที่บรรยายไว้ก่อนหน้านี้และเคลือบที่ 30,000 เซลล์ต่อหลุมในจาน 96 หลุมและเติบโตในชั่วข้ามคืน ในวันที่ทำการทดสอบ เพลตถูกปรับสมดุลให้อุณหภูมิห้อง จากนั้น 100 ไมโครลิตรสร้างสารละลายการทำงาน Steady-Luc ที่มี D- Luciferin ขึ้นใหม่ในแต่ละหลุม เพลตถูกปิดและผสมบนเชคเกอร์แบบโคจรเป็นเวลาห้านาที แล้ววางลงในเครื่องอ่าน SpectraMax i3x และผสม การเรืองแสงถูกอ่านทุก ๆ ห้านาทีเป็นเวลาทั้งหมดห้าชั่วโมงโดยมีการสั่นของวงโคจรสามวินาทีก่อนการอ่านแต่ละครั้ง

    ผลลัพธ์

    เส้นโค้งมาตรฐานลูซิเฟอเรส

    สำหรับการเปรียบเทียบ เส้นโค้งมาตรฐานเพื่อระบุช่วงการตรวจจับของการทดสอบยังถูกดำเนินการด้วยการทดสอบโกลว์ลูซิเฟอเรสของคู่แข่ง ในทั้งสองกรณี การทดสอบระบุความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างความเข้มข้นของการเรืองแสงและลูซิเฟอเรส (รูปที่ 2) เดอะ อาร์2 ค่าของลูซิเฟอเรสเท่ากับ 0.998 โดยใช้ชุดทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter และ 0.999 โดยใช้ชุดทดสอบของคู่แข่ง การทดสอบ t ที่จับคู่กันของข้อมูลที่ทำให้เป็นมาตรฐานบ่งชี้ผลลัพธ์ที่เท่ากันที่ความเข้มข้นแต่ละส่วน (P < 0.05) คำนวณโดยใช้ GraphPad Prism การใช้ชุดอุปกรณ์ทั้งสองชุด ขีดจำกัดล่างของการตรวจจับ (LLD) ของลูซิเฟอเรสคือ 5 เฟมโทแกรม/หลุมในรูปแบบ 384 หลุม

    รูปที่ 2 เส้นโค้งมาตรฐาน Luciferase ในรูปแบบ 384 หลุม ผลลัพธ์เชิงเส้นจากการเจือจางลูซิเฟอเรสบริสุทธิ์ 10 เท่าในการทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter (สีเขียว) (R2 = 0.999) หรือการทดสอบของคู่แข่ง (สีแดง) (R 2 = 0.998) ในการสอบวิเคราะห์ทั้งสองแบบ LLD = 5 femtogram/well

    การวัดลูซิเฟอเรสในเซลล์ที่ทรานส์เฟก

    การไทเทรตของเซลล์ CHO-K1 ที่ทรานส์เฟกชั่วคราวด้วยลูซิเฟอเรสซึ่งเริ่มต้นที่ 30,000 เซลล์/หลุมถูกปิเปตลงในหลุมที่ตามด้วยสารละลายทำงานของ Steady-Luc Reporter แสดงในรูปที่ 3 ทั้งการทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter และการทดสอบเรืองแสง luciferase ของคู่แข่งแสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างจำนวนเซลล์และการเรืองแสง สำหรับเซลล์ที่ได้รับ pGL4.13 luciferase vector 0.8 ไมโครกรัม R 2 = 0.995 โดยใช้ชุดทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter และ R 2 > 0.999 โดยใช้ชุดทดสอบของคู่แข่ง ชุดอุปกรณ์ทั้งสองตรวจพบการเจือจางต่ำสุดของเซลล์ที่ทดสอบในการสอบวิเคราะห์ 468 เซลล์/หลุม

    รูปที่ 3 การวัดลูซิเฟอเรสในเซลล์ที่ทรานส์เฟก เซลล์ CHO-K1 ที่ไหลมารวมกัน 90% ถูกทรานส์เฟกด้วย 1.7 ไมโครกรัม pGL4 (หิ่งห้อย) (สีแดง), 0.8 pGL4 (หิ่งห้อย) (สีเขียว) หรือ pGL3 (กลุ่มควบคุม) ลูซิเฟอเรสพลาสมิด (สีน้ำเงิน) (NS) SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter assay (R 2 >0.995 ที่ 0.8 μg plasmid) และ (NS) การทดสอบคู่แข่ง (R2 = 0.999 ที่ 0.8 ไมโครกรัมพลาสมิด) ชุดคิททั้งสองตรวจพบจำนวนเซลล์ต่ำสุด/หลุมในการสอบวิเคราะห์ (468 เซลล์/หลุม)

    คัดกรองแอพพลิเคชั่น

    การทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter เป็นการทดสอบการเรืองแสงแบบเรืองแสงที่ให้กรอบเวลาสัญญาณขยาย (รูปที่ 4) จานที่มีลูซิเฟอเรสซึ่งแสดงออกเซลล์ CHO-K1 ที่ 30,000 เซลล์/หลุมถูกอ่านทุกห้านาทีเพื่อจำลองการประมวลผลแบบกลุ่มของเพลตคัดกรอง เมื่อห้าชั่วโมง สัญญาณจะอยู่ภายใน 20% ของค่าเริ่มต้น ในแต่ละเพลตในหน้าจอการทดสอบของผู้รายงาน จะมีการรวมการควบคุมสำหรับการปรับข้อมูลให้เป็นมาตรฐานในพื้นหลัง เพื่อให้สามารถเปรียบเทียบข้อมูลในเพลตจำนวนมากได้ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 5 สัญญาณอยู่ภายใน 15% ใน 20 เพลต ซึ่งชี้ให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของการวิ่งเพลต 20 เพลตในระยะเวลา 90 นาทีด้วยการสอบวิเคราะห์นี้

    รูปที่ 4 สัญญาณ Luciferase ในเซลล์ CHO-K1 เมื่อเวลาผ่านไป เซลล์ CHO-K1 ถูกทรานส์เฟกด้วยลูซิเฟอเรส ในวันที่ทำการทดสอบ เพลตถูกปรับให้สมดุลกับอุณหภูมิห้อง จากนั้น 100 ไมโครลิตรที่สร้างสารละลายการทำงาน Steady-Luc ที่มี D-Luciferin ขึ้นใหม่ก็ถูกเติมลงในแต่ละหลุม เพลตถูกปิดและผสมบนเชคเกอร์แบบโคจรเป็นเวลาห้านาที จากนั้นวางในเครื่องอ่าน SpectraMax i3x และผสม การเรืองแสงถูกอ่านทุก ๆ ห้านาทีเป็นเวลาห้าชั่วโมงโดยมีการสั่นของวงโคจรสามวินาทีก่อนการอ่านแต่ละครั้ง

    รูปที่ 5. การคัดกรองแอปพลิเคชัน ข้อมูลดิบจากเซลล์ CHO-K1 ที่ทรานส์เฟกลูซิเฟอเรสในการสอบวิเคราะห์ SpectraMax Glo Steady-Luc สัญญาณเฉลี่ยจากเซลล์ที่ทรานส์เฟกลูซิเฟอเรสถูกพล็อตเป็นตัวอย่างของการประมวลผลแบบแบตช์ระหว่างการสอบวิเคราะห์การคัดกรองซึ่งเพลตถูกอ่านทุกห้านาที บนเพลตคัดกรอง การควบคุมพื้นหลังจะใช้เพื่อทำให้ข้อมูลเป็นมาตรฐาน เพื่อให้สามารถเปรียบเทียบการเปรียบเทียบได้ในหลายเพลต

    บทสรุป

    นักข่าวที่ใช้ Luciferase ตรวจวิเคราะห์โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทเรืองแสงได้รับความนิยมมากขึ้นเรื่อยๆ สำหรับการวิเคราะห์ปริมาณงานสูงของชีววิทยาเคมีและการประยุกต์ใช้ในการค้นคว้ายา ชุดทดสอบ SpectraMax Glo Steady-Luc Reporter ช่วยให้สามารถหาปริมาณที่ละเอียดอ่อนของการแสดงออกของหิ่งห้อย luciferase ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ด้วยการใช้โปรโตคอลการทดลองที่เป็นเนื้อเดียวกัน ส่วนผสมสูตรพิเศษของสารในชุดอุปกรณ์นี้ช่วยขยายกรอบเวลาอย่างมีนัยสำคัญด้วยสัญญาณคงที่ ดังนั้นจึงช่วยให้สามารถประมวลผลเพลตในการตรวจคัดกรองได้ ชุดทดสอบนี้เหมาะสำหรับเครื่องอ่านไมโครเพลท SpectraMax จาก Molecular Devices โดยมีโปรโตคอลที่กำหนดค่าไว้ล่วงหน้าสำหรับลูกค้าที่ใช้ซอฟต์แวร์ SoftMax Pro ของ Molecular Devices สำหรับการรับและวิเคราะห์ข้อมูล


    Reporter Gene Vectors

    เวกเตอร์คือพลาสมิดซึ่งเป็นองค์ประกอบนอกโครโมโซมซึ่งมีลำดับยีนของนักข่าวเพื่อนำส่งไปยังเซลล์ที่เพาะเลี้ยง เวคเตอร์ไม่เพียงแต่จัดให้มียีนผู้รายงานเท่านั้น แต่ยังอาจมีหลายตำแหน่งสำหรับการโคลนนิ่ง, โปรโมเตอร์, องค์ประกอบการตอบสนอง, ลำดับโพลีอะดีนิเลชัน, มาร์กเกอร์ที่เลือกได้ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือองค์ประกอบลำดับอื่นๆ ที่ช่วยในการแสดงออกและการคัดเลือก Reporter vectors มีความสำคัญต่อความสำเร็จในการตรวจวิเคราะห์ของนักข่าว

    PGL4 Luciferase Reporter Vectors การเข้ารหัส Firefly และ เรนิลลา ลูซิเฟอเรส

    เนื่องจากเวกเตอร์ถูกใช้เพื่อส่งยีนผู้รายงานไปยังเซลล์เจ้าบ้าน ลำดับการควบคุม เช่น ไซต์การจับปัจจัยการถอดรหัส และโมดูลโปรโมเตอร์ภายในแกนหลักของเวกเตอร์สามารถนำไปสู่พื้นหลังที่สูงและการตอบสนองที่ผิดปกติ นี่เป็นปัญหาทั่วไปสำหรับเวกเตอร์นักข่าวของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม รวมถึง pGL3 Luciferase Reporter Vectors นักวิทยาศาสตร์ของเราใช้กลยุทธ์ "การทำความสะอาด" ที่ประสบความสำเร็จซึ่งอธิบายไว้สำหรับยีนของนักข่าวกับแกนหลักของ pGL3 Vector ทั้งหมด โดยจะขจัดลำดับการกำกับดูแลที่คลุมเครือในทุกที่ที่ทำได้ ในขณะที่ยังคงฟังก์ชันการทำงานของผู้รายงานไว้ นอกจากนี้ พื้นที่การโคลนหลายแห่งยังได้รับการออกแบบใหม่ด้วยไซต์ SfiI ที่ไม่เหมือนใครเพื่อการถ่ายโอนองค์ประกอบ DNA ที่น่าสนใจได้ง่าย ลบแหล่งกำเนิด f1 ของการจำลองและลบอินตรอน นอกจากนี้ ตำแหน่งสัญญาณหยุดชั่วคราว/การถอดความแบบสังเคราะห์โพลีสังเคราะห์ถูกวางไว้ที่ต้นน้ำของบริเวณการทำสำเนาพันธุ์จำนวนมาก (ในเวคเตอร์ที่ไม่มีโปรโมเตอร์) หรือโปรโมเตอร์ HSV-TK, CMV หรือ SV40 (ในเวคเตอร์ที่มีโปรโมเตอร์) ความพยายามอย่างกว้างขวางนี้ส่งผลให้กระดูกสันหลังเวกเตอร์ที่ออกแบบใหม่และไม่ซ้ำใครของ pGL4 Vectors นอกจากนี้ยังมีชุดของ pGL4 Vectors ที่มีการลบโปรโมเตอร์ CMV บางส่วนเพื่อการใช้งานที่เหมาะสมของโปรโมเตอร์ที่แข็งแกร่ง

    ลูซิเฟอเรสเวคเตอร์ตระกูล pGL4 ประกอบด้วยคุณสมบัติที่หลากหลาย เช่น ตัวเลือกหิ่งห้อยที่ปรับให้เหมาะสมหรือ เรนิลลา ยีนลูซิเฟอเรส, เวอร์ชัน Rapid Response™ สำหรับการตอบสนองชั่วคราวที่ดีขึ้น, เครื่องหมายที่เลือกได้ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม, เวกเตอร์พื้นฐานที่ไม่มีโปรโมเตอร์, เวกเตอร์ควบคุมที่ประกอบด้วยโปรโมเตอร์ และเวกเตอร์ที่ออกแบบไว้ล่วงหน้าด้วยองค์ประกอบการตอบสนองที่คุณเลือก (รูปที่ 6)

    รูปที่ 6 ตระกูล pGL4 Luciferase Reporter Vectors รวมเอาคุณลักษณะเพิ่มเติมที่หลากหลาย เช่น ยีน luciferase ทางเลือก การตอบสนองอย่างรวดเร็ว&เวอร์ชันการค้า เครื่องหมายและเวกเตอร์ที่สามารถเลือกได้ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีหรือไม่มีโปรโมเตอร์และองค์ประกอบการตอบสนอง

    PNL Vectors การเข้ารหัส NanoLuc® Luciferase

    NanoLuc® luciferase มีอยู่ในเวกเตอร์ที่หลากหลายสำหรับใช้ในการวิเคราะห์ยีนของนักข่าวของการควบคุมการถอดรหัส เวกเตอร์ pNL เหล่านี้อิงตามแกนหลักของเวกเตอร์ pGL4 ดังนั้นจึงมีข้อดีหลายประการเช่นเดียวกัน: การกำจัดไซต์ที่มีผลผูกพันแฟคเตอร์การถอดรหัสและองค์ประกอบด้านกฎระเบียบที่เป็นไปได้อื่นๆ เพื่อลดความเสี่ยงของผลลัพธ์ที่ผิดปกติ การถ่ายโอนลำดับที่ง่ายดายจากพลาสมิดที่มีอยู่ และตัวเลือกต่างๆ ลำดับโปรโมเตอร์ รวมถึงไม่มีโปรโมเตอร์ โปรโมเตอร์ขั้นต่ำ และโปรโมเตอร์แบบไวรัล ครอบครัวของพาหะมีตัวเลือกยีน NanoLuc® (ไม่ผสม นุก, PEST ที่ไม่เสถียร NlucP และหลั่งออกมา secNluc). การแปรผันของยีน NanoLuc® เหล่านี้ได้รับการปรับให้เหมาะสมที่สุดกับโคดอนและมีองค์ประกอบด้านกฎระเบียบที่เป็นไปได้มากมายหรือคุณลักษณะที่ไม่พึงประสงค์อื่นๆ เช่น การนำไซต์ของเอ็นไซม์การจำกัดทั่วไปออก

    นอกจากนี้ยังมีเวกเตอร์นักข่าวโดยบังเอิญที่เข้ารหัสทั้ง NanoLuc® และหิ่งห้อยลูซิเฟอเรสในการถอดเสียงเดียว เวกเตอร์เหล่านี้ไม่มีโปรโมเตอร์ โปรโมเตอร์ขั้นต่ำหรือโปรโมเตอร์ CMV สำหรับใช้ในการคัดกรองปริมาณงานสูง ศึกษาอัตราการหมุนเวียนโปรตีนของโปรตีนส่งสัญญาณหลักสองชนิดที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อความเครียดของเซลล์โดยใช้เวกเตอร์นักข่าว

    Reporter Vectors

    กลุ่มผลิตภัณฑ์เวกเตอร์รายงานการเรืองแสงที่ล้ำสมัยของเราครอบคลุมถึง pGL4 เวกเตอร์ —หิ่งห้อยรุ่นล่าสุดและ เรนิลลา เวกเตอร์นักข่าวลูซิเฟอเรส และ pNL เวกเตอร์ซึ่งมียีนนักข่าว NanoLuc® luciferase


    เชิงนามธรรม

    ภาวะขาดเลือดขาดเลือดในหัวใจซ้ำๆ ทำให้เกิดพังผืดและหัวใจล้มเหลวในที่สุด แม้ว่ายีนบางชนิด เช่น SOD หรือ hemoxygenase และ antisense ต่อAT1R, ACE และ (β1-AR สามารถให้การปกป้องหัวใจในระยะสั้นจากภาวะขาดเลือดขาดเลือด ไม่มีกลไกที่เป็นที่รู้จักสำหรับการตอบสนองต่ออุบัติการณ์ของภาวะขาดเลือดขาดเลือดซ้ำๆ อย่างต่อเนื่อง เราตั้งสมมติฐานว่า "เวกเตอร์เฝ้าระวัง" ที่ออกแบบมาให้แสดงออกอย่างเฉพาะเจาะจงในหัวใจและเปิดใช้ยีนบำบัดเฉพาะในช่วงที่ขาดออกซิเจนเท่านั้น จะช่วยป้องกันโรคหัวใจได้ เพื่อให้ได้ความจำเพาะของหัวใจ เราได้ใส่โปรโมเตอร์ MLC2v ลงในไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ adeno (AAV) ที่ออกแบบมาเพื่อส่ง AS ไปยัง AT1R และ gfp ในการทดลองในหลอดทดลองในเซลล์คาร์ดิโอไมโอไซต์ (เซลล์ H9C2) MLC2v-AAV-gfp กระตุ้นการแสดงออกของยีนในเซลล์ทั้งหมดในระดับที่เทียบได้กับโปรโมเตอร์ไซโตเมกาโลไวรัส (CMV) ในการทดลองในร่างกาย rAAV-MLC2v-gfp ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำในหนูเมาส์หรือหนูแรท โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) DNA อยู่ในไต หัวใจ (ช่องขวาและซ้าย) ปอด ต่อมหมวกไตและม้าม อย่างไรก็ตาม GFP mRNA แสดงเฉพาะในหัวใจและไม่มีในเนื้อเยื่ออื่น ในการเปิดทรานส์ยีน rAAV ระหว่างภาวะขาดเลือด เราได้ใส่องค์ประกอบการตอบสนองภาวะขาดออกซิเจน (HRE) สิ่งนี้เพิ่มการควบคุมการถอดความเมื่อ O2 ระดับต่ำ ดังนั้นจึงมีองค์ประกอบ 4 อย่างสำหรับเวคเตอร์เฝ้าระวัง a gene switch (HRE), โปรโมเตอร์เฉพาะหัวใจ (MLC2v), ยีนบำบัด (AS-AT)1R) และยีนนักข่าว (gfp) เพื่อปิดเสียงหรือลดระดับการแสดงออกพื้นฐานในขณะที่ยังคงความเฉพาะเจาะจง เราได้ลดความยาวของโปรโมเตอร์ MLC2v จาก 3 kb เป็น 1775 bp หรือ 281 bp โปรโมเตอร์ที่ถูกตัดทอนมีประสิทธิภาพเท่าเทียมกันในการแสดงออกเฉพาะของหัวใจ การศึกษาเบื้องต้นกับ rAAV-HRE-gfp ในหลอดทดลอง แสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นใน 1% O2 ใน 4 ถึง 6 ชั่วโมง โดยการเพิ่มปัจจัยที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน (HIFα) (5 ไมโครกรัม) เพิ่มเติม การแสดงออกของ MLC2v-gfp จะเพิ่มขึ้น 4 เท่าใน 1% O2. การขยายเพิ่มเติมของยีนเป็น 400 เท่าใน 1% O2 สามารถทำได้ด้วยพลาสมิดคู่ โครงสร้างอาจทำหน้าที่เป็นต้นแบบ “เวคเตอร์เฝ้าระวัง” เพื่อเปิดใช้งานยีนสำหรับการรักษาโรคในเนื้อเยื่อจำเพาะที่มีสัญญาณทางสรีรวิทยา

    หัวใจของมนุษย์อาจมีภาวะขาดออกซิเจนซ้ำๆ ซึ่งนำไปสู่ความเสียหายของเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจที่เงียบหรือเปิดเผย 1 สะสมนี้อาจนำไปสู่ภาวะหัวใจล้มเหลว ในความพยายามที่จะต่อสู้กับสิ่งนี้ด้วยยีนบำบัด เรากำลังเสนอให้พัฒนา "เวคเตอร์เฝ้าระวัง" ที่ไม่ได้ใช้งานจนกว่าจะเปิดใช้งานโดยขาดออกซิเจน ซึ่งจะช่วยปกป้องหัวใจระหว่างภาวะขาดเลือดด้วยยีนบำบัด แนวคิดนี้ต้องใช้วิศวกรรมของเวกเตอร์ที่เสถียรซึ่งจะมี 4 องค์ประกอบ (รูปที่ 1): (1) เวกเตอร์ที่ปลอดภัยที่สามารถเข้าถึงหัวใจได้โดยการฉีดอย่างทั่วถึงและแสดงการแสดงออกของยีนในหัวใจที่มั่นคง (2) ยีนบำบัดสำหรับ การป้องกันโรคหัวใจขาดเลือด (3) โปรโมเตอร์เฉพาะเนื้อเยื่อเพื่อขับเคลื่อนทรานส์ยีนเพื่อแสดง mRNA ในหัวใจเท่านั้นและ (4) สวิตช์ยีนที่จะเปิดโปรโมเตอร์เฉพาะเนื้อเยื่อเพื่อตอบสนองต่อการขาดออกซิเจนและจะปิดเพื่อตอบสนองต่อ นอร์ม็อกเซีย

    รูปที่ 1. การออกแบบทั่วไปสำหรับ “เวคเตอร์เฝ้าระวัง” ที่สามารถใช้สำหรับการป้องกันอย่างต่อเนื่องกับภาวะหัวใจขาดเลือด เบาหวานชนิดที่ 1 โรคหลอดเลือดสมอง หัวใจวาย มะเร็ง หรือแม้แต่การก่อการร้ายทางชีวภาพ องค์ประกอบหลักคือ (1) เวกเตอร์ที่ปลอดภัยและเสถียร (2) การสลับยีน (3) โปรโมเตอร์เฉพาะเนื้อเยื่อและ (4) ยีนเพื่อการรักษา (พร้อมยีนนักข่าวเพื่อตรวจสอบกิจกรรม)

    สำหรับเวกเตอร์ ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับอะดีโน (AAV) ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเวกเตอร์ที่เสถียรและไม่ก่อให้เกิดโรค 2,3 มียีนหลายตัวที่สามารถพิจารณาปกป้องหัวใจระหว่างภาวะขาดเลือดได้ ในการศึกษาก่อนหน้านี้ 4 เราพบว่าตัวรับ angiotensin II type 1 (AT1-R) antisense (AS) ปกป้องหัวใจของหนูจากการขาดเลือดขาดเลือด-reperfusion Dzau et al 5 ได้แสดงให้เห็นเมื่อเร็วๆ นี้ว่าหนูดัดแปรพันธุกรรมที่มีเฮมอกซีเจเนสได้รับการปกป้องจากภาวะหัวใจขาดเลือด ซูเปอร์ออกไซด์ dismutase ป้องกันอนุมูลซุปเปอร์ออกไซด์ที่เกิดขึ้นระหว่างการขาดเลือดหรือการเกิดซ้ำ 6 ดังนั้น ยีนเหล่านี้เป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับทรานส์ยีนป้องกันโรคหัวใจในเวกเตอร์ สำหรับการแสดงออกที่จำเพาะต่อเนื้อเยื่อของ AAV ในหัวใจ เราได้ศึกษารูปแบบกระเป๋าหน้าท้องของ myosin light chain (MLC-2v) การแสดงออกของ MLC-2v 7,8 มีความสำคัญในการพัฒนาของหัวใจในระหว่างการสร้างตัวอ่อน และการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของ MLC-2v ทำให้เกิดความบกพร่องของหัวใจ 8 ในมนุษย์ cardiomyopathy สัมพันธ์กับการกลายพันธุ์ของจุดใน MLC-2v 9 MLC-2v ดูเหมือนจะมีความเฉพาะเจาะจงสูงสำหรับหัวใจ ทั้งในระหว่างการพัฒนาของตัวอ่อนและในการพัฒนาหลังคลอดและการเจริญเติบโต โปรโมเตอร์ MLC-2v คือ 3.0 kb แต่ลำดับที่ให้คุณสมบัติของความจำเพาะของหัวใจอยู่ภายใน 250 bp ใกล้กับกล่อง TATA 8,9–13 เราทดสอบความจำเพาะของ 1700 kb และ 281 bp MLC-2v โปรโมเตอร์ใน AAV ที่ส่งในหลอดทดลองและในร่างกาย ในการเปิดเวกเตอร์ เราได้ทดสอบองค์ประกอบควบคุมภาวะขาดออกซิเจน (HRE) ซึ่งเปิดใช้งานโดยทรานส์แอคทิเวตติ้งปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจน (HIF-1) เพื่อตอบสนองต่อการลดออกซิเจน 14,15 ภายใต้สภาวะปกติ หน่วยย่อย HIF-1α จะตรวจไม่พบเพราะถูกย่อยสลายโดยโปรตีโอโซม 16,17 แต่ในระหว่างที่ขาดออกซิเจน 18 แม้ว่าเราจะยังไม่เสร็จสิ้นและทดสอบส่วนประกอบทั้งหมดของเวกเตอร์ที่ระมัดระวัง แต่เรานำเสนอผลการศึกษาความจำเพาะของหัวใจของ MLC-2v และการโต้ตอบกับ HRE และ HIF-1α

    วิธีการ

    การสร้างพลาสมิดและรีคอมบิแนนท์ AAV

    เวกเตอร์ที่ได้มาจาก AAV แบบเส้นตรงและแบบเส้นเดี่ยวสามารถปรับให้เข้ากับยีนและโปรโมเตอร์ได้หลายตัวระหว่างส่วนปลายแบบกลับด้าน (ITR) ที่ปลายแต่ละด้าน (รูปที่ 1) เราแทรกยีนนักข่าว โปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) และโปรโมเตอร์ MLC-2v ของหนู 1.7 kb (pMLC-2v-GFP) วิธีการเตรียมลูกผสม AAV (rAAV) ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 19 pMLC-2v-GFP ถูกบรรจุลงใน AAV-2 (rAAV-MLC-2v-GFP)

    A 281 bp (−264 ถึง +17, Genebank: U26708) ชิ้นส่วนของโปรโมเตอร์ MLC-2v ถูกขยายโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) จาก pMLC-2v-GFP ด้วยไพรเมอร์คู่ที่ออกแบบด้วยไซต์ HindIII 5′ ที่ปลาย ชิ้นส่วน MLC-2v ถูกย่อยโดย XhoI และ HindIII และผูกติดกับยีนลูซิเฟอเรสพลาสมิดที่ย่อยด้วย XhoI/HindIII (pGL)-SV40 (Promega) เพื่อสร้าง pGL-MLC

    ตาม Semenza et al, 14 a 68bp human enolase (ENO) 1 ลำดับ HRE (-416 ถึง -349, Genebank: X16287) ถูกแทรกเข้าไปในด้าน 5′ ของโปรโมเตอร์ MLC-2v ใน pGL-MLC เพื่อสร้าง pGL-HRE /MLC.

    pCEP4/HIF-1α ซึ่งมีลำดับ HIF-1α cDNA ของมนุษย์ที่ปลายน้ำของโปรโมเตอร์ cytomegalovirus เป็นของขวัญจาก Dr Semenza (Johns Hopkins University)

    การเปลี่ยนถ่ายในหลอดทดลอง

    สายเซลล์ myoblast หัวใจของตัวอ่อนหนู, 20 H9c2 (ATCC: CRL1446), หรือเซลล์ไกลโอมา C6 (ATCC: CCL-107) ถูกปลูกใน DMEM ที่เสริมด้วยโซเดียม ไพรูเวต, 10% เซรั่มวัวในครรภ์ (FBS) หรือ 5% FBS ใน ตู้ฟักไข่ (Quene Systems, Inc) ที่มีความชื้น 5% CO2 และอากาศ 95% ที่อุณหภูมิ 37°C ภาวะขาดออกซิเจนทำได้โดยใช้ห้องออกซิเจน (เซนเซอร์ออกซิเจน) โดยการอพยพและก๊าซด้วย 1% O2/5% CO2/94% ไม่มี2 ซ้ำแล้วซ้ำอีก ปิดผนึกห้องให้แน่น แล้วฟักที่อุณหภูมิ 37°C

    เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของโปรโมเตอร์ MLC-2v ในเซลล์ ทั้งเซลล์ H9c2 และ C6 ถูกทรานส์เฟกด้วย pGL-MLC (1 ไมโครกรัม/หลุม) ที่มีการควบคุมภายในด้วยพลาสมิด pRL-TK (50 ng/หลุม, Promega) โดยใช้ Lipofectamine (Invitrogen) ใน จาน 6 หลุม. ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน เซลล์ไลเซตถูกเตรียม การสอบวิเคราะห์ลูซิเฟอเรสถูกดำเนินการด้วยระบบทดสอบลูซิเฟอเรสคู่ (Promega) และหาปริมาณด้วยเครื่องวัดความส่องสว่างแบบโมโนไลท์ 3010 (Pharmingen) ผลลัพธ์แสดงเป็นอัตราส่วนของกิจกรรมของหิ่งห้อย luciferase มากกว่า เรนิลลา กิจกรรมของลูซิเฟอเรส

    สำหรับการทดลองโคทรานเฟกชันด้วย pCEP4/HIF-1α, H9c2 ถูกทรานส์เฟกด้วย pGL-HRE/MLC 2 ไมโครกรัม/หลุม, พลาสมิดควบคุม pRL-TK 100 นาโนกรัม/หลุม, pCEP4/HIF-1alpha จำนวนต่างๆ และเวกเตอร์เปล่าเพื่อให้เซลล์ทั้งหมด ได้รับพลาสมิดทั้งหมด 6 ไมโครกรัมในจานขนาด 60 มม. ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน สื่อถูกเปลี่ยนและเพลตที่ซ้ำกันถูกฟักที่ 1% หรือ 20% O2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนเตรียมไลเซท

    การแสดงออกของ AAV ใน Vivo

    สัตว์ทั้งหมดถูกเลี้ยงไว้ในห้องควบคุมอุณหภูมิในรอบกลางวัน/กลางคืน 12 ชั่วโมง โดยสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี คณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของมหาวิทยาลัยฟลอริดาอนุมัติขั้นตอนการทดลองทั้งหมด

    การแสดงออกของ AAV ในสัตว์ที่โตเต็มวัย

    หนูเมาส์ BALB/c เพศผู้ที่โตเต็มวัย (n=6) ได้รับมาจาก Harlan (อินเดียแนโพลิส, Ind) และให้ยาสลบด้วยเพนโทบาร์บิทัล (80 มก./กก.) 10 10 อนุภาคติดเชื้อของ rAAV-MLC-2v-GFP (100 ไมโครลิตร) ถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำ หลังจาก 2 ถึง 8 สัปดาห์ สัตว์ถูกวางยาสลบอย่างล้ำลึกด้วยเพนโทบาร์บิทัล (120 มก./กก.) ตัวอย่างม้าม ตับ ปอด ไต ช่องซ้าย อัณฑะ และสมอง ถูกผ่าและแช่แข็งบนน้ำแข็งแห้ง

    การแสดงออกของ AAV ในสัตว์เล็ก

    หนู Sprague Dawley เพศผู้อายุห้าวัน (n=3) ได้มาพร้อมกับเขื่อนของพวกมันจาก Harlan พวกเขาถูกเลี้ยงไว้กับเขื่อนจนถึงอายุ 21 วัน เมื่ออายุได้ 6 วัน ลูกหมาถูกวางยาสลบด้วยการฉีด Metofane เข้าเส้นเลือดด้วยอนุภาคติดเชื้อ 10 10 ตัวของ rAAV-MLC-2v-GFP (25 ไมโครลิตร) หรือน้ำเกลือในปริมาณเท่ากันกับกลุ่มควบคุม สี่สัปดาห์ต่อมา หนูถูกวางยาสลบอย่างล้ำลึกด้วยคีตามีน ไซลาซีน และอะเซโปรมาซีน (30, 6 และ 1 มก./กก. ตามลำดับ ฉีดเข้าใต้ผิวหนัง) และผสมกับน้ำเกลือที่เย็นจัดผ่านทางช่องท้องด้านซ้าย ตัวอย่างของม้าม ตับ ปอด ไต ช่องซ้าย อัณฑะ หัวใจ และสมอง ถูกผ่าและแช่แข็งบนน้ำแข็งแห้งเพื่อวัด DNA, RNA และโปรตีน GFP

    การตรวจจับ GFP

    RNA และ DNA ทั้งหมดถูกแยกออกโดยใช้รีเอเจนต์ TRIZOL การแสดงออกของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) ถูกวิเคราะห์โดย PCR ที่ซ้อนกัน ไพรเมอร์จำเพาะของ GFP ที่ใช้ในการขยายสัญญาณครั้งแรกคือ 5′-CAGCGGAGGGTGAAGGTG-3′(ความรู้สึก) และ 5′-CAGGGCAGACTGGGTGGACA-3′ (แอนติเซนส์) ไพรเมอร์จำเพาะของ GFP ที่ใช้ในการขยายเสียงที่สองคือ 5′-GCCA- CATACGGAAAGCTCAC-3′ (ความรู้สึก) และ 5′-ATGGTTGTTCG-G GAGGAGCA-3′(แอนติเซนส์)

    RT-PCR

    DNase I ย่อย RNA ทั้งหมด 20 ไมโครกรัมในของผสมปฏิกิริยา 40 ไมโครลิตรซึ่งประกอบด้วย 40 U DNase I และ 33 U RNase inhibitor การถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT) และการขยายสัญญาณครั้งแรกถูกดำเนินการในหลอดเดียว RNA สี่ไมโครกรัม (2 ไมโครกรัม) ที่ปรับสภาพด้วย DNase I ถูกเติมลงในปริมาตร 20 ไมโครมิลลิลิตรสุดท้ายของปฏิกิริยา PCR การขยายเสียงครั้งแรกดำเนินการในสภาวะต่อไปนี้: 60 นาทีที่ 37°C (RT) 4 นาทีที่ 94°C 35 รอบ 1 นาทีที่ 94°C 1 นาทีที่ 58°C (การหลอม) 1 นาทีที่ 72°C และ ช่วงขยายสุดท้าย 7 นาทีที่ 72°C ในวัฏจักรความร้อนของ PE DNA 480 ผลิตภัณฑ์หนึ่งไมโครลิตรจากการขยายเสียงครั้งแรกถูกเติมลงในปริมาตรสุดท้ายของปฏิกิริยา PCR 25 ไมโครลิตร เงื่อนไขของการขยายเสียงครั้งที่สองเหมือนกับครั้งแรก ยกเว้นการเพิ่ม 30 รอบด้วยการหลอมที่อุณหภูมิ 60°C

    PCR

    DNA หนึ่งไมโครกรัมถูกขยายโดย PCR ที่ซ้อนกันเพื่อตรวจจับการแสดงออกของ GFP ขั้นตอนเหมือนกันกับการตรวจหา GFP ใน RNA (RT-PCR) ยกเว้นการย่อย DNase I และการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT)

    อิเล็กโทรโฟรีซิส

    วิเคราะห์ผลิตภัณฑ์แอมพลิฟายเออร์บนอะกาโรส 1% ที่ย้อมด้วยเอทิเดียม โบรไมด์ ขนาดผลิตภัณฑ์ที่คาดไว้คือ 489 bp

    การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

    เนื้อเยื่อถูกบ่มในสารละลายของซัมโบนีข้ามคืนและแช่แข็งที่ความหนา 20 ไมโครเมตร The sections were blocked with blocking buffer (10 mmol/L TBS, 1.5% normal goat serum and 1% BSA) for 1 hour and incubated in primary antibody (0.1% anti-GFP, rabbit IgG) overnight at 4°C. After washing with TBS, the sections were incubated with 0.5% anti-rabbit IgG FITC in the dark at room temperature for 1 hour. The sections were washed and put on slides. The slides were covered by slips with fluoromount G when dry. GFP was detected within 3 hours by confocal microscopy.

    ผลลัพธ์

    In Vitro

    The pGL-MLC was specifically expressed in cardiomyocytes. Figure 2 shows the luciferase activity of pGL-MLC-2v in cardiomyocytes (H9c2) and a lack of expression in a nonmyocardial cell line (C6). The relative luciferase activity ratio of H9c2 cells to C6 cells was 29.38±13.11. The uptake efficiency in both cell types was 90%.

    รูปที่ 2 The expression of luciferase activity (relative to control) in cardiac (H9c2 cells) versus glioma (C6) cells after treatment with pGL-MLC. Myocardial cells specifically expressed the transgene. Cells were transfected with control pRL-TK (50 ng/well) and pGL-MLC (1 μg/well) plasmids. Duplicate plates were incubated at 20% O2 for 24 hours (mean±SD, n=3 independent experiments).

    ใน Vivo

    PCR of DNA showed the transduction of rAAV-MLC-2v-GFP in many tissues at 4 weeks after a systemic injection. The tissue-specific expression of GFP under MLC-2v promoter was examined by RT-PCR of RNA in the adult mouse tissues and young rats (Figure 3). GFP DNA was detected in the spleen, liver, lung, kidney, and heart. However, GFP mRNA was detected only in the heart.

    รูปที่ 3 Top, Expression of GFP DNA in various tissues of the young rat detected by PCR. Bottom, Expression of GFP mRNA in the same tissues, detected by RT-PCR. Analysis was made of DNA and RNA extracted from the tissues 4 weeks after a single systemic injection of rAAV-MLC-2v-GFP.

    Four weeks after intracardiac injection of rAAV-MLC-2v-GFP, the presence of GFP in various tissues of rats was further examined by immunofluorescence staining (Figure 4). The green epifluorescence of the protein was clearly apparent in the heart and absent in the control (no GFP). GFP was undetectable in the kidney and liver of the same animals and undetectable in controls.

    รูปที่ 4 Expression of rAAV-MLC-2v-GFP was present in the heart, but absent in the liver and kidney at 4 weeks after transduction in young rat. Control: rAAV without GFP. The immunofluorescence staining with an antibody to green fluorescent protein reveals intense expression in heart only, which matches the expression of mRNA from the same animal in Figure 3.

    Hypoxia did not induce an increase in transgene expression of the pGL-HRE/MLC (Figure 5). However, hypoxia induces a 3 to 4-fold increase in transgene expression when the HRE-MLC-2v enhancer/promoter complex is in the presence of 0.5 to 4 μg of HIF-1α in H9c2 cells (Figure 5).

    รูปที่ 5 Hypoxia induces a 3- to 4-fold increase in transgene expression when the HRE/MLC enhancer/promoter complex is in the presence of rHIF-1alpha. H9c2 cells were cotransfected with 2 μg/well pGL-HRE/MLC (281 bp) and 100 ng/well pRL-TK, in the absence of rHIF-1α or in the presence of various amount of rHIF-1α plasmid, respectively. Twenty-four hours after transfection, duplicates were exposed to 1% or 20% O2 for another 24 hours. The ratio of firefly luciferase/เรนิลลา luciferase activity was normalized to the result obtained for cells transfected with pGL-HRE/MLC (281 bp) and exposed to 20% O2 (X-Fold). Expression at 1% relative to 20% O2 was calculated to determine the hypoxia induction ratio. (mean±SD, n=3 independent experiments).

    การอภิปราย

    The results demonstrate that the MLC-2v promoter incorporated into a rAAV vector can drive a reporter gene specifically in the heart. rAAV-MLC-2v-GFP was injected systemically, either through direct injection into the heart or via the jugular vein. Measurements of DNA showed that the vector was taken up into multiple tissues, including liver, lung, kidney, heart, and spleen. Although the rAAV-MLC-2v-GFP was taken up into many tissues after a single injection, the transgene (gfp) was only expressed in heart tissue. This was found in both mice and in rats. In two animals we found low-level expression in the liver but not in the kidney or other tissues. As AAV has limited loading capacity, we tested two truncated forms of MLC-2v. We used the 1700 bp length for the promoter in vivo and 250 bp in vitro to attempt to reduce basal levels without losing specificity. Both lengths contain the heart-specific cis regulatory elements 8 that endow the MLC-2v with its heart-specific responsiveness. 9,10 In glioma cells (C6) there was no expression of luciferase, although there was comparable uptake efficiency with or without the MLC-2v promoter.

    Attaching HRE to the MLC-2v with luciferase (Luc), as the transgene, did not alter basal expression in vitro at 20% O2. However, the HRE plus MLC-2v did not respond to 1% O2. With an HRE-SV40 promoter-Luc plasmid in heart cells, we have shown elsewhere that HRE will drive the promoter up to 7-fold under hypoxia within 4 to 6 hours. 21 We considered that the HRE/MLC-2v complex may have reduced the accessibility of the HIF-1α binding. To test this, we used an additional plasmid expressing the hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α). 14–17 When we cotransfected a plasmid containing HIF-1α cDNA with pGL-HRE/MLC and exposed the cells to 1% oxygen we noted a 4-fold increase in Luc expression. Thus, the results indicate that MLC-2v can be used as a specific promoter for heart tissue, and HIF-1α plus HRE (but not HRE alone) will cause the MLC-2v to increase transgene expression in vitro by at least 4-fold in response to hypoxia. This is not a major limitation because dual vectors overcome the vector size limitation 22 and increase gene expression. 23 We are not yet satisfied that a 4-fold increase is sufficient to provide a cardioprotective effect with a therapeutic gene. A double plasmid approach that produces a powerful chimeric transcription factor consisting of the yeast transactivator factor GAL4 DNA binding domain and the p65 transactivation domain 24,25 is being tested. 21 Incorporating the HRE in this double plasmid system with SV40 promoter increased Luc gene expression by 400-fold when activated by hypoxia. 21

    The concept of a vigilant vector for cardioprotection can be applied generally to a number of other disease states. For example, in diabetes type 1, glucose would be the gene switch and insulin and its necessary enzymes would be the transgenes. The tissue specificity could be limited to the pancreas or to muscle. In cancer, tumor markers could be the gene switch, and the transgenes could be tumor suppressors. In heart attacks the switch would again be hypoxia or a protein marker and the transgene tPA. Similarly in stroke, hypoxia could be the switch and GFAP the tissue-specific promoter with hemoxygenase or superoxide dismutase or AT1-R-antisense as the therapeutic genes. For the vector, the rAAV seems to have the most desirable qualities of being safe and stable for a very long time. 2,3 Obviously each vigilant vector has to be designed and thoroughly tested, both in vivo and in vitro. Basal levels times of response, tissue specificity and amplification of signals are all challenges to be met. The present results represent promising new data for the development of a vigilant vector for long-term protection of cardiac performance during exposure to hypoxia.


    Tol2in frog

    Xenopus laevis has been a useful model animal in developmental biology. ล่าสุด, Xenopus tropicalis, a relative of X. laevis, is becoming an important model frog. It is amenable for use in genetic studies because of its unique features in comparison with X. laevis, specifically its diploid genome, smaller body size, and shorter generation time. Transgenic X. เขตร้อน have been constructed based on the restriction enzyme-mediated integration technique, which requires careful treatments of eggs and sperm [24].

    To develop an alternative and simpler method for creating transgenic X. เขตร้อน, the activity of the Tol2 transposon system was tested in ซีโนปุส. First, both a Tol2 transposon-donor plasmid and the transposase mRNA were introduced into two-cell stage X. เขตร้อน และ X. laevis embryos by microinjection. The transposon construct was excised from the donor plasmid, indicating that the Tol2 transoposon system is active in these ซีโนปุส เอสพีพี [25]. Second, a donor plasmid that harbored a Tol2 construct containing the GFP expression cassette was co-injected with the transposase mRNA into one-cell stage X. เขตร้อน embryos, and GFP- positive F0 frogs (30% to 40% of the injected embryos) were raised to adulthood. GFP-positive F1 progeny were produced by 30% to 40% of such F0 adults, indicating that the Tol2 transposon system can be used for transgenesis in ซีโนปุส (Figure 4) [26]. However, the germline transmission frequency is still lower than frequencies in zebrafish transgenesis, in which more than 50% of injected F0 fish constantly transmit transposon insertions to the F1 generation, even without pre-screening of the F0 injected fish for GFP positives. Therefore, in ซีโนปุส improvement in transgenic frequency will be important in making the Tol2 transposon system a more powerful genetic tool.

    Transgenesis in Xenopus tropicalis. The synthetic transposase mRNA and a transposon donor plasmid containing a Tol2 construct with a ubiquitous promoter and the gene encoding green fluorescent protein (GFP) are co-injected into X. เขตร้อน fertilized eggs. NS Tol2 construct is excised from the donor plasmid [25] and integrated into the genome. In the study conducted by Hamlet and coworkers [26], injected GFP-positive tadpoles were raised to adulthood. Tol2 insertions created in germ cells are transmitted to the F1 รุ่น. Germ cells of the injected frogs are mosaic, and, by crossing theinjected frog (founder) with wild-type frog, nontransgenic tadpoles and transgenic tadpoles heterozygous for the Tol2 insertion are obtained [26].


    PTK-GLuc Vector

    The pTK-GLuc Vector is a mammalian expression vector that encodes the secreted luciferase from the copepod Gaussia princeps as a reporter, under the control of the constitutive Herpes Simplex Virus thymidine kinase promoter. Gaussia Luciferase (GLuc) is a 20 kDa protein encoded by a "humanized" sequence, and it contains a native signal peptide at the N-terminus that allows it to be secreted from mammalian cells into the cell culture medium (1,2). pTK-GLuc has a multiple cloning site (MCS) between the GLuc stop codon and the polyadenylation site. A neomycin resistance gene under the control of an SV40 promoter allows selection for stable integration of the plasmid into the mammalian cell genome using G418. Figure 1: pTK-GLuc multiple cloning site (MCS)
    The Gaussia Luciferase sequence is shown with a blue background. Only unique restriction sites are shown.

    DNASU and Addgene are central repositories for plasmid clones and collections that may also be helpful.

    ไฮไลท์

    • TK promoter: 18&ndash771
    • GLuc coding: 802&ndash1359
    • Start codon: 802&ndash804
    • Stop codon: 1357&ndash1359
    • Signal peptide: 802&ndash852
    • Multiple cloning site (MCS) downstream of GLuc: 1360&ndash1391 (NotI, AgeI, XhoI, XbaI)
    • SV40 late polyadenylation signal: 1392&ndash1622
    • Neo promoter (SV40): 2215&ndash2550
    • Neomycin resistance gene 2602&ndash3396
    • Neo R poly-A(SV40 early): 3570&ndash3700
    • Bacterial replication ori (pMB1) 4730&ndash4142
    • Amp resistance 5761&ndash4901

    Product Source

    Features

    • Multiple samples can be obtained from the same transfected cells (i.e., before and after experimental treatments or at multiple time points).
    • 90&ndash95% of GLuc activity is found in the cell culture medium, with the remaining 5&ndash10% detectable in cell lysates. This allows flexibility when assaying GLuc along with other cotransfected reporters.
    • The activity of GLuc is high and the GLuc assay is sensitive enough to detect very small amounts of GLuc enzyme activity.
    • GLuc is very stable in the cell culture medium so the GLuc activity detected reflects the amount of GLuc secreted by the transfected cells over a period of several days. GLuc can also be stored at 4°C for several days without any loss in activity.
    • GLuc does not use the same substrate as Cypridina Luciferase. Therefore, it is possible to assay both GLuc and CLuc independently in cell culture medium from cells expressing both reporters (3,4).
    • The pTK-GLuc Vector can be transfected into cells using any standard transfection protocol and stable cell lines can be established using Neomycin (G418) selection.

    GLuc 3´ end Forward Primer (20-mer)
    GCCAGCAAGATCCAGGGCCA (1310&ndash1325)

    GLuc 5´ End Reverse Primer (24-mer)
    TCAGGGCAAACAGAACTTTGACTC (829&ndash806)

    Application Features

    • The pTK-GLuc Vector can be used as a control for assessing the efficiency of transfection in mammalian cells. Plasmids containing other constitutive promoter elements are also available (see Companion products Sold Separately).
    • pTK-GLuc Vector has a multiple cloning site (MCS) between the GLuc stop codon and the polyadenylation signal. This allows the cloning of sequences that will be part of the GLuc mRNA, such as 3´ UTR sequences, that can be used for RNA stability, RNAi or miRNA target evaluation.
    • GLuc can be used as a stand alone reporter or in conjunction with other compatible reporters such as Cypridina Luciferase (CLuc) (3). GLuc and CLuc are ideally suited for co-expression as both are secreted and highly active enzymes providing ease of use and sensitivity (3,4).

    Storage Buffer

    10 mM Tris-HCl
    1 mM EDTA
    pH 7.5 @ 25°C

    1. Verhaegen, M. and Christopoulos, T.K. (2002). ก้น Chem . 74, 4378-4385.
    2. Tannous, B.A. และคณะ (2005). มล. Ther. 11, 435–443.
    3. Otsuji, et al. (2004). ก้น ชีวเคมี. 329, 230-237.
    4. Wu, et al. (2007). ไบโอเทค. 42, 290-292.

    ผลิตภัณฑ์นี้อยู่ภายใต้สิทธิบัตร เครื่องหมายการค้าและ/หรือลิขสิทธิ์อย่างน้อยหนึ่งรายการซึ่งเป็นเจ้าของหรือควบคุมโดย New England Biolabs, Inc (NEB)

    แม้ว่า NEB จะพัฒนาและตรวจสอบผลิตภัณฑ์ของตนสำหรับแอปพลิเคชันต่างๆ การใช้ผลิตภัณฑ์นี้อาจทำให้ผู้ซื้อต้องได้รับสิทธิ์ในทรัพย์สินทางปัญญาของบุคคลที่สามเพิ่มเติมสำหรับแอปพลิเคชันบางอย่าง

    สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับสิทธิ์ทางการค้า โปรดติดต่อทีมพัฒนาธุรกิจระดับโลกของ NEB ที่ [email protected]

    ผลิตภัณฑ์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยเท่านั้น ผลิตภัณฑ์นี้ไม่ได้มีวัตถุประสงค์เพื่อใช้สำหรับวัตถุประสงค์ในการรักษาหรือวินิจฉัยในมนุษย์หรือสัตว์

    New England Biolabs (NEB) is committed to practicing ethical science &ndash we believe it is our job as researchers to ask the important questions that when answered will help preserve our quality of life and the world that we live in. However, this research should always be done in safe and ethical manner. เรียนรู้เพิ่มเติม.

    Licenses

    ผลิตภัณฑ์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยเท่านั้น ผลิตภัณฑ์นี้ไม่ได้มีวัตถุประสงค์เพื่อใช้สำหรับวัตถุประสงค์ในการรักษาหรือวินิจฉัยในมนุษย์หรือสัตว์

    By opening this package or by using the materials enclosed within Recipient is legally bound and accepts the following terms and conditions:

    Non-Commercial Entities: This product is covered by U.S. Patent No. 6,232,107 and other patents that are the legal property as assigned to Prolume Ltd./Nanolight Technologies. This product is licensed only to the purchasing laboratory-research group. Recipient agrees not to transfer this plasmid or derivatives of this vector to any other laboratory, person or research group, even if within the same institution. Recipient agrees not to alter or make any changes to the nucleotide coding sequence or secretory coding sequence of the luciferase(s) contained within without prior written permission from Prolume Ltd./Nanolight Technologies (www.nanolight.com). Recipient agrees not to file for any patent rights or inventions claiming any portion of the Luciferase(s) within the material without prior written permission from Prolume Ltd./Nanolight Technologies.

    Commercial For-Profit Entities & Non-Profit Foundations (herein referred to as Commercial Recipients): Commercial Recipients wishing to derive products, engage in the sale or license of any products, discover drugs, or make inventions by use of the materials enclosed, fully agree to the terms mentioned above for Non-Commercial entities AND ADDITIONALLY agrees to and are hereby bound to use the materials FOR EVALUATION PURPOSES ONLY. Commercial Recipient hereby agrees to destroy and cease use of any materials or derivatives containing any portion of these materials within 180 days from receipt. Commercial Recipient agrees not to use the materials for any use, other than the 180-day suitability evaluation without prior written permission or obtaining a valid license from Prolume Ltd./Nanolight Technologies.

    Any Recipient that does not accept the license terms mentioned above, shall return the unopened package and materials to NEB for a full refund.

    เครื่องหมายการค้า

    BIOLUX® is a registered trademark of New England Biolabs, Inc.
    QIAGEN® is a registered trademark of Qiagen.


    The Pacific White Shrimp β-actin Promoter: Functional Properties and the Potential Application for Transduction System Using Recombinant Baculovirus

    A newly isolated Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) beta-actin promoter SbaP and its derivative compact construct SbaP (ENX) have recently been demonstrated to promote ectopic gene expression in vitro and in vivo. To further explore the potential transduction application, this newly isolated shrimp promoter SbaP was comparatively tested with cytomegalovirus (CMV), simian virus 40 (SV40), polyhedrin (Polh), and white spot syndrome virus immediate early gene 1 (WSSV ie1) four constitutive promoters and a beta-actin promoter (TbaP) from tilapia fish to characterize its promoting function in eight different cell lines. Luciferase quantitation assays revealed that SbaP can drive luciferase gene expression in all eight cell lines including sf21 (insect), PAC2 (zebrafish), EPC (carp), CHSE-214 (chinook salmon), GSTEF (green sea turtle), MS-1 (monk seal), 293T (human), and HeLa (human), but at different levels. Comparative analysis revealed that the promoting activity of SbaP was lower (≤10-fold) than CMV but higher (2-20 folds) than Polh in most of these cell lines tested. Whereas, SbaP mediated luciferase expression in sf21 cells was over 20-fold higher than CMV, SV40, Polh, and TbaP promoter. Compared to the SbaP, SbaP (ENX), which was constructed on the basis of SbaP by deletion of two "negative" regulatory elements, exhibited no significant change of promoting activity in EPC and PAC2 cells, but a 5 and 16 % lower promoting effect in 293T and HeLa cells, respectively. Additionally, a recombinant baculovirus was constructed under the control of SbaP (ENX), and efficient promoter activity of newly generated baculoviral vector was detected both in vitro of infected sf21 cells and in vivo of injected indicator shrimp. These results warrant the potential application of SbaP, particularly SbaP (ENX) in ectopic gene expression in future.

    คำสำคัญ: Promoter activity Recombinant baculovirus SbaP Shrimp beta-actin promoter The Pacific white shrimp.


    Luciferase promoter vector over p-AcGFP1-C1 vector - Biology

    Our promise to you:
    Guaranteed product quality, expert customer support.

    Reporter Stable Cell Lines

    As useful tools for scientific research, reporter stable cell lines are those cells involved in expression of reporter protein(s) which are engineered through integrating the reporter expression cassettes into cell genomes mediated by plasmid or lentivirus vectors. In the studies of life science and biotechnology, the commonly used reporter genes are visually identifiable including green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (RFP), luciferase, secreted alkaline phosphatase (SEAP) etc.

    According to the upstream regulator of the reporter gene, reporter cell lines can be further divided into two groups: 1) Constitutive Reporter Cell Lines in which reporters are constitutively expressed under the control of a constitutive, strong promoter such as CMV promoter and 2) Inducible Reporter Cell Lines in which reporters are inducibly expressed under the control of a minimal promoter fused to multiple inducer response elements.

    Based on years of experience and in-depth investigation, scientists at Creative Biogene have established a large number of stable reporter cells in many popular cell lines suitable for multiple applications.

    Constitutive Reporter Cell Lines

    Inducible Reporter Cell Lines

    Table 1. Frequently Requested - Constitutive Reporter Cell Lines

    หมวดหมู่ผู้สื่อข่าวHost Cell
    Fluorescent ReporterGFP143 B, 324, 4T1, 9L, A375, A498, A549, AGS, Anip 973, ASPC -1, B16F0, B16 F10, Boy, BT 474, BV2, Bx Pc3, Ca761, CAOV3, Capan-1, Capan-2, CHO-K1, CNE2Z, colo205, Colon 38, COS-7, CT-26, DAOY, DU145, EKVX, FaDu, FEMX I, Flo-1, H460, H69, HCC70, HCT-116, HCT-15, HCT-8, HEK293, HEK293T, HeLa, Hep2, Hep 3B, HEP-G2, HGC27, HOP-62, HT 1080, HT-29, HTB 9, Huh-7, JURKAT, K562, KM-12, KM 28 BM, KU-7, LL/2, LnCap, LOXMIVI, LS 174, Ls180, L-SLM, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-435 2C5, MDA-MB-435 4A4, MDA-MB-453, MDA-MB-468, MDCK, Mel526, MIA-Paca 2, MMT 060562, MOLM13, MSTO-211H, MV3, N87, NALM6, NCI-H1299, NCIH1437, NCI-H1975, NCI-H661, NCI-N87, NIH3T3, NUGC 4, OPM2, OST, OVCAR-3, OVCAR-8, PaCa28, Panc-1, Pan02, PC-3, PC-12, R40LN, RGMI#186, RPMI8226, SH-SY5Y, SK-BR-3, SK-Hep-1, SK-LU-1, Sk-mel-5, SK-OV-3, SL4, SN12C, SNB-19, SOSN2, SW1116, SW480, SW620, SCC-25, T24T, T47D, TOV21, U2OS, U87 MG, U937, UACC257, UM-UC-3, UM-UC 14, Vcap, WiDr, XPAI
    RFP143 B, 4T1, A375, A549, ASPC-1, B16F0, B16-F10, Bx Pc3, BV2, CEM, CHO-K1, CNE2Z, Colon 38, Colo26, CT26.WT, Dunning3327, DAOY, FEMX I, FaDu, FG A-12, H9C2(2-1), HCT-116, HCT-8, HEK293, HEK293T, Hep2, Hep 3B, Hep G2, HGC27, HMMG/HOS, HT 1080, HT29, Huh-7, KAK-1, LnCap, LOXMIVI, LL/2 H460, MDA-MB-231, MDA-MB-435 4A4, MDA-MB-435 2C5, MDA-MB-468, Mel526, MGC803, MIA-Paca 2, MMT 060562, MSTO-211H, MV3, MX-1, NCI-H1299, NCIH1568, NCIH1975, NIH3T3, NPA, NUGC 4, OVCAR-3, OVCAR-5, OVCAR-8, OST, Pan02, PC-3, R40LN, R90L, R90P, SK-BR-3, SW1116, SW480, SL4, SN12C, SOSN2, SH-SY5Y, SK-Hep-1, Sk-mel-5, T24T, T47D, TOV21, U14, U2OS, U87 MG, UM-UC 14, XPAI
    GFP + RFP143 B, B16 F10, DU145, H460, HCT-116, HT 1080, Lewis Lung, MDA-MB-435, MDA-MB-231, MIA-Paca 2, MMT 060562, MV3, PC3, U87 MG, XPAI
    Luciferase ReporterLuciferase4T1, A375, A549, B16F10, CT26.WT, HCT116, HT1080, LL/2, MCF-7, MDA-MB-231, SKOV-3
    Dual ReporterGFP + LuciferaseAGS, HCC70, HT-29, MCF7, NCI-H1299, NCI-H1975, NCI-H661, NCI-N87
    RFP + LuciferaseA549, CNE2Z, GBC-SD, H9C2(2-1), HCT-8, HEK293T, Hep3B, HepG2, HOS, Huh7, Li-7, MDA-MB-231, NCI-H1299, PLC/PRF/5, RBE, SK-HEP-1

    Table 2. Frequently Requested - Inducible Reporter Cell Lines