ข้อมูล

3 ไพรเมอร์ที่ต้องรู้ว่า Homozygous, Heterozygous หรือ WT

3 ไพรเมอร์ที่ต้องรู้ว่า Homozygous, Heterozygous หรือ WT



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ในการทดลองในจินตนาการนี้ ฉันกำลังใช้ T-DNA เพื่อสร้างการกลายพันธุ์แบบสอดแทรกซึ่งจะถูกสุ่มแทรกเข้าไปใน DNA ที่ซึ่งมันอาจถูกแทรกเข้าไปในยีน และขัดขวางมัน

เพื่อให้ได้บุคคลที่เป็นโฮโมไซกัส ถ้าฉันทำงานเกี่ยวกับพืช ฉันสามารถผสมเกสรพืชเฉพาะนี้เองที่มียีนนี้รบกวนการสร้างลูกหลานที่เป็นโฮโมไซกัสได้

เพื่อพิสูจน์ว่าฉันสามารถทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ 3 ตัว

คำถามคือ ทำไมต้อง 3 ไพรเมอร์? ฉันจะใช้ไพรเมอร์ 4 ตัว! ฉันได้ค้นคว้าและพยายามทำความเข้าใจด้วยตนเองมาระยะหนึ่งแล้ว แต่ฉันไม่พบข้อสรุปในเชิงบวกใดๆ ฉันคิดว่ามันควรจะเป็นพื้นฐานสวยและฉันขาดอะไรบางอย่าง

ฉันคิดว่าฉันต้องการไพรเมอร์เดินหน้าและถอยหลังสำหรับ T-DNA แต่ไพรเมอร์ตัวที่ 3 ล่ะ? ถ้าฉันใช้ไพรเมอร์สองตัวนี้เท่านั้น ฉันก็จะไม่สามารถแยกแยะระหว่างโฮโมไซกัสและเฮเทอโรไซกัสได้

ขอบคุณ!


ยีนน็อคเอาท์

NS ยีนที่น่าพิศวง (ตัวย่อ: KO) เป็นเทคนิคทางพันธุกรรมที่ทำให้ยีนของสิ่งมีชีวิตตัวใดตัวหนึ่งไม่ทำงาน ("ถูกกำจัด" ของสิ่งมีชีวิต) อย่างไรก็ตาม KO ยังสามารถอ้างถึงยีนที่ถูกทำให้ล้มลงหรือสิ่งมีชีวิตที่มียีนที่น่าพิศวง สิ่งมีชีวิตที่น่าพิศวง หรือง่ายๆ น็อคเอาท์ ใช้เพื่อศึกษาการทำงานของยีน โดยปกติแล้วจะศึกษาผลของการสูญเสียยีน นักวิจัยทำการอนุมานจากความแตกต่างระหว่างสิ่งมีชีวิตที่น่าพิศวงกับบุคคลปกติ

เทคนิค KO นั้นตรงกันข้ามกับการทำยีนแบบน็อคอิน การทำลายยีนสองตัวพร้อมกันในร่างกายเรียกว่า a น็อคเอาท์คู่ (DKO). ในทำนองเดียวกันเงื่อนไข น็อคเอาท์สามตัว (TKO) และ น็อคเอาท์สี่เท่า (QKO) ใช้เพื่ออธิบายยีนที่ถูกเคาะออกสามหรือสี่ยีนตามลำดับ อย่างไรก็ตาม เราจำเป็นต้องแยกความแตกต่างระหว่าง KO แบบเฮเทอโรไซกัสและโฮโมไซกัส ในอดีตมีเพียงหนึ่งในสองสำเนาของยีน (อัลลีล) ที่ถูกเคาะออก ในระยะหลังทั้งคู่จะถูกทำให้ล้มลง


การวิเคราะห์เฮเทอโรไซกัสแบบมีเงื่อนไข STXBP1 การกลายพันธุ์ในเซลล์ประสาทของมนุษย์

3 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, สแตนฟอร์ด, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา

ติดต่อกับ: Christopher Patzke, Stanford University School of Medicine, 265 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA โทรศัพท์: 650.724.5264 อีเมล: [email protected]

หมายเหตุผู้แต่ง: Christopher Patzke และ Yan Han มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

1 ภาควิชาสรีรวิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์

2 สถาบันสเต็มเซลล์ชีววิทยาและเวชศาสตร์ฟื้นฟูและภาควิชาพยาธิวิทยา และ

3 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, สแตนฟอร์ด, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา

ติดต่อกับ: Christopher Patzke, Stanford University School of Medicine, 265 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA โทรศัพท์: 650.724.5264 อีเมล: [email protected]

หมายเหตุผู้แต่ง: Christopher Patzke และ Yan Han มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

1 ภาควิชาสรีรวิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์

2 สถาบันสเต็มเซลล์ชีววิทยาและเวชศาสตร์ฟื้นฟูและภาควิชาพยาธิวิทยา และ

3 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, สแตนฟอร์ด, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา

ติดต่อกับ: Christopher Patzke, Stanford University School of Medicine, 265 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA โทรศัพท์: 650.724.5264 อีเมล: [email protected]

หมายเหตุผู้แต่ง: Christopher Patzke และ Yan Han มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

1 ภาควิชาสรีรวิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์

2 สถาบันสเต็มเซลล์ชีววิทยาและเวชศาสตร์ฟื้นฟูและภาควิชาพยาธิวิทยา และ

3 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, สแตนฟอร์ด, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา

ติดต่อกับ: Christopher Patzke, Stanford University School of Medicine, 265 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA โทรศัพท์: 650.724.5264 อีเมล: [email protected]

หมายเหตุผู้แต่ง: Christopher Patzke และ Yan Han มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

1 ภาควิชาสรีรวิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์

2 สถาบันชีววิทยาเซลล์ต้นกำเนิดและเวชศาสตร์ฟื้นฟูและภาควิชาพยาธิวิทยาและ

3 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, สแตนฟอร์ด, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา

ติดต่อกับ: Christopher Patzke, Stanford University School of Medicine, 265 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA โทรศัพท์: 650.724.5264 อีเมล: [email protected]

หมายเหตุผู้แต่ง: Christopher Patzke และ Yan Han มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

ค้นหาบทความโดย Maxeiner, S. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 ภาควิชาสรีรวิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์

2 สถาบันชีววิทยาเซลล์ต้นกำเนิดและเวชศาสตร์ฟื้นฟูและภาควิชาพยาธิวิทยาและ

3 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, สแตนฟอร์ด, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา

ติดต่อกับ: Christopher Patzke, Stanford University School of Medicine, 265 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA โทรศัพท์: 650.724.5264 อีเมล: [email protected]

หมายเหตุผู้แต่ง: Christopher Patzke และ Yan Han มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

1 ภาควิชาสรีรวิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์

2 สถาบันชีววิทยาเซลล์ต้นกำเนิดและเวชศาสตร์ฟื้นฟูและภาควิชาพยาธิวิทยาและ

3 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, สแตนฟอร์ด, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา

ติดต่อกับ: Christopher Patzke, Stanford University School of Medicine, 265 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA โทรศัพท์: 650.724.5264 อีเมล: [email protected]

หมายเหตุผู้แต่ง: Christopher Patzke และ Yan Han มีส่วนร่วมในงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน

การกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัสในโปรตีนที่จับกับซินแทกซิน 1 (STXBP1) ยีนซึ่งเข้ารหัส Munc18-1 ซึ่งเป็นองค์ประกอบหลักของเครื่องจักรหลอมรวมเยื่อหุ้มเซลล์พรีไซแนปติก ทำให้เกิดโรคไข้สมองอักเสบในวัยแรกเกิดในวัยแรกเกิด (กลุ่มอาการ Ohtahara) แต่ยังไม่ชัดเจนว่าการสูญเสีย Munc18-1 บางส่วนทำให้เกิดการนำเสนอทางคลินิกที่รุนแรงนี้อย่างไร ที่นี่ เราสร้างเซลล์ ES ของมนุษย์ที่ออกแบบมาเพื่อแสดงเฮเทอโรไซกัสและโฮโมไซกัสตามเงื่อนไข STXBP1 การกลายพันธุ์ที่สูญเสียการทำงานและศึกษา WT ของไอโซนิกและ STXBP1-เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์ที่ได้มาจากเซลล์ ES ที่กลายพันธุ์ตามเงื่อนไขเหล่านี้ เราแสดงให้เห็นว่า heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ลดระดับของโปรตีน Munc18-1 และหุ้นส่วนที่มีผลผูกพัน นั่นคือ t-SNARE-protein Syntaxin-1 โดยประมาณ 30% และลดการปล่อยสารสื่อประสาทที่เกิดขึ้นเองและที่เกิดขึ้นได้เกือบ 50% ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราจึงยืนยันว่าการใช้เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนมนุษย์ (ES) ที่ออกแบบทางวิศวกรรมเป็นวิธีที่ใช้ได้ในการศึกษาการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับโรคในเซลล์ประสาทของมนุษย์บนภูมิหลังทางพันธุกรรมที่มีการควบคุม แสดงให้เห็นว่าบางส่วน STXBP1 การสูญเสียการทำงานอย่างรุนแรงบั่นทอนการปลดปล่อยสารสื่อประสาทในเซลล์ประสาทของมนุษย์ และแนะนำว่า heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ทำให้เกิดโรคไข้สมองอักเสบในระยะแรกโดยเฉพาะผ่านการด้อยค่าของ presynaptic

ความก้าวหน้าล่าสุดในพันธุศาสตร์ของมนุษย์ระบุการกลายพันธุ์ของเฮเทอโรไซกัสหลายร้อยชนิดที่อาจทำให้เกิดความผิดปกติทางพัฒนาการทางระบบประสาท เช่น ปัญญาอ่อน ออทิสติก หรือโรคจิตเภท (1 – 5) การระบุการกลายพันธุ์เหล่านี้ทำให้เกิดคำถามสำคัญ 2 ข้อ: การกลายพันธุ์ที่กำหนดให้ทำให้เกิดโรคจริงหรือ หรือเป็นตัวแทนของความหลากหลาย? หากการกลายพันธุ์ทำให้เกิดโรค มันจะก่อให้เกิดการด้อยค่าที่นำไปสู่โรคได้อย่างไร? วิธีการดั้งเดิมในการตอบคำถามเหล่านี้คือการศึกษาเซลล์ประสาทที่แตกต่างจากเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent stem (iPS) ที่เกิดจากผู้ป่วย เปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทที่ได้จากเซลล์ควบคุม iPS เพื่อระบุความผิดปกติที่อาจเกิดขึ้น (6-17) แม้ว่าจะมีประสิทธิภาพ วิธีการนี้ไม่จำเป็นต้องเปิดเผยว่าการกลายพันธุ์ก่อให้เกิดฟีโนไทป์เฉพาะหรือไม่ เนื่องจากการทดสอบและควบคุมเซลล์ประสาทที่วิเคราะห์นั้นมีภูมิหลังทางพันธุกรรมที่แตกต่างกันและได้มาจากโคลนของเซลล์ iPS ที่แตกต่างกัน (18, 19) ภูมิหลังทางพันธุกรรมอาจมีความสำคัญ เนื่องจากการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับโรคจำนวนมากสามารถสร้างฟีโนไทป์ที่แตกต่างกันในทางคลินิกได้

การกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัสหลายร้อยรายการในโปรตีนที่จับกับซินแทกซิน 1 (STXBP1) มีการสังเกตยีนในผู้ป่วยที่มีโรคไข้สมองอักเสบในระยะเริ่มแรก (เรียกว่า Ohtahara หรือ West syndrome refs. 20 - 22 ) และการนำเสนอทางคลินิกอื่น ๆ ที่มักจะรุนแรง (23 - 25) อย่างไรก็ตาม ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดว่า STXBP1 การกลายพันธุ์และการสูญเสีย Munc18-1 บางส่วนส่งผลต่อการทำงานของระบบประสาทของมนุษย์ ไม่ว่าการกลายพันธุ์เหล่านี้จะก่อให้เกิดโรคโดยทำให้เกิดการด้อยค่าของ nonneuronal หรือไม่ และการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก STXBP1 การกลายพันธุ์อาจคล้อยตามการรักษา (26, 27)

เพื่อที่จะตอบคำถามเหล่านี้ เราจำเป็นต้องมีแนวทางที่ช่วยให้เราสามารถทดสอบว่าการสูญเสียหน้าที่ของ STXBP1 ส่งผลต่อคุณสมบัติของเซลล์ประสาทของมนุษย์โดยเฉพาะในเซลล์ที่มีภูมิหลังทางพันธุกรรมที่ควบคุม ด้วยเหตุนี้ เราจึงใช้การรวมตัวกันอีกครั้งเพื่อทำให้เกิดการกลายพันธุ์ STXBP1 การเข้ารหัสยีน Munc18-1 ในเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อน (ES) H1 ของมนุษย์ (รูปที่ 1A) เซลล์ ES (ซึ่งไม่แสดง Munc18-1) ติดเชื้อไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ adeno-recombinant (AAV) ที่มี WT ของมนุษย์ STXBP1 ลำดับจากการเข้ารหัสภูมิภาค exon 2 ใน AAV exon 2 ถูกขนาบข้างด้วยไซต์ loxP (สำหรับการลบ exon โดย Cre-recombinase) และตลับเทปต้านทานการเลือกยาที่ล้อมรอบด้วยไซต์ frt (สำหรับการลบโดย Flp-recombinase ) ถูกแทรกเพิ่มเติมติดกับไซต์ loxP 5′ (รูปที่ 1A) AAV ที่มีตัวทำเครื่องหมายความต้านทานต่างกัน 2 ตัวถูกผลิตขึ้นเพื่อให้เกิดการสร้างเซลล์ KO (cKO) แบบมีเงื่อนไขแบบเฮเทอโรและโฮโมไซกัส สำเนาพันธุ์ที่ดื้อต่อยาหลายตัวถูกแยกและคัดกรองโดย PCR สำเนาพันธุ์เซลล์ ES แบบเฮเทอโรไซกัสและโฮโมไซกัสที่เป็นอิสระสองตัวถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์ (รูปที่ 1B และรูปที่ 1 เพิ่มเติม วัสดุเสริม A และ C ที่มีออนไลน์พร้อมบทความนี้ doi:10.1172/JCI78612DS1) วิธีการ cKO นี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อให้สามารถวิเคราะห์ผลกระทบของการกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรและโฮโมไซกัสในเซลล์ของมนุษย์บนภูมิหลังทางพันธุกรรมที่มีการควบคุม ซึ่งจะช่วยขจัดผลกระทบที่อาจก่อให้เกิดความสับสนซึ่งเกิดจากการเปลี่ยนแปลงภูมิหลังทางพันธุกรรมหรือการเลือกโคลนของเซลล์ (28)

พันธุวิศวกรรมของเงื่อนไข STXBP1 การกลายพันธุ์ของยีนในเซลล์ ES ของมนุษย์และการสร้างเซลล์ iN จากเซลล์ ES ที่กลายพันธุ์ตามเงื่อนไข (NS) กลยุทธ์การกำหนดเป้าหมาย NS STXBP1 ยีนถูกทำให้กลายพันธุ์โดยการรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันในเซลล์ H1 ES โดยใช้ AAV ที่มีลำดับที่ระบุ สำเนาพันธุ์ที่ดื้อยาได้รับการยืนยันโดย PCR โดยใช้ไพรเมอร์หมายเลข 1 ถึงไม่มี 3. ตัวอย่างที่ 2, exon 2 วงรีสีแดง, loxP ไซต์ สามเหลี่ยมสีน้ำเงิน, ไซต์ frt (NS) การวิเคราะห์ PCR ของเซลล์ WT ES และสำเนาพันธุ์เซลล์ ES เฮเทอโรไซกัสและโฮโมไซกัสอิสระ 2 ตัว PCR ถูกดำเนินการด้วยไพรเมอร์ที่ระบุ (ดู NS). ในแผงนี้ มัน18-1 +/+ หมายถึงเซลล์ ES ที่ไม่ได้กำหนดเป้าหมาย () การออกแบบเลนติไวรัสเวคเตอร์สำหรับการสร้างความแตกต่างอย่างรวดเร็วของ Ngn2 ที่ควบคุมโดยเซลล์ ES ไปเป็นเซลล์ iN (NS) แผนภาพการไหลของการทดลองเซลล์ iN เซลล์ ES ที่กลายพันธุ์แบบมีเงื่อนไขถูกรวมเข้าด้วยกันในวันที่ -1 โดยมี lentiviruses ที่ใช้สำหรับการสร้างเซลล์ iN (แสดงใน ) บวกกับ lentivirus ที่แสดง Flp-recombinase อย่างใดอย่างหนึ่ง (ซึ่งเอาตลับความต้านทานออกและเปิดใช้งานอีกครั้ง STXBP1 การแสดงออกส่งผลให้ มัน18-1 +/+ เซลล์ประสาท) หรือ Cre-recombinase (ซึ่งลบ exon 2 ของ STXBP1 ยีนส่งผลให้ มัน18-1 –/+ หรือ มัน18-1 –/– เซลล์ประสาท) (อี) ภาพการเรืองแสงที่เป็นตัวแทนของกลุ่มควบคุมและเซลล์ iN ที่กลายพันธุ์ที่ได้มาจากเฮเทอโรไซกัส (บนสุด) หรือโฮโมไซกัสแบบมีเงื่อนไข STXBP1-เซลล์ ES กลายพันธุ์ (ด้านล่าง) เซลล์ ES ถูกรวมเข้าด้วยกันในวันที่มีการเหนี่ยวนำเซลล์ iN ด้วย lentivirus ที่แสดง EGFP สำหรับการแสดงภาพเซลล์ประสาทในวันที่ 23 แถบมาตราส่วน: 200 μm สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการเลือกเซลล์ประสาทและภาพที่เป็นตัวแทน โปรดดูรูปที่ 1 เพิ่มเติม

เพื่อวิเคราะห์ผลฟีโนไทป์ของ STXBP1 เราใช้วิธีการเหนี่ยวนำให้เกิดเซลล์ประสาท (เซลล์ iN) ซึ่งเซลล์ประสาทผลิตจากเซลล์ ES หรือ iPS โดยบังคับการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส (29, 30) ก่อนอื่นเราทดสอบว่า heterozygous และ homozygous หรือไม่ STXBP1เซลล์ ES ที่กลายพันธุ์สามารถแปลงเป็นเซลล์ประสาท iN ได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัส Neurogenin-2 (Ngn2) โดยใช้รูปแบบของโปรโตคอลมาตรฐานของเราที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (รูปที่ 1, C และ D และอ้างอิง 29) เราสร้าง ES เซลล์ในวันที่ –1 ด้วยไวรัสที่แสดง Ngn2 และทรานส์แอคติเวเตอร์ที่ควบคุมด้วยเตตราไซคลีน (rtTA) แบบย้อนกลับ (ซึ่งขับเคลื่อนการสร้างความแตกต่างโดยตรงของเซลล์ ES ไปเป็นเซลล์ประสาทโดยขั้นตอนมาตรฐาน อ้างอิงที่ 29 ) และเพิ่มเติมด้วยไวรัสที่แสดง Flp-recombinase (เพื่อถอดตลับความต้านทานและสร้างแอคทีฟ STXBP1 อัลลีล) หรือ Cre-recombinase (เพื่อลบ exon 2 และปิดการใช้งาน STXBP1 นิพจน์ เนื่องจากการลบ exon 2 จะสร้าง codon หยุดก่อนกำหนด) ด้วยเหตุนี้ เราจึงผลิตเซลล์ ES จากจำนวนเซลล์ ES isogenic WT control neuron (เรียกว่า มัน18-1 +/+ ) และ heterozygous หรือ homozygous STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ (เรียกว่า มัน18-1 –/+ หรือ มัน18-1 –/– ตามลำดับ) การผลิตเซลล์ประสาทเหล่านี้มีประสิทธิภาพในทำนองเดียวกันกับการแสดงออกร่วมของ Flp- หรือ Cre-recombinases อย่างไรก็ตาม เราสังเกตว่า homozygous แต่ไม่ใช่ heterozygous STXBP1-กลายพันธุ์ มัน18-1 –/– เซลล์ประสาทเริ่มเสื่อมโทรมหลังจาก 1 สัปดาห์และแสดงให้เห็นการตายของเซลล์ประสาทจำนวนมากในช่วง 3 สัปดาห์ในการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 1E และรูปที่ 3A เสริม ดูการวิเคราะห์ด้านล่าง)

การวิเคราะห์ Immunoblotting พบว่า heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์มีระดับโปรตีน Munc18-1 ลดลง ในขณะที่โฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์ขาดโปรตีน Munc18-1 ตามที่คาดไว้ (รูปที่ 2A) การหาปริมาณของระดับโปรตีน Munc18-1 ในเซลล์ iN ที่ได้มาจากเฮเทอโรไซกัสอิสระ 2 ตัว STXBP1- สำเนาพันธุ์เซลล์ ES ที่กลายพันธุ์แสดงให้เห็นว่าทั้งคู่มีระดับ Munc18-1 ที่ลดลงที่คล้ายคลึงกัน (

ลดรูปที่ 2B และรูปที่ 1B เพิ่มเติม 30% สำหรับระดับ mRNA) การสำรวจโปรตีน synaptic อื่นๆ พบว่าระดับ Syntaxin-1 ลดลงอย่างเฉพาะเจาะจงเช่นกัน (รูปที่ 2B และรูปที่ 2 เพิ่มเติม A และ B) ไม่มีการตรวจสอบโปรตีนอื่นที่แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงในระดับ ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาในหนูทดลองที่ระดับโปรตีน Syntaxin-1 ถูกระงับเมื่อโปรตีน Munc18-1 ถูกลบออก และระดับโปรตีน Munc18-1 จะถูกระงับอย่างตรงกันข้ามเมื่อการแสดงออกของ Syntaxin-1 ลดลง (31 – 34) แสดงให้เห็นว่า Munc18-1 และ Syntaxin-1 มีพฤติกรรมเหมือนหน่วยย่อยที่พึ่งพาอาศัยกันของคอมเพล็กซ์ที่ทำให้เสถียรซึ่งกันและกัน

องค์ประกอบของโปรตีน การอยู่รอด และการสร้างความแตกต่างของเซลล์ประสาทของ STXBP1-เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์ (NS) Immunoblots และจุดควบคุมที่ย้อมด้วย Ponceau และเซลล์ iN กลายพันธุ์ heterozygous และ homozygous (NS) ระดับโปรตีนในการควบคุมที่ตรงกันและโคลนที่เป็นอิสระของ heterozygous STXBP1-เซลล์ iN ที่กลายพันธุ์ ซึ่งกำหนดโดยอิมมูโนโบลต์ติ้งเชิงปริมาณ (ดูรูปเพิ่มเติมที่ 2, A และ B) *NS < 0.05, ของนักเรียน NS ทดสอบ. () พล็อตส่วนของเซลล์ประสาทที่รอดตายเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (เส้นประ) เป็นฟังก์ชันของเวลาเพาะเลี้ยง สภาวะที่ทดสอบ: เซลล์เฮเทอโรไซกัสจากเซลล์ ES โคลน 2 เซลล์อิสระ (สีแดง) เซลล์โฮโมไซกัสที่สร้างขึ้นด้วยสภาวะมาตรฐานที่เพาะเลี้ยงเพียงอย่างเดียว (สีเขียว) หรือเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ WT iN (สีน้ำเงิน) โฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ iN กลายพันธุ์ซึ่งเกิดการกลายพันธุ์ 1 สัปดาห์หลังจากการเหนี่ยวนำเซลล์ iN (สีดำ) การเสื่อมสภาพของโฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์มีความสำคัญสูงทางสถิติในทุกสภาวะ NS < 0.01 2 ทาง ANOVA (NS) เฮเทอโรไซกัส STXBP1-เซลล์ iN กลายพันธุ์ที่ย้อมสำหรับเครื่องหมายเดนไดรต์ MAP2 แถบมาตราส่วน: 100 μm. (อี) ความยาวทั้งหมดของเดนไดรต์ (ซ้าย) จำนวนกิ่ง (กลาง) และขนาดโสม (ขวา) หาปริมาณด้วยเซลล์ควบคุมและเซลล์ iN ที่กลายพันธุ์ซึ่งได้มาจากเซลล์ ES ที่กลายพันธุ์ 2 ตัวที่แยกจากกัน (NS) Dendrites จากการควบคุมและ heterozygous STXBP1- เซลล์ iN กลายพันธุ์ที่ย้อมสีสำหรับ MAP2 และ synapsin เพื่อแสดงภาพเทอร์มินัล presynaptic แถบมาตราส่วน: 10 μm. (NS) ความหนาแน่น (ซ้าย) และขนาด (ขวา) ของ synapsin-positive puncta ตามเดนไดรต์ในเฮเทอโรไซกัส STXBP1-เซลล์ iN กลายพันธุ์ที่ได้มาจากโคลนของเซลล์ ES 2 ตัวที่เป็นอิสระ แถบข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SEM จำนวนการทดลองอิสระที่ดำเนินการจะแสดงในกราฟ

ตั้งแต่โฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ดูเหมือนจะเสื่อมสภาพ (รูปที่ 1E) เราวัดการอยู่รอดของเซลล์ประสาทด้วยเฮเทอโรไซกัสหรือโฮโมไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์เป็นฟังก์ชันของเวลาในวัฒนธรรม (รูปที่ 2C และรูปที่ 3A เพิ่มเติม) เราพบว่า heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ไม่แสดงความแตกต่างในการอยู่รอดเมื่อเทียบกับเซลล์ประสาทกลุ่มควบคุม ในขณะที่เซลล์ประสาทแบบโฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ได้แสดงการสูญเสียเซลล์ประสาทสัมพัทธ์แล้ว (

40%) ที่จุดแรกที่ตรวจสอบ (วันที่ 5 หลังจากการเหนี่ยวนำเซลล์ iN) โฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์ยังคงตายเมื่อเวลาผ่านไป โฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ยังเสื่อมโทรมเมื่อทำการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ประสาทของมนุษย์ WT ซึ่งบ่งชี้ว่าการเสื่อมสภาพเป็นแบบอิสระของเซลล์ (รูปที่ 2C) ฟีโนไทป์ของ neurodegeneration นี้สอดคล้องกับการสังเกตในหนู Munc18-1–KO ที่เป็นส่วนประกอบ (31) ยิ่งกว่านั้นเมื่อเราแนะนำโฮโมไซกัส STXBP1 การลบออกหลังจากเซลล์ iN ถูกสร้างขึ้นแล้ว (1 สัปดาห์หลังจากการเหนี่ยวนำเซลล์ iN) เซลล์ประสาทยังคงเสื่อมสภาพอย่างรวดเร็ว ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโปรตีน Munc18-1 จำเป็นสำหรับการอยู่รอดของเซลล์ประสาทมากกว่าข้อกำหนดเฉพาะของเซลล์ประสาท (รูปที่ 2C) ในแนวทางอิสระที่สองในการประเมินการอยู่รอดของโฮโมไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ เราวัดปริมาณสัมพัทธ์ของมนุษย์ GAPDH จีโนม DNA และ mRNA ใน WT และ Munc18-1–ทำให้เซลล์ iN หมดลงหลังจากเพาะเลี้ยง 4 สัปดาห์ เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์แสดงการตายของเซลล์ประมาณ 70% และ 60% ตามลำดับ ขึ้นอยู่กับ GAPDH ระดับ DNA หรือ mRNA (รูปที่ 3, B และ C) เนื่องจากความเสื่อมของพวกมัน จึงไม่มีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับ homozygous STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์

ต่อไปเราทดสอบเพื่อตรวจสอบว่า heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์มีความคล้ายคลึงกับเซลล์ประสาท WT ในแง่ของรูปร่าง การเกิดอาร์เบอร์ไรเซชันของเดนไดรต์ และจำนวนไซแนปส์ การหาปริมาณของความยาวรวมของเดนไดรต์และจำนวนของกิ่งเดนไดรต์ต่อเซลล์ประสาท เช่นเดียวกับขนาดของโสมที่ตรวจพบว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลง (รูปที่ 2, D และ E) ในทำนองเดียวกัน การวัดจำนวนไซแนปส์ต่อเซ็กเมนต์เดนไดรต์หรือขนาดไซแนปส์ก็ไม่สามารถระบุความแตกต่างระหว่าง WT และ STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ (รูปที่ 2, F และ G) ดังนั้น heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ไม่ได้ขัดขวางการพัฒนาปกติของเซลล์ประสาทหรือการสร้างเซลล์ประสาท

นำโดยสมมติฐานที่ว่าเซลล์ประสาทของมนุษย์มีเซลล์ประสาท heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์อาจแสดงการเปลี่ยนแปลงการทำงาน เราวิเคราะห์เซลล์ประสาทอิเล็กโตรกายภาพวิทยา สอดคล้องกับไม่มีการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา เราตรวจพบว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงในคุณสมบัติทางไฟฟ้าที่แท้จริง (รูปที่ 3, A–C) อย่างไรก็ตาม การวัดกระแส postsynaptic ที่เกิดจากการกระตุ้นขนาดเล็กที่เกิดขึ้นเอง (mEPSC) เผยให้เห็นฟีโนไทป์เดียวกันในเซลล์ประสาทที่ได้มาจากโคลนของเซลล์ ES กลายพันธุ์ที่เป็นอิสระทั้งสอง: การลดลงอย่างมากในความถี่ mEPSC โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงในแอมพลิจูด mEPSC บ่งชี้ถึงการด้อยค่าในการปล่อยสารสื่อประสาท presynaptic ( รูปที่ 4, A และ B) แผนภาพการกระจายสะสมของช่วงเวลาระหว่างเหตุการณ์แสดงให้เห็นว่าการด้อยค่านี้มีการกระจายอย่างสม่ำเสมอในไซแนปส์ กล่าวคือ มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมากในความถี่ mEPSC ที่ต่ำกว่าในทุกไซแนปส์ทั้งหมด (รูปที่ 4, A และ B)

คุณสมบัติทางไฟฟ้าภายในปกติในเฮเทอโรไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์ (NS) เฮเทอโรไซกัส STXBP1- เซลล์ iN กลายพันธุ์ไม่มีการเปลี่ยนแปลงความต้านทานอินพุต (ซ้าย) หรือความจุ (ขวา) เซลล์ประสาทที่ได้มาจากโคลนของเซลล์ ES กลายพันธุ์ที่แตกต่างกัน 2 ตัวถูกวิเคราะห์ตามที่ระบุไว้ (NS) ตัวแทนร่องรอยของการวิเคราะห์คุณสมบัติการยิงที่มีศักยภาพของการควบคุมและ heterozygous STXBP1- เซลล์ iN กลายพันธุ์ เซลล์ประสาทที่อยู่ในโหมดแคลมป์ปัจจุบันถูกฉีดด้วยพัลส์ปัจจุบันที่เพิ่มขึ้น (เพิ่มขึ้นทีละ 10 pA) โปรโตคอลทดลองแสดงอยู่ที่ด้านล่าง () กราฟสรุปของเกณฑ์การเริ่มทำงานที่อาจเกิดขึ้นในการดำเนินการซึ่งกำหนดในเซลล์ควบคุมและเซลล์ iN ที่กลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัสที่ได้มาจากสำเนาพันธุ์เซลล์ ES 2 ตัวที่ต่างกัน กราฟสรุปแสดงค่าเฉลี่ย ± SEM ของเซลล์/วัฒนธรรมอิสระที่วิเคราะห์ระบุไว้ในแถบ

ลดการปล่อยสารสื่อประสาทที่เกิดขึ้นเองใน heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์ (NS และ NS) การปล่อยสารสื่อประสาทที่เกิดขึ้นเองบกพร่องใน heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์ ร่องรอยที่เป็นตัวแทนของ mEPSC ที่บันทึกในเทโทรโดทอกซิน (TTX) 1 ไมโครโมลาร์จากสำเนาพันธุ์ 2 ตัวที่ต่างกันจะแสดงที่ด้านบน กราฟสรุปของพารามิเตอร์ mEPSC แสดงอยู่ด้านล่าง ซ้าย พล็อตสะสมของช่วงระหว่างเหตุการณ์ mEPSC (สิ่งที่ใส่เข้าไป: ความถี่เฉลี่ย mEPSC) ด้านขวา พล็อตสะสมของแอมพลิจูด mEPSC (สิ่งที่ใส่เข้าไป: แอมพลิจูดเฉลี่ยเฉลี่ย) **NS < 0.01, unpaired, 1-tailed Student’s NS ทดสอบเปรียบเทียบวิธีการ***NS < 0.001 การทดสอบ Kolmogorov-Smirnov สำหรับการเปรียบเทียบการแจกแจงสะสม กราฟสรุปแสดงค่าเฉลี่ย ± SEM จำนวนเซลล์/วัฒนธรรมอิสระที่วิเคราะห์ระบุไว้ในแท่งกราฟ

เพื่อแสดงลักษณะการส่งสัญญาณ synaptic เพิ่มเติมในเซลล์ประสาทกลายพันธุ์ Munc18-1 เราได้ตรวจสอบการตอบสนองของ synaptic ที่ปรากฏ เราสังเกตในเซลล์ประสาทที่ได้มาจากการกลายพันธุ์ของเซลล์ ES โคลนที่เฮเทอโรไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์ทำให้เกิดการลดลงอย่างมาก (

ศักยภาพในการดำเนินการ 45%) – EPSC ที่กระตุ้นการทำงานคล้ายกับการเปลี่ยนแปลงความถี่ mEPSC (รูปที่ 5, A และ B) แอมพลิจูดของ EPSC ที่เกิดจากรถไฟกระตุ้น 10 Hz/10 วินาทีก็ลดลงเช่นกัน (รูปที่ 5, C และ D) แอมพลิจูดของ EPSC ลดลงอย่างสม่ำเสมอตลอดขบวน 10 Hz ในแง่สัมบูรณ์ (รูปที่ 5D) แต่การวิเคราะห์ของ EPSC สัมพัทธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับการตอบสนองครั้งแรกที่ตรวจพบว่าไม่มีความแตกต่างระหว่างกลุ่มควบคุมและ STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ (รูปที่ 5E) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าพลาสติกซินแนปติกระยะสั้นไม่เปลี่ยนแปลง

เฮเทอโรไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์บั่นทอนการปลดปล่อยสารสื่อประสาทที่เกิดขึ้น (NS และ NS) ร่องรอยตัวแทน (NS) และกราฟสรุปแอมพลิจูด (NS) ของ EPSC ที่เกิดจากศักยภาพการดำเนินการที่แยกออกมาในการควบคุมและ STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ที่ได้มาจากโคลนของเซลล์ ES 2 ตัวที่ต่างกัน () ร่องรอยตัวแทนของ EPSC ที่เกิดจากการกระตุ้น 10 Hz/10 วินาทีในการควบคุมและ heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์ (NS และ อี) การวิเคราะห์เชิงปริมาณของ EPSC ที่เกิดจากรถไฟกระตุ้น 10 Hz เป็นค่าสัมบูรณ์ (NS) หรือแอมพลิจูดสัมพัทธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับการตอบสนองครั้งแรก (อี). แอมพลิจูดของขบวน 10 วินาทีทั้งหมด (แผงด้านซ้าย) และ 10 ตัวกระตุ้นแรก (แผงตรงกลาง) จะถูกพล็อตเป็นฟังก์ชันของจำนวนการกระตุ้น ในขณะที่แอมพลิจูดเฉลี่ยที่เกิดขึ้นจาก 10 สิ่งเร้าสุดท้ายจะแสดงในแผงด้านขวา โปรดทราบว่าในขณะที่ heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์แสดงแอมพลิจูดสัมบูรณ์ที่ลดลงอย่างสม่ำเสมอ การปั้นซินแนปติกที่สะท้อนโดยแอมพลิจูดสัมพัทธ์เป็นเรื่องปกติ (NS และ NS) การวัดการปลดปล่อยที่เกิดจากซูโครสไฮเปอร์โทนิกเพื่อประเมินขนาดของ RRP ของถุงน้ำ แผงหน้าปัดแสดงร่องรอยตัวแทน (NS) และกราฟสรุปการโอนค่าธรรมเนียมสะสมตามฟังก์ชันของเวลา (NS, ซ้าย) หรือยอดโอนเฉลี่ยทั้งหมด (NS, ขวา). กราฟสรุปแสดงค่าเฉลี่ย ± SEM ของเซลล์/วัฒนธรรมอิสระที่วิเคราะห์ระบุไว้ในแถบ การเปรียบเทียบทางสถิติทำโดย Student's NS ทดสอบเปรียบเทียบเฮเทอโรไซกัส STXBP1 กลายพันธุ์เพื่อควบคุม *NS < 0.05 **NS < 0.01 ***NS < 0.001

ฟีโนไทป์ที่สังเกตพบอาจถูกนำมาพิจารณาด้วย ท่ามกลางปัจจัยอื่นๆ การลดลงของจำนวนไซแนปส์หรือการลดขนาดของพูลที่ปล่อยได้ง่าย (RRP) ต่อไซแนปส์ การวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาของเราข้างต้นแสดงให้เห็นว่าจำนวนไซแนปส์ไม่เปลี่ยนแปลงใน heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์ พิจารณาความเป็นไปได้แรก (รูปที่ 2, F และ G) ดังนั้นเราจึงวัดขนาดของ RRP โดยใช้การกระตุ้นโดยไฮเปอร์โทนิกซูโครสเป็นเครื่องมือในการประมาณ RRP (รูปที่ 5F และ ref. 35 ) น่าแปลกที่เราพบว่าขนาดของ RRP หรือจลนพลศาสตร์ของการปล่อยมันไม่เปลี่ยนแปลงโดย heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ (รูปที่ 5G) ดังนั้น heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ลดขนาดของสารสื่อประสาทที่ถูกกระตุ้นด้วย Ca 2+ โดยไม่เปลี่ยนแปลงสภาพความเป็นพลาสติกในระยะสั้น ซึ่งบ่งชี้ถึงผลกระทบที่ออกฤทธิ์ที่ปลายน้ำของการเตรียม vesicle priming ใน RRP แต่ต้นน้ำของ Ca 2+ กระตุ้นการปลดปล่อย

เพื่อกำหนดเพิ่มเติมและยืนยันอย่างอิสระถึงฟีโนไทป์ที่แข็งแกร่งอย่างน่าประหลาดใจของ heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์ เราใช้ออพโตเจเนติกส์เพื่อวิเคราะห์การเชื่อมต่อแบบรวมกัน เนื่องจากการทดลองดังกล่าวยังไม่เป็นกิจวัตรในภาคสนาม เราจึงพัฒนาและทดสอบวิธีการที่แตกต่างกัน 2 วิธีสำหรับการวิเคราะห์ ซึ่งทั้งสองวิธีให้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ 6 และ 7)

เฮเทอโรไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์ลดการปล่อยสารสื่อประสาท presynaptic ที่ไซแนปส์ของเซลล์ iN ตามที่เปิดเผยโดยการวิเคราะห์ออปโตเจเนติกส์ของการเชื่อมต่อแบบรวมของไซแนปติก (NS) แผนภาพการไหลของการทดลองเซลล์ออพโตเจเนติก iN โดยใช้ทรานส์เฟกชันแชนเนลโรดอปซินเบาบาง เฮเทอโรไซกัส STXBP1-เซลล์ iN ที่กลายพันธุ์หรือกลุ่มควบคุม WT ถูกสร้างขึ้นตามที่บรรยายไว้สำหรับรูปที่ 1, ทรานส์เฟกเบาบางที่วันที่ 21 ด้วย tdTomato-CHiEF (อนุพันธ์ของแชนเนลโรดอปซิน-2) และวิเคราะห์โดยการปะติดปะต่อที่วันที่ 26 สำหรับการทดลองกู้ภัย หนู Munc18- 1 ถูกโคทรานส์เฟกกับแชนเนลโรดอปซินในวันที่ 21 (NSNS) ไมโครกราฟคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของเซลล์ iN ที่ทรานส์เฟกซึ่งแสดงออกถึงเซลล์ iN tdTomato-CHiEF (สีแดง) ถูกย้อมเคาน์เตอร์สำหรับ MAP2 (สีเขียว) และไซแนปซิน (สีชมพู) ภาพกำลังขยายที่สูงขึ้นของพื้นที่บรรจุกล่องแสดงไว้ทางด้านขวา (B1, WT control B2, heterozygous STXBP1-กลายพันธุ์โดยไม่ต้องช่วยชีวิต B3, heterozygous STXBP1-กลายพันธุ์พร้อมกู้ภัย) แท่งมาตราส่วน: 100 μm. (อี) แผนผังไดอะแกรมของการวิเคราะห์ออปโตเจเนติกของการเชื่อมต่อแบบรวม synaptic tdTomato-CHiEF–เซลล์ประสาทพรีไซแนปติกที่เป็นบวกถูกกระตุ้นโดยพัลส์แสงสั้น และ EPSC ถูกบันทึกจากเซลล์ประสาทโพสต์ไซแนปติกเชิงลบของ tdTomato-CHiEF (NS) ตัวอย่างร่องรอยของ EPSC ที่กระตุ้นด้วยแสง แถบสีดำด้านบนเส้นแสดงพัลส์แสง 2 มิลลิวินาที (NS) กราฟสรุปแสดงแอมพลิจูด EPSC (ซ้าย) และค่าสัมประสิทธิ์การแปรผัน (ขวา) กราฟแสดงค่าเฉลี่ย ± SEM จำนวนเซลล์/วัฒนธรรมอิสระที่วิเคราะห์ระบุไว้ในแถบ *NS < 0.05 **NS < 0.01, ของนักเรียน NS ทดสอบ.

เฮเทอโรไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์ลดการปล่อยสารสื่อประสาท presynaptic ที่ไซแนปส์ที่เกิดขึ้นจากเซลล์ iN ไปบนเซลล์ประสาทเยื่อหุ้มสมองของหนูเมาส์ที่เพาะเลี้ยงร่วมกันตามที่เปิดเผยโดยการวิเคราะห์ออปโตเจเนติกของการเชื่อมต่อ synaptic แบบรวม (NS) แผนภาพการไหลของการทดลองเซลล์ optogenetic iN โดยใช้เซลล์ประสาทของหนูเมาส์ที่มีการเพาะเลี้ยงร่วมกัน เฮเทอโรไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์หรือเซลล์ประสาทควบคุม WT ถูกสร้างขึ้นตามที่บรรยายไว้สำหรับรูปที่ 1 แต่ด้วยการแสดงออกร่วมกันของ tdTomato-CHiEF เซลล์ iN ถูกเพาะเลี้ยงร่วมกันด้วยเซลล์ประสาทคอร์เทกซ์ของหนูเมาส์จำนวนมากในวันที่ 7 และวิเคราะห์โดยการใช้แพตช์แคลมป์ที่วันที่ 21 (NS) ไมโครกราฟที่เป็นตัวแทนของ tdTomato-CHiEF ซึ่งแปลงเซลล์ประสาทของมนุษย์ (สีแดง) ที่ได้รับการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ประสาทของคอร์เทกซ์ของเมาส์หลักในวันที่ 7 และวิเคราะห์ในวันที่ 21 เซลล์ประสาททั้งหมดถูกระบุว่าเป็น MAP2 (สีเขียว) ซินแนปซิน (สีชมพู) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ). แถบมาตราส่วน: 100 μm. () ตัวอย่างร่องรอยของ EPSC ที่กระตุ้นด้วยแสงที่บันทึกจากเซลล์ประสาทของเมาส์ (NS) กราฟสรุปของแอมพลิจูดของ EPSC ที่ถูกกระตุ้นด้วยแสง (ซ้าย) และค่าสัมประสิทธิ์การแปรผัน (ขวา) กราฟสรุปแสดงค่าเฉลี่ย ± SEM ของเซลล์/วัฒนธรรมอิสระที่วิเคราะห์ระบุไว้ในแถบ *NS < 0.05 **NS < 0.01 ***NS < 0.001, ของนักเรียน NS ทดสอบเปรียบเทียบเฮเทอโรไซกัส STXBP1 กลายพันธุ์เพื่อควบคุม

ในแนวทางแรก เราผลิตการควบคุมและ heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์ตามที่บรรยายไว้ข้างต้น (รูปที่ 1D) แต่ทรานส์เฟกเซลล์ประสาทอย่างเบาบางด้วยพลาสมิดซึ่งแสดงออก tdTomato-tagged และ codon-optimized channelrhodopsin แวเรียนต์ tdTomato-CHiEF ( 36 ) ถูกแสดงออกโดยลำพังหรือร่วมกับโครงสร้างกู้ภัย Munc18-1 . ทรานส์เฟกชันถูกดำเนินการที่ 21 วันหลังจากการเหนี่ยวนำของการสร้างความแตกต่างของเซลล์ iN และเซลล์ประสาทถูกวิเคราะห์ 5 วันหลังจากการทรานส์เฟกโดยการแก้ไขเซลล์ประสาทที่ไม่ทรานส์เฟกและการวัด EPSC ที่เหนี่ยวนำโดยพัลส์ 2 มิลลิวินาทีของแสงสีน้ำเงิน (รูปที่ 6A) กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงยืนยันว่าเซลล์ประสาทชุดย่อยเล็กๆ ถูกทรานส์เฟก แต่เซลล์ประสาทเหล่านี้สร้างไซแนปส์มากมายบนเซลล์ประสาทที่ไม่ผ่านการทรานส์เฟก (รูปที่ 6, B–D) ด้วยโครงแบบการทดลองนี้ เราสามารถเลือกออปโตเจเนติกส์กระตุ้นอินพุตของเซลล์ประสาทที่แสดงออกแชนเนลโรดอปซิน 1 หรืออาจเป็น 2 เซลล์บนเซลล์ประสาทเป้าหมายภายหลังการสังเคราะห์สัญญาณที่แก้ไขแล้ว และเพื่อวัดการตอบสนองต่อศักยภาพของการกระทำเดี่ยวที่เหนี่ยวนำโดยการกระตุ้นด้วยแสงแบบสั้นๆ (รูปที่ 6E ). ยิ่งไปกว่านั้น โดยโคทรานส์เฟกพลาสมิดที่แสดง Munc18-1 โครงร่างการทดลองนี้ช่วยให้ประเมินความสามารถของ WT Munc18-1 ในการช่วยชีวิตฟีโนไทป์ที่สันนิษฐานได้ โปรดทราบว่าการช่วยชีวิตมีเฉพาะในเซลล์ประสาทพรีไซแนปติกที่แสดงแชนเนลโรดอปซิน ในขณะที่เซลล์ประสาทอื่นๆ ทั้งหมดกลายพันธุ์ และการช่วยเหลือนั้นถูกนำเข้าสู่เซลล์ประสาทพรีไซแนปติกที่กลายพันธุ์หลังจากที่เซลล์ประสาทเหล่านี้พัฒนาเดนไดรต์และซอนและเกิดไซแนปส์

การกระตุ้นออปโตเจเนติกของเซลล์ประสาทพรีไซแนปติกแสดงให้เห็นว่า เมื่อเทียบกับเซลล์ประสาทควบคุม STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์แสดงการลดลงประมาณ 2 เท่าในแอมพลิจูดของ EPSC (รูปที่ 6, F และ G) ตามที่คาดไว้สำหรับการกระตุ้นเซลล์ประสาทพรีไซแนปติกเพียง 1 อันและอาจเป็นไปได้ 2 เซลล์ แอมพลิจูด EPSC สัมบูรณ์ที่เกิดจากการกระตุ้นออพโตเจเนติกส์ของเซลล์ประสาทควบคุมที่ทรานส์เฟกเบาบางนั้นเล็กกว่าที่สร้างโดยการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของเซลล์ประสาททั้งหมดเกือบ 10 เท่า (เปรียบเทียบรูปที่ 5B กับรูปที่ 6G) แอมพลิจูด EPSC ที่ถูกกระตุ้นด้วยไฟฟ้าจะสัมพันธ์กับแอมพลิจูด 5 mEPSC โดยประมาณ ในขณะที่ EPSC ที่ถูกกระตุ้นด้วยไฟฟ้านั้นสอดคล้องกับแอมพลิจูด 50 mEPSC โดยประมาณ (เปรียบเทียบรูปที่ 4 กับรูปที่ 6E) ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ประสาทเดี่ยวก่อตัวขึ้นระหว่างการสัมผัส synaptic 6 ถึง 10 อัน และการกระตุ้นด้วยไฟฟ้านั้นกระตุ้นประมาณ ไซแนปส์มากกว่าการกระตุ้นออปโตเจเนติก 10 เท่า

การแสดงออก presynaptic ที่โดดเด่นของ WT Munc18-1 ใน STXBP1-เซลล์ประสาทกลายพันธุ์เพียง 5 วันก่อนการบันทึกช่วยฟีโนไทป์ได้อย่างสมบูรณ์ แสดงให้เห็นว่าฟีโนไทป์เกิดจากความบกพร่องในการทำงานของพรีไซแนปติกซึ่งสามารถย้อนกลับได้หลังการพัฒนา (รูปที่ 6F) เรายังวัดค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันโดยการประเมินทางอ้อมของความน่าจะเป็นของการปล่อย Ca 2+ ที่ถูกกระตุ้น แต่สังเกตว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงในเซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์ (รูปที่ 6G) ซึ่งสอดคล้องกับการขาดการเปลี่ยนแปลงในความเป็นพลาสติกในระยะสั้น (รูปที่ 5)

ในแนวทางออปโตเจเนติกที่สอง เราสร้างเงื่อนไขแบบมีเงื่อนไข STXBP1- เซลล์ ES ที่กลายพันธุ์ด้วยการแสดงออก lentivirus สำหรับ tdTomato-CHiEF ในวันที่ –1 ร่วมกับ lentiviruses ที่ใช้ในการกระตุ้นการสร้างความแตกต่างโดยตรงของเซลล์ ES เข้าไปในเซลล์ประสาทและด้วย lentiviruses ที่สร้างการควบคุม WT หรือ heterozygous STXBP1-เซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์ (รูปที่ 7A) ในลักษณะนี้ เซลล์ iN ทั้งหมดแสดง CHiEF ของแวเรียนต์แชนเนลโรดอปซิน จากนั้นเราทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ iN ในวันที่ 7 ด้วยเซลล์ประสาทคอร์เทกซ์ปฐมภูมิที่เพาะเลี้ยงใหม่จากหนูแรกเกิดมากเกินไป ทำให้ประชากรเบาบางของเซลล์ iN ที่แสดงออกแชนเนลโรดอปซินถูกผสมกับเซลล์ประสาทของเมาส์ WT ที่มีปริมาณมากขึ้น (รูปที่ 7B) เซลล์ประสาทของหนูเมาส์ถูกแพตช์หลังจากวันที่ 21 และการส่งผ่านแบบซินแนปติกถูกกระตุ้นเชิงแสงในเซลล์ presynaptic iN เราพบว่าในแนวทางออพโตเจเนติกส์แรก heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ทำให้แอมพลิจูดของ EPSC ลดลงเกือบ 2 เท่า ซึ่งเป็นการยืนยันฟีโนไทป์ในโปรโตคอลการทดลองนี้ (รูปที่ 7, C และ D) อีกครั้ง เราสังเกตเห็นว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงในสัมประสิทธิ์การแปรผัน ดังนั้นด้วยวิธีการทดลองที่แตกต่างกัน 2 วิธี เราจึงยืนยันว่า heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ทำให้ความแรงของ synaptic ลดลงประมาณ 2 เท่าในเซลล์ประสาทกระตุ้นที่สร้างโดยโปรโตคอลเซลล์ iN

ในการศึกษานี้ เราได้ศึกษาในเซลล์ประสาทของมนุษย์ ไม่ว่าจะเป็น heterozygous หรือ homozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ที่สูญเสียการทำงานทำให้เกิดการด้อยค่าอย่างมีนัยสำคัญในการพัฒนาเซลล์ประสาท, อาร์บอไรเซชันของเดนไดรต์, การอยู่รอดของเซลล์ประสาท และการส่งผ่าน synaptic โครงการนี้ได้รับแรงบันดาลใจจากการสังเกตทางคลินิกว่าการกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัสใน STXBP1 ยีนซึ่งเข้ารหัสโปรตีนหลอมรวมเมมเบรน synaptic Munc18-1 ทำให้เกิดโรคไข้สมองอักเสบในวัยแรกเกิดในรูปแบบที่รุนแรงซึ่งเรียกว่ากลุ่มอาการโอทาฮารา (20 – 22) แม้ว่าผู้ป่วยหลายร้อยคนด้วย STXBP1 มีการอธิบายการกลายพันธุ์กลไกการก่อโรคของการกลายพันธุ์เหล่านี้ไม่ชัดเจน ในหนู เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่าการลบโฮโมไซกัสของ STXBP1 สร้างบล็อกทั้งหมดในการส่งผ่าน synaptic และการเสื่อมสภาพของระบบประสาท (31) แต่การลบแบบเฮเทอโรไซกัสของ STXBP1 ทำให้เกิดฟีโนไทป์ที่ไม่รุนแรง ( 37 , 38 ) จึงเกิดคำถามว่า heterozygous เป็นอย่างไร STXBP1 การกลายพันธุ์ที่ในหนูมีผลเพียงเล็กน้อยเท่านั้นที่สามารถทำให้เกิดความบกพร่องทางคลินิกอย่างรุนแรงในผู้ป่วยในมนุษย์ เพื่อตอบคำถามนี้ เราได้ตรวจสอบฟีโนไทป์ของเฮเทอโรไซกัสและโฮโมไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์ในเซลล์ประสาทของมนุษย์ โดยมีแนวคิดว่าเซลล์ประสาทของมนุษย์อาจตอบสนองต่อการกลายพันธุ์ที่แตกต่างจากเซลล์ประสาทของเมาส์ แท้จริงแล้วเราพบว่า heterozygous STXBP1 การลบก็เพียงพอแล้วในเซลล์ประสาทของมนุษย์ในการสร้างความบกพร่องที่สำคัญในการส่งสัญญาณ synaptic แต่ไม่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการพัฒนา การจัดกลุ่มของเดนไดรต์ หรือการอยู่รอดของเซลล์ประสาท โฮโมไซกัส STXBP1 ในทางตรงกันข้าม การลบทำให้การอยู่รอดของเซลล์ประสาทลดลงอย่างมากในลักษณะที่คล้ายกับผลกระทบต่อเซลล์ประสาทของเมาส์

ฟีโนไทป์ของเฮเทอโรไซกัส STXBP1– เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์นั้นรุนแรงพอที่จะอธิบายได้อย่างน่าเชื่อถือสำหรับการนำเสนอทางคลินิกของผู้ป่วยกลุ่มอาการโอทาฮารา แม้ว่าผลกระทบเพิ่มเติมจาก STXBP1 การกลายพันธุ์ที่เกินกว่าที่วิเคราะห์ในที่นี้อาจนำไปสู่การนำเสนอทางคลินิก ธรรมชาติของฟีโนไทป์ที่เราสังเกตในเฮเทอโรไซกัส STXBP1-เซลล์ประสาทของมนุษย์กลายพันธุ์นั้นน่าประหลาดใจใน 2 ประการ อย่างแรก เราพบว่า Munc18-1 ที่ลดลงค่อนข้างน้อยโดยที่ระดับ Syntaxin-1 ลดลงอย่างสอดคล้องกันทำให้เกิดการปลดปล่อยสารสื่อประสาทลดลงอย่างมาก ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่า Munc18-1 และ Syntaxin-1 เป็นหน่วยย่อยของสารเชิงซ้อนที่มีการพึ่งพาซึ่งกันและกันซึ่งมีอัตราการจำกัดการปลดปล่อยสารสื่อประสาทแม้ว่าระดับโปรตีนโดยรวมจะลดลงเพียงบางส่วนเท่านั้น ฟีโนไทป์มีขนาดใหญ่โดยไม่คาดคิดสำหรับการกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัสเมื่อเปรียบเทียบกับฟีโนไทป์ของเมาส์ (31, 32, 37) อาจเป็นเพราะเซลล์ประสาทของมนุษย์มีความไวต่อการสูญเสีย Munc18-1 มากกว่าเซลล์ประสาทของเมาส์ ประการที่สอง เราพบว่า heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ไม่ได้ทำให้ RRP ลดลงหรือส่งผลกระทบเฉพาะกับความน่าจะเป็นในการปลดปล่อยครั้งแรก แต่กลับทำให้แอมพลิจูดของ EPSC ลดลงอย่างสม่ำเสมอตลอดขบวนการกระตุ้นโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงในความเป็นพลาสติกในระยะสั้น การลดลงของความถี่ mEPSC โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงในแอมพลิจูดของ mEPSC บ่งชี้ว่าการลดลงของแอมพลิจูด EPSC สะท้อนถึงการด้อยค่าของ Ca 2+ ที่กระตุ้นการปลดปล่อย แต่ความน่าจะเป็นของการกระตุ้น Ca 2+ ดูเหมือนจะไม่เปลี่ยนแปลงโดยอิงจากสภาพความเป็นพลาสติกในระยะสั้นที่ไม่เปลี่ยนแปลง เรายืนยันข้อสรุปเหล่านี้อย่างอิสระโดยใช้วิธีการออพโตเจเนติกส์ที่วิเคราะห์การส่งสัญญาณ synaptic ระหว่างคู่ของเซลล์ประสาทและยืนยันว่าการลบ Munc18-1 ที่ต่างกันทำให้เกิดความแรงของไซแนปส์ลดลง แต่ไม่อยู่ในความน่าจะเป็นที่จะปลดปล่อย ในกรณีนี้โดยประเมินโดยสัมประสิทธิ์การแปรผัน ของความกว้าง EPSC (รูปที่ 6 และ 7) การทดลองออพโตเจเนติกส์ยังแสดงให้เห็นว่าฟีโนไทป์ถูกสร้างโดยกลไกพรีไซแนปติกอย่างหมดจด เนื่องจากมันสามารถได้รับการช่วยเหลือโดย presynaptic WT Munc18-1 (รูปที่ 6) หรืออาจถูกชักนำโดยการลบพรีไซแนปติกของ STXBP1 ยีน (รูปที่ 7) นอกจากนี้ การทดลองออพโตเจเนติกส์พบว่า STXBP1-ฟีโนไทป์ที่กลายพันธุ์ไม่ได้เกิดจากการด้อยค่าในการพัฒนาเซลล์ประสาท แต่เกิดจากความผิดปกติของเทอร์มินัลพรีไซแนปติก เนื่องจากฟีโนไทป์สามารถช่วยชีวิตได้ในเซลล์ประสาทหลังจากเกิดนิวริไทต์และไซแนปส์ (รูปที่ 6) ดังนั้น การลดลงของระดับของสารเชิงซ้อน Munc18-1/Syntaxin-1 ที่เกิดจากเฮเทอโรไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์ (รูปที่ 2) ดูเหมือนจะลดกิจกรรมของถุงน้ำที่ปลายน้ำของไพรเมอร์ แต่ต้นน้ำของ Ca 2+ ที่กระตุ้นการปลดปล่อย โดยไม่ขึ้นกับกลไกที่นำไปสู่ฟีโนไทป์ที่ผิดปกตินี้ การสังเกตฟีโนไทป์นี้และแนวทางในการสร้างเซลล์ประสาทของมนุษย์ที่กลายพันธุ์ตามเงื่อนไขและการวิเคราะห์เซลล์ประสาทตามหน้าที่ที่นำเสนอในที่นี้ อาจถูกนำมาใช้เพื่อพัฒนาแพลตฟอร์มการตรวจคัดกรองสำหรับยาที่อาจทำให้การปลดปล่อยลดลง และอาจช่วยให้อาการของผู้ป่วยโรค heterozygous ดีขึ้นได้ STXBP1 การกลายพันธุ์

ในการทดลองนี้ เราไม่ได้ใช้การผสานรวมของไวรัสเวคเตอร์เพื่อสร้างโคลนเซลล์ ES กลายพันธุ์ แต่สร้างการกลายพันธุ์แบบมีเงื่อนไขที่อนุญาตให้เปรียบเทียบเซลล์ประสาทที่กลายพันธุ์และ WT ที่ได้มาจากโคลนเดียวกัน (โดยทั่วไป หลังจากการกลายพันธุ์เกิดขึ้นตามเงื่อนไข ไม่ใช่เซลล์เดียว เกิดการแบ่งแยก) นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์โคลนกลายพันธุ์อิสระ 2 ตัว ดังนั้น การออกแบบของการทดลองเหล่านี้ทำให้แน่ใจได้ว่าฟีโนไทป์ที่สังเกตพบนั้นเกิดจากการกลายพันธุ์ที่ตั้งใจไว้อย่างแท้จริง เนื่องจากมันถูกควบคุมอย่างเข้มงวดสำหรับภูมิหลังทางพันธุกรรม การแปรผันของโคลน และผลกระทบจากการแทรกจีโนม (C.H.Pak, T. Danko, M. Wernig และ T.C. Südhof ข้อสังเกตที่ไม่ได้เผยแพร่) อย่างไรก็ตาม การทดลองทั้งหมดของเราดำเนินการโดยใช้เซลล์ ES หนึ่งเซลล์ เซลล์ H1 และเราไม่ทราบว่าฟีโนไทป์ที่เราสังเกตเห็นนั้นได้รับอิทธิพลจากภูมิหลังทางพันธุกรรมมากน้อยเพียงใด ในผู้ป่วยมนุษย์ heterozygous STXBP1 การกลายพันธุ์ดูเหมือนจะส่งผลอย่างสม่ำเสมอในการนำเสนอทางคลินิกที่คล้ายคลึงกัน ตรงกันข้ามกับการกลายพันธุ์ของยีนมนุษย์อื่นๆ ที่สร้างฟีโนไทป์ที่หลากหลาย นี่แสดงให้เห็นว่าภูมิหลังทางพันธุกรรมไม่ได้มีบทบาทสำคัญใน STXBP1 ยีน อาจเป็นเพราะว่า Munc18-1 ที่เข้ารหัสทำหน้าที่ศูนย์กลางในการรับส่งข้อมูลของเมมเบรน และในปัจจุบันเราไม่สามารถประเมินว่าภูมิหลังทางพันธุกรรมมีอิทธิพลต่อฟีโนไทป์อย่างไร อย่างไรก็ตาม ผลกระทบเชิงหน้าที่ของเฮเทอโรไซกัส STXBP1 การกลายพันธุ์ที่เราสังเกตเห็นมีความลึกซึ้ง เนื่องจาก Munc18-1 มีความจำเป็นเท่าเทียมกันในการปลดปล่อยสารสื่อประสาทในเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นและยับยั้ง (31, 39) ผลกระทบเหล่านี้จึงน่าจะมีอยู่ในทั้งสองอย่าง และทั้งสองก็มีแนวโน้มที่จะส่งผลต่อการนำเสนอทางคลินิกในผู้ป่วยกลุ่มอาการ Ohtahara ข้อมูลปัจจุบันประกอบขึ้นจากสิ่งที่เราเชื่อว่าเป็นก้าวแรกสู่การทำความเข้าใจว่า heterozygous เป็นอย่างไร STXBP1 การกลายพันธุ์ทำให้เกิดโรค Ohtahara และแนะนำว่าการกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัสนั้นทำให้เกิดโรคได้จริง แต่จะต้องมีขั้นตอนเพิ่มเติมก่อนที่จะพิจารณาวิธีการรักษาที่เป็นไปได้

โครงสร้างไวรัส โครงสร้างเลนติไวรัสต่อไปนี้ถูกใช้: (a) FUW-TetO-Ngn2-T2A-puromycin (โดยที่ FUW หมายถึง F-ubiquitin-W) ซึ่งแสดงออก TetO-Ngn2-T2A-puromycin cassette (โปรโมเตอร์ TetO ขับเคลื่อนการแสดงออกของ Ngn2 ของเมาส์ที่มีความยาวเต็มที่และ ของพูโรมัยซินผ่านทางลำดับการตัดแยก-เปปไทด์ T2A รูปที่ 1C และการอ้างอิง 29 ) (b) FUW-rtTA ที่มี rtTA ( 29 ) (c) FUW-TetO-EGFP ซึ่งแสดงออก EGFP ( 29 ) (d) FSW-NLS-mCherry ซึ่งแสดงออก mCherry นำหน้าด้วยลำดับการแปลตำแหน่งด้วยนิวเคลียร์ (ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ไซแนปซินของมนุษย์ที่จำเพาะต่อเซลล์ประสาท) เพื่อตรวจสอบการตายของเซลล์ (e) FUW-GFP::Cre หรือ FUW-Flp เพื่อแสดง Cre- หรือ Flp-recombinase (f) FUW-oCHiEF: :tdTomato แสดงตัวแปร channelrhodopsin ที่แท็กด้วย tdTomato oCHiEF โครงสร้าง AAV สองชนิดถูกใช้สำหรับการกำหนดเป้าหมายยีน (ยังแสดงไว้ในรูปที่ 1A) โครงสร้างแรกมีดังนี้: สำหรับการกำหนดเป้าหมายของอัลลีลแรกของ STXBP1 บนโครโมโซม 9 โครงสร้างมีลำดับจากขอบเขตที่เข้ารหัส exon 2 ขนาบข้างด้วยไซต์ loxP และตลับเทปความต้านทานแบบผกผันที่อยู่ติดกับไซต์ 5′ loxP เทปต้านทานประกอบด้วยโปรโมเตอร์ PGK, ยีนต้านทานพูโรมัยซิน และลำดับ SV40 polyA ตลับความต้านทานถูกล้อมรอบด้วยไซต์ frt สำหรับการรวมตัวกันอีกครั้ง แขน 5′ ของโครงสร้างรวม 1.5 kb ของลำดับที่อยู่ต้นน้ำของ exon 2 แขน 3′ มีลำดับ 1.3 kb ที่อยู่ปลายน้ำของ exon 2 โครงสร้างที่สองมีดังนี้: สำหรับการกำหนดเป้าหมายของวินาที อัลลีล ลำดับที่เข้ารหัสยีนต้านทานพูโรมัยซินของโครงสร้างแรกถูกแลกเปลี่ยนกับยีนต้านทานบลาสซิซิดิน อย่างอื่นไม่เปลี่ยนแปลง

การสร้างไวรัส Lentiviruses ถูกผลิตขึ้นตามที่อธิบายไว้ (29 ) ในเซลล์ HEK293T (ATCC) โดย cotransfection กับ 3 helper plasmids (pRSV-REV, pMDLg/pRRE และ vesicular stomatitis virus G protein expression vector) ที่มี DNA vector ของ lentiviral vector จำนวน 12 ไมโครกรัม และแต่ละตัวมี 6 μg ของ Helper plasmid DNAs ต่อพื้นที่เพาะเลี้ยง 75 ซม. 2) โดยใช้แคลเซียมฟอสเฟต Lentiviruses ถูกเก็บเกี่ยวภายใน 48 ชั่วโมงหลังการถ่าย อัดด้วยการหมุนเหวี่ยง (49,000) NS เป็นเวลา 90 นาที) แขวนลอยใหม่ใน MEM แบ่งส่วนย่อย และแช่แข็งที่ –80°C การทดลองใช้เฉพาะการเตรียมไวรัสที่มีประสิทธิภาพในการติดเชื้อมากกว่า 90% ที่ประเมินโดยการแสดงออกของ EGFP หรือการดื้อยาเพียวโรมัยซิน AAV-DJ ( 40 ) ถูกใช้เพื่อนำส่งโครงสร้างการกำหนดเป้าหมายสำหรับการสร้างเซลล์ cKO AAV-DJ ถูกผลิตขึ้นในเซลล์ HEK293T โดย cotransfection ของ pHelper, pDJ และ AAV vector (8.5 ไมโครกรัมของ DNA ต่อพื้นที่เพาะเลี้ยง 75 ซม. 2) โดยใช้แคลเซียมฟอสเฟต เซลล์ถูกเก็บเกี่ยว 72 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟชันใน PBS/1 มิลลิโมลาร์ EDTA และหลังจากรอบการแช่แข็ง/การละลาย 1 รอบ เก็บ AAV จากไซโทพลาสซึมโดยใช้เบนโซเนสนิวคลีเอสที่ความเข้มข้นสุดท้าย 50 หน่วย/มล. ที่ 37°ซ เป็นเวลา 30 นาที หลังจากล้างสารแขวนลอยออกจากเศษเซลล์โดยการหมุนเหวี่ยงช้าๆ (3,000 NS เป็นเวลา 30 นาที) AAVs ถูกแยกออกหลังจากการปั่นแยกอย่างรวดเร็ว (400,000 .) NS เป็นเวลา 120 นาที) ในไอโอไดซานอล (ไล่ระดับจาก 15%–60%) จากชั้น 40% และทำให้เข้มข้นต่อไปโดยใช้หลอดรวมศูนย์ที่มีความเข้มข้น (10, 000 MWCO, เมอร์ค UFC0910024) ตามโปรโตคอลที่ผู้ผลิตแนะนำ

การเพาะเลี้ยงเซลล์ ทำการทดลองตามที่อธิบายไว้ ( 29 ) เซลล์ H1 ES (แหล่งข้อมูลการวิจัยของ WiCell) ได้รับการบำรุงรักษาเป็นเซลล์ที่ปราศจากตัวป้อนในตัวกลาง mTeSR1 (เทคโนโลยีเซลล์ต้นกำเนิด) เซลล์เกลียของหนูเมาส์ถูกเพาะเลี้ยงจากสมองส่วนหน้าของหนูเมาส์ WT CD1 แรกเกิด (41) โดยสังเขป โฮโมจีเนตสำหรับสมองของหนูเมาส์แรกเกิดถูกย่อยด้วยปาเปนและ EDTA เป็นเวลา 20 นาที และเซลล์ถูกแยกออกจากกันโดยการบดให้ละเอียดเพื่อหลีกเลี่ยงการเติบโตของเซลล์ประสาทและเคลือบบนขวด T75 ใน DMEM ที่เสริมด้วย FBS 10% เมื่อไปถึงการบรรจบกัน เซลล์เกลียถูกทริปซิไนซ์และทำซ้ำที่ความหนาแน่นต่ำกว่าทั้งหมด 2 ถึง 3 ครั้งเพื่อกำจัดปริมาณการติดตามที่เป็นไปได้ของเซลล์ประสาทของหนูเมาส์ก่อนที่การเพาะเลี้ยงเซลล์เกลียจะถูกใช้สำหรับการทดลองการเพาะเลี้ยงโคด้วยเซลล์ iN

การกำหนดเป้าหมายยีนในเซลล์ ES เซลล์ H1 ES ถูกทรานส์ดิวซ์โดย AAV ที่มีโครงสร้างที่หนึ่งหรือที่สอง (ที่บรรยายไว้ข้างต้น) โครงสร้างแรกถูกใช้เพื่อสร้างเซลล์ ES กลายพันธุ์เฮเทอโรไซกัสแบบมีเงื่อนไข ยาคัดเลือกถูกเติมและเก็บไว้ในอาหาร mTeSR1 จนถึง 2 วันหลังจากการถ่ายโอน เซลล์ ES ที่รอดชีวิตได้รับอนุญาตให้เติบโตเป็นอาณานิคมและถูกคัดแยกทีละเซลล์ โคโลนีที่กำหนดเป้าหมายอย่างถูกต้องห้าโคโลนีจากทั้งหมด 91 โคโลนีได้รับการยืนยันโดยการตรวจคัดกรอง PCR โดยใช้ PCR 2 ชุดที่มี oligosequences CATGTTAACCAGGATGGTCTCAATCT และ ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT หรือ ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT และ CAAGATCCCATCTCATAAT ตามลำดับ จากภายนอกการสตรีมบนไซต์ 2 รายการตามลำดับ โครงสร้างที่สองถูกใช้เพื่อสร้างเซลล์ ES แบบมีเงื่อนไขของโฮโมไซกัสกลายพันธุ์ การรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันเกิดขึ้นได้โดยการทรานส์ดักชันของสำเนาพันธุ์เฮเทอโรไซกัสหมายเลข 1 และการเลือกใช้ยาในภายหลังด้วย blasticidin และ puromycin โคโลนีที่กำหนดเป้าหมายอย่างถูกต้องสองโคโลนีจาก 80 โคโลนีได้รับการยืนยันโดยการตรวจคัดกรอง PCR โดยใช้ oligosequences GGGGGAATGGAAGGTGAGTAGAAAGTA และ TAACTGCCTGACCAGGTGGTCTTTAAGA (อ้างอิงเป็นไพรเมอร์หมายเลข 2 และหมายเลข 3 ในรูปที่ 1A) การตัดตอน exon 2 ที่ประสบความสำเร็จบน Cre-recombinase–mediated recombination ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ oligosequences: GGTGGGTTGGTTATGGCTCAGTAAAC และ TAACTGCCTGACCAGGTGGTCTTTAAGA (เรียกว่าไพรเมอร์หมายเลข 1 และหมายเลข 3 ในรูปที่ 1A)

โปรโตคอลมาตรฐานสำหรับการสร้างเซลล์ iN จากเซลล์ ES ของมนุษย์กลายพันธุ์แบบมีเงื่อนไขและสำหรับการเปิดใช้งานการกลายพันธุ์ตามเงื่อนไข มีการอธิบายการสร้างเซลล์ iN ไว้ก่อนหน้านี้ ( 29 ) โดยสังเขป เซลล์ ES ของมนุษย์ที่เป็นเป้าหมายถูกบำบัดด้วย Accutase (เทคโนโลยีเซลล์นวัตกรรม) และชุบเป็นเซลล์ที่แยกตัวออกจากเพลต 24 หลุม (1 × 10 4 เซลล์/หลุม) ในวันที่ –2 (รูปที่ 1B) เซลล์ถูกเคลือบบนแผ่นปิดที่เคลือบด้วย Matrigel (BD Biosciences) ใน mTeSR1 ที่มีไธอาโซวิวิน 2 ไมโครโมลาร์ (BioVision) ในวันที่ -1 เลนติไวรัสที่เตรียมตามที่บรรยายไว้ข้างต้น (0.3 ไมโครลิตร/หลุมของเพลต 24 หลุม) ถูกเติมในตัวกลาง mTeSR1 สดที่มีพอลิเบรน (8 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, ซิกมา-อัลดริช) lentiviruses สองประเภทที่แตกต่างกันถูก coinfected: lentiviruses ที่ใช้สำหรับการเหนี่ยวนำเซลล์ iN ตามที่อธิบายไว้ (29 ) และ lentiviruses ที่แสดง Flp-recombinase (เพื่อคืนค่ายีน WT) หรือ Cre-recombinase (เพื่อสร้างอัลลีลที่เป็นโมฆะ) ภายใต้การควบคุมของ โปรโมเตอร์ ubiquitin (รูปที่ 1D) ในวันที่ 0 อาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่ด้วย N2/DMEM/F12/NEAA (Invitrogen) ที่มี BDNF ของมนุษย์ (10 ng/ml, PeproTech), NT-3 ของมนุษย์ (10 ng/ml, PeproTech) และ Laminin-1 ของหนูเมาส์ (0.2 ไมโครกรัม/มล., อินวิโตรเจน) ด็อกซีไซคลิน (2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, Clontech) ถูกเติมในวันที่ 0 เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของยีน TetO และคงอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อจนกระทั่งสิ้นสุดการทดลอง ในวันที่ 1 ช่วงเวลาการคัดเลือกพูโรมัยซิน 24 ชั่วโมง (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เริ่มต้นขึ้น ในวันที่ 2 เซลล์เกลียของหนูเมาส์ถูกเติมลงในอาหารเลี้ยงเซลล์นิวโรเบสที่เสริมด้วย B27/กลูตาแมกซ์ (อินวิโตรเจน) ที่มี BDNF, NT3 และ Laminin-1 Ara-C (2 ไมโครโมลาร์, Sigma-Aldrich) ถูกเติมไปยังอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อยับยั้งการงอกขยายของแอสโตรไซต์ หลังจากวันที่ 2 50% ของสื่อในแต่ละหลุมถูกแลกเปลี่ยนทุก 2 วัน FBS (2.5%) ถูกเติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อในวันที่ 10 เพื่อสนับสนุนความอยู่รอดของแอสโตรไซต์ และเซลล์ iN ถูกตรวจวิเคราะห์หลังอย่างน้อย 21 วันในการทดลองส่วนใหญ่

การสร้างเซลล์ iN สำหรับการทดลองออปโตเจเนติกส์ สำหรับการทดลองทรานส์เฟกชันแชนแนลโรดอปซิน (tdTomato-CHiEF) (รูปที่ 6) เซลล์ iN ที่ผลิตด้วยโปรโตคอลมาตรฐานถูกถ่ายแบบเบาบางโดยแคลเซียมฟอสเฟตในวันที่ 21 ด้วยเวคเตอร์การแสดงออก tdTomato-CHiEF ที่ไม่มีหรือมีการทรานส์เฟกชันด้วยเวกเตอร์สำหรับการแสดงออก Munc18-1 ( FSW หนู Munc18-1). เซลล์ถูกวิเคราะห์อย่างน้อย 5 วันต่อมาเพื่อให้แน่ใจว่าการแสดงออกของแชนเนลโรดอปซินที่แข็งแกร่ง สำหรับการทดลองเพาะเลี้ยงในหนูทดลอง (รูปที่ 7) โปรโตคอลมาตรฐานสำหรับการผลิตเซลล์ iN ถูกแก้ไขโดยการติดเชื้อร่วมในวันที่ –1 ด้วยไวรัสเลนติเพิ่มเติมสำหรับ tdTomato-CHiEF และเซลล์คอร์เทกซ์ของหนูเมาส์หลักที่ผ่าและแยกออกใหม่ถูกเพิ่มในวันที่ 7 เซลล์ถูก วิเคราะห์ 14 วันต่อมา (วันที่ 21)

การทดลองอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์และอิมมูโนโบลต์ติ้ง การทดลองอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ถูกดำเนินการอย่างสำคัญตามที่อธิบายไว้ (29) โดยย่อ เซลล์ iN ที่เพาะเลี้ยงได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ใน PBS เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ล้าง 3 ครั้งด้วย PBS และบ่มใน 0.2% Triton X-100 ใน PBS เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกปิดกั้นใน PBS ที่มีซีรัมแพะ 5% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีปฐมภูมิถูกใช้ข้ามคืนที่ 4°ซ, เซลล์ถูกล้างใน PBS 3 ครั้ง และแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลากเรืองแสง (Alexa Fluor, 1:1000) ถูกนำไปใช้เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกใช้ในการทดลองทางอิมมูโนไซโตเคมี: MAP2 (Sigma-Aldrich 1:1,000), Synapsin (E028 1:2,000), Nanog (Millipore 1:1000), Oct4 (sc-8628, Santa Cruz Biotechnology Inc. 1:1000) , SSEA-4 (Millipore 1:1000), Tra-1-60 (Millipore 1:1000) และ Tra-1-81 (Millipore 1:1000) สัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาท dendritic ถูกมองเห็นโดย MAP2 immunocytochemistry การทดลอง immunoblotting เชิงปริมาณทั้งหมดดำเนินการด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่มีไอโอดีน (125 I) ตามที่อธิบายไว้ (42) ตัวอย่างถูกแยกโดย SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส Blots ถูกบล็อกในน้ำเกลือ Tris-buffered ที่มี 0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich) และนมปราศจากไขมัน 5% เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เมมเบรนที่ถูกปิดกั้นถูกบ่มในบัฟเฟอร์การปิดกั้นที่มีแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4°C ตามด้วยการล้าง 3 ถึง 5 ครั้ง เมมเบรนที่ถูกล้างถูกบ่มในบัฟเฟอร์การปิดกั้นที่มีแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วย HRP (MP Biomedicals, 1:8000) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหรือแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลาก I 125 (PerkinElmer, 1:1000) ข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง อิมมูโนบลอต HRP ได้รับการพัฒนาด้วยเคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง (GE Healthcare) 125 I blots สัมผัสกับหน้าจอ phosphorimager (Amersham) เป็นเวลา 1 ถึง 7 วันและสแกนด้วยเครื่องสแกน Storm (GE Healthcare) ตามด้วยการหาปริมาณด้วยซอฟต์แวร์ ImageQuant (GE Healthcare) สำหรับการตรวจภูมิคุ้มกัน แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกใช้: NeuN (ABN78, Millipore), TuJ1 (MMS-435P, Covance), complexin 1/2 (L668), Munc18 (610336, BD Transduction), SNAP25 (P913), synaptobrevin-2 ( P939), synaptotagmin1 (41.1, Synaptic Systems), synapsin (E028), Syntaxin-1 (438B), β-actin (A1978, Sigma-Aldrich), Syntaxin-16 (4398), synaptophysin (Synaptic Systems, 7.2), GDP -ตัวยับยั้งการแยกตัว (Synaptic Systems, GDI) (81.2), โปรตีนที่มีวาโซลิน (Synaptic Systems, VCP), ซีรีนที่เกี่ยวข้องกับคาโมดูลิน/ทรีโอนีนไคเนส (CASK, N3927), L1CAM (UJ127.11, Sigma-Aldrich) และ SynCAM (T2412).

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (RT-PCR) ของเซลล์เพาะเลี้ยงแบบรวม RNA ถูกแยกออกโดยใช้ RNAqueous Kit (Applied Biosystems) ที่บำบัดด้วย DNase (Applied Biosystems) และคัดลอกกลับด้วย Superscript III (Invitrogen) ระดับ mRNA ถูกหาปริมาณโดยการทดสอบ RT-PCR โดยใช้ระบบ Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR และซอฟต์แวร์วิเคราะห์ RQ

การหาปริมาณของสัณฐานวิทยา ความหนาแน่น synaptic และการอยู่รอด การวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาและความหนาแน่นของ synaptic ถูกดำเนินการอย่างสำคัญตามที่อธิบายไว้ (43) โดยสังเขป ภาพได้มาโดยใช้กล้องดิจิตอล Leica DFC400 ที่ติดมากับกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว Leica DMIL LED โดยมีวัตถุประสงค์ ×10 ซึ่งขับเคลื่อนโดยซอฟต์แวร์การจัดหาภาพ Leica Application Suite รูปภาพจากเซลล์ประสาท 30 ถึง 40 เซลล์ต่อสภาวะถูกสร้างขึ้นใหม่โดยใช้แอปพลิเคชั่น MetaMorph neurite โดยให้คะแนนสำหรับความยาวของเดนไดรต์ทั้งหมด จุดกิ่งเดนไดรต์ และพื้นที่โสม สำหรับการวิเคราะห์ synapsin puncta ได้ภาพมาโดยใช้ระบบไมโครสโคปแบบคอนโฟคอล Nikon A1RSi และกำหนดความหนาแน่นของ puncta โดยใช้ซอฟต์แวร์ Nikon NIS-Elements การวิเคราะห์การอยู่รอดของเซลล์ iN ทำได้ 2 วิธี ประการแรก ตรวจสอบการรอดชีวิตโดยตรงโดยใช้ภาพของนิวเคลียสของเซลล์ iN ที่แสดง mCherry ที่ตำแหน่งเดียวกันกับจานเพาะเลี้ยงที่ถ่ายวันเว้นวัน จำนวนเซลล์ถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) สำหรับแต่ละเงื่อนไขการทดลอง ค่าเฉลี่ยของรูปภาพจาก 20 ถึง 30 หลุมเพาะเลี้ยง (จากจานเพาะ 96 หลุม) ถือเป็น NS = 1. โดยรวมแล้ว ค่าเฉลี่ยของ NS = 3 ถูกคำนวณ ประการที่สอง จำนวนจีโนมทั้งหมด GAPDH ยีนดีเอ็นเอและของ GAPDH mRNA ในเซลล์ iN ถูกเฝ้าติดตามโดย PCR เชิงปริมาณ ตัวอย่าง DNA และ RNA ถูกรวบรวมจากเซลล์ iN หลังการเพาะเลี้ยง 4 สัปดาห์โดยใช้ DNeasy Blood & Tissue Kit (แค็ตตาล็อก QIAGEN 69504) หรือ RNAqueous-Micro Kit (แคตตาล็อกของแอมเบียน 1931) ตามลำดับ ความเข้มข้นของ DNA และ RNA ถูกวัดโดย NanoDrop 1000 Spectrophotometer RT-PCR เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้ USB VeriQuest Probe One-Step qRT-PCR Master Mix (แคตตาล็อก Affymetrix 75700) บนระบบ Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR และซอฟต์แวร์วิเคราะห์ RQ RT-PCR ดำเนินการตามโปรโตคอลที่แนะนำโดยผู้ผลิต: 1 รอบที่ 50°C เป็นเวลา 15 นาที 1 รอบที่ 95°C เป็นเวลา 10 นาที 35 รอบที่ 95°C เป็นเวลา 15 วินาที และ 60°C เป็นเวลา 30 วินาที GAPDH PrimeTime Assay (เทคโนโลยีดีเอ็นเอแบบรวม) เฉพาะสำหรับลำดับของเมาส์ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลดหมายเลขเซลล์สำหรับการเพาะเลี้ยง iN โดยการตรวจจับหมายเลขเซลล์ glia GAPDH PrimeTime Assay (เทคโนโลยีดีเอ็นเอแบบรวม) เฉพาะสำหรับลำดับของมนุษย์ถูกใช้เพื่อตรวจหาความอุดมสมบูรณ์ของมนุษย์ GAPDH ทั้งในระดับ DNA และ mRNA ในเซลล์ควบคุมและเซลล์ iN ที่กลายพันธุ์ จำนวนเซลล์ iN สัมพัทธ์ถูกประเมินโดยระดับ GAPDH ของมนุษย์ที่ถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงระดับ GAPDH ของหนูเมาส์ ลำดับของ PrimeTime Assays มีดังนี้: โพรบ GAPDH ของเมาส์: TGTTCCAGTATGACTCCACTCACGG forward primer: GTGGCAAAGTGGATTGTTG reverse primer: TTGACTGTGCCGTTGAATTTG โพรบ GAPDH ของมนุษย์: CAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGA forward primer: AGGGGGTGTGTGACCATG ไพรเมอร์แบบย้อนกลับ: AGGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGA

การทดลองทางไฟฟ้าสรีรวิทยามาตรฐาน ในเซลล์ iN ที่เพาะเลี้ยง ศักยภาพในการดำเนินการถูกบันทึกในการกำหนดค่าทั้งเซลล์แบบแคลมป์ปัจจุบันที่อุณหภูมิห้อง (สารละลายปิเปต: 123 mM K-gluconate, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl2, 1 mM K2ATP, 0.2 mM Na4GTP และกลูโคส 4 มิลลิโมลาร์) ศักย์ของเมมเบรนถูกเก็บไว้ใกล้ −65 mV และกระแสขั้นตอนถูกฉีดเพื่อกระตุ้นศักย์ไฟฟ้าในการดำเนินการด้วยการเพิ่มทีละ 20-pA การส่งแบบ Synaptic และกระแสที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้าทั้งเซลล์ได้รับการตรวจสอบในโหมดแคลมป์แรงดันทั้งเซลล์ (สารละลายปิเปต: 120 mM CsCl, 5 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 10 mM EGTA, 3 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP และ 10 mM QX-314) สารละลายอาบน้ำในการทดลองทั้งหมดมีดังต่อไปนี้: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4 และน้ำตาลกลูโคส 10 mM การตอบสนอง Synaptic ถูกวัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (44) การตอบสนองของ synaptic ที่ถูกกระตุ้นนั้นถูกกระตุ้นโดยการฉีดกระแส 1 มิลลิวินาทีผ่านอิเล็กโทรดภายนอกเซลล์เฉพาะที่ (อิเล็กโทรดสองขั้วแบบศูนย์กลาง FHC, แคตตาล็อก CBAEC75) ด้วยเครื่องกระตุ้นชีพจรแบบแยกเดี่ยวรุ่น 2100 (ระบบ AM) และบันทึกในโหมดแคลมป์แรงดันโดยใช้เครื่องขยายสัญญาณ Multiclamp 700B Clampex 10.4 ข้อมูล ซอฟต์แวร์การจัดหา (อุปกรณ์โมเลกุล) ข้อมูลถูกแปลงเป็นดิจิทัลที่ 10 kHz ด้วยตัวกรองความถี่ต่ำ 2 กิโลเฮิรตซ์ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ Clampfit 10.4 (Axon Instruments) สิ่งประดิษฐ์กระตุ้นสำหรับการตอบสนอง synaptic ที่ปรากฏถูกนำออกเพื่อแสดงภาพกราฟิก

การทดลองทางไฟฟ้าสรีรวิทยาออปโตเจเนติก ในการทดลองโดยใช้เซลล์ iN ที่ทรานส์เฟกอย่างเบาบางซึ่งแสดงออก tdTomato-CHiEF เซลล์ที่ทรานส์เฟกถูกระบุโดยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง และเซลล์ iN ที่ไม่เรืองแสงโดยรอบที่แสดงภาพผ่านเลนส์ DIC ถูกแพตช์ จากนั้นจึงวัด EPSC เป็นฟังก์ชันของพัลส์แสงสีน้ำเงิน 2 มิลลิวินาที (470 นาโนเมตร) ที่สร้างขึ้นด้วยแหล่งกำเนิดแสงแลมบ์ดา DG-4 (เครื่องมือซัตเตอร์) ใยแก้วนำแสงที่เชื่อมต่อกับคอนเดนเซอร์แบบสองพอร์ตถูกใช้เพื่อนำทางพัลส์เข้าไปในกล้องจุลทรรศน์ การทดลองโดยใช้เซลล์ประสาทเยื่อหุ้มสมองของหนูเมาส์ที่มีการเพาะเลี้ยงร่วมกันถูกดำเนินการในลักษณะคล้ายคลึงกัน ยกเว้นว่าเซลล์ประสาทของหนูเมาส์ที่อยู่รอบๆ เซลล์ iN ที่แสดง tdTomato-CHiEF ของมนุษย์ถูกแพตช์

การนำเสนอข้อมูลและสถิติ ข้อมูลทั้งหมดที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ Student's แบบ 2 ทางอย่างใดอย่างหนึ่ง NS การทดสอบ (หรือระบุไว้เป็นอย่างอื่น) 2-way ANOVA หรือการทดสอบ KS เปรียบเทียบตัวอย่างทดสอบกับตัวอย่างควบคุมที่ตรวจสอบในการทดลองเดียวกัน

การอนุมัติการศึกษา การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดย Stem Cell Research Oversight (SCRO) ที่สำนักงานการปฏิบัติตามกฎระเบียบด้านการวิจัยของมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด มหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด (SCRO 518: การศึกษาโรคทางสมองที่ส่งผลต่อการส่งผ่านซินแนปติกโดยใช้เซลล์ประสาทที่เหนี่ยวนำโดยมนุษย์) การทดลองเกี่ยวกับสัตว์ได้รับการอนุมัติโดย Stanford IACUC, Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) Research Compliance Office, Stanford University


อ้างอิง

มาลี P. et al. วิศวกรรมจีโนมมนุษย์ที่นำทางด้วย RNA ผ่าน Cas9 ศาสตร์ 339, 823–1278 (2013)

Hsu, P. D. , Lander, E. S. & Zhang, F. การพัฒนาและการประยุกต์ใช้ CRISPR-Cas9 สำหรับวิศวกรรมจีโนม เซลล์ 157, 1262–1278 (2014)

Cong, L. และคณะ วิศวกรรมจีโนมมัลติเพล็กซ์โดยใช้ระบบ CRISPR/Cas ศาสตร์ 339, 819–823 (2013)

Dow, L.E. และคณะ เหนี่ยวนำได้ ในร่างกาย การแก้ไขจีโนมด้วย CRISPR-Cas9 เนเจอร์ ไบโอเทค. 33, 390–394 (2015)

Platt, R. J. และคณะ หนูเคาะ CRISPR-Cas9 สำหรับการแก้ไขจีโนมและการสร้างแบบจำลองมะเร็ง เซลล์ 159, 440–455 (2014)

วัง H. et al. หนูรุ่นขั้นตอนเดียวที่มีการกลายพันธุ์ในหลายยีนโดยวิศวกรรมจีโนม CRISPR/Cas-mediated เซลล์ 153, 910–918 (2013)

Canver, M. C. และคณะการแสดงคุณลักษณะของประสิทธิภาพการลบจีโนมโดยอาศัยระบบ palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease interspaced interspaced อย่างสม่ำเสมอในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เจ. ไบโอล. เคมี. 289, 21312–21324 (2014)

Yang, H. et al. หนูรุ่นขั้นตอนเดียวที่มีนักข่าวและอัลลีลแบบมีเงื่อนไขโดยวิศวกรรมจีโนม CRISPR/Cas-mediated เซลล์ 154, 1370–1379 (2013)

Inui, M. และคณะ การสร้างโมเดลเมาส์อย่างรวดเร็วด้วยการกลายพันธุ์ของจุดที่กำหนดโดยระบบ CRISPR/Cas9 วิทย์ ตัวแทน 4, 5396 (2014)

ฮาส, C. et al. การกลายพันธุ์ของสวีเดนทำให้เกิดโรคอัลไซเมอร์ในระยะเริ่มแรกโดยความแตกแยกของเบต้า - ซีเครเตสภายในเส้นทางการหลั่ง ธรรมชาติ Med. 1, 1291–1296 (1995)

กลุ่มความร่วมมือโรคอัลไซเมอร์ โครงสร้างของพรีเซนนิลิน 1 (S182) ยีนและการระบุการกลายพันธุ์ใหม่ 6 แบบในตระกูล AD ที่เริ่มมีอาการ ยีนธรรมชาติ 11, 219–222 (1995)

Jiang, W. , Bikard, D. , Cox, D. , Zhang, F. & Marraffini, L. A. การแก้ไขจีโนมแบคทีเรียด้วย RNA ที่แนะนำโดยใช้ระบบ CRISPR-Cas เนเจอร์ ไบโอเทค. 31, 233–239 (2013)

Yang, L. et al. การเพิ่มประสิทธิภาพของการแก้ไขจีโนมเซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์ที่ไม่มีรอยแผลเป็น กรดนิวคลีอิก 41, 9049–9061 (2013)

Kleinstiver, B. P. และคณะ นิวคลีเอส CRISPR-Cas9 ที่ออกแบบทางวิศวกรรมพร้อมความจำเพาะของ PAM ที่เปลี่ยนแปลง ธรรมชาติ 523, 481–485 (2015)

Bialk, P. , Rivera-Torres, N. , Strouse, B. & Kmiec, E. B. กฎระเบียบของกิจกรรมการแก้ไขยีนที่ควบคุมโดยระบบ oligonucleotides เดี่ยวและ CRISPR/Cas9 PLOS ONE 10, e0129308 (2015)

Elliott, B. , Richardson, C. , Winderbaum, J. , Nickoloff, J. A. & Jasin, M. การแปลงยีนจากการซ่อมแซมการแตกของสองเกลียวในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม มล. เซลล์. ไบโอล. 18, 93–101 (1998)

Beumer, K. J. , Trautman, J. K. , Mukherjee, K. & Carroll, D. การใช้ DNA ผู้บริจาคระหว่างการกำหนดเป้าหมายยีนด้วยนิวคลีเอสนิ้วสังกะสี ยีน จีโนม พันธุศาสตร์ (G3) 3, 657–664 (2013)

Rivera-Torres, N. , Strouse, B. , Bialk, P. , Niamat, R. A. & Kmiec, E. B. ตำแหน่งของความแตกแยกของ DNA โดย TALEN และการซิงโครไนซ์เซลล์มีอิทธิพลต่อความถี่ของการแก้ไขยีนที่ควบคุมโดยโอลิโกนิวคลีโอไทด์สายเดี่ยว PLOS ONE 9, e96483 (2014)

Taghian, D. G. & Nickoloff, J. A. Chromosomal double-strand แบ่งตัวกระตุ้นการแปลงยีนที่ความถี่สูงในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม มล. เซลล์. ไบโอล. 17, 6386–6393 (1997)

Götz, J. & Ittner, L. M. แบบจำลองสัตว์ของโรคอัลไซเมอร์และภาวะสมองเสื่อมส่วนหน้า ธรรมชาติ รายได้ Neurosci. 9, 532–544 (2008)

Yagi, T. et al. การสร้างแบบจำลองโรคอัลไซเมอร์ในครอบครัวด้วยการกระตุ้นด้วยเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent ฮึ่ม มล. ยีนต์. 20, 4530–4539 (2011)

อิสราเอล, M.A. และคณะ การตรวจสอบโรคอัลไซเมอร์แบบประปรายและครอบครัวโดยใช้เซลล์ต้นกำเนิด pluripotent ที่เหนี่ยวนำ ธรรมชาติ 482, 216–220 (2012)

คอนโด, T. et al. แบบจำลองโรคอัลไซเมอร์ด้วย iPSCs เผยให้เห็นฟีโนไทป์ของความเครียดที่เกี่ยวข้องกับ Aβ ภายในเซลล์และการตอบสนองต่อยาที่แตกต่างกัน เซลล์ สเต็มเซลล์ 12, 487–496 (2013)

Muratore, C. R. และคณะ การกลายพันธุ์ APPV717I ของโรคอัลไซเมอร์ในครอบครัวเปลี่ยนแปลงการประมวลผล APP และการแสดงออกของ Tau ในเซลล์ประสาทที่ได้รับ iPSC ฮึ่ม มล. ยีนต์. 23, 3523–3536 (2014)

Sproul, A. A. และคณะ การกำหนดลักษณะเฉพาะและการทำโปรไฟล์ระดับโมเลกุลของ PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors PLOS ONE 9, e84547 (2014)

Woodruff, G. และคณะ การกลายพันธุ์ presenilin-1 ΔE9 ส่งผลให้กิจกรรม γ-secretase ลดลง แต่ไม่สูญเสียฟังก์ชัน PS1 ทั้งหมดในเซลล์ต้นกำเนิดจากมนุษย์ ตัวแทนเซลล์ 5, 974–985 (2013)

Lin, S. , Staahl, B. T. , Alla, R. K. & Doudna, J. A. ปรับปรุงวิศวกรรมจีโนมมนุษย์ที่กำกับด้วย homology โดยควบคุมจังหวะเวลาของการส่งมอบ CRISPR/Cas9 eLife 3, e04766 (2015)

Yu, C. และคณะ โมเลกุลขนาดเล็กช่วยเพิ่มการแก้ไขจีโนม CRISPR ในเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent เซลล์ สเต็มเซลล์ 16, 142–147 (2015)

Maruyama, T. et al. เพิ่มประสิทธิภาพในการแก้ไขจีโนมอย่างแม่นยำด้วย CRISPR-Cas9 โดยการยับยั้งการรวมปลายที่ไม่เป็นเนื้อเดียวกัน เนเจอร์ ไบโอเทค. 33, 538–542 (2015)

Chu, V. T. และคณะ เพิ่มประสิทธิภาพของการซ่อมแซมที่เน้นความคล้ายคลึงกันสำหรับการแก้ไขยีนที่แม่นยำของ CRISPR-Cas9 ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เนเจอร์ ไบโอเทค. 33, 543–548 (2015)

Fu, Y. และคณะ การกลายพันธุ์นอกเป้าหมายความถี่สูงที่เกิดจากนิวคลีเอส CRISPR-Cas ในเซลล์ของมนุษย์ เนเจอร์ ไบโอเทค. 31, 822–826 (2013)

Kahler, D.J. และคณะ ปรับปรุงวิธีการตั้งโปรแกรมไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ใหม่โดยใช้การคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ PLOS ONE 8, e59867 (2013)

Cowan, C. A. และคณะ ต้นกำเนิดของสายเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนจากบลาสโตซิสต์ของมนุษย์ น. อังกฤษ. เจ เมด 350, 1353–1356 (2004)

Goecks, J., Nekrutenko, A. & Taylor, J. และทีม Galaxy กาแล็กซี่: แนวทางที่ครอบคลุมสำหรับการสนับสนุนการวิจัยเชิงคำนวณที่เข้าถึงได้ ทำซ้ำได้ และโปร่งใสในวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต จีโนม ไบโอล. 11, R86 (2010)

Blankenberg, D. et al. Galaxy: เครื่องมือวิเคราะห์จีโนมบนเว็บสำหรับผู้ทดลอง สกุลเงิน โพรโทค มล. ไบโอล. บทที่ 19 หน่วย 19.10.1–21 (2010)

Andrews, S. FastQC: เครื่องมือควบคุมคุณภาพสำหรับข้อมูลลำดับปริมาณงานสูง (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)

Zhang, J. , Kobert, K. , Flouri, T. & Stamatakis, A. PEAR: การควบรวมกิจการการอ่านแบบคู่ของ Illumina ที่รวดเร็วและแม่นยำ ชีวสารสนเทศศาสตร์ 30, 614–620 (2014)

Pearson, W. R. , Wood, T. , Zhang, Z. & Miller, W. การเปรียบเทียบลำดับ DNA กับลำดับโปรตีน จีโนมิกส์ 46, 24–36 (1997)

Blankenberg, D. และคณะ การจัดการข้อมูล FASTQ ด้วย Galaxy ชีวสารสนเทศศาสตร์ 26, 1783–1785 (2010)

Li, H. & Durbin, R. การจัดตำแหน่งการอ่านระยะยาวที่รวดเร็วและแม่นยำด้วยการแปลง Burrows-Wheeler ชีวสารสนเทศศาสตร์ 26, 589–595 (2010)

Tsai, S. Q. และคณะ FokI nucleases ที่นำโดย Dimeric CRISPR RNA สำหรับการแก้ไขจีโนมที่มีความเฉพาะเจาะจงสูง เนเจอร์ ไบโอเทค. 32, 569–576 (2014)

Koike-Yusa, H. , Li, Y. , Tan, E.-P. , Velasco-Herrera, M. D. C. & amp Yusa, K. การตรวจคัดกรองทางพันธุกรรมแบบถอยกว้างทั้งจีโนมในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมด้วยไลบรารี RNA ของ Lentiviral CRISPR-guide เนเจอร์ ไบโอเทค. 32, 267–273 (2014)

อาร์ คอร์ ทีม. R: ภาษาและสภาพแวดล้อมสำหรับการคำนวณทางสถิติ (มูลนิธิอาร์เพื่อการคำนวณทางสถิติ พ.ศ. 2558)

Zhu, Z. , González, F. & Huangfu, D. แพลตฟอร์ม iCRISPR สำหรับการแก้ไขจีโนมอย่างรวดเร็วในเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent ของมนุษย์ วิธีการ เอนไซม์. 546, 215–250 (2014)

ฮิลล์, เจ. ที. และคณะ Poly peak parser: วิธีการและซอฟต์แวร์สำหรับการระบุอินเดลที่ไม่รู้จักโดยใช้การจัดลำดับ Sanger ของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส กำลังพัฒนา ไดน์. 243, 1632–1636 (2014)

Cradick, T. J. , Qiu, P. , Lee, C. M. , Fine, E. J. & Bao, G. COSMID: เครื่องมือบนเว็บสำหรับระบุและตรวจสอบ CRISPR/Cas ไซต์นอกเป้าหมาย มล. เธอ. กรดนิวคลีอิก 3, e214 (2014)

Shi, Y. , Kirwan, P. & Livesey, F. J. กำหนดความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent ของมนุษย์กับเซลล์ประสาทในสมองและโครงข่ายประสาท โปรโตคอลธรรมชาติ 7, 1836–1846 (2012)

Ran, F.A. และคณะ Double nicking โดย RNA-guided CRISPR Cas9 เพื่อเพิ่มความจำเพาะในการแก้ไขจีโนม เซลล์ 154, 1380–1389 (2013)

Jonsson, T. และคณะ การกลายพันธุ์ใน แอป ป้องกันโรคอัลไซเมอร์และการลดลงของความรู้ความเข้าใจที่เกี่ยวข้องกับอายุ ธรรมชาติ 488, 96–99 (2012)


บทนำ

การเติมเต็มระหว่างอัลลีลถูกกำหนดให้เป็นความสามารถของอัลลีลที่กลายพันธุ์ที่ต่างกันสองอัลลีลเพื่อทำงานร่วมกันได้ดีกว่าอัลลีลทั้งสองที่สามารถทำได้ด้วยตัวเอง แม้จะมีความเป็นสากลที่ใกล้เคียงกันในสิ่งมีชีวิตระดับล่าง [1] ศักยภาพในการมีส่วนทำให้เกิดความแตกต่างทางคลินิกในโรคของมนุษย์นั้นแทบจะไม่ได้รับการพิจารณา หลักฐานของการเสริม interallelic ที่ loci ที่เกี่ยวข้องทางคลินิกนั้น จำกัด เฉพาะการศึกษาทางชีวเคมีและเซลล์เกี่ยวกับความผิดปกติของการเผาผลาญจำนวนหนึ่งที่มีข้อบกพร่องในเอนไซม์รวมถึง propinyl-CoA คาร์บอกซิเลส [2], argininosuccinate lyase [3], galactose-1-phosphate uridylyltransferase [4 ] และเมทิลมาโลนิล CoA มิวเตส [5]

เฮเทอโรไซโกตแบบผสมคือบุคคลที่มีอัลลีลกลายพันธุ์ที่แตกต่างกันสองอัลลีลที่มียีนเดียวกัน ในกรณีที่ไม่มีอัลลีลที่โดดเด่น (ชนิดพันธุ์ป่า [น้ำหนัก]) อันตรกิริยาทางพันธุกรรมระหว่างอัลลีลแบบถอย (ที่กล่าวถึงในที่นี้เป็นผล 𠇋iallelic”) อาจส่งผลให้เกิดผลลัพธ์ทางฟีโนไทป์ที่แตกต่างกันซึ่งรวมถึงการเติมเต็มระหว่างอัลลีล แม้ว่าอาการของโรคจะดีขึ้นโดยการเสริม interallelic จะสร้างอคติในการตรวจทางคลินิก แต่การขาดหลักฐานเกี่ยวกับการเสริม interallelic หรือผล biallelic อื่น ๆ ในโรคของมนุษย์น่าจะเกิดจากความยากลำบากในการแยกแยะผลกระทบดังกล่าวจากสภาพแวดล้อมและภูมิหลังทางพันธุกรรม

XPD เข้ารหัสหนึ่งในสองส่วนประกอบเฮลิเคสของการถอดรหัสพื้นฐาน/ปัจจัยซ่อมแซม DNA IIH (TFIIH) ซึ่งเป็นคอมเพล็กซ์มัลติฟังก์ชั่น 10 ยูนิตซึ่งจำเป็นสำหรับกระบวนการหลายอย่าง รวมถึงการเริ่มต้นการถอดรหัสพื้นฐานและการซ่อมแซมความเสียหายของ DNA ผ่านเส้นทางการซ่อมแซมการตัดออกของนิวคลีโอไทด์ (NER) [6,7]. การเปลี่ยนแปลงใน XPD ส่งผลให้ฟังก์ชัน TFIIH บกพร่องนั้นสัมพันธ์กับความผิดปกติของระบบหลายระบบที่ไวต่อแสง UV รวมถึง xeroderma pigmentosum (XP), XP ร่วมกับกลุ่มอาการค็อกเคน (CS) และไตรโคไทโอดีสโตรไฟ (TTD) [8�] XP ถูกทำเครื่องหมายด้วยความผิดปกติของเม็ดสีที่เกิดจากแสงแดดและมีความเสี่ยงมะเร็งผิวหนังเพิ่มขึ้นมากกว่า 1,000 เท่า กรณีที่รุนแรงสามารถเกิดขึ้นได้ด้วยการชะลอการเจริญเติบโตและการเสื่อมของระบบประสาทขั้นต้น [11] ในทางกลับกัน CS และ TTD เป็นความผิดปกติของ progeroid แบบปล้องที่โดดเด่นด้วยความล้มเหลวในการเจริญเติบโตหลังคลอดแบบก้าวหน้าและการทำลายล้างเบื้องต้นทำให้เกิดความผิดปกติของระบบประสาทอย่างรุนแรง แต่ไม่มีความโน้มเอียงของมะเร็งที่ชัดเจน [12�] ผู้ป่วยที่มี TTD ยังแสดงผมและเล็บเปราะขาดกำมะถันและผิวหนังที่เป็นเกล็ด [13] ซึ่งเป็นผลมาจากข้อบกพร่องในการถอดรหัสพื้นฐานในเซลล์บางประเภท [16,17] ความผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับความโน้มเอียงของมะเร็งของ XP ร่วมกับภาวะแทรกซ้อนทางระบบประสาทของ CS (XPCS) แม้ว่าจะพบได้ยากก็ตาม [18]

มากมาย XPD การกลายพันธุ์เกี่ยวข้องกับฟีโนไทป์เฉพาะของโรค (เช่น XPD R722W กับ TTD และ XPD R683W ที่มี XP) และด้วยเหตุนี้จึงถูกมองว่าเป็นสาเหตุของกลุ่มอาการที่สอดคล้องกัน อัลลีลที่ไม่สัมพันธ์กับความผิดปกติเพียงอย่างเดียวถือเป็นอัลลีล “likely null” [19,20] อัลลีลเหล่านี้บางส่วนล้มเหลวในการสนับสนุนการมีชีวิตในเดี่ยว ชิโซแซ็กคาโรไมซิสปอมเบ ยีสต์สายพันธุ์ที่มีการกลายพันธุ์เป็นโมฆะใน XPD คล้ายคลึงกัน rad15 และถือว่าไม่มีกิจกรรมทางชีวภาพที่สำคัญ [19] การจำแนกประเภทอัลลีลนี้เป็นสาเหตุหรือเป็นโมฆะในปัจจุบัน กำหนดสิ่งที่เราเรียกว่าเป็นกระบวนทัศน์ “monoallelic” XPD โรค. อย่างไรก็ตาม การระบุในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาของผู้ป่วยกลุ่มเสริม XP เสริม D ที่มีการนำเสนอโรคที่ผิดปกติ ซึ่งรวมถึงอาการของทั้ง XP และ TTD [8] ทำให้เกิดข้อสงสัยเกี่ยวกับความสามารถของกระบวนทัศน์แบบโมโนอัลเลลิกดังกล่าวในการอธิบายความแตกต่างทางคลินิกในเฮเทอโรไซโกตของสารประกอบ

ก่อนหน้านี้ เราได้สร้างโมเดลเมาส์ TTD (XPD R722W ) ที่จำลองกลุ่มอาการของมนุษย์ [15,21] ที่นี่เรารายงานการสร้างการกลายพันธุ์เพิ่มเติม Xpd อัลลีลที่ล้มเหลวในการสนับสนุนการมีชีวิตได้ด้วยตัวเอง แต่ยังคงรักษาการเสื่อมสภาพก่อนวัยอันเนื่องมาจาก TTD ลักษณะเฉพาะของผิวหนัง ความสามารถในการซ่อมแซม DNA ของเซลล์ และการอยู่รอดของรังสียูวีเมื่อมีอยู่ในสถานะเฮเทอโรไซโกตแบบผสม


การประเมินการแบ่งชั้นความเสี่ยงโรคหัวใจและหลอดเลือด

hypercholesterolemia ในครอบครัวคิดเป็น 5%�% ของ CHD ในผู้ป่วยที่อายุน้อยกว่า 55 ปี28 หากไม่ได้รับการรักษา 50% ของผู้ชายต่างเพศจะพัฒนา CHD ก่อนอายุ 50 และ 100% เมื่ออายุ 70 ​​ปี และประมาณ 12% ของเพศหญิงที่มีความหลากหลายทางเพศจะมี CHD เมื่ออายุ 50 ปี เพิ่มขึ้นเป็น 74% ภายใน 70 ปี อย่างไรก็ตาม การแสดงออกทางคลินิกของ CHD ในผู้ป่วย FH ที่แตกต่างกันนั้นมีความต่างกันอย่างมากในแง่ของอายุที่เริ่มมีอาการและความรุนแรง CHD มีแนวโน้มที่จะจัดกลุ่มที่มีความถี่สูงกว่าในบางครอบครัว แต่ความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่างบุคคลอาจเกิดขึ้นได้30 แม้กระทั่งในกลุ่มตัวอย่างที่มาจากครอบครัวที่มีการกลายพันธุ์เดียวกันใน LDLR ยีนซึ่งบ่งชี้ว่าปัจจัยทางพันธุกรรมหรือสิ่งแวดล้อมอื่น ๆ มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาของหลอดเลือดใน FH.31 ดังนั้นจึงได้มีการกำหนดปัจจัยเสี่ยงหลายประการสำหรับ FH เพื่อแบ่งชั้นความเสี่ยง การใช้ค่าประมาณความเสี่ยงมาตรฐานสำหรับคอเลสเตอรอลจะประเมินความเสี่ยง CHD ใน FH ต่ำเกินไปอย่างจริงจัง ดังนั้น จึงไม่ควรใช้คะแนนความเสี่ยงของ Framingham ในสถานการณ์นี้ 32,33 ปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญสำหรับ CHD ในผู้ป่วย FH ได้แก่ อายุ (ผู้ชาย ≥ 30 ปีหรือผู้หญิง & #x02265 45 ปี) ผู้สูบบุหรี่อย่างแข็งขัน ประวัติครอบครัวของ CHD ก่อนวัยอันควร (ญาติระดับแรกเพศชาย < 55 ปี หรือ ญาติระดับแรกเพศหญิง < 65 ปี) LDL-C สูงมาก (> 330 มก./เดซิลิตร หรือ 8.5 mmol/L) HDL-C ต่ำ (< 40 mg/dL หรือ 1.0 mmol/L) ความดันโลหิตสูง (> 140/90 mm Hg) เบาหวาน, Lp (a) > 60 mg/dL .20

บุคคลที่ไม่มีอาการที่มี FH ควรได้รับการประเมินสำหรับ CHD แบบไม่แสดงอาการโดยอาศัยการสาธิตของกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือดโดยการทดสอบความเครียด (การทดสอบคลื่นไฟฟ้าหัวใจในการออกกำลังกาย, การตรวจคลื่นไฟฟ้าหัวใจด้วยคลื่นเสียงหรือการทดสอบคลื่นวิทยุนิวไคลด์) หรือการสาธิตของแผ่นโลหะหลอดเลือดหัวใจโดยการถ่ายภาพ perfusion ของกล้ามเนื้อหัวใจ, การตรวจหาแคลเซียมในหลอดเลือดด้วย เอกซเรย์คอมพิวเตอร์ลำแสงอิเล็กตรอนหรือ multislice (เกลียว) CT หลอดเลือดไม่แสดงอาการในตำแหน่งอื่นควรได้รับการประเมินโดยดัชนีข้อเท้าและแขนที่ไม่ลุกลาม การหนาตัวตรงกลางของหลอดเลือดในช่องท้องโดยการตรวจด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง และการตรวจด้วยคลื่นเสียงในช่องท้องเพื่อตรวจหาหลอดเลือดโป่งพองของหลอดเลือด20


NS C. elegans จีโนม

C. elegans เป็นสิ่งมีชีวิตยูคาริโอตหลายเซลล์ตัวแรกที่มีลำดับจีโนมของมัน (C. elegans การจัดลำดับ Consortium 1998). เป็นข้อมูลลำดับจากเพิ่มเติม โรคหลอดเลือดหัวใจตีบ ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา ข้อมูลจาก C. elegans ได้ให้พื้นฐานสำหรับการศึกษาจีโนมเปรียบเทียบที่หลากหลาย (Coghlan 2005) ทั้งหมด C. elegans จีโนมคือ 100 Mb (C. elegans Sequencing Consortium 1998) และมียีนเข้ารหัสโปรตีน 20,444 ยีน (WormBase release WS245, ตุลาคม 2014) ทั้งคู่ C. elegans เพศประกอบด้วยโครโมโซมออโตโซม 5 อันที่ชื่อกลุ่มเชื่อมโยง (LG) I, II, III, IV และ V และโครโมโซม X ยีนแต่ละตัวของ C. elegans ถูกจัดเรียงในรูปแบบยูคาริโอตทั่วไปโดยมีบริเวณที่ไม่ได้แปล 5′, กรอบการอ่านแบบเปิด (ORF) ที่มีเอ็กซอนและอินตรอน และบริเวณที่ไม่ได้แปล 3′ เมื่อเทียบกับยีนของสัตว์มีกระดูกสันหลัง C. elegans ยีนมีขนาดค่อนข้างเล็กโดยมีขนาดยีนเฉลี่ย 3 kb เนื่องจากการมีอยู่ของอินตรอนที่เล็กมาก (Spieth and Lawson 2006) C. elegans ยีนยังมีอินตรอนขนาดปกติจำนวนมาก) โครโมโซมไม่มีเซนโตรเมียร์แบบดั้งเดิมระหว่างไมโทซิสที่สปินเดิลไมโครทูบูลยึดติดกับตำแหน่งมากกว่าหนึ่งตำแหน่งตามโครโมโซม อันที่จริง ลำดับที่จำเพาะดูเหมือนจะไม่จำเป็นสำหรับการยึดติดเนื่องจากทรานส์ยีนที่มี DNA นอกโครโมโซมสามารถสืบทอดได้ตลอดการแบ่งตัวของเซลล์จำนวนมาก

NS C. elegans จีโนมมีสองลักษณะที่ผิดปกติ: mRNA ที่เข้ารหัสโปรตีนส่วนใหญ่คือ ทรานส์- spliced ​​และยีนบางตัวจัดอยู่ในโอเปอรอน (Blumenthal 2005) ทรานส์- splicing เป็นการเพิ่มลำดับผู้นำ 22-นิวคลีโอไทด์หนึ่งในสองลำดับ (SL1 และ SL2) ที่ส่วนปลาย 5′ ของ mRNA เชื่อว่าลำดับผู้นำจะช่วยในการเริ่มต้นการแปล และเนื่องจากทราบลำดับ SL1/2 จึงสามารถใช้ในการทดลองเพื่อระบุลำดับที่ปลาย mRNA 5′ บาง C. elegans mRNA เกิดขึ้นจากการถอดเสียงแบบหลายยีนด้วย mRNA แรกที่ต่อเข้ากับ SL1 และ mRNA ที่ตามมาเป็น SL2 ยีนที่เข้ารหัสสำหรับการถอดเสียงเหล่านี้มีระยะห่างกันอย่างใกล้ชิดและถูกคัดลอกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์เพียงตัวเดียว การถอดเสียงเหล่านี้คล้ายกับที่ผลิตโดยแบคทีเรียตัวดำเนินการและรหัสสำหรับผลิตภัณฑ์ยีนที่แสดงร่วมกัน (Blumenthal 2005) อย่างไรก็ตาม มีความแตกต่างกันตรงที่การถอดเสียงที่ประมวลผลแล้วใน C. elegans สร้าง mRNA หลายตัว การทดลองในอดีตบ่งชี้ว่า DNA ไม่ได้ถูกเมทิลเลตใน C. elegansแต่เมื่อเร็ว ๆ นี้ การศึกษาความละเอียดที่สูงขึ้นได้ชี้ให้เห็นว่าเมทิลเลชันบางอย่างเกิดขึ้น (Hu และคณะ 2558). ลักษณะของการควบคุมยีน เช่น การถอดรหัส การแปล การเปลี่ยนแปลงของโครมาติน และการดัดแปลงหลังการถอดรหัส (การแพร่หลาย ฟอสโฟรีเลชัน ฮิสโตนเมทิเลชัน และไกลโคซิเลชัน) ล้วนได้รับการศึกษาโดยใช้เครื่องมือทางพันธุกรรมของ C. elegans.


ดร.ลูอิส-สมิธรายงานว่าไม่มีการเปิดเผยข้อมูล นางสาวคาเมอร์ได้รับการสนับสนุนงานวิจัยจากมูลนิธิวิทยาศาสตร์แห่งชาติ ดร. Griffin, Childs และ Psyden รายงานว่าไม่มีการเปิดเผยข้อมูล Dr. Titov ได้รับการสนับสนุนด้านการวิจัยจาก Tosteson และ Fund for Medical Discovery ดร. Duff, Pyle และ Taylor รายงานว่าไม่มีการเปิดเผยข้อมูล Dr. Yu-Wai-Man ได้รับการสนับสนุนด้านการวิจัยจากสภาวิจัยทางการแพทย์ ดร. Ramesh และ Horvath รายงานว่าไม่มีการเปิดเผยข้อมูล Dr. Mootha ดำรงตำแหน่งคณะกรรมการที่ปรึกษาทางวิทยาศาสตร์ของ Raze Therapeutics เป็นที่ปรึกษาให้กับ Raze Therapeutics ได้รับรางวัลวิทยากรกิตติมศักดิ์จากวิทยาลัยวิชาการ มหาวิทยาลัย และโรงพยาบาล และได้รับการสนับสนุนด้านการวิจัยจาก NIH และ Howard Hughes Medical Institute Dr. Chinnery เป็นบรรณาธิการของ สมอง และได้รับการสนับสนุนงานวิจัยจาก Medical Research Council และ Wellcome Trust ไปที่ Neurology.org/ng เพื่อดูแบบฟอร์มการเปิดเผยข้อมูลแบบเต็ม

พีเอฟซี เป็น Wellcome Trust Senior Fellow in Clinical Science (101876/Z/13/Z) และ UK NIHR Senior Investigator ที่ได้รับการสนับสนุนจาก Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UP_1501/2), Wellcome Trust Center for Mitochondrial Research (096919ZZ) /11/Z), Medical Research Council (UK) Center for Translational Muscle Disease (G0601943), EU FP7 TIRCON และ National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Center ซึ่งตั้งอยู่ที่โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยเคมบริดจ์ NHS Foundation Trust และ มหาวิทยาลัยเคมบริดจ์. ร.ว.ท. ได้รับทุนจาก Wellcome Trust Center for Mitochondrial Research (096919Z/11/Z), Medical Research Council (UK) Center for Translational Muscle Disease (G0601943), Lily Foundation และ UK NHS ผู้เชี่ยวชาญเฉพาะทาง “ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียที่หายากของ ผู้ใหญ่และเด็ก” บริการในนิวคาสเซิลอะพอนไทน์ P.Y.-W.-M. เป็น Medical Research Council (MRC, UK) Clinician Scientist (G1002570) P.Y.-W.-M. ยังได้รับเงินทุนจาก Fight for Sight (UK) และสถาบันวิจัยสุขภาพแห่งชาติของสหราชอาณาจักร (NIHR) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของความร่วมมือด้านการวิจัยการแปลโรคที่หายาก วี.เค.เอ็ม. เป็นนักวิจัยของสถาบันการแพทย์ Howard Hughes ความคิดเห็นที่แสดงเป็นความคิดเห็นของผู้เขียนและไม่จำเป็นต้องเป็นความคิดเห็นของ NHS, NIHR หรือ Department of Health


กิจกรรม

ต่อไปนี้เป็นรายการคำศัพท์ทางพันธุศาสตร์โดยย่อและ แมลงหวี่ สัญกรณ์ที่ใช้ในกิจกรรมนี้

ยีน หน่วยข้อมูลทางพันธุกรรมที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอ

อัลลีล หนึ่งในรูปแบบทางเลือกของยีน

ฟีโนไทป์ ลักษณะของสิ่งมีชีวิตที่แสดงออก

จีโนไทป์ การสร้างพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต

โฮโมไซกัส มีอัลลีลที่เหมือนกันสองอัลลีลสำหรับลักษณะเฉพาะ

heterozygous การมีอัลลีลที่แตกต่างกันสองอัลลีลสำหรับลักษณะเฉพาะ

อัลลีลที่โดดเด่น ในสภาวะเฮเทอโรไซกัส อัลลีลที่แสดงออกมา

อัลลีลถอย ในสภาวะ heterozygous อัลลีลที่ไม่แสดงออก

แบบป่า บุคคลที่มีฟีโนไทป์ปกติ นั่นคือ ฟีโนไทป์ที่พบโดยทั่วไปในประชากรตามธรรมชาติของสิ่งมีชีวิต

กลายพันธุ์ บุคคลที่มีฟีโนไทป์ที่แตกต่างจากฟีโนไทป์ปกติ

  • ประเภทไวด์ถูกกำหนดด้วย “+” สำหรับอัลลีลใดๆ
  • การกลายพันธุ์ถูกกำหนดโดยตัวอักษรหรือตัวอักษรที่เกี่ยวข้องกับฟีโนไทป์ของการกลายพันธุ์
  • การกลายพันธุ์ที่สืบทอดมาแบบถอยกลับเขียนด้วยอักษรตัวพิมพ์เล็ก
  • การกลายพันธุ์ที่สืบทอดมาอย่างเด่นชัดเป็นตัวพิมพ์ใหญ่
  • การกลายพันธุ์ของ X-linked ถูกเขียนเป็นตัวยกให้กับโครโมโซม X (เช่น X w ) โครโมโซม Y ยังระบุสำหรับผู้ชายอีกด้วย
  • จีโนไทป์ที่เขียนจะแสดงอัลลีลสองอัลลีลที่คั่นด้วยเครื่องหมายทับ (เช่น +/vg).
  • การถ่ายทอดทางพันธุกรรม
  • ชีววิทยาพัฒนาการ
  • ปัญหาสุขภาพของมนุษย์ (เช่น โรคพิษสุราเรื้อรัง)

  1. ให้นักเรียนเปิดหน้านักเรียนในคอมพิวเตอร์หรือแจกเอกสาร
  2. ฉายภาพแมลงวันประเภทป่าสองตัว (ภาพ “A”)
    • ให้นักเรียนอ่านข้อความและตอบคำถามเกี่ยวกับแมลงวันป่า
    • นำการอภิปรายเกี่ยวกับสิ่งที่พวกเขาสังเกตเห็น จากนั้นแนะนำแนวคิดของ ฟีโนไทป์.
    • ขอแสดงความยินดีกับนักเรียนที่รู้ว่าแมลงวันเป็นตัวผู้และตัวเมีย บอกพวกเขาว่าแมลงวันที่มีผิวคล้ำเข้มที่ปลายท้องเป็นตัวผู้
  3. ภาพโครงการ “B” แมลงวันป่าที่จับคู่กับกลายพันธุ์ร่องรอย (อย่าบอกชื่อแมลงวันกลายพันธุ์จนกว่าพวกเขาจะสังเกตได้)
    • ให้นักเรียนเปรียบเทียบแมลงวันทั้งสองและกรอกคอลัมน์คำอธิบายในตาราง
    • บอกนักเรียนว่าฟีโนไทป์ของแมลงวันตัวนี้เป็น “ร่องรอย” เพราะมีปีกที่แข็งแรง และให้พวกเขาบันทึกไว้
  4. ทำซ้ำ #3 กับแมลงวันที่เหลือแต่ละชุด

บันทึก: แมลงวันกลายพันธุ์สุดท้าย ตาสีขาว เป็นฟีโนไทป์ที่มองเห็นได้ง่าย แต่รูปแบบการสืบทอด (X-linked) เหมาะที่สุดกับนักเรียนขั้นสูง สำหรับบทเรียนเบื้องต้น คุณอาจต้องการข้ามขั้นตอนนี้

  • เตือนนักเรียนว่าด้วยการกลายพันธุ์ที่โดดเด่น แต่ละคนสามารถมีจีโนไทป์ที่เป็นไปได้สองแบบ
  • หากคุณรวมแมลงวันตาขาวไว้ด้วย นักเรียนจะต้องได้รับการแนะนำให้รู้จักกับแนวคิดเกี่ยวกับลักษณะที่เกี่ยวข้องกับเพศ และพวกเขาจะต้องพิจารณาถึงยีนของแมลงวันตัวผู้และตัวเมีย

เกือบ 100 ปีที่แมลงวันผลไม้ แมลงหวี่ melanogaster มีบทบาทสำคัญในการวิจัยทางพันธุศาสตร์และอณูชีววิทยา ในกิจกรรมนี้ เราได้เลือกแมลงวันกลายพันธุ์ที่มองเห็นรูปแบบต่างๆ ได้ง่าย และใช้พวกมันเป็นกระดานกระโดดน้ำเพื่อช่วยให้นักเรียนเรียนรู้เกี่ยวกับฟีโนไทป์ จีโนไทป์ และรูปแบบการถ่ายทอดทางพันธุกรรม

แมลงวันป่าตัวผู้และตัวเมีย
ชายและหญิงมีลักษณะแตกต่างกันบ้าง ความแตกต่างอย่างหนึ่งที่มองเห็นได้ง่ายในโฟโตไมโครกราฟคือตัวผู้จะมีสีคล้ำขึ้นที่ส่วนปลายของช่องท้อง (ความแตกต่างอื่นๆ คือ ปลายหน้าท้องของตัวผู้จะกลมในขณะที่ตัวเมียจะแหลม และตัวผู้มี “หวีทางเพศ” ซึ่งเป็นบริเวณขนสีเข้มที่ขาหน้าซึ่งตัวเมียไม่มี แต่จะเห็นความแตกต่างเหล่านี้ได้ยาก ภาพ)

ฟีโนไทป์และจีโนไทป์
ฟีโนไทป์ลักษณะทางกายภาพถูกกำหนดโดย จีโนไทป์หรือลักษณะทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต ลักษณะของยีนเดี่ยวถูกกำหนดโดยอัลลีลสองอัลลีล หนึ่งอัลลีลได้รับมาจากมารดาและอีกอัลลีลมาจากบิดา ฟีโนไทป์เป็นคำอธิบาย ในขณะที่จีโนไทป์ในกรณีนี้คือคู่ของอัลลีลที่แต่ละอัลลีลอาจเหมือนกัน (homozygous เช่น +/+, vg/vg) หรือต่างกัน (เฮเทอโรไซกัส เช่น +/vg Cy/+).

รูปแบบการสืบทอด
เมื่อต้องใช้อัลลีลเดียวกันสองสำเนาเพื่อแสดงฟีโนไทป์เฉพาะ เราบอกว่ารูปแบบการสืบทอดสำหรับคุณลักษณะนั้นคือ ถอย. ตัวอย่างเช่น ลักษณะร่องรอยเป็นกรรมพันธุ์ถอย จีโนไทป์ของแมลงวันร่องรอยต้องเป็น vg/vg. การกลายพันธุ์แบบถอยถอยอื่น ๆ ในกิจกรรมนี้คือไม่มีตาและไม้มะเกลือ ตัวอย่างลักษณะของมนุษย์ที่มีแนวโน้มว่าจะสืบทอดมาแบบด้อยคือยอดของหญิงม่าย (เส้นผมของบุคคลมาถึงจุดที่ด้านบนของหน้าผาก) เมื่อต้องมีอัลลีลเพียงตัวเดียวในการแสดงคุณลักษณะ เช่นเดียวกับกรณีที่มีการกลายพันธุ์ปีกหยิก รูปแบบการสืบทอดของมันคือ ที่เด่น. จีโนไทป์ของแมลงวันปีกหยิกอาจเป็น ไซ/+ หรือ ไซ/ย. ตัวอย่างของลักษณะที่สืบทอดมาอย่างเด่นชัดในมนุษย์คือสำหรับ achondroplasia ซึ่งเป็นรูปแบบหนึ่งของคนแคระ

จีโนไทป์ของแมลงวันป่า
เมื่อเราสังเกตแมลงวันที่มีลักษณะเป็นสัตว์ป่า และเรากำลังพิจารณาถึงจีโนไทป์ของแมลงวัน เราไม่รู้จริงๆ ว่ามันเป็น homozygous หรือ heterozygous สำหรับการกลายพันธุ์แบบถอยกลับ มันอาจมีอัลลีลหนึ่งอัลลีลที่เป็นไวด์ ตัวอย่างเช่น สำหรับสีร่างกาย และอัลลีลที่ด้อย เช่น อัลลีลไม้มะเกลือ เนื่องจากไม้มะเกลือได้รับการถ่ายทอดทางพันธุกรรมอย่างถดถอย เรารู้ว่าแมลงวันป่าต้องมีอัลลีลอย่างน้อยหนึ่งอัลลีลที่เป็นประเภทไวด์สำหรับสีร่างกาย เราสามารถค้นพบจีโนไทป์ของมันได้โดยทำการผสมข้ามพันธุ์กับโฮโมไซโกตแบบถอย ในตัวอย่างนี้ แมลงวันไม้มะเกลือ แนวคิดนี้ครอบคลุมในกิจกรรม Genetic Crosses

การกลายพันธุ์แบบ X-linked
การกลายพันธุ์ของตาขาวเป็นการกลายพันธุ์ของแมลงวันครั้งแรกที่ค้นพบ มันเป็น X-เชื่อมโยง, หรือ เกี่ยวพันทางเพศ, การกลายพันธุ์ เช่นเดียวกับมนุษย์ แมลงวันที่มีโครโมโซม X สองตัวเป็นตัวเมีย และแมลงวันที่มี X หนึ่งตัวและ Y หนึ่งตัวเป็นตัวผู้ ในแมลงวันผลไม้ โครโมโซม Y มีโครงสร้างที่แตกต่างจากโครโมโซม X และไม่มียีนที่เป็นส่วนประกอบกับยีนที่อยู่ใน X ดังนั้นยีนใดๆ ที่อยู่บน X ในตัวผู้จะแสดงออกมา ในขณะที่กฎปกติ การถ่ายทอดทางพันธุกรรมแบบเด่นและด้อยใช้กับแมลงวันเพศเมียเพราะมีโครโมโซม X สองอัน ผู้ชายที่มีตาขาวจะต้องมีการกลายพันธุ์สีขาวบนโครโมโซม X ตัวเดียว ในแมลงวันตัวเมีย การกลายพันธุ์สีขาวนั้นสืบทอดอย่างด้อย ดังนั้นการกลายพันธุ์สีขาวสองชุดจึงจำเป็นในการสร้างตัวเมียที่มีตาขาว

สนับสนุนโดย รางวัลพันธมิตรการศึกษาวิทยาศาสตร์ (SEPA) จากศูนย์ทรัพยากรการวิจัยแห่งชาติ สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, และ มูลนิธิ David และ Lucile Packard


คาร์ดิโอไมโอแพทีแบบขยายในหนูกลายพันธุ์โปรตีนซีที่จับกับไมโอซินที่เป็นโฮโมไซกัส

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย McConnell, B. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 Division of Cardiology, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย Aristizabal, O. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 Division of Cardiology, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย Turnbull, D. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย Georgakopoulos, D. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 Division of Cardiology, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย Niimura, H. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย Fischman, D. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย Seidman, C. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Department of Genetics, Howard Hughes Medical Institute and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA 2 แผนกโรคหัวใจและหลอดเลือดและ Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 3 แผนกหัวใจและหลอดเลือด ภาควิชาแพทยศาสตร์ Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 4 Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine, New York, New York 10016, สหรัฐอเมริกา 5 แผนกโรคหัวใจ, The Johns Hopkins Medical Institute, Baltimore, Maryland 21287, USA 6 Department ของ Molecular Cardiology, Lerner Research Institute, The Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, Ohio 44195, USA 7 Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts 02115, USA 8 Department of Cell Biology, Weill Medical College of Cornell University, New York , New York 10021, USA

ติดต่อกับ Jonathan Seidman, Department of Genetics, Harvard Medical School, 200 Longwood Avenue, Alpert Building, Boston, Massachusetts 02115, USA โทรศัพท์: (617) 432-7871 โทรสาร: (617) 432-7832 อีเมล: [email protected]

ค้นหาบทความโดย Seidman, J. ใน: JCI | PubMed | Google Scholar

Published พฤศจิกายน 1, 1999 - ข้อมูลเพิ่มเติม

เพื่อชี้แจงบทบาทของ cardiac myosin-binding protein-C (MyBP-C) ในโครงสร้างและการทำงานของกล้ามเนื้อหัวใจ เราได้ผลิตหนูที่แสดงรูปแบบของโปรตีน sarcomere ที่เปลี่ยนแปลงไป การกลายพันธุ์ที่ออกแบบทางวิศวกรรมเข้ารหัสรูปแบบที่ถูกตัดทอนของ MyBP-C ซึ่งโดเมนการจับสายหนักของ myosin ของหัวใจและโดเมนการจับไทตินถูกแทนที่ด้วยเรซิดิวกรดอะมิโนชนิดใหม่ ข้อบกพร่องของเฮเทอโรไซกัสที่คล้ายคลึงกันในมนุษย์ทำให้เกิดคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic หนูเมาส์ที่เป็นโฮโมไซกัสสำหรับอัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์จะแสดงโปรตีนที่ถูกตัดปลายน้อยกว่า 10% ในแถบ M ของซาร์โคมีร์ปกติอย่างอื่น หนูเมาส์ที่เป็นโฮโมไซกัสที่มีอัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์นั้นใช้ได้แต่แสดงการโจมตีของทารกแรกเกิดของคาร์ดิโอไมโอแพทีที่ขยายตัวแบบก้าวหน้าที่มีจุลพยาธิวิทยาที่โดดเด่นของ myocyte hypertrophy, myofibrillar disarray, fibrosis และ dystrophic calcification Echocardiography ของหนูกลายพันธุ์ homozygous แสดงให้เห็นการขยายตัวของหัวใจห้องล่างซ้ายและการหดตัวของกล้ามเนื้อหัวใจตายเมื่อแรกเกิดลดลงเมื่อสัตว์โตเต็มที่ การวิเคราะห์ปริมาตรความดันของหัวใจห้องล่างซ้ายในหนูทดลองที่กลายพันธุ์ homozygous ที่โตเต็มวัยพบว่ามีการหดตัวของซิสโตลิกที่หดหู่และมีความผิดปกติของไดแอสโตลิก ข้อมูลเหล่านี้แก้ไขความเข้าใจของเราเกี่ยวกับบทบาทที่ MyBP-C เล่นในการสร้างกล้ามเนื้อกระตุกหัวใจ (myofibrillogenesis) ในระหว่างการพัฒนาของหัวใจ และบ่งชี้ถึงความสำคัญของโปรตีนนี้สำหรับการทำงานของซาร์โคเมียร์ในระยะยาวและลักษณะทางสัณฐานวิทยาของหัวใจตามปกติ นอกจากนี้เรายังเสนอว่าหนูที่มีภาวะ hypertrophic cardiomyopathy ในครอบครัวที่เป็น homozygous อาจเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในการทำนายความรุนแรงของโรคที่การกลายพันธุ์เหล่านี้จะก่อให้เกิดในมนุษย์

โรคหัวใจขาดเลือดเกินและพองเป็นพยาธิสภาพที่สำคัญที่เพิ่มมวลกล้ามเนื้อหัวใจ แม้ว่าจะมีรูปแบบการเปลี่ยนแปลงที่แตกต่างกันออกไป (ทบทวนในการอ้างอิง 1 , 2 ) คาร์ดิโอไมโอแพที Hypertrophic ทำให้เกิดผนังหน้าท้องหนาขึ้นโดยไม่เพิ่มปริมาตรของหัวใจห้องล่าง ในขณะที่ทั้งความหนาของผนังและปริมาตรของห้องเพิ่มขึ้นในโรคกล้ามเนื้อหัวใจตายขยาย พารามิเตอร์การหดตัวยังแยกแยะความแตกต่างระหว่างโรคเหล่านี้ได้โดยรักษาหรือปรับปรุงการทำงานของซิสโตลิกในหัวใจที่มีภาวะ hypertrophic แต่ลดลงใน cardiomyopathy พอง ในขณะที่เหตุการณ์ที่กระตุ้นให้เกิดโรคเหล่านี้มักจะแตกต่างกัน การสังเกตทางคลินิกบ่งชี้ว่าสัญญาณระดับโมเลกุลและ/หรือเหตุการณ์ในเซลล์มีความทับซ้อนกันที่อาจเกิดขึ้นได้ซึ่งสร้างหัวใจขึ้นมาใหม่ เนื่องจากผู้ป่วยโรคคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic บางรายพัฒนาฟีโนไทป์ขยาย

การกลายพันธุ์ใน cardiac myosin-binding protein-C (MyBP-C) คิดเป็นประมาณ 20% ของ familial hypertrophic cardiomyopathy (FHC) (3-7) ในขณะที่การกลายพันธุ์ของโปรตีน sarcomere อื่น ๆ ที่มีส่วนร่วมในการสร้างแรงคาดว่าจะทำให้เกิด FHC โดยผลกระทบด้านลบที่เด่นชัดต่อคุณสมบัติการหดตัว กลไกที่ข้อบกพร่องของ MyBP-C ของหัวใจทำให้เกิด FHC มีความแน่นอนน้อยกว่า (ทบทวนในการอ้างอิง 8 , 9 ). MyBP-C เป็นโปรตีน myofibrillar ขนาดใหญ่และอุดมสมบูรณ์ โดยมีหน้าที่ทั้งโครงสร้างและการควบคุม (10) ในระหว่างการพัฒนาของหัวใจ การแสดงออกของ MyBP-C สอดคล้องกับการเริ่มต้นของ myofibrillogenesis และเชื่อว่าลวดลายคล้ายไฟโบรเนกติน 3 แบบมีความจำเป็นสำหรับการประกอบเส้นใยหนา ในหัวใจที่โตเต็มที่ MyBP-C พบได้ในแถบขวาง 7-9 เส้น (ระยะห่างประมาณ 43 นาโนเมตร) ซึ่งอยู่ในโซน C ของแถบซาร์โคเมียร์ A ( 11 – 13 ) ในขณะที่ MyBP-C ไม่ได้มีส่วนร่วมโดยตรงในการสร้างแรง ฟอสโฟรีเลชั่นแบบย้อนกลับได้โดยโปรตีนไคเนส A ที่ขึ้นกับแคมป์ (14) และไคเนสโปรตีนที่ขึ้นกับแคลเซียม/คาลโมดูลิน ( 15 ) อาจส่งผลต่อการทำงานของการหดตัวโดยการกระตุ้นหัวใจแอคโตไมโอซิน ATPase ( 16 ) หรือมีอิทธิพล การสร้างแรงตึงของ myofibril และความเร็วการหดตัว ( 17 ) การกลายพันธุ์ MyBP-C ที่ก่อให้เกิด FHC หกตัวที่คาดการณ์ว่าจะเข้ารหัสพอลิเปปไทด์ที่ถูกตัดปลาย (3 – 5 ) ที่ไม่มีคาร์บอกซิลเรซิดิวที่จำเป็นในการจับสายหนักของไมโอซินและไทตินและมีเรซิดิวใหม่ที่ปลายคาร์บอกซิลของพวกมันได้รับการอธิบายไว้ FHC เป็นลักษณะเด่นของ autosomal และบุคคลที่ได้รับผลกระทบจะมีลักษณะต่างกันสำหรับการกลายพันธุ์เหล่านี้ บุคคลที่มีการกลายพันธุ์ที่ก่อให้เกิด FHC ทั้ง 6 เหล่านี้มีรูปแบบที่คล้ายคลึงกันทางคลินิกของ FHC กลไกที่ FHC ก่อให้เกิดการกลายพันธุ์ MyBP-C รบกวนโครงสร้างและการทำงานของหัวใจ เนื่องจากไม่พบเปปไทด์ที่กลายพันธุ์หรือระดับที่ลดลงของ MyBP-C ในเนื้อเยื่อหัวใจจากผู้ป่วยที่ได้รับผลกระทบ (18)

เราได้สร้างหนูที่มียีน MyBP-C ของหัวใจในหนูที่เปลี่ยนแปลงโดยกลายพันธุ์ซึ่งเข้ารหัสเปปไทด์ที่ถูกตัดทอน ซึ่งคล้ายกับที่พบในโรคกล้ามเนื้อหัวใจตายเกินในมนุษย์ แม้ว่าผู้ป่วย FHC จะเป็น heterozygous แต่มี 1 มิวแทนท์และ 1 อัลลีล MyBP-C ชนิด wild เราได้เพาะพันธุ์หนูที่มีอัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์เป็น homozygosity เพื่อให้พวกมันมีเฉพาะอัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์เท่านั้น โปรตีน MyBP-C ปกติไม่สามารถแสดงออกในเนื้อเยื่อหัวใจของหนูเหล่านี้ และเปปไทด์ MyBP-C ที่กลายพันธุ์ถูกพบที่ระดับที่ลดลงอย่างเห็นได้ชัด เราตั้งสมมติฐานว่าหนูที่เป็นโฮโมไซกัสที่มีอัลลีล MyBP-C กลายพันธุ์อาจมีฟีโนไทป์ของหัวใจที่แตกต่างจากหนูทดลองที่มีอัลลีลที่กลายพันธุ์เพียงตัวเดียวและอัลลีลชนิดพันธุ์ป่าเพียงตัวเดียว เราได้ศึกษาโครงสร้างหัวใจและหน้าที่ของหนูเมาส์กลายพันธุ์ที่เป็นโฮโมไซกัสเพื่อกำหนดกลไกที่ดีขึ้นโดยที่ FHC ทำให้เกิดการกลายพันธุ์ MyBP-C เปลี่ยนแปลงสรีรวิทยาของหัวใจ

การสร้างหนู MyBP-C ของหัวใจกลายพันธุ์ homozygous ลำดับ MyBP-C ของ Murine ถูกขยายจาก RNA หัวใจโดย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ 3301F และ 3900R ที่ได้มาจากมนุษย์ที่เผยแพร่ MYBPC3 ลำดับยีน (หมายเลขทะเบียน EMBL X84075) และใช้เพื่อสอบสวนไลบรารีจีโนมย่อย 129SvJ (ไม่ได้เผยแพร่) โคลนแบคทีเรีย λMyBPc ที่มียีน MyBP-C ของหนูถูกแยกออก ซึ่งมีขนาด 7.4-kb Speแฟรกเมนต์ I ถูกคัดลอกย่อยเป็น pBluescript และแสดงคุณลักษณะโดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วน ขอบเขตอินทรอน-เอกซอนถูกอนุมานโดยการเปรียบเทียบกับยีนมนุษย์ (รูปที่ 1a) ชิ้นส่วนปลายทู่ขนาด 2 กิโลไบต์ซึ่งเข้ารหัสยีนนีโอมัยซินที่ขนาบข้างด้วย LoxP ลำดับถูกตัดออกจากพลาสมิด pPTloxPNeo (กรุณาให้โดย J. Rossant) และแทรกลงใน อีโคไซต์ RV ภายใน exon 30

แผนผังของ (NS) โครงสร้างจีโนมของ MyBP-C . แบบป่า, MyBP-C (LoxP), และ MyBP-C(นีโอ) อัลลีล, RNA ที่ผลิตโดยแต่ละอัลลีล, และ (NS) โครงสร้างของโปรตีน MyBP-C ที่เข้ารหัสโดยแต่ละอัลลีล (NS) Exons 29–32 ของยีน MyBP-C ของหัวใจในหนูจะแสดงสำหรับแต่ละอัลลีล (ดูวิธีการ) การกลายพันธุ์เปลี่ยนแปลงเฉพาะ exon 30 exon อื่นทั้งหมดเหมือนกัน เส้นสีดำที่อยู่เหนือแต่ละส่วนของยีนสะท้อนถึงโครงสร้างของ RNA ที่เข้ารหัสซึ่งระบุในการปฐมนิเทศ 5′→3′ เส้นหนาเป็นเอ็กซอนรวมอยู่ใน RNA เส้นบาง ๆ ระบุส่วนที่ข้ามไปของยีนที่ไม่พบในอาร์เอ็นเอ จีโนไทป์ของหนูเมาส์ถูกกำหนดหาด้วยไพรเมอร์ 1F, 1R, 2F, 2R และ 3R ไพรเมอร์ 4F และ 4R ถูกใช้เพื่อกำหนดโครงสร้างของโครงสร้าง MyBP-C RNA ของ RNA ที่อนุมานได้ระบุไว้เหนือแต่ละอัลลีล (NS) โครงสร้างของปลายคาร์บอกซิลของโพลีเปปไทด์ MyBP-C ที่เข้ารหัสโดย MyBP-C(นีโอ) และ MyBP-C(ล็อกซ์) อัลลีลถูกอนุมานได้จากลำดับของอาร์เอ็นเอที่พบในโพรงด้านซ้ายของหนูที่เป็นโฮโมไซกัสที่มีอัลลีลที่ระบุ เรซิดิว (ระหว่างเรซิดิว 1064 และ 1111) ของโปรตีนประเภท wild ถูกเข้ารหัสโดย exon 30 เรซิดิวกรดอะมิโนที่ปลายคาร์บอกซิลของโปรตีนกลายพันธุ์ (ตัวหนา) ถูกเข้ารหัสโดยการเปลี่ยนแปลงการอ่านของ exon 30 (Lox) หรือ exon 31 (นีโอ). โปรตีน MyBP-C ชนิดดั้งเดิมคือกรดอะมิโน 1270 ตัว ในขณะที่โปรตีน MyBP-C(Lox) คือกรดอะมิโน 1240 ตัวที่ยาว ลำดับที่สมบูรณ์ของปลายคาร์บอกซิลทั้งสองนี้จะไม่ปรากฏ จุดสิ้นสุดของคาร์บอกซิลของการกลายพันธุ์ของมนุษย์ที่คล้ายคลึงกันที่พบในแฟมิลี NN (3) ถูกแสดงไว้สำหรับการเปรียบเทียบ ความแตกต่างระหว่างโปรตีน NN ของครอบครัวและโปรตีน MyBP-C(Neo) สะท้อนความแตกต่างของลำดับระหว่างหนูเมาส์และยีน MyBP-C ของมนุษย์ exon 31

โครงสร้างการกำหนดเป้าหมายถูกนำเข้าไปในเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน (ES) และเลือก ( 19 ) โคโลนีถูกคัดกรองสำหรับการรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันโดยการวิเคราะห์ Southern blot โดยใช้โพรบภายนอก (ไม่แสดงข้อมูล) เซลล์ ES ที่เป็นเป้าหมายถูกฉีดเข้าไปในบลาสโตซิสต์ของเมาส์ตามที่อธิบายไว้ (20) ตรวจพบจีโนไทป์จาก DNA ส่วนหางในลูกหลานของสัตว์จำพวกเดียวกันโดยการวิเคราะห์ด้วย PCR (การสอบวิเคราะห์ 25 ไมโครลิตร) โดยใช้ไพรเมอร์ (รูปที่ 1a) เพื่อขยาย exon 30: 1F (CTAGGTACTAACAG GCTCCTGCTT), 1R (CCTACCATGCAGGAAACCAGAATA) และไพรเมอร์: 2F (GGTTACCTTTTT) 2R (GTAGCCGGATCAAGCGTATG) เพื่อขยายเทปนีโอมัยซินที่ใส่

นอกจากนี้ ไคเมริกเมาส์เพศผู้ถูกผสมพันธุ์กับหนูเมาส์แปลงพันธุ์ EIIa-Cre (กรุณาจัดหาโดย H. Westphal, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA อ้างอิงที่ 21 ) เพื่อผลิตลูกหลานที่ LoxP-ขนาบข้าง นีโอ ยีนถูกลบอย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 1a) จีโนไทป์ MyBP-C (Lox) ถูกกำหนดหาโดยการวิเคราะห์ PCR ของ exon 30 และไม่มีลำดับ Neo หนู homozygous สำหรับ MyBP-C(นีโอ) หรือ MyBP-C(ล็อกซ์) อัลลีล (ทั้งสองที่กำหนด MyBP-C t/t ) ถูกผลิตขึ้นโดยการเพาะพันธุ์สัตว์ต่างชนิดกัน

การวิเคราะห์อาร์เอ็นเอ RNA ทั้งหมดแยกได้จากช่องซ้าย (LV) ช่องขวา (RV) และเอเทรียม โดยใช้ Trizol (GIBCO BRL Life Technologies, Frederick, Maryland, USA) และวิเคราะห์โดยขั้นตอน Northern blot มาตรฐาน (22) ตรวจพบ MyBP-C RNA โดยใช้เม็ดมีด 32 P-labeled จากสำเนา cDNA ของเมาส์ที่กำหนด pcMyBPC ซึ่งเข้ารหัส MyBP-C เรซิดิวกรดอะมิโน 582–1110 ตรวจพบ RNA อื่นโดยใช้โพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์จำเพาะการถอดรหัส P-labeled 5′- 32 ตัวพร้อมเงื่อนไขการผสมพันธุ์มาตรฐาน ( 23 ) ดังนี้ Ca 2+ -ATPase (SERCA): 5′-AACAACGCACATGCACGCACCCGAACAC CTT-ATATTTCTGCAAATGG GAPDH: 5′-GGAA-CATGTAGA-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG สัญญาณไฮบริไดเซชันถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA) และปรับให้เป็นมาตรฐานตามความเข้มของสัญญาณที่สังเกตพบด้วยโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่จำเพาะสำหรับ GAPDH RNA นักเรียน NS ทำการทดสอบเพื่อตรวจสอบว่าข้อมูลมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มของหนูหรือไม่

โครงสร้างของ MyBP-C RNA ได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ถูกขยายด้วย RT-PCR โดยใช้สภาวะที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (3) ด้วยไพรเมอร์ 4F (TCAGGTGACCTGGACCAAAGAG) และ 4R (ATGTTATGGCTGAAGACCCGG)

การวิเคราะห์โปรตีน แยกเนื้อเยื่อหัวใจ ล้างใน PBS ของ Dulbecco ซับบนกระดาษกรอง และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ยับยั้งน้ำแข็งเย็น (24 ) ที่มีโพแทสเซียม ไดไฮโดรเจน ฟอสเฟต 50 มิลลิโมลาร์ (KH)24), 70 mM โซเดียมฟลูออไรด์ (NaF) และ 5 mM EDTA, ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอส (5 µg/mL antipain, 10 µg/mL leupeptin, 5 µg/mL pepstatin A, 43 µg/mL PMSF, 5 mM EGTA, และ 0.1 ไมโครโมลาร์ โซเดียม ออร์โธวานาเดต) เศษส่วน Myofibrillar แยกได้จากโฮโมจิเนตของโปรตีนทั้งหมดโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 NS เป็นเวลา 5 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C เม็ดถูกแขวนลอยใหม่ในการยับยั้งบัฟเฟอร์บวก 1% ไทรทัน X-100 myofibrils ที่สกัดด้วยผงซักฟอกถูกหมุนเหวี่ยงอีกครั้งที่ 5000 NS เป็นเวลา 5 นาที และเม็ดถูกแขวนลอยใหม่ในการยับยั้งบัฟเฟอร์

การแยกส่วนของโปรตีนถูกแยกด้วยวิธีมาตรฐานบน 6% polyacrylamide mini gels (การวิเคราะห์ Western blot), 6% polyacrylamide slab gels (หัวใจ α- และ β-myosin heavy chain [MHC] isoforms ref. 25 ) หรือ 12% polyacrylamide slab gels ( โปรตีนทั้งหมด) ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดหาโดยใช้การทดสอบโปรตีนของแบรดฟอร์ด สัดส่วนของการเต้นของหัวใจ α- และ β-MHC ถูกหาปริมาณโดยการวัดความหนาแน่นและซอฟต์แวร์ NIH-Image (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, เบเทสดา, แมริแลนด์, สหรัฐอเมริกา)

MyBP-C ถูกระบุโดยการวิเคราะห์ Western blot (Amersham Pharmacia Biotech UK, Little Chalfont, Buckinghamshire, England ref. 26 ) ของโปรตีนทั้งหมดหรือ myofibrillar homogenates แยกจากกันโดยเจล SDS-PAGE (125 V เป็นเวลา 2 ชั่วโมง) ถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส (35 V เป็นเวลา 2.5 ชั่วโมง) และบ่มด้วยกล้ามเนื้อโครงร่างต่อต้านไก่ของกระต่าย MyBP-C γ-serum polyclonal antibody (เจือจาง 1:10,000 อ้างอิง 27 ) ตรวจพบโปรตีนที่ติดฉลากแอนติบอดีโดยใช้ชุดคิมิลูมิเนสเซนส์ที่ปรับปรุงให้ดีขึ้น (ECL+Plus Amersham Life Sciences Inc.) ปริมาณสัมพัทธ์ของโปรตีนที่ติดฉลากแอนติบอดีถูกหาปริมาณโดยการวัดความหนาแน่นและซอฟต์แวร์ NIH-Image

สัณฐานวิทยาและกล้องจุลทรรศน์ สัตว์ถูกสังเวยโดยปากมดลูกเคลื่อนและหัวใจถูกตัดออก ล้างด้วย PBS (GIBCO) และชั่งน้ำหนัก แยกเนื้อเยื่อหัวใจตามที่อธิบายไว้ (28) และการประเมินทางพยาธิวิทยาดำเนินการโดยผู้ชำนาญโรคหัวใจที่มีประสบการณ์

เนื้อเยื่อที่ถูกตัดออกถูกติดตั้งในบล็อกพาราฟินตามที่อธิบายไว้ (25) และส่วนที่ 3–7-μM ถูกย้อมด้วย hematoxylin และ eosin (H&E) หรือ Masson trichrome (American HistoLabs Inc. Gaithersburg, Maryland, USA) ได้ภาพกำลังขยายสูงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง Zeiss Axiophoto (Carl Zeiss Inc., Thornwood, New York, USA) ซึ่งติดตั้งกล้องถ่ายน้ำมันขนาด×2.5, ×20 และ×40 และกล้องถ่ายภาพดิจิทัลของ Sony (DKC-5000) โซนี่ คอร์ป กรุงโตเกียว ประเทศญี่ปุ่น)ดูภาพโดยใช้ซอฟต์แวร์ Adobe Illustrator (Adobe Systems Inc., Mountain View, California, USA)

ส่วน LV และ RV ถูกเตรียมสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (29) โดยสังเขป ส่วนที่ได้รับการแก้ไขด้วยกลูตาราลดีไฮด์ 2.5% + พาราฟอร์มัลดีไฮด์ 2% ในบัฟเฟอร์คาโคดิเลต 0.1 โมลาร์ pH 7.4 จากนั้นล้าง 3 ครั้งในบัฟเฟอร์คาโคดิเลต 0.1 โมลาร์ pH 7.4 และหลังการตรึงใน 1% ออสเมียมเตตรอกไซด์ (OsO)4) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างออกด้วย dH20 และยูแรนิลอะซิเตต 1% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง (การย้อมด้วยเอ็นบล็อค) เม็ดแบบตายตัวถูกทำให้แห้งในแอลกอฮอล์ ล้างด้วยโพรพิลีนออกไซด์สองครั้งเป็นเวลา 20 นาที และฝังค้างคืนด้วยอัตราส่วน 1:1 ของโพรพิลีนออกไซด์ต่อสารละลายเรซินของสเปอร์ร์ หลังจากผ่านไป 12 ชั่วโมง สารละลายนี้ถูกแทนที่ด้วยสารละลายของสเปอร์ร์ 100% แล้วทำโพลีเมอร์ในเตาอบแห้งที่ 70°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ส่วนบางเฉียบ (หนา 100 นาโนเมตร) จากตัวอย่างที่ย้อมและฝังตัวถูกสังเกตในโหมดการส่งสัญญาณโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบฟิลิปส์ CM12 (FEICompany, http://www.feic.com)

การประเมินฟังก์ชัน LV Transthoracic Echocardiography ดำเนินการในหนูอายุ 0 ถึง 3 วันโดยใช้เทคนิค echocardiographic ความถี่สูง (25 ) การถ่ายภาพด้วยคลื่นเสียงสะท้อนหัวใจทำได้โดยไม่ต้องใช้ยาสลบ และโดยที่หนูถูกยับยั้งไว้เล็กน้อยในท่าหงายโดยใช้ Humphrey Ultrasound Biomicroscope (รุ่น 840 Humphrey Instruments, San Leandro, California, USA) พารามิเตอร์ LV ได้มาจากภาพสะท้อนการเต้นของหัวใจ 2 มิติในมุมมองแกนสั้น อัตราการเต้นของหัวใจของหนูเมาส์ในทารกแรกเกิดถูกกำหนดจากการติดตาม Doppler คลื่นต่อเนื่องโดยใช้ระบบ Doppler ความถี่สูง (25, 30)

การตรวจหัวใจด้วยคลื่นเสียงสะท้อนผ่านทรวงอกในหนูที่โตเต็มวัย (> 3 สัปดาห์) โดยใช้เครื่องตรวจคลื่นเสียงความถี่สูง Sonos 5500 ที่มีทรานสดิวเซอร์ 12 เมกะเฮิรตซ์ (Hewlett-Packard, Andover, Massachusetts, USA) หนูเมาส์ถูกดมยาสลบด้วย 2.5% Avertin (0.010 มล./กรัม) และอุ่นด้วยแผ่นความร้อนระหว่างการตรวจหัวใจด้วยคลื่นเสียงสะท้อน ได้ภาพ echocardiographic สองมิติโดยให้หนูวางตัวในตำแหน่ง decubitus ด้านข้างซ้ายหรือหงาย พารามิเตอร์ LV ได้มาจากการสอบสวนในโหมด M ในมุมมองแกนสั้น เส้นผ่านศูนย์กลางหัวใจห้องบนซ้ายมุมฉาก (LAD) ได้มาจากภาพสะท้อนหัวใจแบบ 2 มิติในมุมมองแกนยาว การวัด Echocardiographic สำหรับการศึกษาในหนูเมาส์ในทารกแรกเกิดและในผู้ใหญ่ เฉลี่ยจากรอบการเต้นของหัวใจอย่างน้อย 3 รอบแยกกัน: ความหนาของผนังด้านหน้า LV (LVAW) ความหนาของผนังด้านหลัง LV (LVPW) เส้นผ่านศูนย์กลาง LV diastolic สูงสุด (LVDD) เส้นผ่านศูนย์กลาง LV systolic ขั้นต่ำ ( LVSD), LV Fractional Shortening (LVFS), LAD สูงสุด และอัตราการเต้นของหัวใจ นัยสำคัญทางสถิติของความแตกต่างในพารามิเตอร์ echocardiographic ระหว่าง wild-type และ MyBP-C หนูถูกกำหนดโดยนักเรียนที่ไม่ได้จับคู่ NS-ทดสอบ. ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD NS NS มีค่าน้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ

วิเคราะห์คุณสมบัติ systolic และ diastolic ของ LV-chamber ในร่างกาย ตามที่อธิบายไว้ (31) โดยสังเขป ใช้สายสวนอิมพีแดนซ์ขนาดเล็ก/ไมโครมาโนมิเตอร์เพื่อสร้างความสัมพันธ์ระหว่างแรงดันและปริมาตร LV แบบเรียลไทม์ สัตว์ได้รับการดมยาสลบด้วยอีโทมิเดต (10–20 มก./กก. ของน้ำหนักตัว), มอร์ฟีน (1-2 มก./กก. ของน้ำหนักตัว) และยูรีเทน (750 มก./กก. ของน้ำหนักตัว) ถูกใส่ท่อช่วยหายใจ และทำการระบายอากาศแบบเทียมด้วยหนูที่ออกแบบเอง เครื่องช่วยหายใจด้วยออกซิเจนแรงบันดาลใจ 100% ที่ปริมาตรน้ำขึ้นน้ำลง 200 ไมโครลิตร และความถี่ 120 ครั้งต่อนาที อัตราการเต้นของหัวใจอยู่ใกล้ปกติ (>500 ครั้งต่อนาที) LV ถูกใส่สายสวนโดยใช้ปลายแหลมที่เปิดเผยโดยการผ่าตัดทรวงอกแบบจำกัด สัญญาณถูกบันทึกที่สถานะคงตัวและระหว่างการลดโหลดชั่วคราวที่เกิดจากการปิดบัง Vena Cava ที่ด้อยกว่าชั่วคราว ข้อมูลถูกสุ่มตัวอย่างที่ 2 kHz และวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ที่กำหนดเอง หลังจากการรวบรวมข้อมูลเบื้องต้น ได้มีการวางโพรบวัดการไหลของหลอดเลือดด้วยอัลตราซาวนด์ (1RB Transonics, Ithaca, New York, USA) รอบ ๆ หลอดเลือดแดงทรวงอกเพื่อวัดการส่งออกของหัวใจ ปริมาตรของจังหวะถูกใช้เพื่อสอบเทียบปริมาตรสัมพัทธ์ที่วัดพร้อมกันโดยสัญญาณ Volume-catheter โดยจับคู่ค่ากับความกว้างเฉลี่ยของลูปความดัน-ปริมาตร การเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์และพารามิเตอร์การไหลเวียนโลหิตที่ได้รับมาส่วนใหญ่ได้รับการสอบเทียบ แม้ว่าจะไม่ได้วัดปริมาตรสัมบูรณ์ก็ตาม การวัดน้ำหนักหัวใจและการตรวจร่างกายโดยรวมทำขึ้นหลังจากเสร็จสิ้นการศึกษาแต่ละครั้ง Student . เปรียบเทียบระหว่างหนู MyBP-C ชนิดพันธุ์ป่าและหนูพันธุ์กลาย NS การทดสอบ ข้อมูลทั้งหมดถูกรายงานเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM และ NS ค่าที่น้อยกว่า 0.05 จะถูกรายงานเป็นตัวเลข ค่าที่สูงกว่าจะถูกระบุว่าไม่มีนัยสำคัญ

โครงสร้าง MyBP-C(Neo) และ MyBP-C(LoxP) อัลลีล ส่วนหนึ่งของยีน MyBP-C ของหนูถูกแยกออกจากคลังจีโนมของแบคทีเรีย λDASH และลำดับนิวคลีโอไทด์ของมันที่กำหนดหา (ไม่ได้เผยแพร่) Exons 29–31 ถูกระบุใน 7.4-kb SpeI แฟรกเมนต์ที่ถูกซับโคลนของยีนต้านทานนีโอมัยซิน (PGK-นีโอโพลีเอ) ขนาบข้างด้วยลำดับ LoxP ถูกสอดเข้าไปในเอ็กซอน 30 (รูปที่ 1a และวิธีการ) โครงสร้างนี้ถูกใช้เพื่อขัดขวางยีน MyBP-C ภายในเซลล์ ES โดยการรวมตัวกันอีกครั้งและกำหนดอัลลีลที่เป็นเป้าหมาย MyBP-C(นีโอ). บลาสโตซิสต์ที่ฉีดด้วยเซลล์ ES ที่มี MyBP-C(นีโอ) อัลลีลผลิตสัตว์ขี้เล่น ปริมาณของ MyBP-C mRNA ที่กลายพันธุ์ในเนื้อเยื่อหัวใจจากหนูที่มีอัลลีลนี้น้อยกว่าปริมาณ MyBP-C mRNA ที่พบในหนูป่า (ดูด้านล่าง) อย่างมีนัยสำคัญ เราตั้งสมมติฐานว่าปริมาณของ MyBP-C mRNA ที่กลายพันธุ์ลดลงเนื่องจากลำดับยีนที่ดื้อต่อ neomycin ใน mRNA ที่กลายพันธุ์ทำให้ RNA เสื่อมลงอย่างรวดเร็วหรือเนื่องจากลำดับเหล่านี้เปลี่ยนแปลงการประมวลผลของสารตั้งต้น MyBp-C RNA เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ อัลลีลที่สองกำหนด MyBP-C (LoxP)ถูกสร้างขึ้นโดยการผสมพันธุ์หนู MyBP-C(Neo) ที่เป็นคิเมริกกับหนูเมาส์แปลงพันธุ์ที่แสดง CRE NS MyBP-C (LoxP) อัลลีลเป็นผลมาจากการตัดตอนของยีนต้านทานนีโอมัยซินโดย CRE recombinase และมีลำดับ LoxP ที่ซ้ำกัน 97-bp ที่เหลือ (รูปที่ 1a และข้อมูลไม่แสดง) ลูกพันธุ์ต่าง ๆ ของสัตว์ chimeric ถูกเพาะพันธุ์เพื่อผลิตหนูที่เป็น homozygous สำหรับ MyBP-C(นีโอ) หรือ MyBP-C (LoxP) อัลลีล โฮโมไซกัสของหนูเมาส์สำหรับอัลลีลแต่ละตัวมีลักษณะเฉพาะโดยการวิเคราะห์ Southern blot และโดยการขยาย PCR ของ MyBP-C (LoxP) อัลลีลกับไพรเมอร์ 1F,1R (รูปที่ 1a) และ MyBP-C(นีโอ) อัลลีลที่มีไพรเมอร์ 1F,3R และ 2F,2R (ไม่แสดงข้อมูลรูปที่ 1a) MyBP-C(Neo) และ MyBP-C(LoxP) ที่เป็น Homozygous สืบพันธุ์ได้ สร้างขนาดครอกปกติ และมีชีวิตอยู่ได้นานกว่า 1 ปี

Cardiac MyBP-C mRNA และการแสดงออกของโปรตีนจากอัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์ ปริมาณของ MyBP-C mRNA ของหัวใจใน MyBP-C(LoxP) และ MyBP-C(Neo) ของเมาส์หัวใจได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ Northern blot การถอดรหัส MyBP-C ของหัวใจจำนวนมาก (4.5 kb) ที่พบในหนูประเภท wild ลดลงอย่างเห็นได้ชัดใน LV (14.5 ± 4% NS = 6) RV (9.5 ± 1% NS = 3) และ atria (18.4 ± 5% NS = 3) ของหนูเมาส์ MyBP-C(Neo) (รูปที่ 2a และข้อมูลไม่แสดง) เนื้อเยื่อหัวใจจากหนู MyBP-C(Neo) และหนู MyBP-C(LoxP) มี MyBP-C mRNA ของหัวใจในปริมาณที่เท่ากันโดยประมาณ (ไม่แสดงข้อมูล)

MyBP-C mRNA และระดับการแสดงออกของโปรตีนในหัวใจของหนู MyBP-C(Neo) ที่เป็นโฮโมไซกัสอายุ 12 สัปดาห์ (กำหนด t/t) (NS) การวิเคราะห์ Northern blot ของ RNA จากช่องซ้ายของหนูประเภท wild-type (+/+) และ MyBP-C(Neo) ที่ผสมพันธุ์กับโพรบ MyBP-C และ GAPDH ของหนู (NS) การวิเคราะห์ Western blot ระบุโปรตีน 150-kDa MyBP-C ในสารสกัด myofibrillar ของ LV ของหนูป่า (+/+) และ MyBP-C(Neo) ที่เป็นโฮโมไซกัส (t/t)

โครงสร้างของ MyBP-C RNA ของหัวใจที่ผลิตจากอัลลีลแต่ละอัลลีลนั้นมีลักษณะเฉพาะโดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของผลิตภัณฑ์ที่ขยายด้วย RT-PCR ที่ได้มาจาก RNA รวมของหัวใจเมาส์กลายพันธุ์แบบโฮโมไซกัส (ดูวิธีการ) โครงสร้างของลำดับ MyBP-C ของหัวใจที่พบในหัวใจของหนูกลายพันธุ์ถูกเปรียบเทียบกับลำดับ RNA แบบป่าและสอดคล้องกับแบบจำลองที่ RNA ที่กลายพันธุ์ต่างกันเป็นผลมาจากรูปแบบการต่อแบบอื่น (รูปที่ 1, a และ b) นั่นคือ RNA ที่ได้มาจาก MyBP-C(นีโอ) อัลลีลแยก exon 30 ในขณะที่ RNA ได้มาจาก MyBP-C (LoxP) อัลลีลขาดส่วน 5′ ของ exon 30 เนื่องจาก RNA ถูกต่อจากปลาย 3′ ของ exon 29 ถึงลำดับ LoxP (รูปที่ 1) โพลีเปปไทด์ MyBP-C กลายพันธุ์ที่คาดการณ์ไว้ซึ่งเข้ารหัสโดยอัลลีล MyBP-C ที่เปลี่ยนแปลงจะต่างกันที่ปลายคาร์บอกซิลของพวกมัน (รูปที่ 1b) NS MyBP-C (LoxP) อัลลีลผลิตโปรตีนที่มีกรดอะมิโนชนิดใหม่ 166 ชนิดและมีสารตกค้างสั้นกว่าโปรตีนชนิดธรรมชาติ 30 ชนิด ในขณะที่โปรตีน MyBP-C(Neo) มีกรดอะมิโนตกค้างสั้นกว่าโปรตีนชนิดธรรมชาติถึง 174 ชนิดและมีกรดอะมิโนชนิดใหม่ 32 ชนิด สารตกค้าง (รูปที่ 1b)

ปริมาณของเปปไทด์กลายพันธุ์ที่พบในโพรงของหนู MyBP-C กลายพันธุ์ homozygous ได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ Western blot แอนติบอดี Polyclonal MyBP-C ระบุโปรตีน 150-kDa ในโปรตีนรวม LV และการเตรียมโปรตีนที่เสริมด้วยมัยโอไฟบริลลาร์ที่รวมเข้ากับไก่ MyBP-C (รูปที่ 2b และข้อมูลไม่แสดง) แม้ว่าโปรตีนที่กลายพันธุ์จากหนู MyBP-C(Neo) ในทางทฤษฎีจะมีขนาดเล็กกว่าโปรตีน MyBP-C ชนิดดั้งเดิม 15 kDa แต่โปรตีนชนิดกลายพันธุ์และโปรตีนจากป่าก็ย้ายที่ตำแหน่งเดียวกันโดยประมาณบนเจล SDS-PAGE 6% (เหตุใดเปปไทด์กลายพันธุ์ที่มีขนาดเล็กกว่าที่รวมเข้ากับโปรตีนชนิดไวด์ขนาดใหญ่จึงไม่แน่นอน) โปรตีน MyBP-C ของหัวใจกลายพันธุ์ในโปรตีนที่เป็นเนื้อเดียวกันทั้งหมดของ LV จากหนูเมาส์ MyBP-C(Neo) คือ 2.3 ± 1% (NS = 6) ปริมาณที่พบในสารสกัดป่าที่คล้ายคลึงกัน (ไม่แสดงข้อมูล) สารสกัด Myofibrillar มีเปปไทด์กลายพันธุ์มากกว่าสารสกัดโปรตีนทั้งหมดในปริมาณที่สอดคล้องกัน ระดับโปรตีน MyBP-C ของหัวใจกลายพันธุ์ในสารสกัด myofibrillar เท่ากับ 9.5 ± 3 % (NS = 8) ปริมาณ MyBP-C ในสารสกัด myofibrillar ชนิด wild-type (รูปที่ 2b) การวิเคราะห์ที่คล้ายคลึงกันแสดงให้เห็นว่าโปรตีนกลายพันธุ์ MyBP-C(LoxP) ยังถูกทำให้สมบูรณ์ในส่วน myofibrillar เมื่อเทียบกับปริมาณในเศษส่วนของไซโตพลาสซึมทั้งหมด (ไม่แสดงข้อมูล)

สัณฐานวิทยาของหัวใจของหนู MyBP-C กลายพันธุ์ homozygous โครงสร้างหัวใจมีลักษณะเฉพาะในหนู MyBP-C กลายพันธุ์ที่อายุ 8-12 สัปดาห์ หัวใจจากทั้ง Homozygous MyBP-C(Neo) และ Homozygous MyBP-C(LoxP) กลายพันธุ์ของหนูที่กลายพันธุ์นั้นขยายใหญ่ขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่มาจากหนูป่า และมีคราบหินปูนที่ผนังห้อง LV ของหัวใจเมาส์ MyBP-C กลายพันธุ์ที่เป็น homozygous แต่ไม่ใช่หนูป่า (รูปที่ 3 และไม่แสดงข้อมูล) น้ำหนักหัวใจทั้งหมดในสัตว์กลายพันธุ์เทียบกับสัตว์ป่า (177.0 ± 5.7 มก., NS = 26 เทียบกับ 113.8 ± 3.8 มก. NS = 25) และตุ้มน้ำหนัก LV (136.0 ± 7.5 มก. NS = 12 เทียบกับ 80.0 ± 4.8 มก. NS = 11) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (NS < 0.001). น้ำหนักหัวใจต่อร่างกายและอัตราส่วนน้ำหนัก LV ต่อร่างกายยังมีค่ามากกว่าในหนู MyBP-C ที่กลายพันธุ์มากกว่าในหนูเมาส์ชนิดพันธุ์ป่า (รูปที่ 3b) ในทางตรงกันข้าม RV atria ด้านซ้ายและขวามีขนาดและน้ำหนักที่เปรียบเทียบกันได้ในหนูกลายพันธุ์และหนูประเภทไวด์ (รูปที่ 3 และไม่แสดงข้อมูล)

การเปรียบเทียบหัวใจจากหนูพันธุ์ธรรมชาติอายุ 8-12 สัปดาห์และหนูกลายพันธุ์โฮโมไซกัส (NS) สัณฐานวิทยาโดยรวมของ Homozygous MyBP-C(Neo) (กำหนด t/t) และหัวใจประเภท wild-type (+/+) และ (NS) น้ำหนักตัวต่อตัวหรืออัตราส่วนน้ำหนักต่อตัว LV แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (NS < 0.001) ในขนาดการเต้นของหัวใจของหนูเมาส์กลายพันธุ์โฮโมไซกัส (t/t) เทียบกับหนูเมาส์ชนิดพันธุ์ป่า (+/+)

ทั้งหัวใจ MyBP-C(Neo) และ MyBP-C(LoxP) ที่เป็น homozygous แสดงให้เห็นถึงความผิดปกติทางเนื้อเยื่อวิทยาที่โดดเด่น ซึ่งรวมถึง myocyte hypertrophy, myofibrillar disarray และพังผืด นอกจากนี้ หัวใจที่กลายพันธุ์ 3 ใน 5 ดวงยังมีการกลายเป็นปูน dystrophic (รูปที่ 4, b และ d) ซึ่งแตกต่างกันไปตามขอบเขตและตำแหน่ง การกลายเป็นปูน LV และ RV ของโฟกัสและการกลายเป็นปูนภายใน multifocal ถูกพบใน 2 ใน 5 ของหัวใจ เช่นเดียวกับการกลายเป็นปูนใน subendocardial ที่มี multifocal interstitial fibrosis (1 ใน 5 หัวใจ) และกล้ามเนื้อ papillary subendocardial ที่มีการเกิดพังผืดในช่องท้องเล็กน้อย (1 ใน 5 หัวใจ)

มิญชวิทยาของพันธุ์ป่าอายุ 8-12 สัปดาห์ (NS) และ MyBP-C(นีโอ) (NSNS) หัวใจของเมาส์ ส่วนถูกย้อมด้วย H&E (NS และ ) หรือ Masson trichrome (NS และ NS).

Sarcomeres จากหัวใจเมาส์ MyBP-C(Neo) กลายพันธุ์ homozygous ถูกตรวจสอบโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (รูปที่ 5) sarcomeres ของหัวใจเมาส์เหล่านี้ได้รับการจัดระเบียบอย่างดีด้วยการจัดแนว A-bands, I-bands และ Z-lines อย่างสม่ำเสมอ แถบนั้นคล้ายกับที่พบใน sarcomeres จากหนูป่า M-line มักหายไปใน sarcomeres จาก LV ของหนูเมาส์ MyBP-C ที่เป็นโฮโมไซกัส (รูปที่ 5) อย่างไรก็ตาม ใน sarcomeres ที่ได้มาจาก RV จะพบ M-line ที่กำหนดไว้อย่างดี (ไม่แสดงข้อมูล)

ไมโครกราฟอิเล็กตรอนแบบส่งผ่านของซาร์โคเมียร์จากพันธุ์ป่าอายุ 12 สัปดาห์ (NS) และ MyBP-C(Neo) เมาส์หัวใจ (t/t) สังเกตลักษณะที่ผิดปกติของ M-line (ดอกจัน) ใน sarcomeres ที่ได้รับจากเมาส์ MyBP-C(Neo) บาร์ 0.5 ม.

การทำงานของหัวใจของหนูที่เป็นโฮโมไซกัสที่มีอัลลีล MyBP-C กลายพันธุ์ การทำงานของหัวใจได้รับการประเมินในหนูเมาส์ MyBP-C(Neo) โฮโมไซกัสที่เป็นผู้ใหญ่และทารกแรกเกิดโดยใช้การตรวจหัวใจด้วยคลื่นเสียงสะท้อนผ่านทรวงอก (รูปที่ 6, a–c และข้อมูลที่ไม่แสดงให้ดูวิธีการ) เมื่อแรกเกิด (0–3 วัน) และตลอดวัย (ตั้งแต่ 3 สัปดาห์หลังคลอด) หัวใจเมาส์ MyBP-C ที่กลายพันธุ์แสดงให้เห็น LV diastolic และ systolic เส้นผ่านศูนย์กลางที่เพิ่มขึ้น รวมถึงการย่อส่วน LV ให้สั้นลง (ตารางที่ 1) ความหนาของผนัง LV ถูกใช้เพื่อประเมินว่ามีกระเป๋าหน้าท้องยั่วยวนอยู่หรือไม่ ในช่วงทารกแรกเกิด ความหนาของผนัง LV ด้านหน้าและด้านหลังในหนู MyBP-C กลายพันธุ์ homozygous ไม่แตกต่างจากความหนาของผนังของหนูป่าหลังการแก้ไขความแตกต่างของน้ำหนักตัว (ตารางที่ 1) เมื่อหนูประเภท wild-type และ mutant มีอายุมากขึ้น ความหนาของผนัง LV เพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม การเพิ่มขึ้นนี้มีมากกว่าในหนู MyBP-C กลายพันธุ์ homozygous และเมื่ออายุ 8 สัปดาห์ของหนูที่กลายพันธุ์มีผนัง LV ที่หนากว่าหนูแบบ wild-type อย่างมีนัยสำคัญ (ตารางที่ 1) . LAD ของหนู MyBP-C กลายพันธุ์ homozygous เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับหนูป่า (1.77 ± 0.13 มม. เทียบกับ 1.53 ± 0.08 มม. NS = 0.01) ที่อายุ 8-12 สัปดาห์ พบวัสดุที่มีความหนาแน่นสะท้อนซึ่งสอดคล้องกับการกลายเป็นปูนของกล้ามเนื้อ papillary และรอยโรคโฟกัสภายใน LV ในหนู MyBP-C กลายพันธุ์ homozygous ทั้งหมด (10 จาก 10) ตัวที่ 8 สัปดาห์ในสัตว์ 6 ตัว การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้อยู่ในระดับปานกลางถึงรุนแรง

การทำงานของหัวใจในหนูป่าและ MyBP-C(Neo) (NS) Schematic และ M-mode echocardiographic tracings จาก wild-type อายุ 12 สัปดาห์ (NS) และเมาส์ MyBP-C(Neo) (). ขนาด LV คำนวณจากการวัดผนังด้านหน้า (1) ผนังด้านหลัง (2) เส้นผ่านศูนย์กลางปลายไดแอสโตลิก (3) และเส้นผ่านศูนย์กลางปลายซิสโตลิก (4) ความคมชัดที่เพิ่มขึ้นในกล้ามเนื้อ papillary หลังอาจสะท้อนถึงการกลายเป็นปูน () (ลูกศร). (NS) ความสัมพันธ์ของปริมาตรแรงดันและโปรไฟล์ dP/dt ของหนูเมาส์แบบไวด์ (+/+) และ MyBP-C(Neo) (t/t)

ขนาดกระเป๋าหน้าท้องด้านซ้ายของหนู MyBP-C ชนิดพันธุ์ป่าและโฮโมไซกัสกลายพันธุ์

การทำงานของหัวใจของหนูเมาส์ MyBP-C(Neo) ที่เป็นโฮโมไซกัสได้รับการประเมินเพิ่มเติมในหนูเมาส์ที่ดมยาสลบโดยการใส่สายสวนภายในร่างกาย (31) ลูปปริมาตรความดันที่ได้รับจากหนูเมาส์ MyBP-C(Neo) ที่เป็นโฮโมไซกัสและหนูเมาส์ชนิดพันธุ์ป่าแสดงให้เห็นความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างการทำงานของหัวใจของ 2 สายพันธุ์เหล่านี้ (รูปที่ 6d) แม้ว่าระยะ isovolumic ของ systole เป็นเรื่องปกติ แต่ความผิดปกติก็เห็นได้ชัดเมื่อเริ่มมีการหดตัวซึ่งสอดคล้องกับการสั้นลงของเศษส่วนที่ผิดปกติที่พบในการศึกษา echocardiographic โปรไฟล์ที่ผิดปกติของการหดตัวของซิสโตลิกสะท้อนให้เห็นในพารามิเตอร์เชิงปริมาณหลายประการ (ตารางที่ 2) คุณสมบัติของไดแอสโตลิก (dP/dTนาที, dP/dTอัตราส่วน, ปริมาตรปลายไดแอสโตลิก (SW(อีดีวี)) เวลาในการเติมสูงสุด เวลาพักผ่อน (เอกภาพ) และการปฏิบัติตามข้อกำหนดของแชมเบอร์ (นอร์มัลไลซ์เบตา) ผิดปกติ อัตราการเต้นของหัวใจ dP/dTmax, ความดัน end-diastolic และความดัน end-systolic ไม่แตกต่างกันระหว่างหนูกลายพันธุ์และหนูป่า

การทำงานของหัวใจของหนูอายุ 12 สัปดาห์ ประเมินโดยการสวนหัวใจในหลอดทดลอง

RNA และการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ cardiomyopathy การแสดงออกของยีนที่เปลี่ยนแปลงไป ซึ่งเป็นคุณลักษณะที่เป็นที่รู้จักของคาร์ดิโอไมโอแพทีแบบพอง (ตรวจสอบในการอ้างอิงที่ 32, 33 ) ถูกตรวจสอบในหนูเมาส์ MyBP-C(Neo) และ MyBP-C(LoxP) กลายพันธุ์ homozygous หนูเมาส์กลายพันธุ์แสดงออก α-skeletal actin ที่ระดับ 16 และ 8 เท่าที่สูงกว่าที่พบในเนื้อเยื่อ LV และ RV จากหนูเมาส์ชนิดพันธุ์ป่า (รูปที่ 7a) การแสดงออกของ Atrial expression ของ α-skeletal actin มีความคล้ายคลึงกันในสัตว์กลายพันธุ์และสัตว์ป่า การแสดงออกของเปปไทด์ในสมอง natriuretic peptide (BNP) เพิ่มขึ้น 5.3 และ 2.2 เท่าใน LV และ RV ของ MyBP-C(Neo) กลายพันธุ์ homozygous เมื่อเทียบกับหนูป่า ตามลำดับ แต่การแสดงออกในเนื้อเยื่อ atrial ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ

การแสดงออกของยีนที่เปลี่ยนแปลงไปในหัวใจจากหนู MyBP-C(Neo) จุดเหนือ (NS) แสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของแอคติน α-โครงร่างและ BNP mRNA เมื่อเปรียบเทียบกับการถอดรหัส GAPDH เจล SDS-page สีเงิน (NS) แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของไอโซฟอร์ม MHC ของหัวใจในสารสกัดที่มีกระเป๋าหน้าท้องทั้งหมดจากหัวใจของหนูเมาส์ MyBP-C(Neo) (จากสัตว์อายุ 8–12 สัปดาห์ที่กำหนด t/t) เปรียบเทียบกับโปรตีนจากหนูเมาส์ป่า (+/+)

การแสดงออกของไอโซฟอร์ม MHC ของหัวใจ α และ β มีการเปลี่ยนแปลงในหลายรูปแบบของคาร์ดิโอไมโอแพทีแบบพอง ไอโซฟอร์มที่เด่น (85%) ใน LV จากหนูเมาส์ชนิดพันธุ์ป่าคือ α-MHC ในขณะที่เพียง 15% เท่านั้นที่เป็น β-MHC ( 25 ) (รูปที่ 7b) เนื้อเยื่อ MyBP-C LV พันธุ์กลายที่เป็นเนื้อเดียวกันเพิ่มการแสดงออกของ β-MHC (48%) อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่การแสดงออกของไอโซฟอร์ม α-MHC ลดลงเหลือ 52%

เพื่อตรวจสอบว่าโปรตีนที่ควบคุมการปั่นจักรยานของ myocyte Ca 2+ มีการเปลี่ยนแปลงในกล้ามเนื้อหัวใจตายของเมาส์ที่กลายพันธุ์แบบ homozygous หรือไม่ เราวัดระดับ RNA ของ sarcoplasmic reticulum Ca 2+ -ATPase (SERCA) ไม่พบความแตกต่างในระดับ SERCA mRNA ใน LV, RV หรือเอเทรียมของหนูกลายพันธุ์ชนิด wild-type และ homozygous (ไม่แสดงข้อมูล)

เราได้ผลิตหนู 2 สายพันธุ์ที่มีอัลลีลกลายพันธุ์ของยีน MyBP-C ของหัวใจ หนูเมาส์ที่เป็นเนื้อเดียวกันซึ่งมีอัลลีลเหล่านี้มีระดับที่ลดลง (< 10% ปกติ) ของเปปไทด์ MyBP-C ที่เปลี่ยนแปลงการกลายพันธุ์ซึ่งแสดงออกในเนื้อเยื่อหัวใจ เปปไทด์ที่ถูกดัดแปลงนั้นสั้นกว่า MyBP-C ชนิดดั้งเดิมและมีลำดับใหม่ที่ปลายคาร์บอกซิลของพวกมัน (รูปที่ 1b) อัลลีลของหนูกลายพันธุ์ MyBP-C(นีโอ) ที่อธิบายไว้ในที่นี้เข้ารหัสเปปไทด์ที่เปลี่ยนแปลงคล้ายกับเปปไทด์กลายพันธุ์ที่พบในบุคคลบางกลุ่มที่มี FHC (รูปที่ 1b และ Family NN ในการอ้างอิง 3) ทั้งการกลายพันธุ์ NN ของครอบครัวและ MyBP-C(นีโอ) อัลลีลสร้าง MyBP-C RNA ที่ไม่มี exon 30 เนื่องจากสารตั้งต้น RNA splices จาก exon 29 ถึง exon 31 (รูปที่ 1a) ประกบสำรองสร้าง frameshift ทำให้ RNA กลายพันธุ์เข้ารหัสโปรตีนที่ถูกตัดทอน (รูปที่ 1b) มนุษย์หรือหนูที่มีความหลากหลายทางเพศที่มีการกลายพันธุ์เหล่านี้ทำให้เกิดภาวะกล้ามเนื้อหัวใจโตมากเกินไป อย่างไรก็ตาม echocardiography และ in vivo cardiac catheterization แสดงให้เห็นว่าผลจากการทำงานของอัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์ homozygous เป็น cardiomyopathy ที่ขยายออก หนูที่เป็นโฮโมไซกัสที่มีอัลลีล MyBP-C กลายพันธุ์มีกระเป๋าหน้าท้องผิดปกติตั้งแต่แรกเกิด ซึ่งจะดำเนินต่อไปตลอดชีวิตและมาพร้อมกับการเจริญเติบโตมากเกินไปของ LV ที่มีการชดเชยแบบก้าวหน้า อาการแสดงทางจุลพยาธิวิทยาของโรค ได้แก่ myocyte hypertrophy, myofibrillar disarray, fibrosis และ dystrophic calcificationการแสดงออกของยีนที่เปลี่ยนแปลงไปในเนื้อเยื่อหัวใจจากหนูกลายพันธุ์ homozygous เป็นเรื่องปกติของรูปแบบที่พบในแบบจำลองอื่น ๆ ของ cardiomyopathy ขยาย (32, 33): α-skeletal actin และ BNP mRNAs พบในระดับสูงและการแสดงออกของ myosin isoform เปลี่ยนไป การศึกษาเหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการทำงานปกติของ MyBP-C ซึ่งเป็นกลไกที่การกลายพันธุ์ในเปปไทด์นี้ทำให้เกิดโรคในมนุษย์ และระบุเพิ่มเติมถึงความเกี่ยวข้องระดับโมเลกุลของคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic และพอง

ในระหว่างการสร้างตัวอ่อน ลักษณะที่ปรากฏของ MyBP-C สัมพันธ์กับลักษณะที่ปรากฏของรอยไขว้ ( 13 ) ซึ่งแสดงถึงบทบาทการพัฒนาสำหรับโมเลกุลนี้ในการจัดแนวเส้นใยหนาภายในซาร์โคเมียร์ เนื่องจากอัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์ที่อธิบายไว้ในที่นี้เข้ารหัสลำดับเปปไทด์ที่ถูกตัดทอนซึ่งมีส่วนร่วมในการจับ myosin และระดับของเปปไทด์ที่ตัดไว้ล่วงหน้านั้นน้อยกว่า MyBP-C ปกติอย่างเห็นได้ชัด เราจึงประหลาดใจเป็นพิเศษที่พบซาร์โคมีร์ที่ใกล้เคียงปกติในหัวใจที่กลายพันธุ์ ทั้งรูปแบบแถบและความยาวของ sarcomeres ไม่ได้รับผลกระทบจากการขาดดุล MyBP-C ข้อมูลเหล่านี้อาจบอกเป็นนัยถึงบทบาทที่ไม่จำเป็นสำหรับ MyBP-C ในการก่อรูปและคงไว้ซึ่งโครงสร้างพื้นฐานของซาร์โคเมียร์ หรืออีกทางหนึ่ง บ่งชี้ว่าโมเลกุลอื่นๆ (อาจเป็น MyBP-H) สามารถแทนที่ฟังก์ชัน MyBP-C เหล่านี้ได้ ไม่ว่าในกรณีใด MyBP-C ไม่จำเป็นต้องใช้ในปริมาณสารสัมพันธ์เพื่อผลิตซาร์โคเมียร์ที่ดูปกติ

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดของเนื้อเยื่อ LV จากหนูทดลองที่เป็นโฮโมไซกัสที่มีอัลลีล MyBP-C กลายพันธุ์แสดงให้เห็นว่าแถบ M มักจะมีความแตกต่างน้อยกว่าและไม่เป็นเนื้อเดียวกันเมื่อเทียบกับที่พบในตัวอย่างชนิดพันธุ์ป่า แถบ M ประกอบด้วยส่วนประกอบที่เกี่ยวข้องกับเส้นใยหนาเป็นหลัก ได้แก่ MyBP-C, M-protein, skelemin และ myomesin โดยปกติ MyBP-C จะสร้างแถบ 7 ถึง 9 แถบในโซน C ของแถบ A ที่ด้านใดด้านหนึ่งของแถบ M ( 11 – 13 , 34 ) ในขณะที่แถบ M ที่กำหนดไว้ไม่ดีใน LV จากหัวใจของเมาส์ที่กลายพันธุ์แบบ homozygous อาจสะท้อนถึงองค์ประกอบที่เปลี่ยนแปลงไปของแถบ MyBP-C เหล่านี้ การค้นพบหลายอย่างบ่งชี้ว่ารูปแบบที่ผิดปกตินี้เป็นผลมาจากความผิดปกติของหัวใจในหนูที่กลายพันธุ์ ประการแรก ระดับที่เท่ากันของเปปไทด์กลายพันธุ์พบได้ในห้องขังทั้งสองห้อง อย่างไรก็ตาม แถบ M ทั้งหมดใน RV (และแถบ LV M บางแถบ) ของสัตว์กลายพันธุ์นั้นปกติ หมายความว่าแรงเคลื่อนพลศาสตร์มีอิทธิพลต่อรูปแบบแถบนี้ ประการที่สอง ยังพบแถบ LV M ที่ไม่ชัดในหนูที่แสดง tropomodulin ซึ่งเป็นส่วนประกอบเส้นใยบาง (35) มากเกินไป เนื่องจากทั้งหนูที่ดัดแปลงพันธุกรรม tropomodulin และหนู MyBP-C กลายพันธุ์ homozygous พัฒนา cardiomyopathy ที่ขยายออก เราขอแนะนำว่าการสูญเสีย M-band ภายใน LV เป็นผลที่ตามมามากกว่าสาเหตุของความผิดปกติของ sarcomere

มนุษย์ต่างเพศที่มีการกลายพันธุ์ของยีน MyBP-C ของหัวใจที่เข้ารหัสโพลีเปปไทด์ที่ถูกตัดทอนจะพัฒนาคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic กลไกที่ทำให้เกิดโรคเหล่านี้ไม่ชัดเจนเนื่องจากไม่พบเปปไทด์ MyBP-C ที่กลายพันธุ์หรือระดับเปปไทด์ที่ลดลงในเศษส่วนของ myofibrillar ที่เตรียมจากเนื้อเยื่อหัวใจของบุคคลที่ได้รับผลกระทบ (18) เมื่อเร็วๆ นี้หนูที่แปลงพันธุ์ได้รับรายงานเพื่อแสดง MyBP-C ของหัวใจกลายพันธุ์ภายใต้โปรโมเตอร์ α-MHC ( 36 ) แต่ระดับนั้นแข็งแกร่งมากจนทำให้การแสดงออกของยีน MyBP-C ชนิดดั้งเดิมภายในร่างกายลดลง หนูที่เป็นเนื้อเดียวกันซึ่งมีอัลลีล MyBP-C กลายพันธุ์เป็นหลักฐานว่ายีน MyBP-C ที่กลายพันธุ์ซึ่งควบคุมโดยโปรโมเตอร์ภายในร่างกายจะผลิตเปปไทด์กลายพันธุ์ที่ดูเหมือนว่าจะรวมเข้ากับซาร์โคเมียร์ นั่นคือ พบเปปไทด์กลายพันธุ์ในสารสกัด myofibrillar มากกว่าสารสกัดเซลล์ทั้งหมดของเนื้อเยื่อ LV (ดูรูปที่ 2b และผลลัพธ์) การขยายผลการค้นพบเหล่านี้ไปยังมนุษย์ที่มีข้อบกพร่องของยีน MyBP-C ของหัวใจที่คล้ายคลึงกันแสดงให้เห็นว่าคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic เกิดจากการกระทำเชิงลบที่โดดเด่นของเปปไทด์ MyBP-C ที่กลายพันธุ์ต่อการทำงานของ sarcomere แม้ว่าความเป็นไปได้ที่การลดปริมาณของ MyBP-C จะมีบทบาท ในกระบวนการของโรคยังไม่ได้รับการยกเว้น

หนูที่แสดงข้อบกพร่องของยีน homozygous sarcomere อาจช่วยในการระบุแง่มุมอื่นของคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic ของมนุษย์ การวิเคราะห์ฟีโนไทป์และจีโนไทป์ในความผิดปกตินี้ได้แสดงให้เห็นถึงอิทธิพลที่สาเหตุทางพันธุกรรมมีต่อการอยู่รอดในบุคคลที่ได้รับผลกระทบ (สำหรับการทบทวนดูอ้างอิง 8, 9) แม้ว่าหนูที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมซึ่งมีลักษณะต่างกันสำหรับการกลายพันธุ์ของยีนของมนุษย์ได้จัดเตรียมรีเอเจนต์ที่สำคัญสำหรับการผ่าชีววิทยาของโรคนี้ แต่ประวัติทางธรรมชาติของโรคในแบบจำลองเหล่านี้ไม่มีประโยชน์ในการกำหนดการกลายพันธุ์ที่ทำให้มนุษย์เสียชีวิตก่อนวัยอันควร ตัวอย่างเช่น บุคคลที่มีการกลายพันธุ์ของไมโอซิน Arg403Gln มีอายุขัยสั้นลงอย่างเห็นได้ชัด ในขณะที่หนูที่มีการกลายพันธุ์ที่เปรียบเทียบกันได้ (α-MHC 403/+ ที่กำหนด) มีการอยู่รอดตามปกติ ในทางตรงกันข้าม การรอดชีวิตในหนู 3 สายที่เป็น homozygous สำหรับการกลายพันธุ์ที่มีภาวะ hypertrophic ของมนุษย์นั้นเลียนแบบการตายก่อนวัยอันควรที่สังเกตได้ในมนุษย์ที่มีการกลายพันธุ์ที่สอดคล้องกัน กล่าวคือ การรอดชีวิตลดลงอย่างเห็นได้ชัดในหนู α-MHC 403/403 แต่ใกล้ปกติในหนูที่มี homozygous อัลลีล MyBP-C ที่กลายพันธุ์ ในขณะที่การศึกษาการกลายพันธุ์ของคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic อื่น ๆ เป็นสิ่งจำเป็นในการตรวจสอบการสังเกตเหล่านี้ เราแนะนำว่าแบบจำลองของหนูที่เป็นโฮโมไซกัสอาจเป็นรีเอเจนต์ที่มีคุณค่าสำหรับการเอาตัวรอดในโปรไฟล์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเนื่องจากข้อมูลทางคลินิกที่เกี่ยวข้องจากมนุษย์ที่มีการกลายพันธุ์มักไม่พร้อมใช้งาน

คำถามสำคัญที่เกิดจากการศึกษาเหล่านี้คือความแตกต่าง 2 เท่าของปริมาณโปรตีน sarcomere ที่กลายพันธุ์ทำให้เกิดฟีโนไทป์ที่แตกต่างกันอย่างเห็นได้ชัด: การเจริญเติบโตมากเกินไปกับการขยายตัว นั่นคือหนูที่ต่างกันซึ่งมีการกลายพันธุ์ของยีน sarcomere ทำให้เกิดคาร์ดิโอไมโอแพทีที่มีภาวะ hypertrophic ในขณะที่หนูกลายพันธุ์ homozygous ที่มีการกลายพันธุ์แบบเดียวกันจะพัฒนา cardiomyopathy แบบพอง เราตั้งสมมติฐานว่าพารามิเตอร์ของฟังก์ชัน sarcomere เช่น การสร้างแรง จะได้รับการตรวจสอบและทำหน้าที่เป็นกลไกการส่งสัญญาณกลางที่กระตุ้นเส้นทางต่างๆ เพื่อสร้างหัวใจใหม่ เมื่อแรงที่เกิดจากส่วนผสมของโปรตีนกลายพันธุ์และโปรตีนซาร์โคเมียร์ปกติบกพร่องเพียงพอ การเจริญเติบโตของมัยโอไซต์ที่ชดเชยจะเกิดขึ้น ส่งผลให้หัวใจโตมากเกินไป อย่างไรก็ตาม เมื่อการทำงานของซาร์โคเมียร์ยังคงไม่เพียงพอแม้จะมีการเติบโต (เช่นใน α-MHC 403/403 และหัวใจ MyBP-C ที่กลายพันธุ์แบบโฮโมไซกัส) วิถีทางอื่นๆ จะถูกกระตุ้น ดังที่เห็นได้จากการแสดงออกของยีนที่เปลี่ยนแปลงไป (เช่น α-skeletal actin, BNP และ β -MHC) การตายของเซลล์ไมโอไซต์ และการเกิดพังผืด หากความรุนแรงของความผิดปกติของซาร์โคเมียร์เป็นสัญญาณกลางที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางเหล่านี้ ส่วนขยายของแบบจำลองนี้คาดการณ์ว่าแรงภายนอกบนไมโอไซต์ เช่น ภาระทางโลหิตศาสตร์หรือการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเมทริกซ์นอกเซลล์ อาจทำให้ความผิดปกติของซาร์โคเมียร์ภายในร่างกายแย่ลง และทำให้สมดุลจากการเจริญเติบโตมากเกินไปที่ชดเชยไปยังแบบไม่ชดเชย ความล้มเหลว. กลไกนี้สามารถอธิบายความก้าวหน้าของภาวะ hypertrophic ไปจนถึง cardiomyopathy แบบพองได้

เราขอขอบคุณ Michael Giewat และ John Gabrovsek สำหรับความช่วยเหลือด้านเทคนิค งานวิจัยนี้ได้รับการสนับสนุนจากสถาบันการแพทย์ Howard Hughes

Bradley K. McConnell และ Karen A. Jones มีส่วนสนับสนุนงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน


ดูวิดีโอ: ทากราฟเสน Excel วธทากราฟเสน Excel แบบงายๆทคณเองกทำได (สิงหาคม 2022).