ข้อมูล

ฉันจะคำนวณเนื้อหา alpha helix จากจุดไข่ปลาได้อย่างไร

ฉันจะคำนวณเนื้อหา alpha helix จากจุดไข่ปลาได้อย่างไร



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันจะคำนวณเนื้อหาอัลฟาเกลียว (เช่นเปอร์เซ็นต์) ในโปรตีนจากรูปไข่โมลาร์ที่กำหนดที่ 222 นาโนเมตรได้อย่างไรโดยไม่ต้องใช้ซอฟต์แวร์ใด ๆ ฉันได้ลองใช้สมการ Greenfield-Fasman แล้ว แต่ดูเหมือนว่าคำตอบจะไม่ถูกต้อง


คุณสามารถใช้ข้อมูลได้ที่เว็บไซต์นี้โดยเฉพาะส่วนที่ 3 (https://www.photophysics.com/resources/tutorials/circular-dichroism-cd-spectroscopy)

สังเกตสเปกตรัมซีดีที่แตกต่างกันสำหรับ alpha-helix, beta-sheets และ random coil หากวัดโปรตีนของคุณที่ 222 นาโนเมตร คุณจะต้องเปรียบเทียบค่าที่วัดได้ของคุณกับสเปกตรัมที่ 222 นาโนเมตร ซึ่งจะทำให้คุณสามารถระบุโครงสร้างรองของโปรตีนได้ แต่ถ้าคุณต้องการความแม่นยำ คุณจะต้องวัดความยาวคลื่นหลายช่วง เพื่อกำหนดการกระจายของเกลียวอัลฟ่า เบต้าชีต และขดลวดสุ่ม เนื่องจากทั้งสามมีส่วนทำให้เกิดสเปกตรัมของการวัด ดังนั้นคุณจำเป็นต้องมีการวัดหลายๆ ค่าเพื่อหาการมีส่วนร่วมที่สัมพันธ์กันของโครงสร้างทุติยภูมิแต่ละรายการ


การเปรียบเทียบคุณสมบัติทางชีวฟิสิกส์และชีวภาพของ α- Helical Enantiomeric ยาต้านจุลชีพเปปไทด์

ในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา (เฉิน และคณะ J Biol Chem 2005, 280:12316–12329) เราใช้an α- เปปไทด์ต้านจุลชีพแบบเฮลิคอล V681 เป็นกรอบการศึกษาผลกระทบของเปปไทด์ไม่ชอบน้ำ amphipathicity และ helicity ต่อกิจกรรมทางชีววิทยาที่เราได้รับหลาย V681 แอนะล็อกที่มีการปรับปรุงอย่างมากในดัชนีการรักษาเปปไทด์ต่อแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวก ในการศึกษานี้ d -enantiomers ของเปปไทด์สามชนิด – V681, V13ANS และ V13Kหลี่ ถูกสังเคราะห์ขึ้นเพื่อเปรียบเทียบคุณสมบัติทางชีวฟิสิกส์และทางชีววิทยากับไอโซเมอร์อีแนนทิโอเมอร์ d -enantiomer แต่ละตัวถูกแสดงโดยสเปกโตรสโคปีไดโครอิซึมแบบวงกลมเพื่อเป็นภาพสะท้อนของ l -isomer ที่สอดคล้องกันในสภาวะที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยและต่อหน้าไตรฟลูออโรเอทานอล 50% l - และ d -enantiomers แสดงฤทธิ์ต้านจุลชีพที่เทียบเท่ากับกลุ่มต่างๆ Pseudomonas aeruginosa เชื้อแยกทางคลินิก แบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวกต่างๆ และเชื้อรา นอกจากนี้ l - และ d -enantiomeric เปปไทด์ยังทำงานอย่างเท่าเทียมกันในความสามารถในการแยกเซลล์เม็ดเลือดแดงของมนุษย์ กิจกรรมที่คล้ายกันของเปปไทด์ l - และ d -enantiomeric บนเยื่อหุ้มเซลล์โปรคาริโอตหรือยูคาริโอตแสดงให้เห็นว่าไม่มีตัวรับ chiral และเยื่อหุ้มเซลล์เป็นเป้าหมายเพียงอย่างเดียวสำหรับเปปไทด์เหล่านี้ เปปไทด์ d -V13KNS มีการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในดัชนีการรักษาเมื่อเทียบกับเปปไทด์หลัก V681 โดย 53 เท่าเทียบกับ ป. แอรูจิโนซา แบคทีเรียแกรมลบ 80 เท่า แบคทีเรียแกรมบวก 69 เท่า และแบคทีเรียแกรมบวก 33 เท่า Candida albicans. ความเสถียรที่ยอดเยี่ยมของ d -enantiomers ต่อการย่อยอาหารของ trypsin (ไม่มีการสลายโปรตีนโดย trypsin) เมื่อเทียบกับการสลายอย่างรวดเร็วของ l -enantiomers เน้นย้ำถึงข้อดีของ d -enantiomers และศักยภาพของ d -enantiomers ในการรักษาทางคลินิก

การใช้ยาปฏิชีวนะแบบดั้งเดิมอย่างแพร่หลายส่งผลให้เกิดสายพันธุ์ที่ดื้อต่อยาปฏิชีวนะจำนวนมาก กระตุ้นให้เกิดความต้องการยาปฏิชีวนะชนิดใหม่อย่างเร่งด่วน (1, 2) เปปไทด์ต้านจุลชีพของ Cationic ได้กลายเป็นตัวเลือกที่สำคัญในฐานะตัวแทนการรักษาที่มีศักยภาพ ( 3-5 ) และแสดงให้เห็นว่ามีฤทธิ์ใน ในร่างกาย การศึกษาสัตว์ (6) แม้ว่าจะไม่ได้กำหนดรูปแบบการดำเนินการที่แน่นอนของเปปไทด์ต้านจุลชีพ (7-9) แต่ได้มีการเสนอว่าเยื่อหุ้มเซลล์ไซโตพลาสซึมเป็นเป้าหมายหลักของเปปไทด์เหล่านี้จำนวนมาก โดยที่การสะสมเปปไทด์ในเมมเบรนทำให้เกิดการซึมผ่านเพิ่มขึ้นและการสูญเสียสิ่งกีดขวาง ฟังก์ชัน ( 10, 11 ) ไม่คาดว่าจะมีการพัฒนาความต้านทานต่อเปปไทด์แอคทีฟของเมมเบรนซึ่งมีเป้าหมายเพียงอย่างเดียวคือเยื่อหุ้มเซลล์ไซโตพลาสซึม เนื่องจากจะต้องมีการเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบไขมันของเยื่อหุ้มเซลล์ของจุลินทรีย์จำนวนมาก อย่างไรก็ตาม อุปสรรคสำคัญในการใช้เปปไทด์ต้านจุลชีพเป็นยาปฏิชีวนะคือความเป็นพิษหรือความสามารถในการแยกเซลล์ยูคาริโอต ซึ่งปกติจะแสดงเป็นกิจกรรมการสลายเม็ดเลือด (ความเป็นพิษต่อเซลล์เม็ดเลือดแดงของมนุษย์) ซึ่งเป็นสาเหตุหลักที่ทำให้ไม่สามารถนำไปใช้เป็นยารักษาโรคแบบฉีดได้

รูปแบบ Enantiomeric ของเปปไทด์ต้านจุลชีพที่มีกรดอะมิโนทั้งหมดถูกใช้เพื่อศึกษากลไกการจับกับเมมเบรน (12-14) เนื่องจากก่อนหน้านี้เคยคิดว่า chirality ของเยื่อหุ้มเซลล์จะต้องใช้ chirality เปปไทด์จำเพาะเพื่อให้มันทำงานได้ อย่างไรก็ตาม การศึกษาจำนวนมากได้แสดงให้เห็นว่าเปปไทด์กรดอะมิโนทั้งหมดมีกิจกรรมที่เท่าเทียมกันกับเอแนนทิโอเมอร์ทั้งหมด (12-19) ซึ่งบ่งชี้ว่ากลไกการต้านจุลชีพของเปปไทด์เหล่านี้ไม่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาสเตอริโอซีเล็คทีฟกับเอนไซม์ไครัลหรือลิพิด หรือตัวรับโปรตีน นอกจากนี้ ออล-ดี-เปปไทด์ยังมีความทนทานต่อการเสื่อมสภาพของเอ็นไซม์โปรตีโอไลติก ซึ่งช่วยเพิ่มศักยภาพของเปปไทด์ในการบำบัดทางคลินิก

ในการศึกษาก่อนหน้าของเรา (20) เราใช้ a เดอโนโว วิธีการออกแบบเพื่อเปลี่ยนแปลงโครงสร้างทุติยภูมิ ความชอบน้ำ และแอมฟิพาทิซิตี้ของ an α- เปปไทด์ต้านจุลชีพแบบเฮลิคัลแอมฟิพาทิก V681 ( 21, 22 ) และได้รับสารประกอบตะกั่วที่มีฤทธิ์ต้านจุลชีพสูงและมีฤทธิ์ทำให้เม็ดเลือดแดงแตกต่ำมาก ในการศึกษานี้ เราเปรียบเทียบคุณสมบัติทางชีวกายภาพและทางชีววิทยาระหว่างเปปไทด์อีแนนชิโอเมอร์กับกรดอมิโนทั้งหมดหรือกรดอมิโนของสารประกอบตะกั่วของเรา ซึ่งรวมถึงฤทธิ์ต้านจุลชีพกับแบคทีเรียหลายสายพันธุ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งกลุ่มที่หลากหลายของ Pseudomonas aeruginosa แยกทางคลินิกด้วยความไวต่อยาปฏิชีวนะ ciprofloxacin ที่หลากหลาย เป็นที่ทราบกันดีว่าการติดเชื้อทางเดินหายใจโดย ป. แอรูจิโนซา เป็นสาเหตุสำคัญของการเจ็บป่วยและเสียชีวิตในผู้ป่วยโรคซิสติกไฟโบรซิส (23-25) ที่เป็นผู้ใหญ่ Pseudomonas aeruginosa การติดเชื้อยังเป็นปัญหาร้ายแรงในผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลด้วยโรคมะเร็งและแผลไฟไหม้ โดยผู้ป่วยดังกล่าวเสียชีวิต 50% (24, 25) ตามข้อมูลที่รวบรวมระหว่างปี 1990 ถึง 1996 โดยศูนย์ควบคุมและป้องกันโรคแห่งสหรัฐอเมริกา (CDC) ป. แอรูจิโนซา เป็นสาเหตุอันดับสองของโรคปอดบวมในโรงพยาบาล (17% ของไอโซเลท) สาเหตุอันดับสามของการติดเชื้อทางเดินปัสสาวะ (11%) สาเหตุอันดับสี่ของการติดเชื้อที่บริเวณผ่าตัด (8%) เชื้อโรคที่พบได้บ่อยที่สุดอันดับที่ 7 จากกระแสเลือด (3%) และอันดับที่ 5 โดยรวม (9%) เราเชื่อว่าการเปรียบเทียบนี้ เดอโนโว การศึกษาการออกแบบเปปไทด์ต้านจุลชีพของ l และ d เป็นขั้นตอนสำคัญในการพัฒนายาต้านจุลชีพชนิดใหม่และทำความเข้าใจกลไกการออกฤทธิ์ของ α- เปปไทด์ต้านจุลชีพแบบเฮลิคอล


วัสดุและวิธีการ

พลาสมิด

พลาสมิดการแสดงออกของ Pho4p pJ1080 ที่ได้มาจาก pET21d (โนวาเจน) เข้ารหัสโดเมน 62 ของกรดอะมิโน bHLH ของ Pho4p และเป็นของขวัญของ D. Wemmer (59) การทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์โดยใช้วิธีการมาตรฐานถูกใช้เพื่อสร้างพลาสมิดที่เข้ารหัส bHLHสั้น แวเรียนต์ของประจุ Pho4p pJ1350, pJ1351 และ pJ1352 (การเข้ารหัสเรซิดิว SAA, EEE และ KKK ต่อท้ายใกล้กับปลาย N) เปปไทด์แวเรียนต์ที่มีประจุที่ยาวกว่า bHLHยาว (SAA, EEE, KKK) ถูกสร้างจาก bHLHสั้น เปปไทด์โดยการแทนที่เรซิดิวของปลาย N 3 ตัว (MDD) ตัวแรกด้วยเรซิดิวของปลาย bZIP N 12 ตัว (MASMTGGQQMGRD) พลาสมิด pDP-AP-1-21, pDP-AP-1-23, pDP-AP-1-25, pDP-AP-1-26, pDP-AP-1-28 และ pDP-AP-1-30 ได้รับการแก้ไข เพื่อรวมไซต์ E-box สำหรับการจับ bHLH เพื่อสร้างโพรบสำหรับการวิเคราะห์เฟสอิเล็กโตรโฟเรติก ( 30)

โอลิโกนิวคลีโอไทด์

โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ถูกดัดแปลงถูกสังเคราะห์โดยใช้เคมีฟอสโฟรามิไดต์มาตรฐาน โอลิโกนิวคลีโอไทด์ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยการเปลี่ยนสภาพ PAGE (อะคริลาไมด์ 20% 29:1 อะคริลาไมด์/ไบซาคริลาไมด์, ยูเรีย 8 โมลาร์), สกัดจากเศษเจล (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA และ 300 mM NaOAc, pH 5.2) และแยกเกลือออกโดยใช้ C18 ตลับแบบย้อนกลับ (Sep-Pak Waters Corporation) ความเข้มข้นของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ถูกกำหนดหาที่ 260 นาโนเมตรโดยใช้สัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของโมลาร์เพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดดังที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (11) โอลิโกนิวคลีโอไทด์ถูกอบอ่อนที่ ∼50 ไมโครโมลาร์ใน NaCl 250 มิลลิโมลาร์ โดยให้ความร้อนจนถึง 95°C และทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้องข้ามคืน

การแสดงออกของโปรตีนและการทำให้บริสุทธิ์

เปปไทด์ bHLH ถูกแสดงออกในเซลล์ BL21(DE3) ในตัวกลางของ Luria–Bertani ( 59) วัฒนธรรมเติบโตที่ 37°C ถึง an NS600 0.6–0.7 และเหนี่ยวนำด้วย isopropyl-β- d -thiogalactopyranoside 5 มิลลิโมลาร์ จากนั้นเพาะเลี้ยงเชื้อที่เหนี่ยวนำให้ฟักตัวเป็นเวลา 8 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C ก่อนการหมุนเหวี่ยง (5000 × NS, 20 นาที) เม็ดเซลล์ถูกแช่แข็งที่ −80°C, ละลายและแขวนลอยใหม่ (20 มล./ล. การเพาะเลี้ยง) ในบัฟเฟอร์ไลซิส (50 mM Tris–HCl, pH 6.0, 1 mM EDTA และ 20 mM DTT) การสลายตัวของเซลล์เริ่มต้นโดย sonication (แต่ละ 15 วินาที, 10 × 4°C Fisher Sonic Dismembrator 60) ตามด้วยการตัดเฉือนด้วยลมโดยใช้ตัวทำลาย Avestin Emulsiflex-C5 ที่ขับเคลื่อนด้วยแรงดัน N2 (140 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว, 4°ซ). ไลเซตที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ ถูกทำให้กระจ่างโดยการหมุนเหวี่ยง (20 000 × NS, 45 นาที, 4°C) และถูกทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมบนคอลัมน์แยกตามแรงโน้มถ่วง SP (Pharmacia Biotech, Sweden) หลังจากการโหลด คอลัมน์การแลกเปลี่ยนประจุบวกถูกล้างด้วย 40 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ไลซิสที่เสริมด้วยความเข้มข้นของเกลือที่เพิ่มขึ้น (0.5, 1.0, 1.5 และ 2.0 โมลาร์ของ NaCl) เศษส่วนที่ถูกชะออกซึ่งมีเปปไทด์ bHLH (1.0 M NaCl สำหรับ bHLHสั้น และ 1.5 M NaCl สำหรับ bHLHยาว) ถูกทำให้เข้มข้นโดยใช้หัวตัดแบบแรงเหวี่ยงตัดน้ำหนักโมเลกุล 5,000 ตัว (VivaSpin 20 VivaScience) และถูกทำให้บริสุทธิ์โดย HPLC [C18 คอลัมน์เฟสย้อนกลับแบบเตรียมการ (250 × 21.2 มม.), Beckman 127P System Gold, บัฟเฟอร์ A: 0.1% กรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA), บัฟเฟอร์ B: 80% CH3CN, 0.1% TFA, เกรเดียนต์ 10–70% บัฟเฟอร์ B นานกว่า 50 นาที] ESI GC-MS ประเมินความบริสุทธิ์ของเปปไทด์เป็น >95% เปปไทด์บริสุทธิ์ถูกไลโอฟิไลซ์สำหรับการจัดเก็บ

BHLH:การศึกษาความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันกับ DNA

สเปกโทรสโกปีแบบวงกลม

การวิเคราะห์เฟสอิเล็กโทรโฟเรติกของการดัดงอดีเอ็นเอ

โพรบดีเอ็นเอสำหรับการวิเคราะห์เฟสถูกสร้างและติดฉลากรังสีโดย PCR จากอนุพันธ์ของพลาสมิด pDP-AP-1-21, pDP-AP-1-23, pDP-AP-1-25, pDP-AP-1-26, pDP-AP -1-28 และ pDP-AP-1-30 ( 30) ที่ถูกดัดแปลงผ่านการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่มุ่งต่อตำแหน่งของตำแหน่งการจับ AP-1 ดั้งเดิมเพื่อสร้างตำแหน่งสำหรับจับ E-box ที่เหมาะสมสำหรับการจับ bHLH โพรบดีเอ็นเอถูกบ่มด้วยเปปไทด์ที่เพียงพอสำหรับการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่ ∼50% ในปฏิกิริยา 20 ไมโครลิตรที่มีบัฟเฟอร์การจับและ 100 ไมโครกรัม/มล. BSA ปฏิกิริยาถูกบ่มบนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาทีก่อน PAGE ตามธรรมชาติ (6% อะคริลาไมด์ 29:1 อะคริลาไมด์/ไบซาคริลาไมด์) ในบัฟเฟอร์ 0.5× TBE สำหรับ 2000 V-h ที่ 22°C เจลแห้งถูกวิเคราะห์ตามข้างต้น

การคำนวณการวิเคราะห์แบบค่อยเป็นค่อยไป

การทำนายพลังงานดัดดีเอ็นเอ

ΔΔNS° มีส่วนร่วมในกระบวนการโดยรวมของการสร้างโปรตีนที่ซับซ้อน – DNA ซึ่งกำหนดเป็น ΔNS°(ตัวแปร) − ΔNS°(SAA) ประมาณจากข้อมูลการทดลองหรือเสนอให้เป็นการเดาที่สมเหตุสมผลซึ่งหาเหตุผลเข้าข้างตนเองจากการสังเกตการทดลอง บุคคล ΔΔNS° ผลงานที่มาจากการทดลองมีประมาณการดังนี้


ผลของ pH ที่เป็นกรดต่อการดูดซับและฤทธิ์ไลติกของเปปไทด์ Polybia-MP1 และแอนะล็อกที่ประกอบด้วยฮิสทิดีนในเยื่อหุ้มไขมันประจุลบ: การศึกษาทางชีวฟิสิกส์โดยพลศาสตร์ของโมเลกุลและสเปกโทรสโกปี

เปปไทด์ต้านจุลชีพ (AMPs) เป็นส่วนหนึ่งของระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของหลายชนิด AMP เป็นลำดับสั้นๆ ที่อุดมไปด้วยสารตกค้างที่มีประจุและไม่มีขั้ว พวกมันทำหน้าที่เกี่ยวกับเฟสลิปิดของพลาสมาเมมเบรนโดยไม่ต้องใช้ตัวรับเมมเบรน Polybia-MP1 (MP1) ที่สกัดจากตัวต่อพื้นเมือง เป็นสารฆ่าเชื้อแบคทีเรียในวงกว้าง ตัวยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งที่ไม่ทำให้เกิดภาวะเม็ดเลือดแดงแตกและไม่เป็นพิษต่อเซลล์ กลไกการทำงาน MP1 และโหมดการดูดซับยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด การดูดซับของลิพิดไบเลเยอร์และกิจกรรมไลติกมักขึ้นอยู่กับสถานะไอออไนเซชันของสารตกค้างที่เป็นกรดสองชนิดและสารตกค้างพื้นฐานสามชนิด และด้วยเหตุนี้จึงขึ้นอยู่กับค่า pH จำนวนมาก ที่นี่ เราตรวจสอบผลของสารละลายกรดจำนวนมาก (pH 5.5) และ pH เป็นกลาง (7.4) ต่อการดูดซับ การแทรก และการไลติกของ MP1 และเมมเบรนแบบจำลอง H-MP1 แบบอะนาล็อกถึงประจุลบ (7POPC:3POPG) H-MP1 เป็นแอนะล็อกสังเคราะห์ของ MP1 โดยมีไลซีนแทนที่ด้วยฮิสติดีน การเปลี่ยนแปลงค่า pH จำนวนมากสามารถปรับประสิทธิภาพของเปปไทด์นี้ได้ การรวมกันของเทคนิคการทดลองต่างๆ และการจำลองเชิงโมเลกุล (MD) แสดงให้เห็นว่าการดูดซับ การแทรก และการไลติกของ H-MP1 มีความไวสูงต่อ pH จำนวนมากเมื่อเทียบกับ MP1 รายละเอียดเกี่ยวกับอะตอมมิคซึ่งจัดทำโดยการจำลอง MD แสดงให้เห็นว่าเปปไทด์สัมผัสกับปลาย N ของพวกมันกับ bilayer ก่อนการแทรกแล้ววางขนานกับ bilayer ใบหน้าที่ไม่ชอบน้ำของพวกมันที่สอดเข้าไปในเฟสของสายโซ่อะซิลรบกวนการบรรจุไขมัน

นี่คือตัวอย่างเนื้อหาการสมัครสมาชิก เข้าถึงผ่านสถาบันของคุณ


วัสดุและวิธีการ

โมเดล

ลำดับ HS (ลำดับกิ้งก่า-HS เป็นชิ้นส่วนแยก) คือ VLYVKLHN เราได้พิจารณาลำดับที่สองเพิ่มเติม HS-α และ HS-β ที่แสดงไว้ในรูปที่ 1 เพื่อตรวจสอบว่าสารตกค้างที่ขนาบข้างส่งผลต่อแนวโน้มการพับอย่างไร ความยาวของเรซิดิวที่เติมลงในลำดับ HS ยาวพอที่จะรวมหน่วยโครงสร้างทุติยภูมิอย่างน้อยหนึ่งหน่วย กล่าวคือ α-helix และ β-strands เสริมหรือ β-แผ่น/กิ๊บติดผมสองอัน (ดูรูปที่ 1 ). นอกจากนี้ ลำดับกิ้งก่าที่สอง ลำดับกิ้งก่ายาวเจ็ดตัว-HE (เกลียวและ shEet) ที่มีสารตกค้างเจ็ดตัว RVQDNIV ได้รับการศึกษาตามที่อธิบายไว้ในข้อมูลสนับสนุน)

การสร้างแบบจำลองโมเลกุล

เพื่อปรับปรุงการสุ่มตัวอย่างในการจำลองไดนามิกของโมเลกุล ใช้วิธี REMD 43 ดำเนินการโดยเรียกใช้ชุดการจำลองอิสระที่อุณหภูมิต่างๆ และการแลกเปลี่ยนที่กำหนดโดยเกณฑ์ของมหานครในแต่ละช่วงเวลา เป็นที่ทราบกันดีว่า REMD เป็นวิธีการสุ่มตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพ 44 และสามารถนำไปใช้กับ α-helical peptides, 34, 45� β-sheet peptides, 47 β-hairpin peptides 48 , โปรตีนขนาดเล็ก 49 และ amyloid การประกอบ. 20 50� วิธี REMD แบบอิงตามอุณหภูมิ ซึ่งช่วยให้สุ่มตัวอย่างตามโครงสร้างได้ดีขึ้น เป็นเครื่องมือที่เหมาะสมสำหรับการศึกษาความเป็นพลาสติกเชิงโครงสร้างของลำดับกิ้งก่าที่แยกได้ HS และปัจจัยที่กระตุ้นให้ลำดับกิ้งก่ารวมตัวเป็นรูปร่างเกลียว ใน HS-α และ β- กิ๊บติดผมใน HS-β รายละเอียดเกี่ยวกับพารามิเตอร์การจำลองและการตั้งค่าสามารถพบได้ในส่วนข้อมูลสนับสนุน S1

มวลสารเคลื่อนที่ด้วยไอออน

แมสสเปกโตรเมตรีตามการเคลื่อนที่ด้วยไอออน (IM-MS) ถูกใช้เพื่อวัดส่วนตัดขวางของการชนกันของโมโนเมอร์ของเปปไทด์ HS-α และ HS-β เปรียบเทียบค่าการทดลองกับภาคตัดขวางทางทฤษฎีของโครงสร้างที่ได้จากการจำลอง ที่นี่ ไอออนถูกสร้างขึ้นโดยนาโนอิเล็กโทรสเปรย์ซึ่งจับโดยเส้นเลือดฝอย ถ่ายโอนไปยังกรวยไอออน ค่อยๆ แยกตัวออกจากกัน ดักจับ และพัลส์เข้าไปในเซลล์ลอยซึ่งเต็มไปด้วยก๊าซฮีเลียม แพ็คเก็ตไอออนถูกดึงผ่านเซลล์ด้วยสนามไฟฟ้าอ่อน ออกจากเซลล์ ถูกเลือกและตรวจจับโดยมวล สามารถตั้งค่าตัวกรองมวลเพื่อเลือกค่าที่แน่นอนของ m/z และการกระจายเวลาที่มาถึงวัดด้วย NS = 0 กำหนดโดยพัลส์เข้าสู่เซลล์และ t = tNS เมื่อไอออนมาถึงเครื่องตรวจจับ โดยการเปลี่ยนแรงดันไฟฟ้าข้ามเซลล์ที่ความดันคงที่ของเซลล์ ค่าของค่าที่ลดลงนั้นแม่นยำมาก K0, สามารถรับได้. ค่าเหล่านี้สามารถเปลี่ยนเป็นส่วนของการชนกันโดยใช้ความสัมพันธ์ทฤษฎีจลนศาสตร์ที่กำหนดไว้อย่างดี 55 หากต้องการแมสสเปกตรัม ไอออนจะถูกส่งต่อจากกรวยไอออนไปยังเซลล์ดริฟท์อย่างต่อเนื่อง ในการทดลองที่อธิบายในที่นี้ IM-MS เซลล์ดริฟท์สองเซลล์ที่แยกจากกันถูกใช้เซลล์หนึ่งที่มีเซลล์ดริฟท์ 56 อันสั้น (5 ซม.) และอีกเซลล์หนึ่งที่มีเซลล์ที่ยาวกว่ามาก (2 ม.) 57 เครื่องมือรุ่นหลังมีความละเอียดสูงกว่ามาก และเนื่องจากการออกแบบของแหล่งกำเนิด มันจึงถ่ายเทไอออนจากหยดละอองนาโนอิเล็กโตรสเปรย์ไปยังเซลล์ดริฟท์อย่างนุ่มนวล นี่เป็นสิ่งสำคัญในการรักษาโครงสร้างที่เหมือนโซลูชันสำหรับการกำหนดแบบตัดขวาง 58�

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านและไดโครอิซึมแบบวงกลม

ภาพกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) ถ่ายที่ t = 0 และ t = 480 ชั่วโมง โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน JEOL 1200 EX ที่มีแรงดันไฟฟ้าเร่ง 80 kV สเปกตรัม dichroism แบบวงกลมถ่ายโดยใช้ Aviv circular dichroism spectrometer รุ่น 202 (Instruments Inc.) และ J-810 spectropolarimeter (JASCO, Tokyo, Japan) สำหรับการศึกษาตามระยะเวลา ขั้นตอนการทดลองโดยละเอียดได้อธิบายไว้ในรายละเอียดในส่วนข้อมูลสนับสนุน S1.3 และ S1.4


การแบ่งแยกแบบวงกลมแก้ไข

การแบ่งแยกแบบวงกลม (CD) เป็นการแบ่งแยกที่เกี่ยวข้องกับแสงโพลาไรซ์แบบวงกลม กล่าวคือ การดูดกลืนแสงที่ต่างกันของแสงที่คนถนัดซ้ายและคนถนัดขวา แสงโพลาไรซ์แบบวงกลมด้านซ้าย (LHC) และแบบโพลาไรซ์แบบวงกลมด้านขวา (RHC) แสดงถึงสถานะโมเมนตัมเชิงมุมสปินที่เป็นไปได้สำหรับโฟตอน ปรากฏการณ์นี้แสดงให้เห็นในแถบดูดกลืนของโมเลกุลไครัลที่ทำงานเชิงแสง ซีดีสเปกโทรสโกปีมีการใช้งานที่หลากหลาย ที่สะดุดตาที่สุดคือ UV CD ถูกใช้เพื่อตรวจสอบโครงสร้างรองของโปรตีน

ซีดีมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ การกระจายแบบหมุนด้วยแสง (ORD) เทคนิคและโดยทั่วไปถือว่าล้ำหน้ากว่า ซีดีวัดในหรือใกล้แถบดูดกลืนของโมเลกุลที่สนใจ ขณะที่ ORD สามารถวัดได้ไกลจากแถบเหล่านี้ ข้อดีของซีดีนั้นชัดเจนในการวิเคราะห์ข้อมูล องค์ประกอบโครงสร้างมีความโดดเด่นชัดเจนมากขึ้น เนื่องจากแถบที่บันทึกไว้ไม่ทับซ้อนกันอย่างกว้างขวางที่ความยาวคลื่นเฉพาะเช่นเดียวกับใน ORD โดยหลักการแล้ว การวัดสเปกตรัมทั้งสองนี้สามารถแปลงระหว่างกันได้ผ่านการแปลงแบบอินทิกรัล หากการดูดกลืนทั้งหมดรวมอยู่ในการวัด

หลักการทางกายภาพ แก้ไข

การแผ่รังสีแม่เหล็กไฟฟ้าประกอบด้วยสนามไฟฟ้า (E) และสนามแม่เหล็ก (B) ที่แกว่งไปมาในแนวตั้งฉากกันและกับทิศทางการแพร่กระจายคลื่นตามขวาง ในขณะที่แสงโพลาไรซ์เชิงเส้นเกิดขึ้นเมื่อเวกเตอร์สนามไฟฟ้าแกว่งในระนาบเดียว แสงโพลาไรซ์แบบวงกลมเกิดขึ้นเมื่อทิศทางของเวกเตอร์สนามไฟฟ้าหมุนรอบทิศทางการแพร่กระจายของมันในขณะที่เวกเตอร์ยังคงขนาดคงที่ ที่จุดเดียวในอวกาศ เวกเตอร์โพลาไรซ์แบบวงกลมจะติดตามวงกลมในช่วงความถี่คลื่นหนึ่งช่วง ดังนั้นชื่อจึงเป็นเช่นนั้น แผนภาพสองแผนภาพด้านล่างแสดงเวกเตอร์ไฟฟ้าของแสงโพลาไรซ์เชิงเส้นและแบบวงกลมในช่วงเวลาหนึ่งของตำแหน่ง พล็อตของเวกเตอร์ไฟฟ้าที่มีโพลาไรซ์แบบวงกลมจะก่อตัวเป็นเกลียวตามทิศทางของการแพร่กระจาย (k) สำหรับแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมด้านซ้าย (LCP) ที่มีการแพร่กระจายไปทางผู้สังเกต เวกเตอร์ไฟฟ้าจะหมุนทวนเข็มนาฬิกา สำหรับแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมด้านขวา (RCP) เวกเตอร์ไฟฟ้าจะหมุนตามเข็มนาฬิกา

เมื่อแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมผ่านตัวกลางแอคทีฟเชิงแสงที่ดูดกลืน ความเร็วระหว่างโพลาไรซ์ด้านขวาและด้านซ้ายจะแตกต่างกันไปตามความยาวคลื่นและขอบเขตที่พวกมันถูกดูดกลืน (εL≠εR) การแบ่งแยกแบบวงกลม คือผลต่าง Δε ≡ εL- εR

พูดง่ายๆ เนื่องจากแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมคือ "ไครัล" มันจึงมีปฏิกิริยากับโมเลกุลไครัลต่างกัน นั่นคือ แสงโพลาไรซ์แบบวงกลมสองประเภทจะถูกดูดกลืนในขอบเขตที่ต่างกัน ในการทดลองด้วยซีดี ปริมาณแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมด้านซ้ายและขวาของความยาวคลื่นที่เลือกเท่ากันจะถูกฉายรังสีสลับกันไปในตัวอย่าง (ไครัล) โพลาไรซ์ตัวใดตัวหนึ่งถูกดูดกลืนมากกว่าอีกขั้วหนึ่ง และความแตกต่างของการดูดกลืนที่ขึ้นกับความยาวคลื่นนี้ถูกวัด ได้สเปกตรัมซีดีของตัวอย่าง เนื่องจากปฏิสัมพันธ์กับโมเลกุล เวกเตอร์สนามไฟฟ้าของแสงจึงลากเส้นเป็นวงรีหลังจากผ่านตัวอย่าง

เป็นสิ่งสำคัญที่ chirality ของโมเลกุลสามารถกำหนดรูปแบบได้แทนที่จะเป็นโครงสร้าง ตัวอย่างเช่น โมเลกุลโปรตีนที่มีโครงสร้างทุติยภูมิเป็นเกลียวสามารถมีซีดีที่เปลี่ยนแปลงตามการเปลี่ยนแปลงของโครงสร้าง

โดยที่ ΔA คือความแตกต่างระหว่างการดูดกลืนแสงของแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมด้านซ้าย (LCP) และแสงโพลาไรซ์แบบวงกลมด้านขวา (RCP) ΔA เป็นฟังก์ชันของความยาวคลื่น ดังนั้นสำหรับการวัดที่มีความหมายต้องทราบความยาวคลื่นที่ดำเนินการ

ไดโครอิซึมแบบวงกลมกรามถูกกำหนดเป็น

โดยที่ εL และ εR เป็นค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของฟันกรามสำหรับแสง LCP และ RCP

แม้ว่าปกติแล้ว ΔA จะถูกวัด แต่ด้วยเหตุผลทางประวัติศาสตร์ การวัดส่วนใหญ่จะรายงานเป็นองศาของ รูปไข่. โมลาร์รีโมลเป็นไดโครอิซึมแบบวงกลมที่แก้ไขเพื่อความเข้มข้น ไดโครอิซึมแบบวงกลมของฟันกรามและรูปวงรีของฟันกราม [] ถูกแปลงได้อย่างง่ายดายโดยสมการ:

ในการใช้งานเชิงปฏิบัติหลายอย่างของการแบ่งแยกแบบวงกลม (CD) ซีดีที่วัดได้ไม่ได้เป็นเพียงคุณสมบัติที่แท้จริงของโมเลกุล แต่ขึ้นอยู่กับโครงสร้างของโมเลกุลด้วย ในกรณีเช่นนี้ ซีดีอาจเป็นหน้าที่ของอุณหภูมิ ความเข้มข้น และสภาพแวดล้อมทางเคมี รวมทั้งตัวทำละลาย ในกรณีนี้ ค่าซีดีที่รายงานจะต้องระบุปัจจัยที่เกี่ยวข้องอื่นๆ เหล่านี้ด้วยจึงจะมีความหมาย

การประยุกต์ใช้กับโมเลกุลชีวภาพ Edit

สเปกตรัมซีดีของโปรตีนที่มีรังสีอัลตราไวโอเลตไกล (อัลตราไวโอเลต) สามารถเปิดเผยลักษณะสำคัญของโครงสร้างทุติยภูมิได้ สเปกตรัมของซีดีสามารถนำมาใช้ในการประมาณเศษส่วนของโมเลกุลที่อยู่ในรูปแบบอัลฟา-เฮลิกส์, โครงสร้างของแผ่นเบตา, โครงสร้างแบบเบตา-เทิร์น หรือโครงแบบอื่นๆ บางส่วน (เช่น ขดลวดสุ่ม) การกำหนดแบบเศษส่วนเหล่านี้ทำให้เกิดข้อจำกัดที่สำคัญเกี่ยวกับรูปแบบทุติยภูมิที่เป็นไปได้ที่โปรตีนสามารถอยู่ได้ โดยทั่วไปแล้ว CD ไม่สามารถบอกตำแหน่งที่อัลฟาเฮลิซที่ตรวจพบนั้นอยู่ภายในโมเลกุลหรือแม้แต่ทำนายได้ทั้งหมดว่ามีกี่ตัว อย่างไรก็ตาม ซีดีเป็นเครื่องมือที่มีค่า โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการแสดงการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้าง ตัวอย่างเช่น สามารถใช้เพื่อศึกษาว่าโครงสร้างทุติยภูมิของโมเลกุลเปลี่ยนแปลงอย่างไรตามหน้าที่ของอุณหภูมิหรือความเข้มข้นของสารทำให้เสียสภาพ เช่น Guanidinium คลอไรด์หรือยูเรีย ด้วยวิธีนี้ มันสามารถเปิดเผยข้อมูลทางอุณหพลศาสตร์ที่สำคัญเกี่ยวกับโมเลกุล (เช่น พลังงานเอนทาลปีและกิ๊บส์ที่ปราศจากพลังงานของการเปลี่ยนสภาพ) ที่ไม่สามารถหามาได้โดยง่าย ใครก็ตามที่พยายามศึกษาโปรตีนจะพบว่าซีดีเป็นเครื่องมือที่มีค่าสำหรับตรวจสอบว่าโปรตีนอยู่ในรูปแบบดั้งเดิมก่อนที่จะทำการทดลองอย่างกว้างขวางและ/หรือมีราคาแพงกับโปรตีนนั้น นอกจากนี้ยังมีการใช้ CD spectroscopy ในเคมีโปรตีนอื่นๆ อีกมากมายที่ไม่เกี่ยวข้องกับการประมาณเศษส่วน alpha-helix

โปรตีนสเปกตรัมซีดีใกล้แสงยูวี (>250 นาโนเมตร) ให้ข้อมูลเกี่ยวกับโครงสร้างระดับอุดมศึกษา สัญญาณที่ได้รับในพื้นที่ 250–300 นาโนเมตรเกิดจากการดูดกลืน การวางแนวไดโพล และธรรมชาติของสภาพแวดล้อมโดยรอบของฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน ซิสเทอีน (หรือสะพานซัลไฟด์ SS) และกรดอะมิโนทริปโตเฟน สเปกตรัมซีดีใกล้ยูวีไม่สามารถกำหนดให้กับโครงสร้าง 3D ใด ๆ ได้ ต่างจาก CD ระยะไกล แต่สเปกตรัมซีดีใกล้แสงยูวีจะให้ข้อมูลเชิงโครงสร้างเกี่ยวกับธรรมชาติของกลุ่มเทียมในโปรตีน เช่น กลุ่มฮีมในเฮโมโกลบินและไซโตโครมค

สเปกโตรสโกปีซีดีที่มองเห็นได้เป็นเทคนิคที่ทรงพลังมากในการศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโลหะกับโปรตีน และสามารถแก้ไขการเปลี่ยนผ่านทางอิเล็กทรอนิกส์ d–d แต่ละรายการเป็นแถบแยก สเปกตรัมซีดีในบริเวณแสงที่มองเห็นได้ถูกสร้างขึ้นเฉพาะเมื่อไอออนของโลหะอยู่ในสภาพแวดล้อมแบบไครัล ดังนั้นจึงตรวจไม่พบไอออนของโลหะอิสระในสารละลาย มีข้อได้เปรียบในการสังเกตเฉพาะโลหะที่จับกับโปรตีน ดังนั้นจึงได้ค่า pH ที่พึ่งพาและปริมาณสารสัมพันธ์ได้ทันที

ซีดีให้ข้อมูลโครงสร้างที่เฉพาะเจาะจงน้อยกว่าผลึกเอ็กซ์เรย์และโปรตีน NMR สเปกโทรสโกปี ซึ่งทั้งคู่ให้ข้อมูลความละเอียดของอะตอม อย่างไรก็ตาม CD spectroscopy เป็นวิธีการที่รวดเร็วซึ่งไม่ต้องการโปรตีนจำนวนมากหรือการประมวลผลข้อมูลจำนวนมาก ดังนั้น ซีดีสามารถใช้ในการสำรวจสภาวะตัวทำละลายจำนวนมาก อุณหภูมิที่แตกต่างกัน ค่า pH ความเค็ม และการมีอยู่ของปัจจัยร่วมต่างๆ

ข้อจำกัดการทดลอง แก้ไข

ซีดีสเปกโตรสโคปีมักใช้ในการศึกษาโปรตีนในสารละลาย ดังนั้นจึงช่วยเสริมวิธีการที่ศึกษาสถานะของแข็ง นี่เป็นข้อจำกัดเช่นกัน เนื่องจากโปรตีนจำนวนมากถูกฝังอยู่ในเยื่อหุ้มในสภาพดั้งเดิม และสารละลายที่มีโครงสร้างเมมเบรนมักจะกระเจิงอย่างรุนแรง

การวัดค่า CD นั้นซับซ้อนเนื่องจากระบบบัฟเฟอร์ที่เป็นน้ำทั่วไปมักจะดูดซับในช่วงที่ลักษณะโครงสร้างแสดงการดูดกลืนแสงที่ต่างกันของแสงโพลาไรซ์แบบวงกลม บัฟเฟอร์ฟอสเฟต, ซัลเฟต, คาร์บอเนตและอะซิเตตโดยทั่วไปเข้ากันไม่ได้กับซีดีเว้นแต่ทำให้เจือจางอย่างมาก เช่น ในช่วง 10-50 mM ควรหลีกเลี่ยงระบบบัฟเฟอร์ Tris อย่างสมบูรณ์เมื่อทำการแสดงแผ่นซีดีที่มีรังสีอัลตราไวโอเลต สารประกอบบอเรตและโอเนียมมักใช้เพื่อสร้างช่วง pH ที่เหมาะสมสำหรับการทดลองซีดี ผู้ทดลองบางคนได้เปลี่ยนฟลูออไรด์เป็นคลอไรด์ไอออน เนื่องจากฟลูออไรด์ดูดซับแสงยูวีได้น้อยกว่า และบางส่วนก็ทำงานในน้ำบริสุทธิ์ อีกเทคนิคหนึ่งที่เกือบเป็นสากลคือการลดการดูดซึมตัวทำละลายโดยใช้เซลล์ที่มีความยาวเส้นทางสั้นกว่าเมื่อทำงานในรังสี UV ที่ห่างไกล ความยาวเส้นทาง 0.1 มม. ไม่ใช่เรื่องแปลกในงานนี้

นอกจากการวัดในระบบที่เป็นน้ำแล้ว CD โดยเฉพาะอย่างยิ่ง Far-UV CD สามารถวัดได้ในตัวทำละลายอินทรีย์เช่น เอทานอล เมทานอล หรือไตรฟลูออโรเอทานอล (TFE) อย่างหลังมีข้อได้เปรียบที่จะกระตุ้นการสร้างโครงสร้างของโปรตีน ทำให้เกิดเบตาชีตในบางส่วนและอัลฟ่าเฮลิซในบางส่วน ซึ่งจะไม่แสดงภายใต้สภาวะที่เป็นน้ำปกติ อย่างไรก็ตาม ตัวทำละลายอินทรีย์ทั่วไปส่วนใหญ่ เช่น อะซีโตไนไตรล์, THF, คลอโรฟอร์ม, ไดคลอโรมีเทน เข้ากันไม่ได้กับแผ่นซีดีที่มีรังสีอัลตราไวโอเลต

อาจเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะสังเกตว่าสเปกตรัมซีดีโปรตีนที่ใช้ในการประมาณโครงสร้างทุติยภูมิเกี่ยวข้องกับการดูดกลืนวงโคจร π ถึง π* ของพันธะเอไมด์ที่เชื่อมกับกรดอะมิโน แถบดูดกลืนเหล่านี้ส่วนหนึ่งอยู่ในรังสีอัลตราไวโอเลตสุญญากาศที่เรียกว่าสุญญากาศ (ความยาวคลื่นน้อยกว่า 200 นาโนเมตร) บริเวณความยาวคลื่นที่น่าสนใจจริง ๆ แล้วไม่สามารถเข้าถึงได้ในอากาศเนื่องจากการดูดกลืนแสงอย่างแรงโดยออกซิเจนที่ความยาวคลื่นเหล่านี้ ในทางปฏิบัติ สเปกตรัมเหล่านี้ไม่ได้วัดในสุญญากาศแต่ในเครื่องมือที่ปราศจากออกซิเจน (เติมด้วยก๊าซไนโตรเจนบริสุทธิ์)


2. ทดลอง

2.1. เครื่องมือและรีเอเจนต์

โซลูชันสต็อค 5 × 10 −3 มอลล −1 NFZ และ NFT (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA ความบริสุทธิ์ – ไม่น้อยกว่า 99.0%) ถูกเตรียมโดยการละลายผลึกของพวกมัน (9.91 × 10 −3 กรัม และ 1.19 × 10 −2 ก. ตามลำดับ) ใน 10 มล. ไดเมทิล ฟอร์มาไมด์ (DMF) บีเอสเอ (2 × 10 −3 mol L −1 ) เตรียมโดยการละลายโปรตีน 1.36 กรัม ( M = 66 kDa, ≥98%, ผงไลโอฟิไลซ์ที่ซื้อจาก Sigma-Aldrich Chemical Co. Ltd. และไม่มีการทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติม) ใน 10.0 มล. 5.0 × 10 −2 mol L −1 สารละลายโซเดียมคลอไรด์และเก็บไว้ที่ 4 °C เพื่อยืนยันความบริสุทธิ์ของ BSA ที่เตรียมไว้ ได้ทำการเจือจางเป็น 2.0 × 10 −5 มอลล −1 และค่าการดูดกลืนแสงที่วัดได้คือ (0.896) ที่ 278 นาโนเมตร เปรียบเทียบกับค่าการดูดกลืนแสง 0.667 จากค่าอ้างอิง 1.0 g L −1 (1.47 × 10 −5 mol L −1 ) บีเอสเอบริสุทธิ์ 16 สารละลายทดลองทั้งหมดถูกปรับด้วยบัฟเฟอร์ Tris–HCl ((ไฮดรอกซี เมทิล)อะมิโน มีเทน–ไฮโดรเจน คลอไรด์) เป็น pH 7.4 สารเคมีอื่นๆ ได้แก่ รีเอเจนต์ระดับวิเคราะห์ และใช้น้ำกลั่นเป็นสองเท่าตลอด

2.2. การศึกษาการดับด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์

2.3. การวัด FT-IR

2.4. การศึกษาความสัมพันธ์แบบวงกลม (CD) และการกระเจิงแสงเรโซแนนซ์ (RLS) สำหรับปฏิสัมพันธ์

2.5. การวัดด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังอะตอม (AFM)

2.6. การศึกษาเทียบท่าระดับโมเลกุล


  1. ตำแหน่งการแตกแยกของโปรฮอร์โมนคอนเวิร์เทสภายในเกลียวอัลฟาที่คาดการณ์ไว้จะเป็นสื่อกลางในการคัดแยก VGF ของเซลล์ประสาทและพอลิเปปไทด์ต่อมไร้ท่อเข้าสู่วิถีการคัดหลั่งที่มีการควบคุม
    การ์เซียและคณะ
    J.Biol.Chem., 2005280:41595
  2. การศึกษาเปรียบเทียบการจับตัวของโปรตีนโปรตีนคอนเวิร์เทสของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและความหมายสำหรับการออกแบบสารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กจำเพาะ
    Tian และ Jianhua
    Int.J.Biol.Sci., 20106:89
  3. การยับยั้งการประมวลผลที่เกี่ยวข้องกับคอนเวอร์เทสของ proendothelin-1
    Denault และคณะ
    J.Cardiovasc.Pharmacol., 199526:S47
  4. สารยับยั้ง Furin สกัดกั้นการแตกแยกของโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 เพื่อยับยั้งการผลิตไวรัสและผลต่อเซลล์
    เฉิงและคณะ
    Cell Rep., 2020

ข้อมูลอ้างอิงด้านล่างนี้เป็นสิ่งพิมพ์ที่ใช้ผลิตภัณฑ์ของ Tocris การอ้างอิงที่เลือกสำหรับ Decanoyl-RVKR-CMK รวมถึง:

6 การอ้างอิง: แสดง 1 - 6

  1. ไซต์ที่มีความแตกแยกหลายชั้นในโปรตีน Spike ของ SARS-CoV-2 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการติดเชื้อของเซลล์ปอดของมนุษย์
    ผู้เขียน: Hoffman Et al.
    โมลเซลล์ 202078:779
  2. สารยับยั้ง Furin สกัดกั้นการแตกแยกของโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 เพื่อยับยั้งการผลิตไวรัสและผลต่อเซลล์
    ผู้เขียน: Cheng Et al.
    ตัวแทนเซลล์. 202033:108254
  3. แบบจำลอง Biowire ของ Interstitial และ Focal Cardiac Fibrosis
    ผู้เขียน: Wang Et al.
    ACS Cent Sci 20195:1146
  4. โรคทางเดินหายใจตะวันออกกลาง โปรตีนเข็มจากโคโรนาไวรัสไม่ได้เปิดใช้งานโดยตรงโดย Cellular Furin ระหว่างที่ไวรัสเข้าสู่เซลล์เป้าหมาย
    ผู้เขียน: Matsuyama Et al.
    เจ ไวรอล 201892
  5. บทบาทของ interleukin-13 ในการกำจัดภาวะภูมิไวเกินรังสีโดยการฉายรังสีรองพื้น
    ผู้เขียน: เอดิน
    Am J Physiol ระบบทางเดินอาหารของตับ Physiol 201455:1066
  6. การเข้าสู่เซลล์โฮสต์ของโคโรนาไวรัสกลุ่มอาการทางเดินหายใจในตะวันออกกลางหลังจากการกระตุ้นโปรตีนขัดขวางสองขั้นตอนโดยใช้ฟิวริน
    ผู้เขียน: Millet & Whittaker
    Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 2014111:15214

ไม่มีคำถามที่พบบ่อยเฉพาะผลิตภัณฑ์สำหรับผลิตภัณฑ์นี้ อย่างไรก็ตาม คุณอาจ

รีวิวสำหรับ Decanoyl-RVKR-CMK

ขณะนี้ไม่มีความคิดเห็นสำหรับสินค้านี้ เป็นคนแรกที่วิจารณ์ Decanoyl-RVKR-CMK และรับรางวัล!


ผลลัพธ์

คำอธิบายและการวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างจุลภาคในโปรตีน Bcl2l10 ของมนุษย์

ข้อมูลโครงสร้าง-หน้าที่โดยละเอียดเป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วสำหรับโปรตีนจากไข่ในจำนวนจำกัด หมายความว่าความเข้าใจพื้นฐานของเราเกี่ยวกับตัวแสดงระดับโมเลกุลที่ขับเคลื่อนการสุกของไข่ การปฏิสนธิ และการพัฒนาก่อนการปลูกถ่ายนั้นมีข้อจำกัดอย่างมาก นอกเหนือจากการเป็นคำพูดที่เด่นชัดของมารดา Bcl-2 ( Burns et al. 2003 Hamatani et al. 2004 Arnaud et al. 2006 Gallardo et al. 2007 Guillemin et al. 2009 Yoon et al. 2009), Bcl2l10 ได้รับการวิวัฒนาการอย่างรวดเร็ว สัตว์มีกระดูกสันหลัง ( Aouacheria et al. 2001, 2005 Guillemin et al. 2009). เพื่อระบุลำดับกรดอะมิโนจำเพาะที่รับผิดชอบต่อระดับความแตกต่างสูงที่สังเกตพบในกลุ่มออร์โธโลยีนี้ ขั้นแรกเราได้สร้างการจัดตำแหน่งหลายลำดับของออร์โธล็อก Bcl2l10 จากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม นก และปลา รวมทั้งไวรัส ( รูปที่ 1) จากการเปรียบเทียบนี้ ปรากฏว่าจุดหมุนระหว่างขดลวดซึ่งอยู่ระหว่างเฮลิซ α5 และ α6 ที่คาดการณ์ไว้จะมีกรดอะมิโนเพิ่มเติมอีกหลายสิบชนิดใน Bcl2l10 ของมนุษย์ซึ่งไม่มีอยู่ในโปรตีนที่คล้ายคลึงกันจากไก่หรือปลาม้าลาย นอกจากนี้ Bcl2l10 ของมนุษย์ยังมีส่วนขยายของกรดอะมิโน 10 ที่ปลาย N ของมันเมื่อเปรียบเทียบกับลำดับออร์โธโลกัสใน NSพวกเรากล้ามเนื้อ และสัตว์มีกระดูกสันหลังที่ไม่ใช่ไพรเมตอื่นๆ ผลิตภัณฑ์ที่ทำนายโดยมนุษย์ Bcl2l10 ยีนได้รับการอธิบายว่าเป็นโปรตีนชนิดยาว 194- ( Aouacheria et al. 2001) หรือ 204-amino acid long protein ( Ke et al. 2001 Zhang et al. 2001) ขึ้นอยู่กับการขาดหรือมีส่วนขยายนี้ ภูมิภาคแรกเรียกว่า LAAS (สำหรับ L ong A mino A cid S tretch ในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้า ( Zhang et al. 2001)) และโดยการเปรียบเทียบ เราตัดสินใจตั้งชื่อ SAAS ที่สอง (สำหรับ S hort A mino A cid S ถอย)

การจัดตำแหน่งหลายลำดับของโปรตีน Bcl2l10 แบบออร์โธโลกัส เจ็ดชนิดที่ใช้มีดังนี้: โฮโมเซเปียนส์ (NP_065129), กล้ามเนื้อ (Q9Z0F3), ถุงน้ำดี (Q90ZN1), Coturnix coturnix (CAA59136), Meleagrid เริมไวรัส 1 (AAG30102), ดานิโอ เรริโอ (NP_919379) และ Gadus morhua (ACZ62638). The conserved BH1–BH4 motifs and the C-terminal transmembrane (TM) domain are indicated above the alignment. The SAAS and LAAS motifs are boxed. The locations of the predicted pore-forming α5 and α6 helices are indicated above the sequence of human Bcl2l10. The presence of a 22-kDa polypeptide corresponding to the form shown in the figure was previously confirmed by western blot analysis of human ovary extracts ( Guillemin et al. 2009).

Multiple sequence alignment of orthologous Bcl2l10 proteins. The seven species used were as follows: Homo sapiens (NP_065129), Mus musculus (Q9Z0F3), Gallus gallus (Q90ZN1), Coturnix coturnix (CAA59136), Meleagrid herpesvirus 1 (AAG30102), Danio rerio (NP_919379), and Gadus morhua (ACZ62638). The conserved BH1–BH4 motifs and the C-terminal transmembrane (TM) domain are indicated above the alignment. The SAAS and LAAS motifs are boxed. The locations of the predicted pore-forming α5 and α6 helices are indicated above the sequence of human Bcl2l10. The presence of a 22-kDa polypeptide corresponding to the form shown in the figure was previously confirmed by western blot analysis of human ovary extracts ( Guillemin et al. 2009).

As a first step in deciphering the evolutionary mechanisms for the appearance of these regions, we have compiled and aligned Bcl2l10 amino acid sequences obtained from publicly available databases ( Blaineau and Aouacheria 2009) or cloned by PCR using genomic DNA from different species, followed by sequencing.

On the one hand, we found that the SAAS region was present in great apes (humans, gorillas, chimps, and orangutans) and absent in gibbons and other monkeys (baboons, macaques, and lemurs) ( fig. 2A) as well as other vertebrates ( supplementary fig. S1 , Supplementary Material online), suggesting that the event giving rise to this N-terminal extension occurred after the Old World monkey–hominoid split and after separation of the lesser apes from the other anthropoid lineages ∼14 to 18 Ma ( Goodman et al. 2005). After careful inspection of the nucleotide alignment ( fig. 2B), it was determined that in anthropoid primates Bcl2l10 contains an internal tandem duplication in which the upstream 30 base pairs are repeated and results in the addition of ten amino acids to the N-terminus (corresponding to the SAAS segment).

Sequence and evolutionary analysis of the SAAS motif of Bcl2l10. (NS) Amino acid sequence alignment of the N-terminal region of Bcl2l10 from 11 primates. Right: Schematic phylogeny of the primate species used in the present study (adapted from Goodman et al. 2009). The Bcl2l10 protein found in anthropoid primates (anthropoids) has an extension of ten amino acids in the N-terminal side compared with other primates (others). Arrows denote the first in-frame methionine in each group. (NS) Alignment of nucleotide sequences determined for the N-terminal region of primate Bcl2l10. The two tandem duplication units (shown in brackets) are bordered on each side by an “ACC” triplet (dotted lines). Possible tandem duplication history (repeat/ancestral) is indicated above the alignment. Arrows denote the start codon ATG found in Bcl2l10 from anthropoids versus other primates. Species abbreviations refer to full names given in (NS). Sequences for Homo sapiens, Pan troglodytes, Pongo pygmaeus, Macaca mulatta, Tarsius syrichta, และ Otolemur garnettii were from Ensembl (respective accession numbers: ENSG00000137875, ENSPTRG00000007083, ENSPPYG00000006483, ENSMMUG00000017372, ENSTSYG00000013586, and ENSOGAG00000008687). Sequences for Gorilla gorilla, Callithrix jacchus, Nomascus leucogenys, Papio anubis, และ Chlorocebus aethiops were deduced from cloned partial ORFs (see Materials and Methods). () Alignments of nucleotide (left) and amino acid (inset) sequence repeats found in human Bcl2l10.

Sequence and evolutionary analysis of the SAAS motif of Bcl2l10. (NS) Amino acid sequence alignment of the N-terminal region of Bcl2l10 from 11 primates. Right: Schematic phylogeny of the primate species used in the present study (adapted from Goodman et al. 2009). The Bcl2l10 protein found in anthropoid primates (anthropoids) has an extension of ten amino acids in the N-terminal side compared with other primates (others). Arrows denote the first in-frame methionine in each group. (NS) Alignment of nucleotide sequences determined for the N-terminal region of primate Bcl2l10. The two tandem duplication units (shown in brackets) are bordered on each side by an “ACC” triplet (dotted lines). Possible tandem duplication history (repeat/ancestral) is indicated above the alignment. Arrows denote the start codon ATG found in Bcl2l10 from anthropoids versus other primates. Species abbreviations refer to full names given in (NS). Sequences for Homo sapiens, Pan troglodytes, Pongo pygmaeus, Macaca mulatta, Tarsius syrichta, และ Otolemur garnettii were from Ensembl (respective accession numbers: ENSG00000137875, ENSPTRG00000007083, ENSPPYG00000006483, ENSMMUG00000017372, ENSTSYG00000013586, and ENSOGAG00000008687). Sequences for Gorilla gorilla, Callithrix jacchus, Nomascus leucogenys, Papio anubis, และ Chlorocebus aethiops were deduced from cloned partial ORFs (see Materials and Methods). () Alignments of nucleotide (left) and amino acid (inset) sequence repeats found in human Bcl2l10.

On the other hand, the α5–α6 interhelical region of Bcl2l10 exhibits variability both in sequence and in length across vertebrate species ( fig. 3A and B). Indeed, the Bcl2l10 protein found in primates, Felis catus and euteleostean fishes, has a long α5–α6 linker, whereas most orthologous proteins present in the other lineages have a shorter interhelical region with unrelated amino acids. Such hypervariability in the LAAS region likely reflects complex patterns of mutation and selection, which perhaps took place after an initial insertion event in the early evolution of the bcl2l10 gene (most probably at the time vertebrates diverged from invertebrates, i.e., when most paralogous genes within the Bcl-2 family were formed— Aouacheria et al. 2005).

The α5–α6 interhelical region of Bcl2l10 has variability in length and in sequence across vertebrate species. (NS) Length of the α5–α6 linker of Bcl2l10 in various vertebrates. All sequences were extracted from Ensembl database (version 58). Proposed phylogeny was adapted from Milinkovitch et al. (2010). Ma, million years ago. (NS) Multiple sequence alignment of the region located between the predicted α5 and α6 helices of Bcl2l10. Species abbreviations refer to full names given in (NS). The α5–α6 connecting region of Bcl2l10 (named LAAS in the human protein) is highly variable in amino acid sequence between vertebrate species. The difficulty in validly identifying short homologous sequences renders the calculation of an evolutionary rate unreliable. The functionally important aspartate (NS) and glutamate (อี) residues involved in calcium binding by human Bcl2l10 are marked with asterisks. The locations of the predicted pore-forming α5 and α6 helices are indicated. The LAAS, LAAS*, BCL2L10-α6L, and BCL2L10-α6S peptides used in this study are schematized above the alignment.

The α5–α6 interhelical region of Bcl2l10 has variability in length and in sequence across vertebrate species. (NS) Length of the α5–α6 linker of Bcl2l10 in various vertebrates. All sequences were extracted from Ensembl database (version 58). Proposed phylogeny was adapted from Milinkovitch et al. (2010). Ma, million years ago. (NS) Multiple sequence alignment of the region located between the predicted α5 and α6 helices of Bcl2l10. Species abbreviations refer to full names given in (NS). The α5–α6 connecting region of Bcl2l10 (named LAAS in the human protein) is highly variable in amino acid sequence between vertebrate species. The difficulty in validly identifying short homologous sequences renders the calculation of an evolutionary rate unreliable. The functionally important aspartate (NS) and glutamate (อี) residues involved in calcium binding by human Bcl2l10 are marked with asterisks. The locations of the predicted pore-forming α5 and α6 helices are indicated. The LAAS, LAAS*, BCL2L10-α6L, and BCL2L10-α6S peptides used in this study are schematized above the alignment.

Bcl2l10 Microstructural Changes Distinctly Impact Cellular Function Toward Apoptosis Regulation

At the structural level, neither the SAAS, at the N-terminus, nor the LAAS additional residues, located between two elements of secondary structure (5th and 6th helices), are expected to modify the global protein fold (see model in fig. 4), as such regions are known to be quite permissive with regards to indels. However, secondary structure predictions using the [email protected] server ( Combet et al. 2000) suggest the possibility of some subtle structural changes ( supplementary fig. S2 , Supplementary Material online). Because the actual structure of membrane-bound or complexed human Bcl2l10 is unknown, making any structural or mechanistic predictions difficult, we sought to identify specific residues in the SAAS and LAAS sequences that may have functional importance. We first asked whether deletion of the SAAS and LAAS regions could impact human Bcl2l10 protein function in apoptosis regulation. For this purpose, recombinant Bcl2l10 constructs harboring a deletion of the first ten amino acids (Nrh, Aouacheria et al. 2001) or missing the segment from amino acids 118 to 133 ( fig. 5A) were assayed by scoring either condensed Hoescht-stained nuclei ( fig. 5B) or Annexin V-positive HeLa cells ( fig. 5C) after treatment with classical apoptosis inducing agents such as thapsigargin or staurosporin. While Bcl2l10 mutants lacking the N-terminal ten amino acids (Δ1–10) retained prosurvival activity at a similar level to the full-length protein ( fig. 5B and C), the mutant lacking the LAAS region lost most of its antiapoptotic ability, irrespective of whether apoptosis is triggered by thapsigargin ( fig. 5C) or by other cell death inducers such as taxol, staurosporin, and tunicamycin (not shown). Although this latter mutant (Δ118–133) did not show reduced mitochondrial localization ( fig. 6), cells expressing pEGFPC1-Bcl2l10Δ118–133 frequently had aggregated GFP fluorescence in the cytoplasm, which may be indicative of structural defects. A more detailed mutational analysis was conducted using Bcl2l10 mutants that included deletions of residues 117–129 and 129–133. As shown in figure 6B, the mutant (▵129–133) deleted for residues 129–133, but not the one lacking amino acids 117–129 (Δ117–129), was deficient in antiapoptotic activity. Furthermore, point mutations involving the negatively charged residues located in this region (E129, E131, D133), or in its close vicinity (D137), decreased the prosurvival effect of human Bcl2l10 ( fig. 5C). Subcellular distribution of the wild-type Bcl2l10 protein and of these mutants fused to GFP was virtually identical ( fig. 6A and not shown). The staining pattern shows a partially diffuse and partially mitochondrial and perinuclear localization consistent with previously published in vitro ( Aouacheria et al. 2001 Ke et al. 2001 Zhang et al. 2001) and in vivo ( Guillemin et al. 2009) results. Taken together, these results reveal that the LAAS region contains a cluster of acidic amino acids that are important for human Bcl2l10 function.

Homology-driven model of human Bcl2l10. The human Bcl2l10 protein (NS) has been modeled using M4T ( Fernandez-Fuentes et al. 2007) on the known 3D solution structure of mouse Diva/Boo (NS) (pdb code: 2kua, Rautureau et al. 2010). The positions of α5–α6 helices are indicated and BH domains are colored as follows: BH1, orange BH2, purple BH3, yellow BH4, red. Presence of the SAAS region is predicted to extend the BH4-containing first helix (NS). In the structural model of human Bcl2l10 (NS), a potential calcium-binding domain is localized in the α5–α6 interhelical loop (in cyan) that protrudes from the surface of the more tightly packed portion of the Bcl-2-like globular fold. The negatively charged Asp/Glu residues expected to be involved in calcium binding are colored in deep blue, with side chains shown as sticks and residue numbers indicated. Proposed structure of the SAAS (in green) is consistent with a disordered N-terminal tail. For the published molecular conformation of the mouse Diva/Boo protein (NS), the first five residues (GPLGS) were deleted from the original PDB file. Despite the absence of SAAS motif, the N-terminus also appears unstructured and solvent exposed. The interhelical α5–α6 linker is colored cyan.

Homology-driven model of human Bcl2l10. The human Bcl2l10 protein (NS) has been modeled using M4T ( Fernandez-Fuentes et al. 2007) on the known 3D solution structure of mouse Diva/Boo (NS) (pdb code: 2kua, Rautureau et al. 2010). The positions of α5–α6 helices are indicated and BH domains are colored as follows: BH1, orange BH2, purple BH3, yellow BH4, red. Presence of the SAAS region is predicted to extend the BH4-containing first helix (NS). In the structural model of human Bcl2l10 (NS), a potential calcium-binding domain is localized in the α5–α6 interhelical loop (in cyan) that protrudes from the surface of the more tightly packed portion of the Bcl-2-like globular fold. The negatively charged Asp/Glu residues expected to be involved in calcium binding are colored in deep blue, with side chains shown as sticks and residue numbers indicated. Proposed structure of the SAAS (in green) is consistent with a disordered N-terminal tail. For the published molecular conformation of the mouse Diva/Boo protein (NS), the first five residues (GPLGS) were deleted from the original PDB file. Despite the absence of SAAS motif, the N-terminus also appears unstructured and solvent exposed. The interhelical α5–α6 linker is colored cyan.

Functional evaluation of mutant Bcl2l10 proteins. (NS) Schematic representation and expression of the recombinant Bcl2l10 constructs in which deletions or point mutations were introduced. The various Flag- or GFP-tagged fusion proteins are depicted. Western Blot analyses were performed 24-h posttransfection on transiently transfected HeLa cells. Proteins were separated by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblot with anti-Flag or anti-GFP antibody. Nitrocellulose membranes were rehybridized with anti-α-vinculin antibody. Bottom: quantification for relative band intensities of Flag- or GFP-tagged products to vinculin. Quantifications were carried out by densitometric analysis using the Kodak EDA 290 Digital Imaging System and 1D Software Package. (NS) Cell death was determined 24-h posttransfection by analyzing anti-Flag immunoreactive HeLa cells (∼250 cells in each experiment) under a fluorescence microscope. Data were compiled from three different fields. Cells were left untreated (−) or were treated for 24 h with dimethyl sulfoxide (control), etoposide (ETO, 10 μM), staurosporin (STS, 1 μM), or thapsigargin (THAP, 10 μM). The mode of cell death, necrosis versus apoptosis, was determined by the cellular permeability to propidium iodide (necrosis) and the morphology of the nuclei after staining with Hoechst 33342 (apoptosis). Propidium iodide–negative cell with condensed or fragmented nuclei were counted as apoptotic. Data are represented as mean ± standard deviation (SD). Results represent the means from three independent experiments. () FACS assays of Annexin V staining in HeLa cells transfected with the mutant constructs. Transfected cells were stained for phosphatidylserine exposure 24 h after transfection using Cy3-conjugated Annexin V, and the percentage of apoptotic GFP-expressing cells was determined by FACS. Cells were left untreated (−) or were treated with thapsigargin (10 μM, 24 h). GFP-NRZ and GFP-BFL-1 were used for comparison. Assays were performed in triplicate. Cell death levels are expressed as mean ± SD. *Significant to Δ129–133 NS < 0.05. Treatment with taxol, tunicamycin, or staurosporin yielded similar results (not shown).

Functional evaluation of mutant Bcl2l10 proteins. (NS) Schematic representation and expression of the recombinant Bcl2l10 constructs in which deletions or point mutations were introduced. The various Flag- or GFP-tagged fusion proteins are depicted. Western Blot analyses were performed 24-h posttransfection on transiently transfected HeLa cells. Proteins were separated by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblot with anti-Flag or anti-GFP antibody. Nitrocellulose membranes were rehybridized with anti-α-vinculin antibody. Bottom: quantification for relative band intensities of Flag- or GFP-tagged products to vinculin. Quantifications were carried out by densitometric analysis using the Kodak EDA 290 Digital Imaging System and 1D Software Package. (NS) Cell death was determined 24-h posttransfection by analyzing anti-Flag immunoreactive HeLa cells (∼250 cells in each experiment) under a fluorescence microscope. Data were compiled from three different fields. Cells were left untreated (−) or were treated for 24 h with dimethyl sulfoxide (control), etoposide (ETO, 10 μM), staurosporin (STS, 1 μM), or thapsigargin (THAP, 10 μM). The mode of cell death, necrosis versus apoptosis, was determined by the cellular permeability to propidium iodide (necrosis) and the morphology of the nuclei after staining with Hoechst 33342 (apoptosis). Propidium iodide–negative cell with condensed or fragmented nuclei were counted as apoptotic. Data are represented as mean ± standard deviation (SD). Results represent the means from three independent experiments. () FACS assays of Annexin V staining in HeLa cells transfected with the mutant constructs. Transfected cells were stained for phosphatidylserine exposure 24 h after transfection using Cy3-conjugated Annexin V, and the percentage of apoptotic GFP-expressing cells was determined by FACS. Cells were left untreated (−) or were treated with thapsigargin (10 μM, 24 h). GFP-NRZ and GFP-BFL-1 were used for comparison. Assays were performed in triplicate. Cell death levels are expressed as mean ± SD. *Significant to Δ129–133 NS < 0.05. Treatment with taxol, tunicamycin, or staurosporin yielded similar results (not shown).

Subcellular localization of wild-type and mutant Bcl2l10 proteins. HeLa cells were cotransfected with mito-DsRed plasmid (encoding DsRed2 fused to the mitochondrial targeting sequence from subunit VIII of human cytochrome c oxidase) and the Flag- or GFP-tagged constructs. Subcellular distribution was analyzed by confocal microscopy 24 h after transfection. DNA dye Topro-3 (blue) was used to visualize nuclei. In merge images (overlay), yellow color shows the colocalization of GFP or Flag fluorescence (green) with mitochondria (red).

Subcellular localization of wild-type and mutant Bcl2l10 proteins. HeLa cells were cotransfected with mito-DsRed plasmid (encoding DsRed2 fused to the mitochondrial targeting sequence from subunit VIII of human cytochrome c oxidase) and the Flag- or GFP-tagged constructs. Subcellular distribution was analyzed by confocal microscopy 24 h after transfection. DNA dye Topro-3 (blue) was used to visualize nuclei. In merge images (overlay), yellow color shows the colocalization of GFP or Flag fluorescence (green) with mitochondria (red).

Interestingly, these negative residues, which are not predicted to be part of the BH3-binding hydrophobic groove of Bcl2l10 ( fig. 4), appear to be strictly conserved in primates ( fig. 3B), whereas being absent (except D137) in other mammals. Given the phyletic distribution of these Asp/Glu residues, we reasoned that positive selection should have operated on the interhelical region to drive their acquisition at the base of the primate lineage, before they became fixed by purifying selection. In order to determine if the negative charge at these positions was involved in conferring some biochemical peculiarity to human Bcl2l10, that is, a favorable characteristic that could be selected for, we carried out extensive similarity searches and sequence motif analysis. We detected that the acidic region EQEGDVARD was bearing resemblance to reported calcium-binding sequences ( Chattopadhyaya et al. 1992 Siedlecka et al. 1999 Shashoua et al. 2003, 2004), and it was thus hypothesized that these residues could be involved in calcium chelation.

Human Bcl2l10 Has Evolved a Novel Calcium-Binding Site

To test the hypothesis that human Bcl2l10 binds to Ca 2+ , standard dot blot 45 Ca–overlay assays were performed. Radiolabeled Ca 2+ was not bound by GST or BSA, was bound robustly by the established Ca 2+ -binding protein calreticulin, and was reproducibly bound by GST-Bcl2l10 ( fig. 7, left, middle, and right panels). Moreover, using the same system, we demonstrated that Nrz-His6 and GST-Nr-13, which are Bcl2l10 orthologous proteins devoid of the LAAS region, were not able to bind 45 Ca 2+ ( fig. 7, left panel). To map the region responsible for the calcium-binding activity of human Bcl2l10, we constructed two mutant genes: a first with an internal deletion whose product was missing the region from residues 118 to 133 and a second encoding amino acid substitutions of selected negatively charged residues in this region (E 131 R/D 133 N). The mutant GST-Bcl2l10 proteins where the LAAS region was deleted (GST-Bcl2l10Δ118–133) or mutated (GST-Bcl2l10[E 131 R/D 133 N]) were successfully produced and purified. Full-length GST-Bcl2l10 and calreticulin, but not GST-BCl2l10Δ118–133 ( fig. 7, left panel) nor GST-Bcl2l10[E 131 R/D 133 N] ( fig. 7, middle panel), bound 45 Ca 2+ . Moreover, while Ca 2+ -binding was detectable for a 26-mer peptide corresponding to the “wild-type” LAAS region of human Bcl2l10 (residues from 115 to 140), a peptide (LAAS*) having the identical point mutations E 131 R/D 133 N, or a control peptide (Bax-BH3) of similar length and containing more Asp and Glu residues (20.6% vs. 15.4% for the LAAS), did not bind Ca 2+ ( fig. 7, middle panel). From this, it is possible to conclude that residues within the LAAS region are crucial for Bcl2l10 binding to Ca 2+ . Moreover, the negatively charged residues important for Bcl2l10 protective activity appear to be required for calcium binding in vitro.

Recombinant Bcl2l10 protein and LAAS peptide bind calcium-45 in vitro. The left and middle panels represent the autoradiographs showing calcium-45 binding and the Ponceau-S-stained blots as sample loading controls. Right panel: Calcium binding was quantified by densitometric analysis followed by normalization based on Ponceau-S staining. Representative data from three individual experiments are presented. Relative binding is indicated (arbitrary units). The indicated polypeptides were directly transferred to nitrocellulose membranes, which were in turn incubated with 45 Ca 2+ , washed, and exposed to film for autoradiography. Approximately 30 μg of recombinant purified GST-wild-type Bcl2l10, GST-Nr-13, Nrz-His6, GST-Bcl2l10Δ118–133, and GST-Bcl2l10[E 131 R/D 133 N] proteins were used along with GST, BSA, and calreticulin (a known calcium-binding protein) as controls. The calcium-45 overlay dot blots were also performed with a synthetic peptide (LAAS) derived from the hypervariable loop of human Bcl2l10, a mutated peptide (LAAS*) incorporating the double amino acid substitution E 131 R/D 133 N, and a peptide that contains the BH3 domain of Bax (BAX-BH3). As expected, the positive control calreticulin (CALR) strongly bound calcium, whereas BSA did not (left and middle panels). The GST-human Bcl2l10 fusion protein reproducibly bound calcium in vitro (left, middle, and left panels), whereas the GST-Bcl2l10Δ118–133 and GST-Bcl2l10[E 131 R/D 133 N] mutant proteins, as well as the homologous chicken GST-Nr-13 and zebrafish Nrz-His6 proteins, which are Bcl2l10 orthologous proteins devoid of LAAS region, did not. Contrary to the BAX-BH3 control peptide, which was defective in calcium binding (middle panel), the LAAS peptide displayed calcium-binding activity (left panel). Amino acid substitutions E 131 R/D 133 N (LAAS*) abolished calcium-binding capacity of this peptide (middle panel).

Recombinant Bcl2l10 protein and LAAS peptide bind calcium-45 in vitro. The left and middle panels represent the autoradiographs showing calcium-45 binding and the Ponceau-S-stained blots as sample loading controls. Right panel: Calcium binding was quantified by densitometric analysis followed by normalization based on Ponceau-S staining. Representative data from three individual experiments are presented. Relative binding is indicated (arbitrary units). The indicated polypeptides were directly transferred to nitrocellulose membranes, which were in turn incubated with 45 Ca 2+ , washed, and exposed to film for autoradiography. Approximately 30 μg of recombinant purified GST-wild-type Bcl2l10, GST-Nr-13, Nrz-His6, GST-Bcl2l10Δ118–133, and GST-Bcl2l10[E 131 R/D 133 N] proteins were used along with GST, BSA, and calreticulin (a known calcium-binding protein) as controls. The calcium-45 overlay dot blots were also performed with a synthetic peptide (LAAS) derived from the hypervariable loop of human Bcl2l10, a mutated peptide (LAAS*) incorporating the double amino acid substitution E 131 R/D 133 N, and a peptide that contains the BH3 domain of Bax (BAX-BH3). As expected, the positive control calreticulin (CALR) strongly bound calcium, whereas BSA did not (left and middle panels). The GST-human Bcl2l10 fusion protein reproducibly bound calcium in vitro (left, middle, and left panels), whereas the GST-Bcl2l10Δ118–133 and GST-Bcl2l10[E 131 R/D 133 N] mutant proteins, as well as the homologous chicken GST-Nr-13 and zebrafish Nrz-His6 proteins, which are Bcl2l10 orthologous proteins devoid of LAAS region, did not. Contrary to the BAX-BH3 control peptide, which was defective in calcium binding (middle panel), the LAAS peptide displayed calcium-binding activity (left panel). Amino acid substitutions E 131 R/D 133 N (LAAS*) abolished calcium-binding capacity of this peptide (middle panel).

Last, we asked whether a peptide corresponding to helix α6 of human Bcl2l10, and which extends a few residues beyond the predicted helical region to incorporate the putative calcium-binding residues, could change its secondary structure in the presence of Ca 2+ . Our CD spectra ( fig. 8A–E) indicate that the folding of this peptide is limited in buffer (small negative shoulder around 220 nm, fig. 8A), and the large negative band around 202 nm indicates a predominance of unfolding. The large intensity decrease of this band upon addition of Ca 2+ indicates some increase of folding. As expected for helix α6, in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) or trifluoroethanol (TFE) used to probe the conformational preferences of peptides ( Buck 1998 Montserret et al. 2000), the CD spectra were typical of α-helical folding with two minima at 208 and 222 nm ( fig. 8A and B). Addition of Ca 2+ , but not Mg 2+ ( fig. 8D), caused an increase in α-helical content of about one helix turn in the presence of SDS ( fig. 8A) or 50% TFE ( fig. 8B) at physiological pH. In contrast, calcium had no effect at acidic pH (where Asp/Glu residues are expected to be protonated and uncharged) ( fig. 8A) or on a truncated peptide (α6S) lacking the Asp/Glu residues located at the C-terminal end of the LAAS region ( fig. 8E). In addition, intrinsic tryptophan fluorescence of this BCL2L10-α6L peptide was quenched by calcium ions (see supplementary fig. S3 , Supplementary Material online). Thus, a peptide containing the negatively charged residues of the α5–α6 connecting region is structurally responsive to the presence of calcium ions. Moreover, these findings suggest that calcium could induce or stabilize the structure of this BCL2L10 region.

Circular dichroism analysis of a peptide corresponding to helix α6 of Bcl2l10 as a function of TFE and calcium concentration. The conformation in solution of a peptide corresponding to the α6 helix of human Bcl2l10 (BCL2L10-α6L: RLKEQEGDVARDGQRLVALLSSRLMGQHRAWLQA, amino acids 126–159) and comprising the potential calcium-binding residues and of a truncated peptide variant lacking this site (BCL2L10-α6S: RDGQRLVALLSSRLMGQHRAWLQA, amino acids 136–159) was determined by CD spectroscopy. (NS) Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6L in the presence or absence of Ca 2+ and in the membrane-mimicking solvent SDS, at neutral or acidic pH. (NS) Effect of calcium ion on the CD spectra. Addition of saturating amounts of CaCl2 enhances helicity of the BCL2L10-α6L peptide in 50% (v/v) TFE. () Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6L in different concentrations of TFE. The addition of TFE increases the α-helicity of the peptide, reaching a plateau at ∼40% TFE. (NS) Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6L in presence of excess amounts of CaCl2 or MgCl2. The α-helicity of the peptide increases by more than 10% in the presence of Ca 2+ (but not Mg 2+ ). (อี) Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6S in presence of excess amounts of CaCl2. Estimated α-helicity of BCL2L10-α6S does not vary in presence of excess amounts of CaCl2.

Circular dichroism analysis of a peptide corresponding to helix α6 of Bcl2l10 as a function of TFE and calcium concentration. The conformation in solution of a peptide corresponding to the α6 helix of human Bcl2l10 (BCL2L10-α6L: RLKEQEGDVARDGQRLVALLSSRLMGQHRAWLQA, amino acids 126–159) and comprising the potential calcium-binding residues and of a truncated peptide variant lacking this site (BCL2L10-α6S: RDGQRLVALLSSRLMGQHRAWLQA, amino acids 136–159) was determined by CD spectroscopy. (NS) Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6L in the presence or absence of Ca 2+ and in the membrane-mimicking solvent SDS, at neutral or acidic pH. (NS) Effect of calcium ion on the CD spectra. Addition of saturating amounts of CaCl2 enhances helicity of the BCL2L10-α6L peptide in 50% (v/v) TFE. () Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6L in different concentrations of TFE. The addition of TFE increases the α-helicity of the peptide, reaching a plateau at ∼40% TFE. (NS) Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6L in presence of excess amounts of CaCl2 or MgCl2. The α-helicity of the peptide increases by more than 10% in the presence of Ca 2+ (but not Mg 2+ ). (อี) Percent of estimated α-helicity of BCL2L10-α6S in presence of excess amounts of CaCl2. Estimated α-helicity of BCL2L10-α6S does not vary in presence of excess amounts of CaCl2.


Acceleration of protein glycation by oxidative stress and comparative role of antioxidant and protein glycation inhibitor

Hyperglycemia in diabetes causes protein glycation that leads to oxidative stress, release of cytokines, and establishment of secondary complications such as neuropathy, retinopathy, and nephropathy. Several other metabolic disorders, stress, and inflammation generate free radicals and oxidative stress. It is essential to study whether oxidative stress independently enhances protein glycation leading to rapid establishment of secondary complications. Oxidative stress was experimentally induced using rotenone and Fenton reagent for in vivo and in vitro studies, respectively. Results showed significant increase in the rate of modification of BSA in the form of fructosamine and protein-bound carbonyls in the presence of fenton reagent. Circular dichroism studies revealed gross structural changes in the reduction of alpha helix structure and decreased protein surface charge was confirmed by zeta potential studies. Use of rotenone demonstrated enhanced AGE formation, ROS generation, and liver and kidney tissue glycation through fluorescence measurement. Similar findings were also observed in cell culture studies. Use of aminoguanidine, a protein glycation inhibitor, demonstrated reduction in these changes however, a combination of aminoguanidine along with vitamin E demonstrated better amelioration. Thus, oxidative stress accelerates the process of protein glycation causing gross structural changes and tissue glycation in insulin-independent tissues. Use of antioxidants and protein glycation inhibitors in combination are more effective in preventing such changes and could be an effective therapeutic option for preventing establishment of secondary complications of diabetes.

นี่คือตัวอย่างเนื้อหาการสมัครสมาชิก เข้าถึงผ่านสถาบันของคุณ


ดูวิดีโอ: БИЗНЕС-ПЛАН МЕДИЦИНСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ (สิงหาคม 2022).