ข้อมูล

ฉันจะหาลำดับพลาสมิด pMON7124 ได้ที่ไหน

ฉันจะหาลำดับพลาสมิด pMON7124 ได้ที่ไหน


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันต้องการแผนที่ของพลาสมิด pMON7124 เนื่องจากไม่ใช่เรื่องง่ายที่จะหาได้ ฉันยินดีรับคำแนะนำใดๆ


ดูเหมือนว่าไม่มีแผนที่ที่ดีของพลาสมิดนี้ เทคโนโลยีแห่งชีวิตใช้เทคโนโลยีนี้ในแบคทีเรียบางสายพันธุ์ คำกล่าวอ้าง:

E. coli ยังมี helper plasmid, pMON7124 (13.2 kb) ซึ่งเข้ารหัสทรานส์โพเซสและให้ความต้านทานต่อเตตราไซคลิน พลาสมิดตัวช่วยจัดเตรียมฟังก์ชันการขนย้าย Tn7 ในทรานส์

พวกเขาเชื่อมโยงกับสิ่งพิมพ์ต้นฉบับ แต่คุณภาพของภาพในนั้นค่อนข้างแย่:

พวกเขาให้ข้อมูลบางอย่างในข้อความ ดังนั้นฉันขอแนะนำให้อ่านบทความนี้ (หากคุณไม่มีสิทธิ์เข้าถึง โปรดแจ้งให้เราทราบ เราสามารถช่วยได้ที่นี่):

หากยังไม่พอ คุณยังสามารถลองหาเวอร์ชันที่ดีกว่าจากผู้เขียนเจอราร์ด เอฟ. เบอร์รี่ (คุณสามารถหาที่อยู่อีเมล Monsanto ของเขาได้จากการค้นหา)


/> เครื่องมือโคลนและจีโนม เรียกดูพลาสมิดที่เกี่ยวข้องกับการโคลนและการดัดแปลงจีโนม รวมถึงรถรับส่ง การรวม นักข่าว และเวกเตอร์การติดแท็ก
/> เมแทบอลิซึม เรียกดูพลาสมิดที่เกี่ยวข้องกับวิถีการเผาผลาญและส่วนประกอบเสริม
/> เครือข่ายและระเบียบยีน เรียกดูพลาสมิดที่มีทั้งองค์ประกอบควบคุมที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติและสังเคราะห์ รวมทั้งโปรโมเตอร์ เทอร์มิเนเตอร์ รีเพรสเซอร์ แอคติเวเตอร์ และอื่นๆ ยังประกอบด้วยวงจรพันธุกรรมที่ประกอบไว้ล่วงหน้า เช่น ลอจิกเกตและเครือข่ายยีนระดับสูง
/> การตรวจจับและการส่งสัญญาณ เรียกดูพลาสมิดที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณระหว่างเซลล์และการตรวจวัดสภาพแวดล้อม
/> สายพันธุ์ เรียกดูคอลเลกชั่นแบคทีเรียสายพันธุ์ทางวิศวกรรมของ Addgene รวมถึงคู่หน้าที่ของพลาสมิด-สเตรน
  • โปรโมเตอร์ Alper Lab Y. Lipolytica
  • Anderson Lab Plasmids และ Phagemids
  • การควบคุมอัตโนมัติเชิงลบของห้องปฏิบัติการ Balazsi และการถ่ายโอนวงจรยีสต์-สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
  • C. Collins Lab Quorum Sensing
  • Ellis Lab GeneGuard
  • Endy Lab Logic Gates, โปรโมเตอร์ BIOFAB/BCD Kit และ pOSIP Plasmid Kit
  • ปัจจัยการถอดความข้าวโพดและข้าวแล็บสีเทา
  • Hasty Lab Biopixels
  • Jaramillo Lab Riboregulation
  • แพลตฟอร์ม Keasling Lab BglBrick การผลิต Terpenoid และการเหนี่ยวนำ Propionate
  • Lim Lab RNA Feedback
  • Lu Lab Multiplexed/Programmable Gene Networks
  • Mascher Lab Bacillus BioBrick Box
  • Mukhopadhyay Lab Efflux Pumps
  • Voigt Lab Repressors, Terminators, Light Signaling, Sigma Factors, Resource Allocator และสวิตช์มุมฉาก

พลาสมิด คอลเลกชั่น

บันทึกพลาสมิดทั้งหมดถูกรวบรวมจากฐานข้อมูลนิวคลีโอไทด์ของ NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) จากแหล่งข้อมูล INSDC (ซึ่งรวมถึง DDBJ, EMBL-EBI และ GenBank) และ RefSeq โดยใช้ยูทิลิตี้บรรทัดคำสั่ง EDirect ( 17) (เวอร์ชัน 9.80) ข้อมูลที่อธิบายไว้ในที่นี้ถูกดึงมาเมื่อวันที่ 14 กันยายน 2018

ไปป์ไลน์การดึงข้อมูลและการประมวลผล

การเก็บรวบรวมข้อมูล

ระเบียน Plasmid ถูกค้นหาในฐานข้อมูล NCBI nucleotide โดยใช้แบบสอบถามจาก Orlek และคณะ (4) และกรองผลลัพธ์ให้มี 'พลาสมิด' เป็นแท็กตำแหน่ง โดยกำหนดให้กับสิ่งมีชีวิตที่เป็นแบคทีเรียและมาจากทรัพยากรที่ระบุ (INSDC หรือ RefSeq) มีการดึงข้อมูลสรุปของเอกสารสำหรับแต่ละ Hit และข้อมูลต่อไปนี้จะถูกดึงออกมาหากมี: UID, คำอธิบายภาพ (ภาคยานุวัติโดยไม่มีหมายเลขเวอร์ชัน), ชื่อ (คำอธิบายลำดับ), วันที่สร้าง, โทโพโลยี (เช่น วงกลมหรือเชิงเส้น), ความสมบูรณ์, รหัสอนุกรมวิธาน, จีโนม แท็กและความยาวของลำดับ สำหรับบันทึก ID อนุกรมวิธาน ชื่อและยศที่เชื่อมโยง เชื้อสายที่สมบูรณ์และ ID อนุกรมวิธาน และชื่อสำหรับสปีชีส์อันดับ สกุล วงศ์ ลำดับ คลาส ไฟลัมและซูเปอร์คิงดอม สำหรับแต่ละ BioSample ID ที่เชื่อมโยงกับเรคคอร์ดพลาสมิด ชื่อตำแหน่งและพิกัด และแหล่งที่มาของการแยกจะถูกแยกออก พิกัดตำแหน่งที่ดึงมาได้รับการประมวลผล และหากไม่มีอยู่ ระบบจะสอบถามชื่อตำแหน่งโดยใช้ API ของ OpenCageData (https://opencagedata.com/) ในกรณีหลัง พิกัดแผนที่ถูกตรวจสอบด้วยตนเองเพื่อแก้ไขการมอบหมายที่เบี่ยงเบนอย่างมากจากตำแหน่งที่คาดหมาย (เช่น ทวีปหรือประเทศที่ไม่ถูกต้อง) สำหรับแต่ละ ID แอสเซมบลีที่เชื่อมโยงกับเรคคอร์ดพลาสมิด สถานะความสมบูรณ์ ลำดับการเปิดตัวและวันที่ส่งจะถูกแยกออกมา และเป็นเวอร์ชันแอสเซมบลีล่าสุดหรือไม่ ถ้าพลาสมิดเร็กคอร์ดเชื่อมโยงกับ ID แอสเซมบลีหลาย ID แอสเซมบลีที่มีแท็ก 'ล่าสุด' ถูกกำหนดให้กับเร็กคอร์ดนี้ หากไม่มีแอสเซมบลีที่เชื่อมโยงใดมีแท็กนี้ อันใหม่ล่าสุดจะถูกเลือกตามวันที่เผยแพร่ลำดับ

บันทึกการกรอง

ต่อจากนั้น บันทึกพลาสมิดที่รวบรวมถูกกรองในหลายขั้นตอนเพื่อขจัดลำดับโครโมโซมที่ไม่สมบูรณ์หรือติดฉลากผิด ขั้นแรก บันทึกพลาสมิดถูกกรองตามคำอธิบายโดยใช้นิพจน์ทั่วไปที่กำหนดโดย Orlek และคณะ (4) โดยความสมบูรณ์และแท็กความสมบูรณ์ของการประกอบ และโดยอนุกรมวิธานเพื่อขจัดลำดับที่ไม่ใช่แบคทีเรีย เร็กคอร์ดจำเป็นต้องมีแท็กความสมบูรณ์ 'สมบูรณ์' และการประกอบแท็ก 'Complete Genome' หากไม่มีแอสเซมบลีที่เกี่ยวข้องกับเรกคอร์ด จะใช้แท็กเร็กคอร์ดเท่านั้นและ ในทางกลับกัน แท็กความสมบูรณ์ที่ว่างเปล่าจะถูกละเว้น กล่าวคือ ใช้เฉพาะแท็กที่ไม่ว่างเปล่าเพื่อลบระเบียน ในขั้นตอนที่สอง บันทึกจะถูกขจัดความซ้ำซ้อน: คู่ของระเบียนที่มีแนวโน้มเท่ากันจะถูกสร้างขึ้นโดยใช้ Mash ( 15) โดยการคำนวณภาพร่างของลำดับพลาสมิดและระยะทางคู่ของพวกมัน เปรียบเทียบลำดับของคู่ที่มีระยะห่างเป็นศูนย์และจัดกลุ่มระเบียนที่เหมือนกันเข้าด้วยกัน สำหรับแต่ละกลุ่ม เลือกหนึ่งระเบียน คล้ายกับวิธีที่ Orlek . อธิบาย และคณะ (4) โดยเลือกระเบียน RefSeq มากกว่าระเบียน INSDC และโดยเลือกระเบียนที่มีข้อมูลเพิ่มเติม (พิกัดตำแหน่งที่แมปและมีชุดประกอบที่เชื่อมโยง) ในกรณีที่ไม่ชัดเจน เรกคอร์ดที่มีวันที่สร้างที่เก่ากว่าจะถูกเลือก ในขั้นตอนของการกรองที่สาม ลำดับโครโมโซมสมมุติถูกระบุและลบออก รายชื่อผู้สมัครถูกสร้างขึ้นโดยการดำเนินการ an ในซิลิโค การวิเคราะห์ rMLST ( 18) เช่น ค้นหา 53 rps ยีนที่ดาวน์โหลดจาก PubMLST (19) (https://pubmlst.org/rmlst/, 14 กันยายน 2018) ในระเบียนพลาสมิดโดยใช้ BLASTn ( 14) (เวอร์ชัน 2.7.1+) ข้อดีของเครื่องหมายเหล่านี้สำหรับการตรวจหาลำดับโครโมโซมสมมุติฐานคือการมีอยู่ของพวกมันในแบคทีเรียทั้งหมด การกระจายตัวของพวกมันรอบโครโมโซม และการอนุรักษ์หน้าที่ของพวกมัน (18) สำหรับการโจมตี BLAST ความครอบคลุมของเรื่องถูกคำนวณเป็น 100 · (การจัดตำแหน่ง ระยะเวลาทั้งหมด ตัวเลข ของ ช่องว่าง)/เรื่อง ระยะเวลา และเก็บเฉพาะ Hit ที่มีอัตลักษณ์ 100% และความครอบคลุมของตัวแบบเท่านั้น ในบางกรณี rps ยีนสามารถระบุตำแหน่งบนพลาสมิด (20) ได้ มีเพียงระเบียนพลาสมิดที่มีจำนวนมากกว่า 5 ตัวเท่านั้น rps ยีน (เช่น มากกว่า 10% ของ 53 ยีน) อยู่ภายใต้การค้นหา BLAST ระยะไกล (megablast) ในฐานข้อมูล NCBI nr/nt โดยใช้แบบสอบถาม Entrez เพื่อแยกลำดับเรื่องที่ไม่ใช่โครโมโซม บันทึกใดๆ ที่มีอย่างน้อยหนึ่งครั้งที่มีข้อมูลระบุตัวตนอย่างน้อย 99% และครอบคลุมการสืบค้น 80% ถูกแยกออกจากคอลเล็กชันพลาสมิด

บันทึกคำอธิบายประกอบ

ลำดับได้รับการอธิบายโดยทำการค้นหา BLASTn สำหรับปัจจัยต้านทานจาก ARG-ANNOT ( 9), CARD ( 10) และ ResFinder ( 11) โดยมีความเฉพาะตัวและความครอบคลุมน้อยที่สุด 95%, ปัจจัยความรุนแรงจาก VFDB ( 12) โดยมีความเฉพาะตัวและความครอบคลุมน้อยที่สุด 95% และตัวจำลองจาก PlasmidFinder ( 13) โดยใช้ Enterobacteriaceae และชุดข้อมูลแกรมบวกที่มีข้อมูลระบุตัวตนน้อยที่สุด 80% และครอบคลุมน้อยที่สุด 60% สำหรับ PlasmidFinder การระบุตัวตนและความครอบคลุมถูกกำหนดตามคำแนะนำของผู้เขียน (13) เครื่องมือ ABRicate ซึ่งดำเนินการโดย Seemann (https://github.com/tseemann/abricate เวอร์ชัน 0.8.7) ใช้เพื่อดาวน์โหลดและเตรียมฐานข้อมูลที่ดำเนินการเมื่อวันที่ 14 กันยายน 2018 ยกเว้น VFDB ที่อัปเดตเมื่อวันที่ 17 กันยายน 2018 สำหรับการค้นหาลำดับ มีการใช้แนวทางที่คล้ายคลึงกับแนวทางที่เว็บเซิร์ฟเวอร์ PlasmidFinder ใช้ (https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/) สคริปต์จากโมดูลหลักของ Center for Genomic Epidemiology (https://bitbucket.org/genomicepidemiology/cge_core_module) ถูกใช้เพื่อเรียกใช้การค้นหา BLAST และประมวลผล Hit ล่วงหน้าซึ่งส่งผลให้มี Hit ที่ดีที่สุดหนึ่งครั้งต่อหัวข้อ จากนั้นจึงกรอง Hit ตามค่าจุดตัดที่กำหนด ในที่สุด Hit ที่ทับซ้อนกันก็ถูกลบออก พลาสมิดที่มีตัวจำลองที่มีรูปแบบ pMLST ที่สอดคล้องกัน (IncA/C, IncF, IncHI1, IncHI2, IncI1 หรือ IncN) ในซิลิโค การวิเคราะห์ pMLST ( 13) โดยใช้รูปแบบและโปรไฟล์จาก PubMLST (19) (https://pubmlst.org/plasmid/, 14 กันยายน 2018) เครื่องมือบรรทัดคำสั่ง mlst ใช้งานโดย Seemann (https://github.com/tseemann/mlst เวอร์ชัน 2.10) ถูกนำไปใช้โดยใช้ข้อมูลระบุตัวตนขั้นต่ำ 85% และความครอบคลุมน้อยที่สุด 66% ตามที่ Carattoli แนะนำ และคณะ (13). สำหรับพลาสมิด IncF ชนิดลำดับถูกกำหนดตามสูตร FAB (21) หากจำนวนอัลลีลที่พบไม่แน่นอน (ในแง่ของความยาวและเอกลักษณ์ของโลคัส) หรือคลุมเครือ (จำนวนครั้งที่แน่นอนหลายครั้ง) แสดงว่าไม่มีการตั้งค่ารหัสอัลลีล หากตัวจำลอง FIC/FII มากกว่าหนึ่งตัวมีอัลลีลที่ตรงกันอย่างน้อยหนึ่งตัวตรง ส่วนแรกของประเภทลำดับถูกตั้งค่าเป็น '−−' เช่น การจำลองแบบ FIC/FII ที่คลุมเครือ หากไม่มีตัวจำลองเหล่านี้มีการโจมตีแบบอัลลีลที่แน่นอน แล้วใช้ 'F-' ถัดไป ใช้ Mash ( 15) (เวอร์ชัน 2.0) เพื่อสร้างภาพร่างของลำดับพลาสมิดนิวคลีโอไทด์โดยใช้พารามิเตอร์ -i -S 42 -p 20 -k 21 -s 1000 การฝัง 2 มิติของลำดับพลาสมิดคำนวณโดยใช้ UMAP ( 22) (เวอร์ชัน 0.2.5) ขั้นแรก ระยะทางเป็นคู่ระหว่างลำดับถูกคำนวณจากแบบร่าง Mash ที่สร้างขึ้น จากนั้น UMAP ถูกนำไปใช้กับเมทริกซ์ระยะทางโดยใช้พารามิเตอร์ n_neighbors=50, n_components=2, init='random', metric='precomputed' พลาสมิดที่คล้ายคลึงกันคู่ที่ไม่ซ้ำกันถูกระบุโดยการคำนวณระยะทางแบบคู่ด้วย Mash โดยมีจุดตัดระยะทาง 0.00123693 ซึ่งสอดคล้องกับแฮชที่แชร์อย่างน้อย 950 จาก 1,000 รายการ ในที่สุด ฐานข้อมูล BLAST ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ makeblastdb จากไฟล์เรียกทำงาน BLAST+ ( 14) (เวอร์ชัน 2.7.1+) ที่เรียกด้วยพารามิเตอร์ -input_type fasta -dbtype nucl

ภาพรวมของพลาสมิดที่เก็บรวบรวม

ทั้งหมด 13 789 บันทึกพลาสมิด (2945 จาก INSDC และ 10 844 จาก RefSeq) ถูกดึงมาจากฐานข้อมูลนิวคลีโอไทด์ NCBI ตามวันที่สร้างบันทึก จำนวนพลาสมิดเพิ่มขึ้นอย่างมากในปีที่ผ่านมา โดยมีลำดับที่ไม่ซ้ำกันมากกว่า 1,000 รายการต่อปีตั้งแต่ปี 2015 (รูปที่ 1) นอกจากนี้ บันทึกที่รวบรวมตั้งแต่ปี 2015 ครอบคลุมมากกว่า 60% ของชุดข้อมูล (9544 ระเบียน) ความยาวลำดับของเร็กคอร์ดพลาสมิดที่ได้รับอยู่ในช่วง 655 ถึง 2 580 084 bp โดยมีค่ามัธยฐาน 52 830 bp นอกจากนี้ คอลเล็กชั่นที่สร้างขึ้นยังครอบคลุมถึง 1753 สปีชีส์ 488 สกุล 201 ตระกูล 98 ออร์เดอร์ 42 คลาสและ 22 phyla สามารถรับพิกัดตำแหน่งได้ 6171 รายการ (44.8%) การใช้ระเบียน PlasmidFinder 5452 (39.5%) สามารถระบุได้ โดย 2617 รายการต้องปฏิบัติตาม ในซิลิโค การวิเคราะห์ PMLST

จำนวนพลาสมิดเร็กคอร์ดที่รวมอยู่ในคอลเล็กชันที่จัดกลุ่มตามปีที่สร้าง NS y-ขนาดแกนคือการแปลงรากที่สอง


จะทราบขนาดพลาสมิดที่แน่นอนได้อย่างไร? - - supercoiled, nicked, เชิงเส้น (27 มี.ค. 2552 )

ตอนนี้ฉันกำลังทำงานกับแบคทีเรียที่แยกได้ใหม่บางตัวด้วยตัวเองและฉันไม่รู้ว่ามีพลาสมิดชนิดใดอยู่ข้างใน
ฉันได้สกัด DNA พลาสมิดออกมาและทำเจลรัน

และมันก็แสดงให้ฉันเห็นด้วยหลายแถบ ใช่ ฉันรู้ว่ามันเป็นเรื่องธรรมดาสำหรับพลาสมิด DNA เนื่องจากโครงสร้างของมัน (ซุปเปอร์คอยล์ นิ๊ก และเชิงเส้น) ดังนั้นจึงให้รูปแบบการย้ายถิ่นที่แตกต่างกัน

ฉันจะทราบขนาดที่แน่นอนของพลาสมิดที่ฉันสกัดได้อย่างไร เนื่องจากมันโยกย้ายต่างกันแต่ในขนาดเดียวกัน ?


กรุณาแก้ไขฉันถ้าฉันผิด
ขอบคุณ.

วิธีเดียวที่จะทราบขนาดที่แน่นอนคือการจัดลำดับ คุณจะได้ขนาดโดยประมาณโดยการตัดมันด้วยเอ็นไซม์จำกัดและดูว่าชิ้นส่วนขนาดใดที่ผลิตขึ้น อาจต้องใช้การทดสอบกับเอ็นไซม์ต่างๆ สองสามตัวเพื่อค้นหาเอ็นไซม์ที่ตัดเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อย ดังนั้นคุณสามารถเพิ่มขนาดชิ้นส่วนขึ้นเพื่อให้ได้ผลรวม

ใช่อย่างที่ HomeBrew บอกว่าคุณต้องตัดพลาสมิดของคุณเพื่อให้ได้พลาสมิดเชิงเส้นจากนั้นเรียกใช้เจลอีกครั้ง แต่คำถามของฉันคือ ถ้าทราบสายพันธุ์แบคทีเรียของคุณแล้ว คุณจะไม่พบลำดับพลาสมิดที่ Genebank หรือที่ไหนสักแห่งที่จะหาว่า RE จะให้แถบเส้นตรงเพียงเส้นเดียวกับคุณได้อย่างไร

เรียกใช้เวกเตอร์มาตรฐานโดยไม่ย่อยและเปรียบเทียบการเคลื่อนที่ของพวกมันและประมาณขนาดโดยประมาณของพลาสมิดปี

แต่แบคทีเรียที่แตกต่างกันอาจมีพลาสมิดต่างกัน ? แล้วฉันจะแน่ใจได้อย่างไรว่ามีพลาสมิดตัวไหน?

เห็นด้วยกับจขกท. ตัดพลาสมิดด้วยเอนไซม์จำกัด และเรียกใช้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วยบันไดดีเอ็นเอ

คุณอาจได้รับชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นจากการย่อย เพียงแค่รวมขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ

ทำซ้ำสำหรับเอ็นไซม์ต่างๆ หลายตัว ในกรณีที่เอ็นไซม์ไม่ตัดหรือตัดบ่อยเกินไป

ตกลง. ขอบคุณทุกท่านมาก! ฉันจะดำเนินการตามข้อจำกัดนั้นต่อไป =)


สารบัญ

ในบางกรณี เวกเตอร์อาจไม่มี MCS แต่สามารถเพิ่ม MCS ลงในเวกเตอร์ได้ [4] ขั้นตอนแรกคือการออกแบบลำดับโอลิโกนิวคลีโอไทด์เสริมที่มีไซต์เอ็นไซม์จำกัดพร้อมกับฐานเพิ่มเติมที่ส่วนท้ายซึ่งเป็นส่วนเสริมของเวกเตอร์หลังจากการย่อย จากนั้นลำดับโอลิโกนิวคลีโอไทด์สามารถอบอ่อนและผูกมัดไปในเวกเตอร์ที่ย่อยและทำให้บริสุทธิ์ได้ เวกเตอร์ที่ย่อยแล้วถูกตัดด้วยเอนไซม์จำกัดที่เสริมส่วนยื่นของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ หลังจากทำ ligation ให้แปลงเวกเตอร์เป็นแบคทีเรียและตรวจสอบการแทรกโดยการจัดลำดับ วิธีนี้สามารถใช้เพื่อเพิ่มไซต์การจำกัดใหม่ไปยังไซต์การโคลนหลายไซต์

ไซต์โคลนหลายแห่งเป็นคุณลักษณะที่ช่วยให้สามารถแทรก DNA ต่างประเทศโดยไม่รบกวนส่วนที่เหลือของพลาสมิด ซึ่งทำให้มีประโยชน์อย่างมากในด้านเทคโนโลยีชีวภาพ วิศวกรรมชีวภาพ และอณูพันธุศาสตร์ [1] MCS สามารถช่วยในการสร้างสิ่งมีชีวิตดัดแปรพันธุกรรม หรือที่เรียกกันทั่วไปว่าสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMO) โดยใช้พันธุวิศวกรรม ในการใช้ประโยชน์จาก MCS ในพันธุวิศวกรรม จะต้องเพิ่มยีนที่น่าสนใจลงในเวกเตอร์ระหว่างการผลิตเมื่อ MCS ถูกตัดออก [5] หลังจากสร้าง MCS และผูกมัดแล้ว จะรวมยีนที่สนใจและสามารถขยายเพื่อเพิ่มจำนวนสำเนายีนในโฮสต์ของแบคทีเรีย หลังจากที่แบคทีเรียทำซ้ำแล้ว ยีนที่สนใจสามารถดึงออกจากแบคทีเรียได้ ในบางกรณี สามารถใช้เวกเตอร์การแสดงออกเพื่อสร้างผลิตภัณฑ์โปรตีน หลังจากแยกผลิตภัณฑ์ออกแล้ว ก็มีการใช้งานที่หลากหลาย เช่น การผลิตอินซูลิน การสร้างวัคซีน การผลิตยาปฏิชีวนะ และการสร้างยีนบำบัด

พลาสมิดของแบคทีเรียหนึ่งตัวที่ใช้ในพันธุวิศวกรรมในฐานะเวกเตอร์การโคลนพลาสมิดคือ pUC18 บริเวณพอลิลิงก์เกอร์ประกอบด้วยไซต์การรู้จำเอ็นไซม์จำกัดหลายจุด ซึ่งได้รับการออกแบบให้เป็นคลัสเตอร์เดียว (พอลิลิงก์เกอร์) มีไซต์จำกัดสำหรับเอ็นไซม์จำกัดต่างๆ รวมถึง EcoRI, BamHI และ PstI เวกเตอร์อีกตัวหนึ่งที่ใช้ในพันธุวิศวกรรมคือ pUC19 ซึ่งคล้ายกับ pUC18 แต่บริเวณพอลิลิงก์เกอร์กลับด้าน E.coli ยังนิยมใช้เป็นโฮสต์ของแบคทีเรียเนื่องจากความพร้อม อัตราการเติบโตอย่างรวดเร็ว และความเก่งกาจ [6]

ขั้นตอนแรกคือการตัด MCS ในพลาสมิดที่ใช้เพื่อสร้างยีนวิศวกรรมทางพันธุกรรม [7] เมื่อ MCS ถูกตัดออก ยีนสำหรับอินซูลินของมนุษย์สามารถถูกเพิ่มเข้าไปได้ ทำให้พลาสมิดดัดแปลงพันธุกรรม หลังจากนั้นพลาสมิดดัดแปลงพันธุกรรมจะถูกใส่เข้าไปในโฮสต์ของแบคทีเรียและปล่อยให้แบ่งตัว เพื่อให้มีปริมาณมากตามที่ต้องการ เซลล์เจ้าบ้านจะถูกใส่ลงในถังหมักขนาดใหญ่ที่มีสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเจ้าบ้าน กระบวนการนี้เสร็จสิ้นโดยการกรองอินซูลินออกจากโฮสต์ การทำให้บริสุทธิ์สามารถเกิดขึ้นได้เพื่อให้สามารถบรรจุและแจกจ่ายอินซูลินไปยังผู้ป่วยโรคเบาหวานได้


ลำดับดีเอ็นเอ

การจัดลำดับดีเอ็นเอให้ลักษณะเฉพาะที่สมบูรณ์ที่สุดของ DNA พลาสมิดลูกผสม การใช้ไพรเมอร์ที่มุ่งเป้าไปที่กระดูกสันหลังของพลาสมิดและ/หรือลำดับการสอดแทรก ความเหมือนกันและลำดับของเบสนิวคลีโอไทด์สำหรับ DNA ที่กำหนดให้ใดๆ สามารถกำหนดได้ ในบริบทของการโคลน การจัดลำดับทำให้ผู้ใช้สามารถยืนยันลำดับดีเอ็นเอของเม็ดมีด การวางแนวของเม็ดมีด และตรวจสอบรอยต่อระหว่างพลาสมิดกับดีเอ็นเอของเม็ดมีดได้ ขนาดของเม็ดมีด DNA จะกำหนดจำนวนและไพรเมอร์ใดที่จำเป็นในการกำหนดลำดับที่สมบูรณ์ ในกรณีที่ต้องกำหนดลำดับการแทรกที่สมบูรณ์ ขอแนะนำให้ใช้ไพรเมอร์ที่กำหนดเป้าหมายทั้งพลาสมิด DNA

100-150 เบสนอกไซต์แทรกและ DNA แทรก สีรองพื้นควรได้รับการออกแบบมาเพื่อให้ครอบคลุมลำดับเม็ดมีดทั้งหมดอย่างน้อย 2 เท่า เพื่อการกำหนดลักษณะที่เชื่อถือได้

ทุกวันนี้ เทคนิคการหาลำดับของ Sanger เป็นวิธีการที่ใช้บ่อยที่สุดในการกำหนดลำดับดีเอ็นเอของพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ การจัดลำดับ Sanger เกี่ยวข้องกับการใช้ DNA polymerase, ไพรเมอร์, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) ที่ไม่ติดฉลาก และ dideoxynucleotide triphosphates ที่ติดฉลากเรืองแสง (ddNTPs) โดยที่แต่ละเบสจะติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์ที่มีลักษณะเฉพาะ การรวมตัวของ ddNTP เข้ากับสายที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ช่วยป้องกันการเติมนิวคลีโอไทด์ที่ตามมา หยุดการยืดตัวต่อไปของโมเลกุล DNA และส่งผลให้ผลิตภัณฑ์ดีเอ็นเอมี ddNTP ที่ติดฉลากเรืองแสงที่ส่วนท้ายของสาย ลำดับของนิวคลีโอไทด์สามารถกำหนดได้โดยการแยกผลิตภัณฑ์ดีเอ็นเอตามขนาด

ในขณะที่การจัดลำดับ Sanger ยังคงเป็นมาตรฐานสำหรับการวิเคราะห์ดีเอ็นเอลูกผสม เทคโนโลยีการหาลำดับถัดไป (NGS) เช่น Illumina®, Ion Torrent ® , Pacific Biosciences ® และ Oxford Nanopore Technologies® เป็นแพลตฟอร์มสำหรับการวิเคราะห์ลำดับที่มีปริมาณงานสูงและต้นทุนต่ำ ชุดผลิตภัณฑ์ NEBNext ® รองรับการจัดลำดับรุ่นต่อไปด้วยเครื่องมือการเตรียมตัวอย่างที่ปรับปรุงเวิร์กโฟลว์ ลดอินพุต และปรับปรุงผลผลิตและคุณภาพของห้องสมุดสำหรับ DNA, ChIP DNA และ RNA รวมถึงเซลล์เดียวและ RNA ขนาดเล็ก

เลือกประเภท:

ผลิตภัณฑ์นี้อยู่ภายใต้สิทธิบัตร เครื่องหมายการค้าและ/หรือลิขสิทธิ์อย่างน้อยหนึ่งรายการซึ่งเป็นเจ้าของหรือควบคุมโดย New England Biolabs, Inc (NEB)

แม้ว่า NEB จะพัฒนาและตรวจสอบผลิตภัณฑ์ของตนสำหรับแอปพลิเคชันต่างๆ การใช้ผลิตภัณฑ์นี้อาจทำให้ผู้ซื้อต้องได้รับสิทธิ์ในทรัพย์สินทางปัญญาของบุคคลที่สามเพิ่มเติมสำหรับแอปพลิเคชันบางอย่าง

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับสิทธิ์ทางการค้า โปรดติดต่อทีมพัฒนาธุรกิจระดับโลกของ NEB ที่ [email protected]

ผลิตภัณฑ์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อการวิจัยเท่านั้น ผลิตภัณฑ์นี้ไม่ได้มีวัตถุประสงค์เพื่อใช้สำหรับวัตถุประสงค์ในการรักษาหรือวินิจฉัยในมนุษย์หรือสัตว์


แหล่งข้อมูลอื่นๆ

นำคำถามมาสู่ห้องเรียนของคุณด้วย pGLO Plasmid (PPT 9.06 MB)

ใช้ pGLO Bacterial Transformation เพื่อแสดงแนวทางปฏิบัติทางวิทยาศาสตร์และวิศวกรรมที่อธิบายไว้ในกรอบงาน NGSS

เพลย์ลิสต์การแปลงแบคทีเรีย pGLO ของ YouTube

ใช้วิดีโอแนะนำสั้นๆ เหล่านี้เพื่อเพิ่มพูนบทเรียนเกี่ยวกับแบคทีเรีย การเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรีย และโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP)

กรณีศึกษา

ส่วนต่อขยายสำหรับนักเรียนซึ่งมีประโยชน์สำหรับการเตรียมสอบ AP ด้วย

กรณีศึกษา: บทบาทของการเปลี่ยนแปลงแบคทีเรียในการควบคุมการแพร่เชื้อมาลาเรีย (PDF 3.3 MB)

กรณีศึกษา: การแฮ็ก Gut Microbiome (PDF 1.5 MB)


16.2 ผลิตภัณฑ์เทคโนโลยีชีวภาพ

1. สิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรมสามารถผลิตผลิตภัณฑ์เทคโนโลยีชีวภาพได้
2. สิ่งมีชีวิตที่มียีนต่างประเทศแทรกเข้าไปคือ ดัดแปลงพันธุกรรม.

NS. แบคทีเรียดัดแปลงพันธุกรรม

1. แบคทีเรียเติบโตในถังขนาดใหญ่ที่สามารถผลิตผลิตภัณฑ์ต่างๆ เช่น อินซูลินและฮอร์โมนการเจริญเติบโตของมนุษย์ และวัคซีน
2. มีการผลิตแบคทีเรียแปลงพันธุ์เพื่อปรับปรุงสุขภาพของพืชและย่อยสลายสาร เช่น น้ำมัน
3. แบคทีเรียแปลงพันธุ์สามารถผลิตผลิตภัณฑ์เคมี เช่น ฟีนิลอะลานีน (สารให้ความหวานเทียม)

NS. พืชดัดแปรพันธุกรรม
1. ยีนจากต่างประเทศทำให้ฝ้าย ข้าวโพด และมันฝรั่งสามารถผลิตสารพิษจากแมลงได้
2. พืชกำลังถูกออกแบบทางวิศวกรรมเพื่อผลิตโปรตีนของมนุษย์ รวมทั้งฮอร์โมน ปัจจัยการแข็งตัวของเลือด และแอนติบอดี

ค. สัตว์ดัดแปรพันธุกรรม

การใช้สัตว์ต้องใช้วิธีการแทรกยีนเข้าไปในไข่ของสัตว์ (ช่วงต้นของการพัฒนา) เมื่อใช้เทคนิคนี้ ไข่สัตว์หลายชนิดได้รับการฉีดฮอร์โมนการเจริญเติบโตของวัว (bGH) เพื่อผลิตปลา วัว สุกร กระต่าย และแกะที่ใหญ่ขึ้น

ยีนฟาร์มา” คือการใช้สัตว์เลี้ยงในฟาร์มดัดแปรพันธุกรรมเพื่อผลิตยาที่ผลิตภัณฑ์หาได้จากน้ำนมของตัวเมีย

NS. การโคลนสัตว์ดัดแปรพันธุกรรม

1. การโคลนดอลลี่ในปี 2540 แสดงให้เห็นว่าสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสามารถโคลนได้
2. การโคลนสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเป็นการฉีดนิวเคลียสของเซลล์ที่โตเต็มวัยเข้าไปในไข่ที่สร้างนิวเคลียส
3. ไข่โคลนเริ่มพัฒนาในหลอดทดลองและจะถูกส่งกลับไปยังแม่ที่เป็นโฮสต์จนกว่าโคลนจะเกิด

สถานการณ์ที่ 1: ม้าอันเป็นที่รักชื่อ Barbero หักขาของเขาในการแข่งขัน หลายคนอธิษฐานขอให้มีสุขภาพที่ดี และใช้เงินหลายพันดอลลาร์เพื่อพยายามทำให้เขาหายดี ส่งจดหมายและดอกไม้ไปที่โรงพยาบาลสัตว์และคอกม้าที่ Barbero อาศัยอยู่ อนิจจา หลังจากหนึ่งปีของการฟื้นตัวที่ไม่ดี การตัดสินใจฆ่า Barbero ก็เกิดขึ้น เจ้าของเก็บตัวอย่าง DNA ของเขาไว้เพื่อให้สามารถโคลน Barbero ได้ คุณคิดว่าพวกเขาควรจะโคลนเขาหรือไม่? ทำไมหรือทำไมไม่.

สถานการณ์ที่ 2: เมลิสสาเป็นเด็กอายุ 5 ขวบที่มีความสุขและเป็นที่รักของครอบครัว เธอป่วยและได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นมะเร็งเม็ดเลือดขาวในวัยเด็ก การค้นหาอย่างสิ้นหวังจึงเกิดขึ้นเพื่อค้นหาผู้บริจาคไขกระดูกที่ตรงกับเมลิสซา หลังจากค้นหามาหนึ่งปี ทัศนะของเมลิสสาก็ช่างน่ากลัว ครอบครัวของเธอตัดสินใจโคลนเมลิสซาเพื่อให้ร่างโคลนของเธอสามารถเป็นผู้บริจาคไขกระดูกได้ คุณคิดว่านี่เป็นความคิดของพระเจ้าหรือไม่? ทำไมหรือทำไมไม่.

16.3 จีโนมิกส์

พันธุศาสตร์ในศตวรรษที่ 21 ความกังวล จีโนม: การศึกษาจีโนมของมนุษย์และสิ่งมีชีวิตอื่นๆ

NS. การจัดลำดับฐาน

  • โครงการจีโนมมนุษย์ได้จัดทำร่างการทำงานของคู่เบสทั้งหมดในโครโมโซมทั้งหมดของเรา
  • งานนี้ใช้เวลา 13 ปีในการเรียนรู้ลำดับเบสคู่สามพันล้านคู่ตามความยาวของโครโมโซมของเรา
  • สิ่งมีชีวิตอื่นกำลังถูกจัดลำดับเพื่อเปรียบเทียบยีนและยีนที่อยู่ในตำแหน่งที่รับผิดชอบต่อความผิดปกติ

NS โครงการ HapMap -- ความแตกต่างของลำดับรายการที่เรียกว่า haplotypes ในมนุษย์

รายละเอียดทางพันธุกรรม

  1. DNA microarrays ระบุจีโนไทป์ที่สมบูรณ์ของบุคคลซึ่งเรียกว่า รายละเอียดทางพันธุกรรม.
  2. โปรไฟล์ดีเอ็นเอสามารถระบุได้ว่าบุคคลนั้นมีความเสี่ยงต่อโรคเฉพาะหรือไม่
  3. โปรไฟล์ทางพันธุกรรมสามารถใช้เพื่อพิจารณาว่าการบำบัดด้วยยาเฉพาะมีความเหมาะสมในสภาวะทางคลินิกที่จำเพาะหรือไม่
  1. โปรตีโอมิกส์ คือการศึกษาโครงสร้าง หน้าที่ และปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนในเซลล์
  2. ข้อมูลที่ได้จากการศึกษาโปรตีโอมิกสามารถใช้ในการออกแบบยาที่ดีกว่า และเพื่อเชื่อมโยงการรักษาด้วยยากับจีโนมเฉพาะของแต่ละบุคคล

ชีวสารสนเทศศาสตร์

  1. ชีวสารสนเทศศาสตร์ เป็นการนำเทคโนโลยีคอมพิวเตอร์มาใช้ในการศึกษาจีโนม
  2. ข้อมูลที่ได้จากการวิเคราะห์ด้วยคอมพิวเตอร์ของจีโนมสามารถแสดงความสัมพันธ์ระหว่างโปรไฟล์ทางพันธุกรรมและความผิดปกติทางพันธุกรรม

16.4 ยีนบำบัด

1. ยีนบำบัด เกี่ยวข้องกับขั้นตอนเพื่อให้ผู้ป่วยมียีนที่แข็งแรงเพื่อทดแทนยีนที่ผิดพลาด
2. ยีนบำบัดยังรวมถึงการใช้ยีนเพื่อรักษาความผิดปกติทางพันธุกรรมและความเจ็บป่วยต่างๆ ของมนุษย์
3. มี อดีตร่างกาย (ภายนอกร่างกาย) และ ในร่างกาย (ภายในร่างกาย) วิธีการบำบัดด้วยยีน

/>งานนี้ได้รับอนุญาตภายใต้ Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License


ฉันจะหาลำดับพลาสมิด pMON7124 ได้ที่ไหน - ชีววิทยา

ข้อมูลเกี่ยวกับวิธีการโคลนนิ่ง

คำอธิบาย
ในการโคลนนิ่งเอ็นไซม์จำกัดมาตรฐาน (RE) เอนไซม์จำเพาะถูกใช้เพื่อแยก DNA ที่ลำดับ DNA จำเพาะ และชิ้นส่วนที่มีปลายที่เข้ากันได้ (หรือชิ้นส่วนปลายทู่) จะถูกมัดเข้าด้วยกันเพื่อสร้างพลาสมิดทรงกลม ซึ่งสามารถแปลงสภาพและขยายพันธุ์ได้ ในแบคทีเรีย สามารถใช้วิธีการนี้เพื่อเพิ่ม ลบ หรือจัดการลำดับดีเอ็นเอได้

เรียนรู้เพิ่มเติม
หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับวิธีการนี้ โปรดอ่านตำราอณูชีววิทยาหรือคู่มือโปรโตคอล

ข้อดี
ข้อได้เปรียบที่สำคัญของการโคลน RE คือเนื่องจากมีการใช้งานมาหลายปี รีเอเจนต์และโปรโตคอลจึงพร้อมสำหรับนักวิจัยส่วนใหญ่

ใน PlasmID
พลาสมิดแทบทุกชนิดสามารถถูกจัดการได้โดยใช้วิธีการโคลนนิ่งของเอนไซม์จำกัด มีประโยชน์อย่างยิ่งคือพลาสมิดเหล่านั้นที่มีจุดโคลนหลายจุด (MCS) หรือที่เรียกว่าพอลิลิงก์เกอร์

คำอธิบาย
เอนไซม์ CpoI (หาได้จาก Fermentas และผู้จำหน่ายรายอื่น) รับรู้ลำดับ cggtccg หรือ cggaccg เอ็นไซม์จะตัดหลังจาก cg แรก โดยเหลือโอเวอร์แฮงก์สามไพรม์คู่เบสสามคู่ คุณสมบัติเหล่านี้ทำให้สามารถใช้ CpoI เพื่อโคลนแฟรกเมนต์ PCR-amplified ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษในเฟรมและกำหนดทิศทางไปยังเวกเตอร์ที่ย่อยด้วย CpoI แนวทาง CpoI สามารถใช้เพื่อเพิ่มส่วนแทรกลงในเวกเตอร์ด้วยไซต์การโคลน aCpoI

เรียนรู้เพิ่มเติม
หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับวิธีการนี้ โปรดดูเอกสารที่ใช้วิธีการ เช่น Petrucco et al (2002) "A Nick-sensing 3' DNA Repair Enzyme จาก Arabidopsis" (PMID: 11948185), Izumiya และคณะ (2003) "การควบคุมวงจรเซลล์ . " (PMID: 12915577 ) หรือ Izumiya et al. (2005) "Kaposi's sarcoma ที่สัมพันธ์กัน " (PMID: 16014952 ) นอกจากนี้ยังเป็นประโยชน์ในการวาดเวกเตอร์และผลิตภัณฑ์ PCR ที่สิ้นสุดเพื่อดูว่าวิธีการทำงานอย่างไร

ข้อดี
ข้อได้เปรียบที่สำคัญของวิธีการโคลนแบบทิศทางตาม CpoI เหนือวิธีการไดเจสต์แบบจำกัดทั่วไป ได้แก่ (1) เนื่องจากส่วนที่ยื่นเป็นคู่เบสสามคู่ จึงง่ายต่อการเก็บสิ่งต่าง ๆ ไว้ในเฟรม และ (2) สามารถใช้เอนไซม์ตัวเดียวในทิศทาง วิธีการ (แนวทางที่มีทิศทางส่วนใหญ่ต้องการให้ปลายด้านหนึ่งถูกตัดด้วยเอนไซม์จำกัดตัวหนึ่ง และปลายอีกข้างหนึ่งถูกตัดด้วยเอนไซม์จำกัดที่ต่างกัน)

ใน PlasmID
พลาสมิดหลายตัวใช้ร่วมกับที่เก็บโดย J. Kamil (ห้องปฏิบัติการของ D. Coen, BCMP Department ที่ Harvard Medical School) ซึ่งมีประโยชน์สำหรับการเพิ่มแท็ก N-terminal และ C-terminal (เช่น 6xHis, แท็ก eptiope T7) ลอง "advanced search" ด้วย "Kamil" เป็นผู้เขียน หรือลอง "search by vector" และเลือก "CpoI-based cloning" เป็นวิธีโคลน

คำอธิบาย
ระบบ Creator (TM) ของ Clontech และพลาสมิดที่ประกอบด้วยไซต์ LoxP อื่นๆ สามารถใช้เพื่อเพิ่ม แทนที่ หรือจัดการ DNA โดยใช้เอนไซม์ Cre ซึ่งกระตุ้นการรวมตัวใหม่เฉพาะไซต์ที่ไซต์ LoxP โปรดทราบว่าไม่ใช่ทุกเวกเตอร์ที่มี LoxP เหมาะสมสำหรับวิธีการโคลนแบบ Cre/Lox บางครั้ง LoxP มีอยู่เพื่อทำให้แนวทางการทดลองบางอย่างเป็นไปได้ซึ่งไม่เกี่ยวข้องกับการโคลนนิ่ง (ตัวอย่างเช่น บางครั้งโครงสร้างที่ประกอบด้วย LoxP จะถูกนำเข้าสู่เซลล์ จากนั้นในการแสดงออกของ Cre จะใช้เพื่อทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลง)

เรียนรู้เพิ่มเติม
หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับวิธีการนี้ โปรดดูเว็บไซต์ Clontech www.clontech.com และข้อมูลอ้างอิงที่เหมาะสม ซึ่งรวมถึง Hoess et al (1982) "P1 การรวมตัวใหม่เฉพาะไซต์: ลำดับนิวคลีโอไทด์ของตำแหน่งการรวมตัวใหม่" (PubMed ID 6954485)

ข้อดี
ข้อได้เปรียบที่สำคัญของระบบคือสามารถโคลนเม็ดมีดลงในเวกเตอร์ 'มาสเตอร์' หรือ 'รายการ' เดียว และทำการโคลนย่อยได้อย่างง่ายดายในเวคเตอร์การแสดงออกต่างๆ มากมายโดยไม่จำเป็นต้องย่อยด้วยเอ็นไซม์จำกัด เจลทำให้บริสุทธิ์ ลิเกต ฯลฯ

ใน PlasmID
open reading frame (ORF) หรือโคลน cDNA ที่ตรวจสอบลำดับจำนวนมากใน pDNR-Dual ที่แชร์กับที่เก็บโดย Harvard Institute of Proteomics (HIP) ที่ Harvard Medical School โคลนบางส่วนเหล่านี้อยู่ในรูปแบบ "closed" เพื่อให้มี codon หยุดปกติ และบางตัวเป็นรูปแบบ "fusion" ซึ่ง codon หยุดถูกแทนที่ด้วย leu codon เพื่อให้สามารถเพิ่มแท็ก C-terminal

คำอธิบาย
ระบบเกตเวย์ (TM) ของ Invitrogen และพลาสมิดที่มีตำแหน่งการรวมตัวใหม่ของแลมบ์ดาฟาจ (att) สามารถใช้เพื่อเพิ่ม แทนที่ หรือจัดการ DNA โดยใช้เอนไซม์ที่กระตุ้นการรวมตัวแบบจำเพาะต่อตำแหน่งที่ไซต์ประเภท att

เรียนรู้เพิ่มเติม
หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับวิธีการนี้ โปรดดูเว็บไซต์ Invitrogen www.invitrogen.com และการอ้างอิงที่เหมาะสม ซึ่งรวมถึง Landy (1989) "Dynamic โครงสร้างและกฎข้อบังคับของ lambda site-specific recombination" (PubMed ID 2528323)

ข้อดี
คล้ายกับแนวทาง Cre/Lox ข้อได้เปรียบที่สำคัญของระบบคือสามารถโคลนเม็ดมีดลงในเวกเตอร์ 'มาสเตอร์' หรือ 'รายการ' เดียว และคัดลอกย่อยได้อย่างง่ายดายในเวคเตอร์การแสดงออกที่แตกต่างกันจำนวนมากโดยไม่จำเป็นต้องย่อยด้วยเอนไซม์จำกัด , เจลเพียวริฟาย, ลิเกต, ฯลฯ.

ใน PlasmID
ตัวอย่าง ได้แก่ open reading frame (ORF) ที่ตรวจสอบลำดับหรือโคลน cDNA จำนวนมากใน pDONR201 หรือ pDONR221 ที่แชร์กับที่เก็บโดย Harvard Institute of Proteomics (HIP) ที่ Harvard Medical School โคลนบางส่วนเหล่านี้อยู่ในรูปแบบ "closed" เพื่อให้มี codon หยุดปกติ และบางตัวเป็นรูปแบบ "fusion" ซึ่ง codon หยุดถูกแทนที่ด้วย leu codon เพื่อให้สามารถเพิ่มแท็ก C-terminal

คำอธิบาย
"Mating-Assisted Genetically Integrated Cloning" หรือ MAGIC ได้รับการพัฒนาโดย Li & Elledge (HHMI/Harvard Medical School) และอาศัยการแตกแยกของ DNA ในร่างกาย และเหตุการณ์การรวมตัวที่คล้ายคลึงกันซึ่งเกิดขึ้นระหว่างการผสมพันธุ์ของแบคทีเรียเพื่อรวมพลาสมิด 'ผู้บริจาค' และ 'ผู้รับ' ที่ออกแบบมาโดยเฉพาะ ( เช่น ผู้บริจาคที่มีการแทรกและเวกเตอร์นิพจน์ผู้รับเฉพาะ)

เรียนรู้เพิ่มเติม
หากต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับวิธีการนี้ โปรดดู Li & Elledge (2005) "MAGIC ซึ่งเป็นวิธีทางพันธุกรรมภายในร่างกายสำหรับการสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมอย่างรวดเร็ว" (PubMed ID 15731760)

ข้อดี
ข้อได้เปรียบที่สำคัญของวิธีนี้คือ แบคทีเรียทำงานโดยการรวมเม็ดมีดและเวกเตอร์เข้าด้วยกัน ดังนั้นจึงสามารถสร้างโครงสร้างได้โดยไม่จำเป็นต้องจำกัดการย่อยของเอนไซม์ การทำให้บริสุทธิ์ด้วยเจล ฯลฯ หรือใช้เอนไซม์ที่ส่งเสริมการรวมตัวกันใหม่

ใน PlasmID
ตัวอย่าง ได้แก่ ชุดของโคลนผู้รับ pPRIME-(เครื่องหมาย)-สำหรับวิธีการที่อิง shRNA ที่แชร์กับที่เก็บโดยห้องปฏิบัติการ Elledge (HHMI/Harvard Medical School)

ข้อกำหนดและเงื่อนไข
2004-2018 โรงเรียนแพทย์ฮาร์วาร์ด
PlasmID ถูกสร้างขึ้นและดูแลโดย DF/HCC DNA Resource Core ที่ Harvard Medical School


การอภิปราย

NS egt ยีนถูกระบุครั้งแรกใน AcMNPV และได้รับการตรวจสอบเพื่อเปลี่ยนระดับ ecdysteroid ของโฮสต์ก่อนที่จะมีการจำลองไวรัส [14] กำลังลบ egt ยีนจาก AcMNPV เร่งการลุกลามไปสู่ความตายในโฮสต์เมื่อเทียบกับไวรัสชนิดไวด์ [15] NS egt ยีนได้รับการระบุใน HearNPV และมีลักษณะเฉพาะ [33] ในความพยายามที่จะสร้างสายพันธุ์ HearNPV ด้วยคุณสมบัติที่ได้รับการปรับปรุง เราได้แทนที่ egt ยีนที่มียีน neurotoxin และวิเคราะห์กิจกรรมทางชีววิทยาของมัน

โปรโมเตอร์จำนวนมากถูกใช้เพื่อแสดงยีนแปลกปลอมในโครงสร้าง recombinant baculovirus รวมถึง เช่น-1 โปรโมเตอร์ p10 โปรโมเตอร์ รูปหลายเหลี่ยม โปรโมเตอร์ เช่นเดียวกับ p6.9 โปรโมเตอร์ [19, 20, 34�]. มีรายงานว่าโปรโมเตอร์ต่างกันนำไปสู่ผลการฆ่าแมลงที่แตกต่างกัน [32, 38] โพลีเฮดริน โปรโมเตอร์เป็นโปรโมเตอร์ที่แข็งแรงและล่าช้า ถูกนำมาใช้ในการแสดงออกของยีนต่างประเทศในพาหะทางการค้าหลายชนิด เช่น pFast Bac plasmids (Invitrogen) และ pIZ/V5-His plasmids (Invitrogen) เพื่อให้แน่ใจว่าการแสดงออกในระดับสูงของ Ar1b ยีน neurotoxin เราเลือก HearNPV รูปหลายเหลี่ยม โปรโมเตอร์ในการศึกษาของเรา

คุณสมบัติที่สำคัญที่สุดอย่างหนึ่งที่เราต้องการให้ไวรัสลูกผสมนี้ปรับปรุงคือความรุนแรง ไวรัสลูกผสมส่วนใหญ่แสดงการลดลงที่น่าพอใจของขนาดยาที่ทำให้ตายปานกลางหรือระยะการตายปานกลาง [18, 21, 23, 24, 39�] ไวรัสลูกผสมในการศึกษานี้ยังแสดงการลดลงอย่างมากใน LT50 เมื่อเทียบกับไวรัสชนิดพันธุ์ป่า (ลดลง 32%) ตัวอ่อนที่ติดเชื้อ Ar1b-HearNPV ในปริมาณสูงจะทำให้เสียชีวิตได้มากกว่า WT-HearNPV At low dosage treatments, the Ar1b-HearNPV-infection showed a lower mortality than WT-HearNPV in the fourth instar larvae ( Fig 8 ). A similar lower mortality was shown in Trichoplusia ni larvae infected with a lower dosage of a scorpion toxin (LqhIT2) recombinant AcMNPV compared with wild type AcMNPV [38]. This may be due to the egt deletion mutants not have enough time to produce enough viruses to kill the older host larvae.

Our Ar1b-expressing recombinant HearNPV provoked symptoms of paralysis and flaccidity in infected larvae, especially one to two days prior to larva death ( Fig 7A ). A similar paralysis phenomenon was induced in AaIT-AcMNPV-infected Heliothis virescens larvae and they usually fell off the plant [39]. As we have described above, one of our aims was to construct a new virus mutant which could reduce larva consumption of the host plant. It was reported that the juvenile hormone esterase (JHE) gene recombinant AcMNPV would lead to 40�% reduction on diet consumption in the inoculated neonate Manduca sexta larvae compared to wild type AcMNPV-infected larvae [44]. However, the feeding inhibition ability of JHE recombinant AcMNPV in older instar larvae is still unknown [44]. While, considerable feeding inhibition ability was shown in Ar1b-HearNPV, even in the fourth instar larvae ( Fig 9 ). On the other hand, the larvae infected by Ar1b-HearNPV had a significant reduction in weight gain compared with HZ8-HearNPV infected larvae ( Fig 10 ). In agreement with our results, NS. frugiperda larvae infected with an egt gene deletion AcMNPV strain [15], and Lymantria dispar larvae infected with an egt deleted LdMNPV [17] gained less weight than larvae infected with wild-type virus. All of these improved properties suggest that application of this Ar1b-expressing HearNPV has potential to provide more effective protection of the cotton than the wild-type HearNPV. In addition, we suggest ar1b can be a candidate for the engineering of other baculovirus recombinant species.

The Asian cotton bollworm (ชม. armigera), which causes considerable economic loss to cotton and many vegetables, is an important polyphagous pest in many countries [45, 46]. The HearNPV has been registered extensively for use on cotton fields as a bioinsecticide in China [47�]. In an effort to develop NPV insecticides for ชม. armigera control, scientists have isolated NPV in USA, Kenya, Australia, and China from diseased ชม. armigera larvae to select a candidate isolate for controlling cotton bollworm [49�]. Several engineering methods that could improve the efficacy of HearNPV have been reported [25]. There also is the potential for recombinant HearNPV to improve the pesticidal efficiency substantially by using new neurotoxin genes from different arthropod species. Our bioassay results implied that ar1b insertion into the HearNPV genome could improve the insecticidal activity of HearNPV and ar1b could be a probable candidate for other recombinant virus species construction.


ดูวิดีโอ: อนกรมเลขคณตอนกรม (อาจ 2022).