ข้อมูล

การทดสอบการแสดงออกของยีนกับโปรตีน

การทดสอบการแสดงออกของยีนกับโปรตีน


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

เป็นเงื่อนไข การตรวจการแสดงออกของยีน และ การทดสอบการแสดงออกของโปรตีน ใช้แทนกันได้ในอณูชีววิทยา? หรือคุณคาดหวังให้แยกความแตกต่างระหว่างคำสองคำนี้

ตัวอย่างเช่น หากฉันแทนที่ลำดับดีเอ็นเอของยีนที่สนใจด้วย GFP DNA จากนั้นจึงหาปริมาณระดับการเรืองแสง ฉันกำลังวัดการแสดงออกของยีนของยีนที่สนใจหรือการแสดงออกของโปรตีนหรือไม่


การแสดงออกของยีนคือการผลิตผลิตภัณฑ์ยีนที่ทำงานได้จากยีน ดังนั้นการแสดงออกของโปรตีนจึงเป็นการอ่านออกของการแสดงออกของยีนสำหรับตำแหน่งยีนที่เข้ารหัสโปรตีน

อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของยีนมักถูกใช้เพื่ออ้างถึงการวัดระดับ mRNA อย่างผิดพลาด การผลิต mRNA เป็นขั้นตอนเบื้องต้นสำหรับการผลิตโปรตีนจากยีน และให้ข้อมูลเกี่ยวกับกิจกรรมการถอดรหัสของตำแหน่งยีน

การแปล mRNA เป็นกระบวนการที่มีการควบคุมอย่างเข้มงวด และการทดสอบทั่วโลกเน้นว่าระดับการถอดรหัส mRNA อธิบายน้อยกว่าครึ่งหนึ่งของความผันแปรของความเข้มข้นของโปรตีน

ตัวอย่างเช่น หากฉันแทนที่ลำดับดีเอ็นเอของยีนที่สนใจด้วย GFP DNA จากนั้นจึงหาปริมาณระดับการเรืองแสง ฉันกำลังวัดการแสดงออกของยีนของยีนที่สนใจหรือการแสดงออกของโปรตีนหรือไม่

คุณกำลังวัดทั้งการแสดงออกของยีนและการแสดงออกของโปรตีนจากโปรโมเตอร์ + ตำแหน่งของยีน GFP หากคุณมีความสนใจในการถอดความจากโปรโมเตอร์ การวัดการถอดเสียงจะเป็นการวัดที่ตรงกว่า


การแสดงออกของยีนและการแสดงออกของโปรตีนนั้นแน่นอน ไม่ สิ่งเดียวกัน. ในขณะที่การนับระดับ mRNA สำหรับยีนเฉพาะ อาจ ให้ข้อบ่งชี้ว่ามีโปรตีนอยู่มากน้อยเพียงใด หลายครั้งที่โปรตีนนั้นไม่มี ในทำนองเดียวกัน การหาระดับโปรตีนไม่ได้หมายความว่าระดับสัมพัทธ์ของ mRNA จะใกล้เคียงกัน มีหลายจุดสำหรับการควบคุมระหว่าง RNA polymerase ที่กลิ้งไปตามยีนและสร้าง pre-mRNA และโปรตีนที่ออกมาจากไรโบโซมและถูกพับและขนส่งไปยังตำแหน่งที่ถูกต้องในเซลล์ mRNA สามารถปิดเสียง เสื่อมคุณภาพ หรือป้องกันไม่ให้ถูกแปลโดยกลไกหลายอย่าง โปรตีนเองอยู่ภายใต้ กว้างขวาง การควบคุมด้วยครึ่งชีวิตที่สามารถเปลี่ยนแปลงได้ตั้งแต่วินาทีจนถึงสัปดาห์ แน่นอน ยีนถูกควบคุมในหลาย ๆ ทางเช่นกัน ตั้งแต่โปรตีนกดขี่ไปจนถึง DNA ที่มีเมทิลเลตไปจนถึงฮิสโตนที่ดัดแปลงทางเคมี และจำนวนของสารเชิงซ้อนโพลีเมอเรสบน DNA และความเร็วในการถอดรหัสสัมพัทธ์ก็อยู่ภายใต้การควบคุมเช่นกัน

ถ้าฉันแทนที่ลำดับดีเอ็นเอของยีนที่สนใจด้วย GFP DNA จากนั้นจึงหาปริมาณระดับการเรืองแสง ฉันกำลังวัดการแสดงออกของยีนของยีนที่สนใจหรือการแสดงออกของโปรตีนหรือไม่

คุณกำลังหาปริมาณระดับโปรตีน ของ GFP. mRNA สามารถอยู่ภายใต้การควบคุมเฉพาะลำดับ (เช่น siRNA) ดังนั้นคุณจึงไม่สามารถพูดได้อย่างชัดเจนว่าระดับ GFP เท่ากับผลิตภัณฑ์ยีนที่คุณสนใจ หลายๆ ครั้งจะเป็นสัดส่วนกัน แต่บางครั้งอาจไม่ใช่ ดังนั้น คุณจะต้องทำการทดสอบอื่นๆ อีกหลายครั้งเพื่อยืนยันผลลัพธ์ของคุณ


เวิร์กโฟลว์การแสดงออกของยีน

นักวิจัยอาจทำการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในระดับต่างๆ กันหลายระดับซึ่งมีการควบคุมการแสดงออกของยีน: การถอดความ หลังการถอดเสียง การแปลภาษา และหลังการแปล
การดัดแปลงโปรตีน

การถอดความ กระบวนการสร้างสำเนา RNA เสริมของลำดับ DNA สามารถควบคุมได้หลายวิธี กระบวนการควบคุมการถอดเสียงเป็นกระบวนการศึกษาและจัดการโดยทั่วไปในการทดลองวิเคราะห์การแสดงออกของยีนทั่วไป

การจับกันของโปรตีนควบคุมกับไซต์การจับดีเอ็นเอเป็นวิธีที่ตรงที่สุดโดยที่การถอดรหัสจะถูกมอดูเลตตามธรรมชาติ อีกทางหนึ่ง กระบวนการควบคุมสามารถโต้ตอบกับเครื่องจักรถอดรหัสของเซลล์ได้ เมื่อไม่นานมานี้ อิทธิพลของการควบคุมอีพีเจเนติกส์ เช่น ผลกระทบของเมทิลเลชันดีเอ็นเอแบบแปรผันต่อการแสดงออกของยีน ได้ถูกค้นพบว่าเป็นเครื่องมืออันทรงพลังสำหรับการทำโปรไฟล์การแสดงออกของยีน เป็นที่ทราบกันดีว่าระดับของเมทิลเลชั่นที่ต่างกันส่งผลต่อการพับของโครมาตินและส่งผลอย่างมากต่อการเข้าถึงยีนต่อการถอดรหัสแบบแอคทีฟ

หลังจากการถอดรหัส ยูคาริโอต RNA มักจะถูกต่อเข้าด้วยกันเพื่อเอาลำดับอินตรอนที่ไม่มีการเข้ารหัสออกและต่อยอดด้วยหางโพลี (A) ในระดับหลังการถอดเสียงนี้ ความคงตัวของอาร์เอ็นเอมีผลอย่างมากต่อการแสดงออกของยีนที่ทำหน้าที่ กล่าวคือ การผลิตโปรตีนที่ทำหน้าที่ RNA รบกวนขนาดเล็ก (siRNA) ประกอบด้วยโมเลกุลกรดนิวคลีอิกสองสายที่มีส่วนร่วมในเส้นทางการรบกวน RNA ซึ่งการแสดงออกของยีนเฉพาะจะถูกปรับ (โดยทั่วไปโดยการลดกิจกรรม) อย่างแม่นยำว่าการปรับนี้สำเร็จได้อย่างไรยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ ขอบเขตการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่กำลังเติบโตนั้นอยู่ในพื้นที่ของ microRNAs (miRNAs) โมเลกุล RNA สั้น ๆ ที่ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมยูคาริโอตหลังการถอดเสียงและสารยับยั้งยีน


ยีนคืออะไร?

Gregor Mendel เป็นคนแรกที่อธิบายถึงการมีอยู่ของยีนและรูปแบบการถ่ายทอดทางพันธุกรรม เขาอธิบายการสืบทอดลักษณะในแง่ของลักษณะที่สืบทอดมาและไม่ได้ใช้คำว่า 'ยีน' คำว่า 'ยีน' ได้รับการพัฒนาขึ้นเมื่อเร็วๆ นี้พร้อมกับการพัฒนาทางพันธุศาสตร์ ยีนเป็นส่วนหนึ่งของ DNA ซึ่งมีคำแนะนำในการสร้างโปรตีน ยีนแต่ละตัวมีลำดับเบสเฉพาะ ซึ่งกำหนดโครงสร้างและหน้าที่ของโปรตีนจำเพาะ ยีนเป็นพิมพ์เขียวของลักษณะทั้งหมดในร่างกาย พวกเขากำหนดลักษณะเฉพาะส่วนใหญ่ของสิ่งมีชีวิตและสามารถส่งต่อคุณลักษณะเฉพาะเหล่านี้ไปยังกระบวนการที่เรียกว่ากรรมพันธุ์รุ่นต่อไปได้ คุณลักษณะเฉพาะเหล่านี้เรียกว่าคุณลักษณะซึ่งบางส่วนมองเห็นได้และบางส่วนไม่สามารถมองเห็นได้


หิ่งห้อยเรืองแสง Luciferase Assays

หิ่งห้อยลูซิเฟอเรสเป็นนักข่าวสารเรืองแสงที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาการควบคุมและการทำงานของยีน เป็นผู้รายงานทางพันธุกรรมที่มีความอ่อนไหวมากเนื่องจากไม่มีกิจกรรมของลูซิเฟอเรสภายในเซลล์หรือเนื้อเยื่อของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม หิ่งห้อยลูซิเฟอเรสเป็นโปรตีน 62,000 ดาลตันซึ่งทำงานเป็นโมโนเมอร์และไม่ต้องการการประมวลผลในภายหลังสำหรับกิจกรรม เอนไซม์เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของ D-luciferin ที่ขึ้นกับ ATP ไปเป็น oxyluciferin ทำให้เกิดการเปล่งแสงที่ศูนย์กลางที่ 560 นาโนเมตร แสงที่ปล่อยออกมาจากปฏิกิริยาจะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับจำนวนโมเลกุลของเอนไซม์ลูซิเฟอเรส

รูปที่ 1. หลักการทดสอบลูซิเฟอเรส ปฏิกิริยาเรืองแสงที่เร่งปฏิกิริยาโดยหิ่งห้อยลูซิเฟอเรสทำให้เกิดแสง

ความแตกต่างระหว่างการเรืองแสงและการเรืองแสงคืออะไร?

การเรืองแสงทางชีวภาพเป็นกระบวนการทางเคมีที่เอ็นไซม์สลายสารตั้งต้น (เช่น ลูซิเฟอเรสและดี-ลูซิเฟอริน) และผลพลอยได้อย่างหนึ่งของปฏิกิริยานี้คือแสง การเรืองแสงตามธรรมชาติเกิดขึ้นในธรรมชาติในสาหร่าย แบคทีเรีย เชื้อรา และสัตว์น้ำบางชนิด เช่น แมงกะพรุน การเรืองแสงเป็นกระบวนการทางกายภาพโดยที่แสงกระตุ้นอิเล็กตรอนในฟลูออโรฟอร์ให้มีสถานะพลังงานที่สูงขึ้น และเมื่ออิเล็กตรอนนั้นตกลงสู่สภาพพื้นดินก็จะปล่อยโฟตอนออกมา

Luciferase Assays ทำงานอย่างไร

การทดสอบ Firefly luciferase (SCT151, SCT154, LUC1, LUCASSY-RO) ได้รับการออกแบบมาเพื่อการหาปริมาณที่ง่ายและมีประสิทธิภาพของกิจกรรมของเอนไซม์ firefly luciferase reporter จากเซลล์ที่เพาะเลี้ยงที่มีความไวและความเป็นเส้นตรงสูง นี่คือการทดสอบการเรืองแสงแบบแฟลชที่ต้องมีการวัดสัญญาณทันทีหลังจากเพิ่มวิธีการทำงานให้กับตัวอย่าง สัญญาณการเรืองแสงจะสลายตัวในช่วงเวลาประมาณ 10 นาทีของปฏิกิริยา แม้ว่าครึ่งชีวิตของสัญญาณอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับระดับการแสดงออกของลูซิเฟอเรส

การผลิตแสงที่เกิดจากปฏิกิริยาลูซิเฟอเรสทำให้เกิดการฆ่าตัวตายที่ผิวเอนไซม์ adenyl-oxyluciferin ส่งผลให้ครึ่งชีวิตสั้นมากของการเปล่งแสงด้วยจลนศาสตร์แบบแฟลช Firefly Luciferase HTS Assay (SCT150) ได้รับการออกแบบด้วยส่วนผสมที่เป็นกรรมสิทธิ์ของสารที่ปรับเปลี่ยนปฏิกิริยาของเอนไซม์เพื่อสร้างสัญญาณที่ยาวนาน (คงที่และเรืองแสง) โดยป้องกันการก่อตัวของ adenyl-oxyluciferin ที่พื้นผิวของเอนไซม์ เป็นชุดทดสอบยีน firefly luciferase reporter ความไวสูงที่เป็นเนื้อเดียวกันสำหรับการหาปริมาณการแสดงออกของหิ่งห้อย luciferase ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีครึ่งชีวิตสัญญาณประมาณ 3 ชั่วโมง (รูปที่ 2). การทดสอบลูซิเฟอเรสแบบเรืองแสงมีสัญญาณการเรืองแสงที่ต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการสอบวิเคราะห์แบบแฟลช ความไวและขีดจำกัดของการตรวจจับการทดสอบจะขึ้นอยู่กับระดับการแสดงออกของลูซิเฟอเรสในระบบทดลองของคุณ เช่นเดียวกับความไวของลูมิโนมิเตอร์

รูปที่ 2 การไทเทรตของลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยรีคอมบิแนนท์ในการทดสอบลูซิเฟอเรสหิ่งห้อย A) ลูซิเฟอเรสลูกผสมถูกเจือจางแบบอนุกรมใน 1X Firefly Lysis Buffer ที่มี 1 Mg/mL BSA และวัดในการสอบวิเคราะห์ B) การทดสอบ Firefly Luciferase HTS เป็นชุดทดสอบยีน firefly luciferase reporter ที่มีความไวสูงและมีความไวสูงคงที่สำหรับการหาปริมาณการแสดงออกของหิ่งห้อย luciferase ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีครึ่งชีวิตสัญญาณประมาณ 3 ชั่วโมง

ความแตกต่างระหว่างหิ่งห้อยและ .คืออะไร Renilla ลูซิเฟอเรส?

การทดสอบหิ่งห้อยลูซิเฟอเรสใช้ลูซิเฟอรินในที่ที่มีออกซิเจน เอทีพี และแมกนีเซียมเพื่อผลิตแสง (สีเขียว/เหลือง 550-70 นาโนโมลาร์) ในขณะที่ Renilla การทดสอบลูซิเฟอเรส (SCT153) ต้องการเฉพาะโคเอเลนเทอราซีนและออกซิเจนเพื่อผลิตแสง (สีน้ำเงิน, 480 นาโนโมลาร์) Renilla ลูซิเฟอเรสถูกใช้เป็นยีนนักข่าวเพื่อศึกษาการควบคุมและการทำงานของยีน ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย. โดยทั่วไปจะใช้ในการสอบวิเคราะห์ตัวรายงานการถอดความแบบมัลติเพล็กซ์หรือเป็นการควบคุมการทรานส์เฟกชันแบบนอร์มัลไลซ์สำหรับการสอบวิเคราะห์ลูซิเฟอเรสหิ่งห้อย เอ็นไซม์ไม่ต้องการการดัดแปลงหลังการแปลสำหรับกิจกรรมและอาจทำหน้าที่เป็นผู้รายงานทางพันธุกรรมทันทีหลังการแปล Coelenterazine สารตั้งต้นสำหรับ Renilla ลูซิเฟอเรสยังเปล่งแสงจากการเกิดออกซิเดชันที่ไม่ขึ้นกับเอนไซม์ ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่าออโตลูมิเนสเซนซ์ การเรืองแสงอัตโนมัติได้รับการปรับปรุงโดยซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออนและเปอร์ออกซีไนไตรต์ในเซลล์และเนื้อเยื่อ

รูปที่ 3 หิ่งห้อยกับ Renilla Luciferase ปฏิกิริยาเรืองแสงที่เร่งปฏิกิริยาโดยหิ่งห้อยลูซิเฟอเรสและเรนิลลาลูซิเฟอเรส

ข้อดีของการทดสอบ Dual Luciferase คืออะไร?

หิ่งห้อย/Renilla การทดสอบ Dual Luciferase (SCT152) ช่วยให้สามารถวัดทั้งหิ่งห้อยและ Renilla กิจกรรมของลูซิเฟอเรสในตัวอย่างเดียวกันที่มีความไวและความเป็นเส้นตรงสูง ก่อนวัดกิจกรรมของหิ่งห้อย luciferase จากนั้นจึงเพิ่ม Renilla Luciferase Assay Buffer 2.0 เพื่อดับกิจกรรมของหิ่งห้อย luciferase พร้อมกันและวัดกิจกรรมของ Renilla luciferase Renilla Luciferase Assay Buffer 2.0 ระงับกิจกรรมของหิ่งห้อย luciferase จนถึงระดับของเซลล์ที่ไม่ถูกถ่าย ซึ่งช่วยให้สามารถวัดค่าของหิ่งห้อยและกิจกรรม Renilla luciferase ตามลำดับในตัวอย่างเดียวกัน นี่คือการทดสอบประเภทแฟลชที่ต้องการวัดการเรืองแสงทันทีหลังจากเพิ่มรีเอเจนต์ในการตรวจจับไปยังตัวอย่างลูซิเฟอเรส สัญญาณหิ่งห้อยจะเสื่อมลงในช่วงเวลาประมาณ 12 นาที ในขณะที่สัญญาณ Renilla จะสลายตัวเมื่อเวลาผ่านไปประมาณ 2 นาที แม้ว่าอาจแตกต่างกันไปตามระดับของเอนไซม์

รูปที่ 4 ภาพรวมการทดสอบลูซิเฟอเรสคู่ ตัวอย่างการตรวจจับหิ่งห้อยและเรนิลลา ลูซิเฟอเรสโดยใช้ไลเซทจากเซลล์ HeLa ที่ไม่ถูกทรานส์เฟกหรือเซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกด้วยลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยเพียงอย่างเดียว (หิ่งห้อยเท่านั้น) หรือทรานส์เฟกร่วมกับหิ่งห้อยและเรนิลลา ลูซิเฟอเรส (หิ่งห้อย + เรนิลา) ในเซลล์ที่ถ่ายด้วยหิ่งห้อยเท่านั้น สัญญาณ Renilla คือการเรืองแสงของหิ่งห้อยที่เหลือหลังจากเพิ่มวิธีแก้ปัญหาการทำงานของ Renilla ลงในปฏิกิริยา

การประยุกต์ใช้ Luciferase Assays คืออะไร?

นักข่าวทางพันธุกรรมใช้เป็นตัวบ่งชี้ในการศึกษาเหตุการณ์ของเซลล์ควบคู่ไปกับการแสดงออกของยีน โดยปกติ ยีนนักข่าวจะถูกโคลนด้วยลำดับดีเอ็นเอที่น่าสนใจในเวกเตอร์การแสดงออก (ซึ่งมียีน Luciferase) ที่ถูกถ่ายโอนไปยังเซลล์ หลังจากการถ่ายโอน เซลล์ถูกหาปริมาณสำหรับการมีอยู่ของตัวรายงานโดยการวัดโปรตีนของตัวรายงานโดยตรงหรือการออกฤทธิ์ของเอนไซม์ลูซิเฟอเรส ยีนนักข่าวที่ดีสามารถระบุได้ง่ายและวัดในเชิงปริมาณเมื่อมีการแสดงออก (ในสิ่งมีชีวิตหรือเซลล์ที่สนใจ)

ตัวอย่างเช่น Sigma และ SwitchGear Genomics™ ได้ร่วมมือกันเพื่อนำเสนอคอลเลกชั่นทั่วทั้งจีโนมมากกว่า 10,000 ภูมิภาค 3′UTR ในระบบเวคเตอร์ตัวรายงาน lentivirus luciferase ที่ปรับให้เหมาะสมที่สุดของเรา เมื่อทำการทดลองโดยใช้ MISSION ® 3′UTR Lenti GoClones รวมถึงการควบคุมที่เหมาะสมจะช่วยให้สามารถตีความผลการแสดงออกของยีนในการทดลองได้อย่างแม่นยำ

ความมีชีวิตของเซลล์ผ่านการตรวจจับ ATP

เนื่องจาก ATP เป็นตัวบ่งชี้ของเซลล์ที่ออกฤทธิ์ทางเมตาบอลิซึม จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตสามารถประเมินได้ขึ้นอยู่กับปริมาณของ ATP ที่มีอยู่ การทดสอบ ATP Cell Viability Luciferase (SCT149, 11699709001) นำเสนอการสอบวิเคราะห์ที่เป็นเนื้อเดียวกันที่มีความไวสูงสำหรับการหาปริมาณ ATP ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ชุดนี้ใช้ประโยชน์จาก ATP ของ Firefly luciferase ในการออกซิไดซ์ D-Luciferin และทำให้เกิดการผลิตแสงเพื่อประเมินปริมาณ ATP ที่มีอยู่ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ขั้นตอนการทดสอบที่ละเอียดอ่อนเกี่ยวข้องกับการเติมค็อกเทลการตรวจจับ ATP เพียงครั้งเดียวไปยังเซลล์ที่เพาะเลี้ยงในตัวกลางที่เสริมด้วยซีรัม ไม่จำเป็นต้องล้างเซลล์ ลอกออกปานกลาง และปิเปตหลายครั้ง ชุดอุปกรณ์นี้สามารถใช้ตรวจจับเซลล์เดียวหรือ 0.01 พิโคโมลของ ATP ได้ สัญญาณที่ผลิตเป็นเส้นตรงภายใน 6 คำสั่งของขนาด โดยการเชื่อมโยงปริมาณของ ATP กับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต การสอบวิเคราะห์มีการนำไปใช้อย่างกว้างขวาง ตั้งแต่การกำหนดจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตไปจนถึงการเพิ่มจำนวนเซลล์ไปจนถึงความเป็นพิษต่อเซลล์ของเซลล์

รูปที่ 5 การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ ATP การใช้ ATP ของ Firefly luciferase ในการออกซิไดซ์ D-Luciferin และการผลิตแสงที่เกิดขึ้นเพื่อประเมินปริมาณ ATP ที่มีอยู่ซึ่งสัมพันธ์กับจำนวนเซลล์และความมีชีวิต

ในร่างกาย การถ่ายภาพ

การถ่ายภาพเรืองแสงทางชีวภาพ (BLI) ได้กลายเป็นเทคนิคที่นิยมในการติดตามเซลล์ด้วยแสงในสัตว์ทดลองขนาดเล็ก เช่น หนู นอกเหนือจากการเรืองแสงอัตโนมัติในพื้นหลังที่ต่ำและความเป็นพิษของเซลล์แล้ว BLI ยังสามารถเปิดใช้งานการแสดงภาพการตรวจสอบพร้อมกันสำหรับการแสดงออกของโปรตีนลูซิเฟอเรสที่แตกต่างกันสองชนิดโดยใช้สารตั้งต้นเฉพาะของพวกมัน กิจกรรมของยีนลูซิเฟอเรสแบบสร้างภาพ (red codon ลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยและลูซิเฟอเรสตัวเมียสีเขียว) ในสัตว์ชนิดเดียวกันสามารถลดความแตกต่างจากความแตกต่างของสัตว์ทดลองแต่ละตัวได้


การวิเคราะห์การแสดงออกและการทดสอบการผูกมัดในตระกูลยีนโปรตีนเคมีของประสาทสัมผัสบ่งชี้ถึงบทบาทหลายประการใน เฮลิโคเวอร์ปา อาร์มิเกรา

มีการเสนอโปรตีน Chemosensory (CSPs) เพื่อจับและขนส่งสารเคมีที่ไม่ชอบน้ำไปยังตัวรับในเซลล์ประสาทรับความรู้สึก เราระบุและโคลน24 CSP ยีนเพื่อให้เข้าใจถึงการทำงานทางสรีรวิทยาของ CSPs ได้ดีขึ้นใน เฮลิโคเวอร์ปา อาร์มิเกรา. การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณระบุว่า CSP ยีนแสดงออกอย่างแพร่หลายในผู้ใหญ่ H. armigera เนื้อเยื่อ รูปแบบการแสดงออกอย่างกว้างๆ ในเนื้อเยื่อของผู้ใหญ่แนะนำว่า CSP เกี่ยวข้องกับกระบวนการของเซลล์ที่หลากหลาย รวมถึงการให้เคมีบำบัด เช่นเดียวกับหน้าที่อื่นๆ ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการให้เคมีบำบัด NS H. armigera CSP ที่ได้รับการถ่ายทอดอย่างสูงในอวัยวะรับความรู้สึกหรือต่อมฟีโรโมน (HarmCSPNS 6, 9, 18, 19) ถูกแสดงออกโดยรีคอมบิแนนท์ในแบคทีเรียเพื่อสำรวจหน้าที่ของพวกมัน การสอบวิเคราะห์การจับแบบแข่งขันด้วยฟลูออเรสเซนต์ถูกใช้เพื่อวัดสัมพรรคภาพการจับของ CSP เหล่านี้กับสารระเหยของพืช 85 ชนิดและส่วนประกอบฟีโรโมน 4 อย่าง HarmCSP6 แสดงสัมพรรคภาพการจับสูงสำหรับส่วนประกอบฟีโรโมน ในขณะที่โปรตีนอีกสามชนิดไม่แสดงสัมพรรคภาพสำหรับสารประกอบใดๆ ที่ทดสอบ HarmCSP6 แสดงออกในเซลล์จำนวนมากที่อยู่ในหรือใกล้กับ sensilla trichodea ยาวบนหนวดของทั้งตัวผู้และตัวเมีย ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า HarmCSP6 อาจเกี่ยวข้องกับการขนส่งฟีโรโมนเพศหญิงใน H. armigera.

นี่คือตัวอย่างเนื้อหาการสมัครสมาชิก เข้าถึงผ่านสถาบันของคุณ


การพูดเปรียบเทียบ: การศึกษาการแสดงออกของยีนกับโปรตีน

อะไรคือความแตกต่างระหว่างการศึกษาการแสดงออกของยีนและโปรตีนเพื่อประเมินประสิทธิภาพผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง? ในคอลัมน์ "การพูดเปรียบเทียบ" ฉบับนี้ Tony O&rsquoLenick ถาม Nava Dayan, Ph.D. สำหรับความคิดเห็นของเธอในหัวข้อนี้ คำตอบของเธอคือ:

เมื่อนักวิทยาศาสตร์ทั่วโลกเริ่มร่วมมือกันทำแผนที่จีโนมมนุษย์ทั้งหมด พวกเขารู้สึกว่าเรามียีนมากกว่า 25,000 ยีนที่เรามีอยู่จริง บางทีอาจเป็นความเย่อหยิ่งของมนุษย์ที่คิดว่าเรามีความสามารถทางชีววิทยาเหนือกว่าสายพันธุ์อื่นมากกว่าที่เป็นจริง ในกระบวนการคลี่คลายโปรไฟล์จีโนมทั้งหมดของเรา เราได้ตระหนักว่าเราถือว่ายีนควบคุมได้มากกว่าที่พวกมันมีอยู่จริง

&ldquocentral dogma of อณูชีววิทยา &rdquo ประกาศเกียรติคุณโดย Francis Crick ในปี 1958&mdashin Essence ว่า DNA หนึ่งตัวถูกแปลเป็น RNA หนึ่งตัว และ RNA หนึ่งตัวถูกแปลเป็นโปรตีนหนึ่งตัวที่แสดงฟังก์ชันเดียว&mdash ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าไม่ถูกต้อง ในความเป็นจริง มีอีพีจีโนมมากกว่า (โดยที่ &ldquoepi&rdquo หมายถึงเหนือกว่า) ในการควบคุมการทำงานทางชีวภาพมากกว่าจีโนม

เข้าสู่ระบบหรือสมัครสมาชิกฟรีเพื่ออ่านเรื่องราวทั้งหมด

ในอุตสาหกรรมของเรา บริษัทต่างๆ ดำเนินการศึกษาการแสดงออกของยีนและนำเสนอสิ่งเหล่านั้นเพื่อบ่งบอกถึงความแน่นอนในผลกระทบของวัตถุดิบและสูตรต่อชีววิทยาของผิวหนัง สิ่งสำคัญคือต้องเข้าใจข้อจำกัดของชุดข้อมูลดังกล่าวและพิจารณาในบริบทที่ถูกต้อง ศัพท์เทคนิค &ldquogene expression&rdquo หมายความว่าลำดับ DNA ถูกแปลในนิวเคลียสของเซลล์ไปเป็น messenger RNA (mRNA) เมื่อยีนเฉพาะถูก &ldquoup ควบคุม &rdquo หมายความว่าปริมาณของ mRNA ที่สร้างขึ้นจากลำดับนั้นจะมีปริมาณสูงกว่าปกติเมื่อ &ldquodown ควบคุม &rdquo หมายความว่ามันต่ำกว่าเมื่อเทียบกับสถานะปกติ

ระบบการตั้งชื่อสำหรับยีนและโปรตีนมีความคล้ายคลึงกัน และประกอบด้วยการรวมกันของตัวอักษรและตัวเลข ตัวอย่างเช่น interleukin 1 alpha ย่อมาจาก IL-1a และ tumor necrosis factor ย่อมาจาก TNF-a การแปล DNA เป็น mRNA เป็นขั้นตอนในการผลิตเปปไทด์และโปรตีน&mdashmRNA อาจแปลเป็นโปรตีนหรือไม่ก็ได้ เปปไทด์และโปรตีนเป็นกรดอะมิโนลำดับที่เล็กหรือใหญ่กว่าตามลำดับ และเป็น &ldquoworking ม้า&rdquo ของร่างกายของเรา พวกมันทำหน้าที่เป็นไซโตไคน์ในการส่งข้อความ เป็นเอ็นไซม์เพื่ออำนวยความสะดวกในการเรียงซ้อนทางชีวเคมีที่ประหยัดพลังงาน และเป็นตัวรับในการสื่อสารระหว่างส่วนต่าง ๆ ของเซลล์และระหว่างเซลล์กับสิ่งแวดล้อม

ด้วยเครื่องมือทางเทคโนโลยีในปัจจุบัน เราสามารถหาปริมาณและรับรองการแสดงออกของยีนและโปรตีนได้ อย่างไรก็ตาม สิ่งสำคัญคือต้องเข้าใจว่าหากมีการแสดงออกของยีน ยีนจะไม่สามารถทำหน้าที่เทียบเท่าได้ทั้งหมด เนื่องจากจำเป็นต้องแปลเป็นโปรตีนเพิ่มเติม ยิ่งไปกว่านั้น แม้ว่าจะมีการสร้างโปรตีน โปรตีนก็ต้องการสภาพแวดล้อมที่เพียงพอในการทำกิจกรรมที่เหมาะสม โครงสร้างสามมิติของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยสภาพแวดล้อมของมันเท่านั้นจะส่งผลต่อ &ldquopost-translational modifieds&rdquo ที่กำหนดโดยสภาพแวดล้อมที่อยู่ในนั้น

ดังนั้น เมื่อทำการศึกษาในหลอดทดลองสำหรับการคัดกรองประสิทธิภาพ ควรพิจารณาและประเมินวิธีการที่ใช้โดยทราบข้อดีและข้อจำกัด ด้วยเทคโนโลยีและเครื่องมือในปัจจุบัน เราสามารถปรับการศึกษาที่คุ้มค่าและมีความหมายเพื่อเพิ่มผลผลิตสูงสุด


  • ในระหว่างการติดฉลากไบโอตินทางเคมี โปรตีนสามารถหยุดทำงานเนื่องจากการไบโอตินิเลชันแบบสุ่มของพื้นผิวโปรตีนโดยการยึดติดของไบโอตินกับโดเมนตัวเร่งปฏิกิริยาโปรตีนหรือโดเมนการจับ ด้วย Avi-Tag โปรตีนแทบทุกชนิดสามารถ biotinylated ในร่างกายหรือในหลอดทดลองได้อย่างง่ายดายและมีประสิทธิภาพโดยใช้ไซต์ AviTag เดียวที่ไม่ซ้ำกัน
  • Biotinylation โดยใช้ Avi-Tag ดำเนินการด้วยเอนไซม์ ส่งผลให้เกิดปฏิกิริยาที่อ่อนโยนและการติดฉลากที่จำเพาะเจาะจงสูง
  • Biotin-AviTag มีกรดอะมิโน 15 ​​ตัว ซึ่งเป็นหนึ่งในห้าของลำดับแท็ก biotinylation ทางเลือกที่มีกรดอะมิโนตกค้างมากกว่า 85 ชนิด ซึ่งถือเป็นการพิจารณาที่สำคัญหากต้องลดความขัดแย้ง steric

รูปที่ 1. OmicsLink ORF cDNA โคลนนิพจน์ด้วย N- และ C-terminus AviTag ในระบบเวกเตอร์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมต่างๆ

มันทำงานอย่างไร


การตรวจยีนนักข่าว

ยีนของนักข่าว เช่น ลูซิเฟอเรส มักจะทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้การถอดรหัสภายในเซลล์ โดยจะตรวจวัดการตรวจหาโปรตีนของผู้รายงานหรือกิจกรรมของเอนไซม์ ผลกระทบของโปรโมเตอร์หรือบริเวณเอนแฮนเซอร์ต่อการแสดงออกของยีนสามารถกำหนดได้โดยการตรวจหานักข่าวในการทดสอบเฉพาะ ซึ่งในอุดมคติแล้วจะมีสัญญาณพื้นหลังต่ำ ความไวสูงและแน่นอนรวดเร็ว แม่นยำ และปลอดภัย ในกรณีของการทดสอบลูซิเฟอเรส การปล่อยโฟตอนจะถูกวัดซึ่งเป็นผลมาจากการเร่งปฏิกิริยาของปฏิกิริยาเคมีที่ต้องใช้ลูซิเฟอริน เอทีพี และออกซิเจนเป็นสารตั้งต้น การผลิตโฟตอนโดยนักข่าวที่เรืองแสงได้นี้เกิดขึ้นช้ากว่าวิธีการที่ใช้ฟลูออเรสเซนต์ เช่น การกระตุ้นของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) เนื่องจากลักษณะของปฏิกิริยาเคมีเมื่อเทียบกับการใช้เลเซอร์ความเข้มสูงเพื่อกระตุ้น GFP อย่างรวดเร็ว อันเป็นผลมาจากกลไกต่างๆ ในการผลิตโฟตอน โดยทั่วไปนักข่าวที่ใช้เคมีเรืองแสงจะมีความสว่างน้อยกว่าโปรตีนเรืองแสง แต่มีข้อได้เปรียบที่ระดับพื้นหลังที่ต่ำกว่าและความไวของสัญญาณที่ดีขึ้นเนื่องจากโฟตอนถูกวัดอย่างง่าย ๆ ซึ่งไม่จำเป็นต้องเริ่มต้นปฏิกิริยา ตารางที่ 1 เปรียบเทียบข้อดีและข้อเสียทั่วไปบางประการของการเรืองแสงกับการเรืองแสง

ตารางที่ 1: คุณสมบัติของสารเรืองแสงกับสารเรืองแสง

เรืองแสง เรืองแสง
แหล่งที่มาของโฟตอนที่ปล่อยออกมา ปฏิกิริยาเคมี โฟตอนพลังงานสูง
จลนพลศาสตร์ของการสร้างโฟตอน ช้าลง เร็วขึ้น
ปัจจัยร่วม/สารตั้งต้น ที่จำเป็น ไม่ต้องการ
ความแรงของสัญญาณ ต่ำกว่า สูงกว่า
ความไว สูงกว่า ต่ำกว่า
พื้นหลัง ต่ำกว่า สูงกว่า
การปรับเปลี่ยนหลังการแปล ไม่ต้องการ ที่จำเป็น
การฟอกสี/ความเป็นพิษต่อแสง ไม่อ่อนไหว อ่อนแอ
การสร้างภาพใต้เซลล์ ปรับปรุง มั่นคง
การวิเคราะห์ปริมาณงานสูง ปรับปรุง มั่นคง


การผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ที่มีความเข้มข้นสูง

ปริญญาเอก Henry Chiou รองผู้อำนวยการ Thermo Fisher Scientific
Jonathan F. Zmuda ปริญญาเอก ผู้อำนวยการ R&D Thermo Fisher Scientific
Maya Yovcheva R&D นักวิทยาศาสตร์และ R&D Lead Thermo Fisher Scientific
ดร.เคนเน็ธ ทอมป์สัน R&D นักวิทยาศาสตร์ เทอร์โม ฟิชเชอร์ วิทยาศาสตร์
Sara Barnes R&D นักวิทยาศาสตร์ Thermo Fisher Scientific
Katalyn Irvin R&D นักวิทยาศาสตร์ Thermo Fisher Scientific
Melissa Cross R&D นักวิทยาศาสตร์ Thermo Fisher Scientific
นาตาชา ลัคกี้ ปริญญาเอก ผู้จัดการผลิตภัณฑ์ Thermo Fisher Scientific

การใช้ระบบนิพจน์เซลล์แมลง Sf9 ที่กำหนดทางเคมีของ ExpiSf™

ระบบเวคเตอร์การแสดงออกของบาคูโลไวรัส (BEVS) จัดให้มีแพลตฟอร์มที่หลากหลายสำหรับการแสดงออกของโปรตีนลูกผสมแต่ละชนิดเช่นเดียวกับสารเชิงซ้อนของโปรตีนมัลติเมอร์ อนุภาคคล้ายไวรัส โปรตีนเมมเบรน และโปรตีนที่เป็นพิษต่อเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เมื่อเร็ว ๆ นี้ BEVS ได้แสดงให้เห็นถึงประโยชน์พิเศษในการผลิตวัคซีนเชิงพาณิชย์สำหรับการใช้งานของมนุษย์และสัตวแพทย์

ข้อดีของ BEVS ได้แก่ ความสามารถในการแสดงออกโปรตีนด้วยการดัดแปลงหลังการแปลที่ดีขึ้นเมื่อเทียบกับแบคทีเรีย ต้นทุนรีเอเจนต์ที่ต่ำลง และความต้องการอุปกรณ์น้อยลงเมื่อเปรียบเทียบกับการแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม และบันทึกที่แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการปรับขนาดสำหรับการผลิตเชิงพาณิชย์ของวัคซีนและรีเอเจนต์บำบัดด้วยเซลล์ . 1

อย่างไรก็ตาม แพลตฟอร์ม BEVS ยังคงมีข้อบกพร่องอยู่หลายประการเมื่อเทียบกับระบบชั่วคราวของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีพลาสมิด ซึ่งรวมถึง: ความแปรปรวนแบบล็อตต่อล็อตของสื่อการแสดงออกเนื่องจากการมีอยู่ของส่วนประกอบที่ไม่ได้กำหนดไว้ เช่น ยีสต์โอเลต ไทเทอร์ของโปรตีนที่ต่ำกว่า และโดยรวมที่นานกว่า ได้เวลาโปรตีน ปัจจัยเหล่านี้สามารถขัดขวางการพัฒนาผลิตภัณฑ์ได้อย่างมากในเวลาที่ผู้ผลิตอยู่ภายใต้แรงกดดันอย่างต่อเนื่องในการพัฒนาวัคซีนและสารชีวภาพอื่นๆ อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพมากขึ้น

ระบบการแสดงออกของแมลงต่างจากระบบการแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจำนวนมากที่เปลี่ยนไปใช้สูตรสื่อที่กำหนดทางเคมีมากกว่าทศวรรษที่ผ่านมา ระบบการแสดงออกของแมลงยังคงอาศัยสูตรสื่อที่มียีสต์ซึ่งมีการกำหนดไว้ไม่ดี ซึ่งสามารถให้ความแปรปรวนแบบล็อตต่อล็อตที่มีนัยสำคัญต่อการเติบโตของเซลล์ ไวรัสบาคูโล การผลิตและการแสดงออกของโปรตีน

สื่อที่ประกอบด้วยยีสต์ยังมีข้อจำกัดในด้านความสามารถในการรักษาการเติบโตของเซลล์ที่มีความหนาแน่นสูงและด้วยเหตุนี้จึงสนับสนุนการติดเชื้อ baculovirus ที่มีความหนาแน่นของเซลล์สูง ซึ่งเป็นประเด็นสำคัญสองประการที่จำเป็นในการเพิ่มชีวมวลและปรับปรุงการไทเทอร์ของโปรตีนต่อปริมาตร

เมื่อเทียบกับการแสดงออกของโปรตีนชั่วคราวของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เวลาจากยีนถึงโปรตีนสำหรับระบบแมลงนั้นยาวนานกว่าอย่างมีนัยสำคัญ โดยทั่วไปแล้วจะอยู่ที่ 3-4 สัปดาห์ เนื่องจากโดยหลักแล้วต้องใช้เวลาในการสร้างสต็อกของแบคทีเรียบาคูโลไวรัสโดยใช้เซลล์ Sf9 ที่ยึดติดตามด้วยการขยายที่ตามมาของ ไวรัสผ่านสต็อก P1, P2 และ/หรือ P3 เพื่อให้ได้ไวรัสที่เพียงพอสำหรับการแสดงออกของโปรตีน

ขจัดความแปรปรวน

เพื่อแก้ไขปัญหาข้อบกพร่องของระบบการแสดงออกของแมลงแบบดั้งเดิม ระบบ ExpiSf™ Expression System ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อขจัดความแปรปรวนที่เกี่ยวข้องกับอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วยยีสต์ เพื่อเพิ่มไทเทอร์ของโปรตีน และเพื่อลดเวลาทั้งหมดในการผลิตโปรตีน ทั้งหมดนี้เพื่อปรับปรุงการวิจัย เช่น การพัฒนาวัคซีน จากม้านั่งไปที่คลินิก

คล้ายกับระบบการแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม Expi293 และ ExpiCHO วิธีการแบบอิงระบบถูกนำมาใช้ในระหว่างการพัฒนาระบบการแสดงออกของ ExpiSf

เป็นขั้นตอนเริ่มต้นในกระบวนการนี้ สื่อเพาะเลี้ยงเซลล์แมลงที่ปราศจากยีสต์ (CD) ที่กำหนดไว้ทางเคมี (CD) ตัวแรกคือ ExpiSf CD Medium ได้รับการพัฒนาเพื่อรองรับการเติบโตของเซลล์ที่มีความหนาแน่นสูง การผลิตไวรัสที่มีไตเตรทสูง และการแสดงออกของโปรตีนที่เพิ่มขึ้น ExpiSf CD Medium จำนวนมากถูกสร้างสูตรและเปรียบเทียบการเจริญเติบโตของเซลล์และระดับการแสดงออกของโปรตีน จลนพลศาสตร์ของการเติบโตที่สอดคล้องกัน (รูปที่ 1A) และโปรตีนไทเทอร์ (รูปที่ 1B) ได้รับจาก ExpiSf CD Medium สี่ล็อตที่แตกต่างกัน

ถัดไป เซลล์ Gibco Sf9 ถูกดัดแปลงเป็นสื่อ ExpiSf CD ผ่านการส่งผ่านระยะยาวอย่างกว้างขวางเพื่อสร้างสายเซลล์ ExpiSf9 ที่มีความหนาแน่นสูง ลักษณะการเติบโตของเซลล์ ExpiSf9 ถูกนำมาเปรียบเทียบกับเซลล์ Sf9 แบบดั้งเดิมโดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ Sf9 ในสื่อที่ประกอบด้วยยีสต์หลายชนิดเป็นเวลาอย่างน้อย 10 ทางเพื่อให้แน่ใจว่ามีการปรับตัว

เมื่อเทียบกับเซลล์ Sf9 ที่ปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มียีสต์ เซลล์ ExpiSf9 ที่ปลูกในสื่อ ExpiSf CD มีความหนาแน่นของเซลล์สูงสุดที่ทำงานได้สูงกว่าในวัฒนธรรมขวดเขย่ามาตรฐาน (>20 × 10 6 เซลล์/มล. เทียบกับ 2–10 × 10 6 เซลล์/มล. รูปที่ 1C) ประมาณสองเท่าของความหนาแน่นสูงสุดของสูตรผสมตัวกลางที่มีความหนาแน่นสูงสุดถัดไป เซลล์ ExpiSf9 ยังมีช่วงการเจริญเติบโตของเฟสล็อกที่กว้างซึ่งครอบคลุมตั้งแต่เซลล์ที่มีชีวิตได้ประมาณ 4–12 × 10 6 เซลล์/มล. โดยมีเวลาเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าที่เสถียรของ

การใช้ประโยชน์จากความหนาแน่นที่สูงกว่าที่เซลล์ ExpiSf9 บรรลุในสื่อ ExpiSf CD ตัวเพิ่มประสิทธิภาพการแสดงออก (ExpiSf Enhancer) ได้รับการพัฒนาเพื่อทำงานร่วมกับสื่อ ExpiSf CD เพื่อให้มีการติดเชื้อที่มีความหนาแน่นสูงอย่างสม่ำเสมอและสม่ำเสมอของเซลล์ ExpiSf9 ที่ 5 × 10 6 เซลล์/มล. ซึ่งนำไปสู่การปรับปรุงระดับโปรตีนหลายเท่าเมื่อเปรียบเทียบกับเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบเดิม ซึ่งเซลล์ติดเชื้อที่ 1–2 × 10 6 เซลล์/มล. ในตัวกลางที่ประกอบด้วยยีสต์ (รูปที่ 1D).

เนื่องจากเชื่อว่าการติดเชื้อ baculovirus ที่เหมาะสมที่สุดของเซลล์ Sf9 จะเกิดขึ้นเมื่อเซลล์อยู่ในระยะล็อกเฟส ช่วงการเจริญเติบโตของล็อกเฟสที่ขยายออกไปของเซลล์ ExpiSf9 ร่วมกับ ExpiSf Enhancer ช่วยให้เซลล์ ExpiSf9 ติดเชื้อที่ความหนาแน่นสูงขึ้นอย่างเห็นได้ชัด กว่าขั้นตอนการทำงานของแมลงแบบดั้งเดิม จึงเป็นการเพิ่มระดับโปรตีนต่อปริมาตร

สุดท้ายนี้ เพื่อลดเวลาโดยรวมของโปรตีน รีเอเจนต์การถ่าย Transfection Reagent ExpiFectamine™ Sf ได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อให้สามารถถ่ายเทเชื้อแขวนลอย ExpiSf9 ที่มีความหนาแน่นสูงได้อย่างอ่อนโยนและไม่เป็นพิษด้วย DNA bacmid ขนาดใหญ่ การผสมผสานการถ่ายเชื้อแบบแขวนลอยสำหรับการสร้าง baculovirus ช่วยให้สามารถเตรียม high titer (1-5 × 10 9 อนุภาคไวรัสติดเชื้อ/มล.) ได้ง่าย ไวรัส P0 คุณภาพสูง ทำให้ไม่จำเป็นต้องขยายไวรัสเพิ่มเติมโดยสมบูรณ์ เวิร์กโฟลว์ลิตรและซับลิตรทั่วไป

นอกจากนี้ การเปลี่ยนถ่ายแบคมิดที่มีสารแขวนลอยช่วยลดเวลาโดยรวมของโปรตีนได้มากถึง 50% (รูปที่ 1E) โดยขจัดความจำเป็นในการขยายไวรัสในขณะเดียวกันก็ขจัดความเสี่ยงของผลกระทบจากการแพร่กระจายของไวรัสที่เป็นอันตราย (โดยที่การรวมตัวของยีน/ระดับการแสดงออกของโปรตีนลดลงระหว่างการสร้างของสะสมของไวรัส P1 +) ตรวจสอบให้แน่ใจว่าใช้ Baculovirus คุณภาพสูงสุดสำหรับการแสดงออกของโปรตีน วิ่ง

รูปที่ 1. ลักษณะการทำงานของระบบนิพจน์ ExpiSf (A) สื่อซีดี ExpiSf สี่ล็อตที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นการเติบโตที่สม่ำเสมอของเซลล์ ExpiSf9 ที่มีความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิตสูงสุด (VCD) ของ

20 × 106 เซลล์/มล. (B) ไทเทอร์ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) สูงขึ้น 4-5 เท่าในสื่อ ExpiSf CD จำนวนมากที่ทดสอบเมื่อเปรียบเทียบกับเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบดั้งเดิมโดยใช้สื่อที่มียีสต์ (YC) (C) เซลล์ ExpiSf9 ในสื่อ ExpiSf CD มีการเจริญเติบโตที่เหนือกว่าเมื่อเทียบกับเซลล์แมลงที่มียีสต์ห้าชนิด (D) ExpiSf Enhancer ที่ใช้ร่วมกับ ExpiSf CD Medium และเซลล์ ExpiSf9 ได้สร้าง GFP titers ที่สูงกว่า 3 เท่าของเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบเดิม ExpiSf Enhancer เพิ่มขึ้นเกือบสองเท่าเมื่อเทียบกับระบบ ExpiSf ที่ไม่มีการเติมเอนแฮนเซอร์ (E) ระบบการแสดงออกของ ExpiSf ลดเวลาที่ต้องใช้ในการเปลี่ยนจาก bacmid DNA เป็นการแสดงออกของโปรตีนลงครึ่งหนึ่ง โดยขจัดความจำเป็นในการขยายไวรัสผ่านการสร้างสต็อกไวรัส P0 ที่มีปริมาณสูงและ titer สูงโดยตรง



การเปรียบเทียบ ExpiSf กับเวิร์กโฟลว์ที่ใช้ Sf9 แบบดั้งเดิม

ระดับการแสดงออกของโปรตีนที่แตกต่างกันสามชนิด—โปรตีนเรืองแสงสีเขียว, โปรตีนหลอมรวม Fc ของมนุษย์ และปัจจัยการตายของเนื้อร้ายเนื้องอก-อัลฟา (TNF-a)—ถูกเปรียบเทียบระหว่างระบบ ExpiSf กับเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบดั้งเดิมที่เซลล์ติดเชื้อที่ 1–2 × 10 6 เซลล์/มล. ในตัวกลางที่มียีสต์

เมื่อเปรียบเทียบกับสื่อที่ประกอบด้วยยีสต์โอเลตที่แตกต่างกันห้าชนิดที่ทดสอบโดยใช้เวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบดั้งเดิม ระบบนิพจน์ ExpiSf ความหนาแน่นสูงสร้างการปรับปรุงระดับการแสดงออก 3-5 เท่าในโปรตีนทั้งสามที่ทดสอบ (รูปที่ 2A).

ตัวรับ G-protein-coupled โดยทั่วไปจะแสดงออกมาในเซลล์แมลง ส่วนหนึ่งเป็นเพราะมีโอกาสเป็นพิษในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่นเดียวกับความต้องการลดระดับไกลโคซิเลชันสำหรับการศึกษาทางชีววิทยาเชิงโครงสร้าง Cannabinoid receptor 2 (CB2) ถูกแสดงออกในระบบ ExpiSf และในเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบดั้งเดิม

เวลาเก็บเกี่ยวเซลล์ที่เหมาะสมที่สุดถูกกำหนดให้เป็น 48 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อใน ExpiSf ซึ่งสอดคล้องกับความมีชีวิตของเซลล์ 70% ในช่วงเวลาของการเก็บเกี่ยวที่มีเวลาการติดเชื้อนานขึ้นทำให้ความมีชีวิตลดลงโดยไม่ปรับปรุงการแสดงออกของ CB2 ต่อเซลล์ (รูปที่ 2B & 2C). การแสดงออก CB2 (ตามที่วัดโดยจำนวนทั้งหมดของโมเลกุล CB2 ต่อเซลล์โดยโฟลว์ไซโตเมตรีเชิงปริมาณ) สูงขึ้น 10 เท่าในระบบนิพจน์ ExpiSf เมื่อเทียบกับเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบดั้งเดิม (รูปที่ 2D).

การปรับปรุงนี้เกิดจากการเพิ่มระดับการแสดงออกทั้งต่อเซลล์และความหนาแน่นที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของเซลล์ ExpiSf9 ในปริมาณที่กำหนดเมื่อเทียบกับเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบเดิม

รูปที่ 2 การเปรียบเทียบระบบนิพจน์ ExpiSf กับเวิร์กโฟลว์ Sf9 แบบเดิมโดยใช้สื่อที่ประกอบด้วยยีสต์ต่างๆ (A) Expression levels of an Fc fusion protein, green fluorescent protein (GFP), and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) were on average >4, >3, or >5-fold higher in the ExpiSf expression system than those obtained using various yeastolate-containing media in a traditional Sf9 workflow. (B) Optimization of CB2 G-protein-coupled chemokine receptor harvest time and (C) post-infection viability kinetics in the ExpiSf Expression System. (D) Increased total CB2 expression levels obtained in the ExpiSf Expression System compared to traditional Sf9 workflow in Sf-900 II medium increased expression of CB2 is due to both higher per cell expression as well as greater cell density in a given volume for the ExpiSf Expression System.



Glycosylation Patterns and Protein Functionality

Although high protein yields are desirable, resultant proteins are less valuable if they are aggregated, misfolded, degraded, or improperly glycosylated. The quality of the proteins expressed in the ExpiSf system was compared to the quality of the same proteins expressed using a traditional Sf9 workflow with yeastolate-containing medium.

Using secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a model protein, glycosylation patterns generated in the ExpiSf were shown to be highly comparable to those of a traditional Sf9 insect workflow, with the predominate glycoforms being Man3, Man3F, and Man6 in both instances (Figure 3A). SDS-PAGE showed a single band with a molecular weight of

57 kD for both workflows (Figure 3B).

The biological activity of TNF-α expressed in the ExpiSf system and by traditional Sf9 workflow was assessed using an NF-κB luciferase reporter gene assay. HIS-tagged TNF-a was expressed and purified by Ni-NTA, and its concentration was determined by A280. TNF-a was expressed at >4-fold higher levels in ExpiSf compared to the traditional Sf9 workflow (Figure 3C) reporter gene assay results demonstrated equivalent biological activity (relative luminescence units RLUs) for the proteins, respectively (Figure 3D).

In summary, the ExpiSf Expression System represents a significant advance in insect cell protein expression in terms of media consistency, protein yield, and time. It enables researchers to streamline protein expression and vaccine development to shorten time lines from bench to clinic.

Figure 3. Comparison of glycosylation patterns and biological activity for proteins expressed in the ExpiSf Expression System and by traditional Sf9 workflow. (A) Glycosylation patterns of secreted alkaline phosphatase (SEAP) were highly similar in the ExpiSf Expression System and in a traditional insect workflow using Sf900-II medium. (B) SDS-PAGE of SEAP purified from the ExpiSf Expression System and a traditional Sf9 workflow using Sf900-II medium. (C) The ExpiSf Expression System generated >4-fold higher TNF-a expression levels compared to a traditional Sf9 workflow. (D) TNF-a activity, as measured by luciferase-based NF?B reporter gene assay, showed equivalent biological response for protein generated in the ExpiSf Expression System and by traditional Sf9 workflow.


Protein Science

We are able to produce and purify the proteins you want in multi-milligram quantities, and our expertise in protein characterisation means that you can have confidence that we will deliver you high quality protein that has passed our rigorous quality control process.

Protein Science Services

We can offer you a complete protein science solution, including:

  • Construct design
  • Cloning
  • Protein expression services and expression system optimisation using อี. โคไล, insect cells, or mammalian cells
  • Protein production services
  • Purification by affinity, ion-exchange and size-exclusion chromatography
  • Protein characterisation

Combinatorial Domain Hunting

Often our scientists will be able to use literature-informed or bioinformatics-based approaches for expression construct design. But if you already know that these methods have been unsuccessful, or you think they will not work on your protein, our unique proprietary technology Combinatorial Domain Hunting (CDH) allows us to quickly identify soluble, highly expressible protein constructs for the most problematic drug target proteins.

Protein Characterisation

The high quality of the proteins that we produce means that you can use them to support a number of key processes in drug discovery and naturally our protein production capability pipelines smoothly into other Domainex services such as:

PoLiPa

An exciting recent development at Domainex is our PoLiPa technology for making pure and stable preparations of solubilised membrane proteins such as GPCRs. The PoLiPa approach seems set to revolutionise membrane protein drug discovery, making these otherwise difficult targets accessible to structural biology, biophysical assays, and other screening technologies.


How is a gene structured?

The genome is not simply a chain of protein-coding genes one after the other. Even within one gene, the protein-coding sequences are interrupted by non-coding regions. These non-coding interruptions are known as intervening sequences or introns. Conversely, the coding sequences that are actually expressed are called exons.

Most, but not all structural eukaryote genes contain introns. Importantly, these introns are initially transcribed with the exons to form the pre-mRNA, however, they are cut out of the transcript and the remaining exons are joined together before the mRNA is finished being processed. This process is called RNA splicing. This completed, processed mRNA is called the mature mRNA.

Generally, the more complex organisms have more and larger introns. One reason for the existence of the intron/exon structure is that exons can code for different functional regions of proteins, so with the inclusion/exclusion of certain exons, genes can produce various forms of their protein for in different tissues or at different times. This is because the transcription machinery can skip certain exons and include other ones, creating transcripts with different sequences. This process is called alternative splicing, and represents an important layer of controlling the proteins that are produced in cells.

Gene Expression

Genes encode proteins and proteins dictate cell function. Therefore, the combination of genes that are active in a particular cell determine the identity of the cell and the tasks it is carrying out. The activation of genes is called gene expression, and it is tightly regulated at several points, from the initial process of transcription, to splicing, to the translation of the proteins and the modifications to the final protein structures. These processes are tightly controlled at every step to closely monitor and maintain cell types with the required characteristics.

How is gene expression regulated?

The main control point for gene expression is usually at the start of transcription. That is, controlling the signal that tells the cell to produce this mRNA and make this protein.

Transcript processing provides an additional level of regulation. This level of regulation includes splicing, where alternative transcripts can be produced depending on the needs of the cell. Additionally, newly synthesized transcripts can be enzymatically broken down to control protein levels in the cell in response to different cues.

The variety of cell types that exist in a multicellular organism comes from the complexity brought about by variety of potential gene expression profiles. Different cell types possess distinct sets of regulators that initiate or repress the production of different transcripts and proteins

Regulatory elements

As mentioned previously, a large proportion of the genome codes for important regulators. That is, the sequences do not make a protein, but the sequences are key in modulating the expression of other genes.

Transcription usually starts when RNA polymerase binds to an important regulatory region called the gene promoter. This sequence is usually located just upstream from the starting point for transcription. The binding of specific proteins to the promoter is usually required for the gene to be transcribed. Thus, the cell can regulate whether the gene is expressed or not through these regulatory factors, which can be general or cell-type specific.

More recently, another type of regulatory elements have been discovered, called enhancer sequences. These also represent a binding site for other regulatory proteins, and they help to control and fine-tune the expression of a gene. There is no strict criteria for what defines an enhancer region, and the landscape of enhancers in the genome is hugely complicated. Enhancers can also only be active in certain cell types of conditions, or can be active all the time. One interesting feature of enhancers is they can be located thousands of nucleotides away from the gene they control. Further complicating things, some regulatory elements or proteins can affect the transcription of multiple genes, and some regulatory proteins can even have different roles for different genes!

The timed turning off/on of genes in a cell represents on layer of control of the content of proteins in a cell, and thus the ตัวตน of that cell. The complexity of the genome in eukaryotes is due to the presence of multiple regulators on the DNA. The concerted actions of regulatory sequences in the DNA, the presence of regulatory factors, and the post-transcriptional/translational processing of a transcript or a protein allows fine-tuning of the gene expression patterns in a cell. This allows cells to perform their required tasks and to respond quickly to changes in the environment.


ดูวิดีโอ: สรปชวะ พนธศาสตร EP1 สารพนธกรรม (มิถุนายน 2022).