ข้อมูล

12.18: ไรโบโซม - ชีววิทยา

12.18: ไรโบโซม - ชีววิทยา


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

การสังเคราะห์โปรตีนใช้พลังงานของเซลล์มากกว่ากระบวนการเผาผลาญอื่นๆ กรดอะมิโนแต่ละตัวมีหมู่อะมิโน (NH2) และหมู่คาร์บอกซิล (COOH) ปฏิกิริยานี้ถูกเร่งโดยไรโบโซมและสร้างโมเลกุลน้ำหนึ่งโมเลกุล

เครื่องจักรสังเคราะห์โปรตีน

นอกจากเทมเพลต mRNA แล้ว โมเลกุลและโมเลกุลขนาดใหญ่จำนวนมากยังมีส่วนช่วยในกระบวนการแปลอีกด้วย องค์ประกอบของแต่ละองค์ประกอบอาจแตกต่างกันไปตามสายพันธุ์ ตัวอย่างเช่น ไรโบโซมอาจประกอบด้วย rRNAs และพอลิเปปไทด์จำนวนต่างกันขึ้นอยู่กับสิ่งมีชีวิต อย่างไรก็ตาม โครงสร้างและหน้าที่ทั่วไปของเครื่องจักรสังเคราะห์โปรตีนเปรียบได้กับแบคทีเรียกับเซลล์ของมนุษย์ การแปลจำเป็นต้องมีการป้อนข้อมูลของเทมเพลต mRNA, ไรโบโซม, tRNA และปัจจัยด้านเอนไซม์ต่างๆ

โพลิโซม

แม้กระทั่งก่อนที่จะแปล mRNA เซลล์ต้องลงทุนพลังงานเพื่อสร้างไรโบโซมแต่ละตัว ใน อี. โคไลมีไรโบโซมระหว่าง 10,000 ถึง 70,000 ในแต่ละเซลล์ ณ เวลาใดเวลาหนึ่ง ไรโบโซมเป็นโมเลกุลขนาดใหญ่ที่ซับซ้อนซึ่งประกอบด้วย rRNA เชิงโครงสร้างและตัวเร่งปฏิกิริยา และโพลีเปปไทด์ที่แตกต่างกันจำนวนมาก ในยูคาริโอต นิวเคลียสมีความเชี่ยวชาญอย่างสมบูรณ์สำหรับการสังเคราะห์และการประกอบ rRNAs

ไรโบโซมมีอยู่ในไซโตพลาสซึมในโปรคาริโอตและในไซโตพลาสซึมและเอนโดพลาสซึมเรติเคิลแบบหยาบในยูคาริโอต ไมโตคอนเดรียและคลอโรพลาสต์ยังมีไรโบโซมของตัวเองในเมทริกซ์และสโตรมา ซึ่งดูคล้ายกับโปรคาริโอตไรโบโซม (และมีความไวต่อยาคล้ายกัน) มากกว่าไรโบโซมที่อยู่นอกเยื่อหุ้มชั้นนอกของพวกมันในไซโตพลาสซึม ไรโบโซมแยกตัวออกเป็นหน่วยย่อยขนาดใหญ่และขนาดเล็กเมื่อไม่ได้สังเคราะห์โปรตีนและเชื่อมโยงใหม่ในระหว่างการเริ่มต้นการแปล โคไล, หน่วยย่อยขนาดเล็กอธิบายว่าเป็น 30S และหน่วยย่อยขนาดใหญ่คือ 50S รวมเป็น 70S (จำได้ว่าหน่วย Svedberg ไม่ใช่สารเติมแต่ง) ไรโบโซมของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมีหน่วยย่อย 40S ขนาดเล็กและหน่วยย่อย 60S ขนาดใหญ่ รวมเป็น 80S หน่วยย่อยขนาดเล็กมีหน้าที่ผูกแม่แบบ mRNA ในขณะที่หน่วยย่อยขนาดใหญ่ผูก tRNA ตามลำดับ โมเลกุล mRNA แต่ละตัวแปลพร้อมกันโดยไรโบโซมหลายตัว โปรตีนสังเคราะห์ทั้งหมดไปในทิศทางเดียวกัน: อ่าน mRNA จาก 5′ ถึง 3′ และสังเคราะห์พอลิเปปไทด์จากปลาย N ไปยังปลาย C โครงสร้าง mRNA/โพลี-ไรโบโซมที่สมบูรณ์เรียกว่า a polysome.

TRNAs

tRNA เป็นโมเลกุล RNA ที่มีโครงสร้างซึ่งคัดลอกมาจากยีนโดย RNA polymerase III ขึ้นอยู่กับสปีชีส์ tRNAs 40 ถึง 60 ชนิดมีอยู่ในไซโตพลาสซึม ทำหน้าที่เป็นตัวปรับต่อ tRNA จำเพาะจับกับลำดับบนแม่แบบ mRNA และเพิ่มกรดอะมิโนที่สอดคล้องกันไปยังสายโซ่โพลีเปปไทด์ ดังนั้น tRNAs จึงเป็นโมเลกุลที่ "แปล" ภาษาของ RNA เป็นภาษาของโปรตีนอย่างแท้จริง

จากโคดอน mRNA ที่เป็นไปได้ 64 อัน—หรือการรวมแฝดสามของ A, U, G และ C— สามระบุการสิ้นสุดของการสังเคราะห์โปรตีน และ 61 ระบุการเติมกรดอะมิโนลงในสายพอลิเปปไทด์ จาก 61 เหล่านี้ codon (AUG) หนึ่งตัวเข้ารหัสการเริ่มต้นการแปลด้วย แอนติโคดอน tRNA แต่ละตัวสามารถจับคู่เบสกับหนึ่งในโคดอน mRNA และเพิ่มกรดอะมิโนหรือยุติการแปลตามรหัสพันธุกรรม ตัวอย่างเช่น ถ้าลำดับ CUA เกิดขึ้นบนเทมเพลต mRNA ในกรอบการอ่านที่เหมาะสม มันจะจับ tRNA ที่แสดงลำดับเสริม GAU ซึ่งจะเชื่อมโยงกับลิวซีนของกรดอะมิโน

ในฐานะที่เป็นโมเลกุลของตัวปรับต่อของการแปล น่าแปลกใจที่ tRNA สามารถใส่ความจำเพาะได้มากลงในแพ็คเกจขนาดเล็กเช่นนี้ พิจารณาว่า tRNA จำเป็นต้องโต้ตอบกับปัจจัยสามประการ:

  1. พวกมันต้องได้รับการยอมรับจากอะมิโนอะซิลสังเคราะห์ที่ถูกต้อง
  2. พวกเขาจะต้องได้รับการยอมรับจากไรโบโซม
  3. พวกเขาต้องผูกกับลำดับที่ถูกต้องใน mRNA

อะมิโนอะซิล tRNA ซินธิเตส

กระบวนการสังเคราะห์ pre-tRNA โดย RNA polymerase III จะสร้างเฉพาะส่วน RNA ของโมเลกุลอะแดปเตอร์เท่านั้น ต้องเติมกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้องในภายหลัง เมื่อ tRNA ถูกประมวลผลและส่งออกไปยังไซโตพลาสซึม ผ่านกระบวนการ "ชาร์จ" ของ tRNA โมเลกุล tRNA แต่ละโมเลกุลเชื่อมโยงกับกรดอะมิโนที่ถูกต้องโดยกลุ่มของเอนไซม์ที่เรียกว่า aminoacyl tRNA synthetases . อย่างน้อย 1 ประเภท อะมิโนอะซิล tRNA ซินธิเทส มีอยู่สำหรับกรดอะมิโน 20 ชนิด จำนวนที่แน่นอนของการสังเคราะห์ aminoacyl tRNA แตกต่างกันไปตามสปีชีส์ เอนไซม์เหล่านี้จับและไฮโดรไลซ์ ATP ก่อนเพื่อกระตุ้นพันธะพลังงานสูงระหว่างกรดอะมิโนกับอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต (AMP) โมเลกุลไพโรฟอสเฟตถูกขับออกจากปฏิกิริยานี้ กรดอะมิโนที่ถูกกระตุ้นจะถูกถ่ายโอนไปยัง tRNA และปล่อย AMP


ความคงอยู่ของ narnaviruses แบบ ambigrammatic จำเป็นต้องมีการแปลกรอบการอ่านแบบเปิดย้อนกลับ

Narnaviruses เป็นไวรัส RNA ที่ตรวจพบในเชื้อรา พืช protists สัตว์ขาปล้องและไส้เดือนฝอย แม้ว่าในตอนแรกจะอธิบายว่าเป็นไวรัสที่ไม่มีการแบ่งส่วนยีนเดี่ยวแบบง่าย ๆ ซึ่งเข้ารหัส RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) ที่ขึ้นกับ RNA แต่ชุดย่อยของ narnaviruses ที่อ้างถึงเป็น "ambigrammatic" มีการกำหนดค่าจีโนมที่ไม่ซ้ำกันซึ่งประกอบด้วยเฟรมการอ่านแบบเปิดที่ทับซ้อนกัน (ORFs) ที่เข้ารหัสบนสายตรงข้าม . การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการสนับสนุนการเลือกเพื่อรักษาองค์กรจีโนมที่ผิดปกตินี้ไว้ แต่ยังขาดการตรวจสอบเชิงหน้าที่ ในที่นี้ เราได้สร้าง Culex narnavirus 1 (CxNV1) ที่แพร่ระบาดโดยยุงเพื่อเป็นแบบจำลองเพื่อตรวจสอบบทบาทหน้าที่ของ ORF ที่ทับซ้อนกันในการจำลองแบบของ narnavirus ใน CxNV1 ORF แบบย้อนกลับที่ไม่มีความคล้ายคลึงกันกับโปรตีนที่รู้จักครอบคลุมเกือบทั้งเซกเมนต์ 3.2 kb ที่เข้ารหัส RdRp นอกจากนี้ ORFs นวนิยายที่ตรงข้ามกันสองตัวและเกือบจะทับซ้อนกันเกือบทั้งหมดพบได้ในเซ็กเมนต์ CxNV1 สมมุติที่สอง นั่นคือ RNA “Robin” 0.8 kb เราพัฒนาระบบเพื่อเปิดใช้ CxNV1 ในสายเซลล์ยุงที่ไร้เดียงสา จากนั้นแสดงให้เห็นว่าจำเป็นต้องมี RdRp ที่ใช้งานได้สำหรับการคงอยู่ของทั้งสองส่วน และจำเป็นต้องมี ORF ย้อนกลับที่ไม่เสียหายในส่วน RdRp เพื่อการคงอยู่ แมสสเปกโตรเมทรีของเซลล์ที่ติดเชื้อ CxNV1 อย่างต่อเนื่องได้ให้หลักฐานสำหรับการแปลค่า ORF แบบย้อนกลับนี้ ในที่สุด การทำโปรไฟล์ไรโบโซมให้รูปแบบรอยเท้าที่โดดเด่นสำหรับสาย CxNV1 RNA ทั้งสี่สายที่แตกต่างจากไรโบโซมที่แปลอย่างแข็งขันบน mRNA โฮสต์หรือไวรัส RNA ที่ติดเชื้อร่วม เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้เพิ่มความเป็นไปได้ที่กระบวนการแปลเองมีความสำคัญต่อการคงอยู่ของนาร์นาไวรัสแบบแอมบแกรม โดยอาจป้องกัน RNA ของไวรัสด้วยไรโบโซม ดังนั้นจึงแนะนำกลยุทธ์ของไวรัสที่ไม่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สำหรับการจำลองแบบและการแพร่เชื้อ

ความสำคัญ พื้นฐานสำหรับความเข้าใจของเราเกี่ยวกับไวรัสอาร์เอ็นเอคือคำอธิบายว่าสายของอาร์เอ็นเอจะถูกส่งผ่านเป็นจีโนมของไวรัส ซึ่งสัมพันธ์กับการเข้ารหัสโปรตีนของไวรัส narnaviruses แบบ Ambigrammatic ทำลายรา ไวรัสเหล่านี้ พบมากในเชื้อรา พืช และแมลง มีลักษณะเฉพาะของยีนที่ทับซ้อนกันสองตัวที่เข้ารหัสบนสายตรงข้าม ซึ่งประกอบด้วยความยาวเกือบเต็มของจีโนมของไวรัส การทับซ้อนที่กว้างขวางดังกล่าวไม่พบในไวรัสอาร์เอ็นเอชนิดอื่น และต้องแลกมาด้วยความยืดหยุ่นทางวิวัฒนาการที่ลดลงในลำดับ การศึกษานี้ได้รับแรงบันดาลใจจากการตรวจสอบผลประโยชน์ที่ทำให้ต้นทุนสมดุล เราแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าข้อกำหนดด้านฟังก์ชันสำหรับการกำหนดค่าจีโนมแบบแอมบิแกรมใน Culex narnavirus 1 ซึ่งแนะนำแบบจำลองสำหรับการแปลความหมายของทั้งสองสายที่อาจเป็นประโยชน์ต่อไวรัสนี้ งานของเราเน้นพิมพ์เขียวใหม่สำหรับการคงอยู่ของไวรัส ซึ่งแตกต่างจากกลยุทธ์ที่กำหนดโดยคำจำกัดความตามรูปแบบบัญญัติของสายการเข้ารหัส


ลิงก์ Ubiquitin ปรับให้ราบรื่นเพื่อการขนส่งภายในธงเพื่อควบคุมการส่งสัญญาณของเม่น

ในกรณีที่ไม่มีลิแกนด์เม่น Patched-1 (Ptch1) จะแปลเป็น cilia และป้องกันการสะสมของเลนส์ปรับเลนส์และการเปิดใช้งานของ smoothened (Smo) เมื่อผูกแกนด์แล้ว Ptch1 จะถูกลบออกจากตา Smo จะถูกกดขี่ข่มเหงและสะสมในตาที่เปิดใช้งานการส่งสัญญาณ กลไกที่ควบคุมการเคลื่อนไหวแบบไดนามิกเหล่านี้ไม่เป็นที่เข้าใจกันดีนัก แต่ข้อบกพร่องในส่วนประกอบการขนส่งภายในธงชาติรวมถึง Ift27 และ BBSome ทำให้ Smo สะสมใน cilia โดยไม่มีการเปิดใช้งานทางเดิน เราพบว่าในกรณีที่ไม่มีการกระตุ้นเส้นทางที่เกิดจากลิแกนด์ Smo จะถูกแพร่หลายและถูกลบออกจาก cilia และกระบวนการนี้ขึ้นอยู่กับส่วนประกอบ Ift27 และ BBSome การเปิดใช้งานการส่งสัญญาณของเม่นจะลดการแพร่หลายของ Smo และการกำจัดเลนส์ปรับเลนส์ทำให้เกิดการสะสม การปิดกั้นการแพร่หลายของ Smo โดยตัวยับยั้ง E1 ligase หรือโดยการกลายพันธุ์สารตกค้างไลซีนสองตัวในวงจรภายในเซลล์ที่สามทำให้ Smo สะสมอย่างผิดปกติใน cilia โดยไม่มีการกระตุ้นทางเดิน ข้อมูลเหล่านี้เป็นกลไกในการควบคุมระดับปรับเลนส์ของ Smo ในระหว่างการส่งสัญญาณของเม่นโดยการควบคุมสถานะการแพร่หลายของตัวรับ

สรุป การส่งสัญญาณของเม่นเกี่ยวข้องกับการเคลื่อนไหวแบบไดนามิกของตัวรับและเอฟเฟกต์เข้าและออกจากตา เราพบว่าพลวัตของ Smo ถูกควบคุมโดย ubiquitination ซึ่งควบคุมการมีปฏิสัมพันธ์กับระบบขนส่งภายในเซลล์เพื่อควบคุมระดับปรับเลนส์ของตัวรับนี้


12.18: ไรโบโซม - ชีววิทยา

ถึงคุณที่ไม่เข้าใจ:
อ่านคำแนะนำก็บอกหมดแล้ว!

เข้าสู่ระบบ / ลงทะเบียนเพื่อโหวต & amp; รีวิว!

บัญชี Newgrounds ฟรีและผู้ใช้ที่ลงทะเบียนเห็นโฆษณาน้อยลง!

มันดี แต่ง่ายเกินไป ฉันคิดว่าคุณควรแสดงคำแนะนำเมื่อผู้เล่นคลิก "เล่น" คุณแสดงคำแนะนำและปุ่มเล่นเกมด้านล่าง

และไม่ควรให้คะแนนกินโมเลกุลด้วย pac-man

ฉันรักมัน! วิธีทำให้การศึกษาเป็นเรื่องสนุก! นี่เป็นโครงการหรือเพียงบางสิ่งที่คุณทำเพื่อความสนุกสนาน? เพราะมันจะทำให้โครงการชีววิทยานักฆ่า!

ทั้งโครงการและเพื่อความสนุกสนานอย่างแท้จริง ฉันได้เกรดดีสำหรับมันด้วย!
ดีที่คุณชอบมัน! ขอขอบคุณ!

ฉันคิดว่ามันใช้ได้และมันไม่ซับซ้อนขนาดนั้นถ้าคุณอ่านคำแนะนำทั้งหมด

แนวความคิดที่ดี แต่คุณทำให้มันยากเกินไปด้วยขีดจำกัดของแอนติโคดอนที่คุณมีได้แม้ว่าคุณจะเติมพวกมันเต็มหน้าจอ พวกมันก็ไม่ตรงกับโคดอนที่ถูกต้องที่กำลังจะฆ่าคุณ ไอเดียดีครับ ขอแก้ไขนิดนึง

ดูเหมือนว่าจะต้องใช้เวลามาก แต่ฉันไม่รู้ว่าจะเล่นได้อย่างไร ดูเหมือนว่าคุณต้องการความรู้ในการทำงานของ RNA เพื่อเล่นเกมนี้

คุณรู้หรือไม่ว่า RNA คืออะไร?
โปรดอ่านคำแนะนำ เป็นเกมที่คุณเล่นตามคำแนะนำ
หวังว่าฉันจะโกรธคุณ :)


ส่วนที่ 2: การเฝ้าระวัง mRNA โดยไรโบโซม

00:00:07.22 สวัสดี ฉันชื่อราเชล กรีน
00:00:09.14 และฉันอยู่ที่คณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยจอห์น ฮอปกิ้นส์
00:00:12.01 และในสถาบันการแพทย์ Howard Hughes
00:00:14.12 วันนี้ฉันจะแชร์อะไรกับคุณ
00:00:15.20 เป็นเรื่องเล่าจากห้องทดลองของฉัน
00:00:17.06 เน้นที่ไรโบโซม
00:00:18.21 ในเซลล์ยูคาริโอต
00:00:19.29 ระบุ RNA ของผู้ส่งสารที่ไม่ดี
00:00:21.24 เพื่อทริกเกอร์ชุดของเหตุการณ์ในเซลล์
00:00:24.15 ที่นำไปสู่การย่อยสลายของผลิตภัณฑ์โปรตีนที่ไม่สมบูรณ์
00:00:27.15 ถึงการสลายตัวของ RNA ของผู้ส่งสาร
00:00:29.01 และทำการรีไซเคิลไรโบโซมคอมเพล็กซ์
00:00:33.02 ดังนั้น RNA ของผู้ส่งสารตัวใดมีข้อบกพร่อง
00:00:35.02 ในห้องขัง คุณอยากจะติดตามดูไหม?
00:00:36.28 มีปัญหาอะไรรึเปล่า
00:00:39.00 ด้วย RNA ของผู้ส่งสารที่กำหนดในเซลล์ยูคาริโอต?
00:00:42.03 ตามที่เราจำได้จากการเรียนรู้เกี่ยวกับการประมวลผล mRNA
00:00:44.04 เรารู้ว่า RNA ของผู้ส่งสารยูคาริโอต
00:00:46.06 ออกมาจากนิวเคลียสด้วยหมวก
00:00:48.01 ที่ 5' สิ้นสุด
00:00:49.08 และด้วยหาง polyA ที่ส่วนท้าย 3'
00:00:51.20 น. และสิ่งเหล่านี้เป็นลายเซ็นหลักของ RNA ของผู้ส่งสารในเซลล์ยูคาริโอต
00:00:55.08 ที่บอกไรโบโซม
00:00:57.02 ว่านี่คือข้อความดีๆ
00:00:58.13 และอันนี้น่าจะแปล
00:01:00.12 นอกจากนี้ เราทราบดีว่า RNA ของผู้ส่งสารทั่วไป
00:01:02.05 เริ่ม codon
00:01:03.18 ที่ส่งสัญญาณการเริ่มต้นของกรอบการอ่านที่เปิดอยู่
00:01:05.21 และโคดอนหยุด
00:01:07.24 ที่แสดงถึงจุดสิ้นสุดของกรอบการอ่านที่เปิดอยู่
00:01:09.26 และเซลล์ต้องการทำอะไร
00:01:11.13 เริ่มต้นตั้งแต่ต้นจนจบ
00:01:13.07 และสร้างโปรตีนที่มีความยาวเต็มที่
00:01:15.03 แล้วจะเกิดอะไรขึ้น
00:01:16.05 อาจมีเหตุการณ์มากมายเกิดขึ้น
00:01:18.24 ในการประมวลผล RNA หรือการกลายพันธุ์
00:01:21.01 ที่จะส่งผลให้ผู้ส่งสาร RNA
00:01:22.22 ที่อาจไม่เหมาะสมจริงๆ
00:01:24.20 ตัวอย่างหนึ่งที่หลายท่านอาจเคยได้ยินเกี่ยวกับ
00:01:26.18 ตัวอย่างเช่น ถ้าผู้ส่งสาร RNA
00:01:28.22 มีโคดอนการสิ้นสุดก่อนกำหนด
00:01:30.12 นั่นคือ แทนที่จะเป็น
00:01:32.10 มีเพียง codon หยุดที่ส่วนท้ายของกรอบการอ่านที่เปิดอยู่
00:01:34.14 พวกมัน โดยการกลายพันธุ์ของกระบวนการอื่นบางอย่าง
00:01:36.22 - อาจเป็นกระบวนการที่ผิดพลาด -
00:01:38.04 พวกเขามีรหัสสิ้นสุดที่ปรากฏขึ้น
00:01:40.28 ในช่วงต้นของกรอบการอ่านที่เปิดอยู่
00:01:42.06 น่าทึ่งมาก เซลล์ยูคาริโอต
00:01:43.21 มีกลไกเข้าที่
00:01:45.19 เพื่อตรวจสอบว่า codon สิ้นสุดหรือไม่
00:01:47.01 เป็นโคดอนการสิ้นสุดที่ถูกต้องหรือโคดอนการสิ้นสุดที่ไม่ถูกต้อง
00:01:50.24 และมันกระตุ้นลำดับเหตุการณ์นี้
00:01:52.08 ที่นำไปสู่การสลายตัวของ RNA ของผู้ส่งสารในที่สุด
00:01:54.27 อีกตัวอย่างหนึ่งของปัญหาที่เป็นไปได้
00:01:57.12 กับผู้ส่งสาร RNA
00:01:58.20 จะเป็น RNA ของผู้ส่งสารที่ตัดด้วยเอ็นโดนิวคลีโอลิติค
00:02:00.12 ถ้า RNA ของผู้ส่งสาร ตรวจพบความแตกแยก
00:02:02.14 ในช่วงกลางของ,
00:02:03.26 ไรโบโซมจะไม่มีวันไปถึง codon หยุดในตอนท้าย
00:02:06.12 และไรโบโซมจะติดอยู่
00:02:07.29 ในกรณีที่ไม่มี codon หยุด
00:02:09.08 และความสามารถในการส่งเสริมกระบวนการเลิกจ้างตามปกติ
00:02:11.27 นี่คือผู้ส่งสาร RNA
00:02:13.08 ที่เซลล์ต้องการกำจัดและไม่ใช้อีก
00:02:15.15 ยังต้องการกำจัดผลิตภัณฑ์โพลีเปปไทด์ที่ไม่สมบูรณ์นั้นออกไปด้วย
00:02:19.25 ตัวอย่างสุดท้ายที่คุณจินตนาการได้อาจเกิดขึ้น
00:02:22.27 คือว่า RNA ของผู้ส่งสารอาจไม่มี codon หยุด
00:02:25.25 ผ่านเหตุการณ์การประกบผิดพลาดหรือการกลายพันธุ์บางอย่าง
00:02:28.02 และในกรณีนั้น ไรโบโซม
00:02:29.14 อาจผ่านไปได้จริง
00:02:32.16 บริเวณที่ไม่ได้แปล 3' ของยีนนั้น
00:02:35.06 และพบกับหางโพลีเอ
00:02:37.02 PolyA เข้ารหัสไลซีน
00:02:38.16 และสิ่งที่คิดว่าจะเกิดขึ้น
00:02:40.04 คือความรู้สึกไรโบโซมว่ามันสร้างไลซีน-ไลซีน-ไลซีน-ไลซีน
00:02:42.27 และทำให้เกิดกระบวนการของ
00:02:47.22 สลายตัวและช่วยชีวิตในห้องขัง
00:02:49.08 ที่เราเรียกว่าการเสื่อมแบบไม่หยุดหย่อน
00:02:50.21 ดังนั้น การสลายตัวที่ไร้สาระ
00:02:51.27 การสลายตัวที่ไม่ไป
00:02:53.00 น. และการสลายตัวแบบไม่หยุดหย่อน
00:02:54.14 น่าจะเป็นสามกระบวนการที่เกี่ยวข้อง
00:02:56.01 นั่นคือทั้งหมดที่มุ่งหมาย
00:02:57.26 ที่อยู่ภายใต้การควบคุมในเซลล์ u
00:02:59.12 n RNA ของผู้ส่งสารที่ก่อผล
00:03:01.04 กำจัด RNA ของผู้ส่งสาร
00:03:02.19 ย่อยสลายผลิตภัณฑ์โปรตีน
00:03:04.02 และช่วยไรโบโซม
00:03:05.20 สำหรับกิจกรรมการแปลที่ตามมา
00:03:07.04 และนั่นคือสิ่งที่จะเน้นของการบรรยายในวันนี้
00:03:10.06 แล้วเราเริ่มสนใจได้อย่างไร
00:03:11.18 ในกระบวนการสลายตัวเหล่านี้
00:03:13.20 ของการเฝ้าระวัง mRNA?
00:03:14.27 เราเริ่มสนใจ
00:03:16.27 เพราะเราสังเกตเห็นในวรรณกรรม
00:03:18.16 ข้อสังเกตที่น่าสนใจ
00:03:19.28 เป็นเวลาหลายปี
00:03:21.11 เราได้ศึกษาขั้นตอนการเลิกจ้างแล้ว
00:03:24.25 ในระบบยูคาริโอต
00:03:26.17 โดยที่ codon หยุดเป็นที่รู้จัก
00:03:28.20 โดยปัจจัยการสิ้นสุดในเซลล์ยูคาริโอต
00:03:31.02 เพื่อปลดปล่อยสายโซ่โพลีเปปไทด์ที่กำลังเติบโต
00:03:32.27 และเราได้ศึกษาปัจจัยเหล่านี้แล้ว
00:03:34.04 และวิธีการทำงานทางชีวเคมี
00:03:35.16 เป็นเวลาหลายปี
00:03:37.20 มีสิ่งพิมพ์ที่ออกมาจากห้องทดลองของ Roy Parker อย่างไรก็ตาม
00:03:40.06 ที่ห้องทดลองของรอยใส่ RNA ของผู้ส่งสารในยีสต์
00:03:43.06 โครงสร้างแบบห่วงยาว
00:03:44.26 - มีความยาว 34 คู่เบส ก้านนี้ -
00:03:48.08 และอันที่จริงมันเป็นโครงสร้างที่ใหญ่มาก
00:03:49.28 ว่าไม่มีไรโบโซมใดที่สามารถดันผ่านมันได้อย่างง่ายดาย
00:03:53.10 และสิ่งที่ห้องทดลองของรอยสังเกต
00:03:55.08 คือผู้ส่งสารนี้ RNA
00:03:58.00 น. ตกเป็นเป้าหมายของการสลายตัวในเซลล์ยูคาริโอต
00:03:59.22 ในกระบวนการที่เขาเรียกว่า No-Go-Decay
00:04:01.12 เพราะไรโบโซมผ่านเข้าไปไม่ได้
00:04:03.19 แต่ข้อสังเกตที่สำคัญในการศึกษานี้
00:04:06.06 คือกระบวนการสลาย mRNA นี้
00:04:07.21 ขึ้นอยู่กับโปรตีนสองชนิด
00:04:09.05 Dom34 และ Hbs1,
00:04:11.24 ซึ่งกลายเป็นคล้ายคลึงกัน
00:04:13.26 ของปัจจัยการสิ้นสุดของยูคาริโอต
00:04:16.06 eRF1 และ eRF3
00:04:17.24 ที่เราเรียนมา
00:04:19.08 และเราได้ศึกษาพวกมันทางชีวเคมี
00:04:21.08 ดังนั้น นี่จึงดูเหมือนเป็นความเข้าใจที่สำคัญ
00:04:22.16 เพราะสิ่งที่มันแนะนำ
00:04:24.06 คือการรับรู้ของผู้ส่งสารที่ไม่ดี RNA
00:04:26.10 อันที่จริงขับเคลื่อนด้วยไรโบโซม อย่างที่คุณอาจสงสัย
00:04:28.09 เพราะไรโบโซมต้องเป็นเอนไซม์
00:04:31.15 หรือตัวเร่งปฏิกิริยา หรือโมเลกุลขนาดใหญ่
00:04:34.10 ที่ตัดสินว่าข้อความนั้นดีหรือไม่
00:04:36.00 ดูเหมือนเป็นความคิดที่มีเหตุผลมาก
00:04:37.12 ว่าไรโบโซมเป็นตัวกำหนด
00:04:39.08 ไม่ว่าผู้ส่งสาร RNA จะดีหรือไม่ดี
00:04:40.22 ฉันควรแปลหรือไม่ควรแปล
00:04:43.16 และนั่นคือจุดเริ่มต้นของงานของเรา
00:04:46.12 เรารู้ว่า Dom34 คล้ายคลึงกันของ eRF1
00:04:48.10 และนั่นถูกเน้นโดยมุมมองเชิงโครงสร้างที่นี่
00:04:50.18 มีโครงสร้างที่รู้จัก eRF1 และ Dom34
00:04:53.24 eRF1 ในการรับรู้ codon หยุด
00:04:55.16 มีบรรทัดฐานการรับรู้ codon อยู่ที่นี่
00:04:57.21 เรียกว่าโดเมน NIKS
00:04:59.21 และที่ด้านบนสุด โต้ตอบกับหน่วยย่อยขนาดใหญ่ของไรโบโซม
00:05:02.17 เป็นบรรทัดฐานของกรดไตรอะมิโน หลักเกณฑ์ GGQ
00:05:06.01 ที่รับผิดชอบการเร่งปฏิกิริยาของการปล่อยเปปไทด์
00:05:09.17 เราเห็นว่า Dom34 มีโดเมนที่คล้ายกัน
00:05:12.08 โดเมนนี้มีความเกี่ยวข้องกับโดเมนนี้อย่างชัดเจน
00:05:14.16 - คุณจะเห็นได้ว่าในแง่ของเบต้าชีต
00:05:16.01 และลานอัลฟ่า
00:05:18.02 อย่างไรก็ตาม มันขาดโดเมนนี้ที่มี GGQ motif
00:05:20.18 ซึ่งจะมีหน้าที่ในการปล่อยสายโซ่โพลีเปปไทด์ที่กำลังเติบโต
00:05:24.06 เราเห็นว่ายังมี
00:05:25.29 ไม่มีรูปแบบการรู้จำ codon
00:05:27.10 แต่คุณสมบัติอื่นๆ ที่พวกเขามีเหมือนกัน
00:05:29.10 พวกเขามีโดเมนนี้ไหม ที่นี่
00:05:30.29 เป็นที่ทราบกันดีว่ามีปฏิสัมพันธ์กับ GTPases
00:05:33.05 ที่จำเป็นต่อขั้นตอนการเลิกจ้าง
00:05:35.08 นี่คือจุดเริ่มต้นของเรา
00:05:36.29 เรามีโปรตีนที่ดูเหมือน
00:05:38.26 มันเกี่ยวข้องกับปัจจัยการยกเลิก
00:05:40.08 และเราสงสัยว่าจะต้องจับไรโบโซม
00:05:42.08 และเรามีเครื่องมือทางชีวเคมี
00:05:44.00 ที่เราต้องการใช้ถามคำถาม
00:05:46.00 เกี่ยวกับสิ่งที่ Dom34 อาจทำ
00:05:47.20 เพื่อให้ RNA ของผู้ส่งสารนั้นสลายตัว
00:05:49.20 ที่ห้องทดลองของ Roy Parker สังเกตเห็น
00:05:52.20 ดังนั้น ด้วยความคิดเหล่านี้
00:05:53.28 สิ่งที่เราทำคือรวม Dom34 และ Hbs1 เข้าด้วยกัน
00:05:57.20 ความคล้ายคลึงกันของปัจจัยการเลิกจ้าง
00:05:59.19 ในสิ่งที่อยู่ในห้องทดลองของเรา
00:06:02.08 ซึ่งเป็นระบบการแปลที่สร้างขึ้นใหม่ในหลอดทดลอง
00:06:05.07 จากยีสต์ Saccharomyces cerevisiae
00:06:09.15 ในห้องทดลองของเรา ในตู้เย็น
00:06:11.00 เราได้ทำให้องค์ประกอบบริสุทธิ์ของไรโบโซม
00:06:12.24 หน่วยย่อยขนาดเล็กและขนาดใหญ่ของไรโบโซม
00:06:14.17 เรามี tRNA, RNA ของผู้ส่งสาร
00:06:17.11 เรามีปัจจัยการเริ่มต้นที่สำคัญห้าประการ
00:06:19.04 ที่ห้องทดลองของ John Loriser แสดงให้เห็นว่าจำเป็น
00:06:21.07 สำหรับการเริ่มต้นในหลอดทดลอง
00:06:23.17 ในรหัส AUG
00:06:24.26 และรับ tRNA ของตัวเริ่มต้นนั้นเข้าไปในไรโบโซม
00:06:27.17 เรามีปัจจัยการยืดตัว
00:06:28.20 เรามีปัจจัยยุติ
00:06:29.28 และในรายการนั้น เราได้เพิ่ม Dom34 และ Hbs1
00:06:33.19 ระบบที่สร้างขึ้นใหม่เช่นนี้ช่วยให้เราทำอะไรได้บ้าง
00:06:35.28 คือการสร้างไรโบโซมเชิงซ้อน
00:06:38.02 กับ RNA ของผู้ส่งสารต่างๆ
00:06:39.18 ระบุเปปไทด์ต่างๆ
00:06:44.24 และขั้นตอนอื่นๆ ในระบบการแปล
00:06:46.12 เราสามารถวาง ตัวอย่างเช่น
00:06:47.21 โคดอนหยุดเข้าไปในไซต์อะมิโนอะซิลของไรโบโซม
00:06:49.15 ถูกรับรู้โดยปัจจัย
00:06:50.16 หรือเราสามารถใส่ความรู้สึก
00:06:52.05 และเราสามารถติดตามกิจกรรมของสารเชิงซ้อนเหล่านี้ได้
00:06:55.07 แสดงว่านี่คือลูกบอลสีน้ำเงิน
00:06:56.28 สำหรับสายโซ่โพลีเปปไทด์ที่กำลังเติบโต
00:06:58.02 ซึ่งมีความหมายว่าเราสามารถติดป้ายได้
00:07:00.08 ซับสเตรต tRNA
00:07:01.14 เราสามารถติดฉลาก tRNA ได้
00:07:02.20 เราสามารถติดฉลากกรดอะมิโน
00:07:04.03 เราสามารถติดป้ายกำกับ RNA ของผู้ส่งสาร
00:07:05.10 เราสามารถติดฉลากไรโบโซมได้
00:07:07.03 และเราสามารถติดตามชะตากรรมของส่วนประกอบต่างๆ ในระบบได้
00:07:09.29 เพื่อถามเกี่ยวกับปฏิกิริยาทางชีวเคมี
00:07:12.22 และนั่นคือสิ่งที่เราทำ
00:07:14.24 และฉันจะแสดงตัวอย่างให้คุณดู
00:07:16.08 ของปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่เราทำ
00:07:18.04 เพื่อเรียนรู้บางสิ่ง
00:07:19.26 เกี่ยวกับฟังก์ชัน Dom34 และ Hbs1
00:07:22.06 เข้าใจว่าปัจจัยเหล่านี้
00:07:23.23 เพิ่งมีส่วนเกี่ยวข้องกับการสลายตัวของ mRNA จริงๆ
00:07:25.17 และไม่เป็นที่รู้จักจริงๆ
00:07:27.15 สิ่งที่พวกเขาอาจทำบนไรโบโซม
00:07:28.28 สิ่งที่เราทำในกรณีนี้
00:07:30.16 เราใช้ระบบชีวเคมีของเราหรือไม่
00:07:31.28 เพื่อสร้างสารเชิงซ้อนไรโบโซมที่ต่างกันสองชนิดขึ้นใหม่
00:07:34.08 สำหรับคนทางซ้าย
00:07:37.00 สิ่งที่เราทำคือ เราสร้างคอมเพล็กซ์
00:07:38.20 ไดเปปทิดิล-tRNA
00:07:39.21 โดยที่เรามีกรดอะมิโนสองตัวบน tRNA ในไซต์ P
00:07:42.06 - เราไปถึงที่นั่นด้วยการเริ่มต้นและยืดออก
00:07:44.28 สำหรับการสังเคราะห์โปรตีนหนึ่งรอบ -
00:07:46.18 และในไซต์ A เราได้วางโคดอนหยุด
00:07:48.03 แต่สุดท้ายก็ไม่สำคัญ
00:07:49.15 และในคอมเพล็กซ์นี้
00:07:51.14 เราจะเห็นว่ามีฉลากกรดอะมิโนอยู่
00:07:52.24 ดังนั้น บนเมไทโอนิล-tRNA
00:07:54.02 เมไทโอนีนมีฉลากกัมมันตภาพรังสี
00:07:56.17 เราสร้างกลุ่มเชิงซ้อนที่คล้ายกันในอีกด้านหนึ่ง ตรงนี้
00:07:59.05 แต่ในกรณีนี้ tRNA เอง
00:08:01.01 มีฉลากกัมมันตภาพรังสี
00:08:02.08 และเราสามารถติดตาม tRNA . ได้
00:08:03.24 แทนที่จะเป็นกรดอะมิโน
00:08:06.20 ในกรณีนี้
00:08:07.28 สิ่งที่เราทำคือ เราเอาเชิงซ้อนเหล่านี้
00:08:09.06 คอมเพล็กซ์ที่มีฉลากไรโบโซมขนาดใหญ่เหล่านี้
00:08:10.22 พร้อมป้ายกำกับในสถานที่ต่างๆ
00:08:12.24 และเราวิ่งบนเจลพื้นเมือง
00:08:14.16 เจลพื้นเมืองช่วยให้วิ่งได้
00:08:16.10 ไม่มากก็น้อย
00:08:17.12 พร้อมส่วนประกอบทั้งหมดที่นั่น
00:08:18.28 และเราถามว่าป้ายหายไปไหน
00:08:21.02 ดังนั้น ที่ด้านบนของเจล
00:08:22.12 ไรโบโซมที่ซับซ้อนยังคงทำงานอยู่
00:08:23.26 ที่ตำแหน่ง 80S
00:08:26.10 และสิ่งที่เราเห็นก็คือโดยปราศจากปัจจัยใดๆ
00:08:28.19 มันทำงานเป็นคอมเพล็กซ์ 80S ขนาดใหญ่
00:08:30.27 อย่างไรก็ตาม เมื่อเราเพิ่ม eRF1 และ eRF3
00:08:32.20 - ปัจจัยการยกเลิกที่ทราบ -
00:08:34.08 สิ่งที่เราคาดหวังจะเกิดขึ้นอย่างแน่นอน
00:08:36.13 ซึ่งในกรณีนี้
00:08:38.27 ซึ่งเรากำลังติดตามเปปไทด์
00:08:40.06 เราปล่อยเปปไทด์
00:08:41.24 ไดเปปไทด์ เม็ท-เพ
00:08:44.08 ในขณะที่ทางขวาตรงนี้
00:08:45.15 โดยที่เรามี tRNA ที่ติดฉลากไว้
00:08:46.28 เกิดอะไรขึ้นคือ tRNA ถูกสร้างขึ้นที่นี่
00:08:50.01 - นี่คือ tRNA ที่มีการดีไซเลต
00:08:51.12 ขาดกรดอะมิโน
00:08:53.14 ดังนั้น นี่คือผลิตภัณฑ์ที่ปล่อยออกมาพร้อมปัจจัยการเลิกจ้าง
00:08:56.04 ต่อไปเราถามว่าเกิดอะไรขึ้น
00:08:57.23 เมื่อเราเพิ่ม Dom34 และ Hbs1
00:08:59.04 ปัจจัยเหล่านี้ที่ดูเหมือนจะมีบทบาท
00:09:00.26 ในการเฝ้าระวัง mRNA
00:09:02.03 แต่เราไม่รู้ว่ามันทำอะไรกับไรโบโซม
00:09:03.19 และเราเห็นการปรากฏตัวของวงดนตรีที่แตกต่างกัน
00:09:05.21 ที่นี่ - ไม่ใช่แถบเปปไทด์ -
00:09:07.23 และวงอื่นที่นี่
00:09:09.10 - ไม่ใช่วง tRNA ที่เลิกใช้แล้ว
00:09:11.28 และสิ่งที่เราให้เหตุผลในเวลานั้น
00:09:14.16 เมื่อเราเห็นวงดนตรีที่ธรรมดา
00:09:15.26 ไปที่คอมเพล็กซ์สองแห่งที่แตกต่างกันนี้
00:09:18.06 แต่แตกต่างจากผลลัพธ์อย่างใดอย่างหนึ่ง
00:09:20.14 ของปฏิกิริยากับ eRF1 และ eRF3
00:09:22.28 เราให้เหตุผลว่านี่อาจเป็น peptidyl-tRNA
00:09:25.04 นั่นคือสิ่งที่เกิดขึ้นจริง
00:09:26.26 คือ Dom34 และ Hbs1
00:09:28.05 เมื่อโต้ตอบกับสารเชิงซ้อนไรโบโซมเหล่านี้
00:09:29.27 ทำให้เกิดการปลดปล่อยจริงๆ
00:09:32.07 ของเพปทิดิล-tRNA เชิงซ้อนทั้งหมด
00:09:34.12 และเราสามารถยืนยันได้ว่า
00:09:36.04 โดยการเพิ่มรีเอเจนต์อื่นที่เรียกว่าเปปทิดิล ไฮโดรเลส
00:09:38.12 ซึ่งปล่อยเปปไทด์อิสระ
00:09:40.12 หรือ tRNA อิสระ
00:09:41.22 นี่คือปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่สำคัญ
00:09:43.28 ที่เราเคยระบุ
00:09:46.10 กิจกรรมใหม่สำหรับโปรตีน Dom34 และ Hbs1
00:09:49.22 และกิจกรรมนี้แนะนำ
00:09:52.22 ส่วนหนึ่งของสิ่งที่โปรตีนเหล่านี้กำลังทำอยู่
00:09:54.08 พวกมันจำไรโบโซมได้หรือเปล่า
00:09:55.16 และพวกเขากำลังอำนวยความสะดวกให้กับเหตุการณ์ที่ทำให้ไม่มั่นคง
00:09:58.24 ที่นำไปสู่การปลดปล่อย
00:10:00.12 ของเปปทิดิล-tRNA จากไรโบโซม
00:10:03.01 นี่คือจุดเริ่มต้นของเรื่องราวทางชีวเคมี
00:10:05.05 และนี่คือบทสรุปของเรื่องนั้น
00:10:07.21 สิ่งที่เราพบเมื่อเวลาผ่านไป
00:10:09.03 คือไรโบโซมเชิงซ้อน
00:10:11.04 เมื่อนำเสนอด้วย Dom34 และ Hbs1
00:10:13.18 ที่จริงแล้ว Dom34 และ Hbs1 ทำอะไร
00:10:16.10 แยกหน่วยย่อยไรโบโซมอย่างมีประสิทธิภาพ
00:10:19.00 เปปทิดิล-tRNA มีแนวโน้มที่จะแบ่งพาร์ติชันด้วยหน่วยย่อยขนาดใหญ่
00:10:22.06 ขึ้นอยู่กับความยาวของสายโซ่โพลีเปปไทด์
00:10:25.06 สิ่งที่เราพบคือปฏิกิริยานี้โดย Dom34 และ Hbs1
00:10:27.26 เป็นอิสระจากโคดอน
00:10:29.12 นั้นสอดคล้องกับโครงสร้าง
00:10:31.08 ที่ฉันให้คุณดูเมื่อหลายสไลด์ที่แล้ว
00:10:33.04 ที่ไม่มีโดเมนการรับรู้ codon บนโปรตีนนี้ Dom34
00:10:36.25 เราเห็นว่าเปปไทด์ไม่ถูกปลดปล่อยออกจาก tRNA
00:10:39.02 สอดคล้องกับข้อเท็จจริงที่ว่าโปรตีน Dom34
00:10:42.12 ขาดบรรทัดฐาน GGQ ที่รับผิดชอบกิจกรรมนั้น
00:10:45.24 ในปัจจัยการเลิกจ้าง
00:10:48.04 และอีกอย่างก็คือโปรตีนเหล่านี้
00:10:50.10 ต้องการแยกหน่วยย่อย
00:10:52.18 เมื่อเทมเพลต RNA ของผู้ส่งสารมีแนวโน้มสั้น
00:10:55.08 ดังนั้น ถ้า RNA ของผู้ส่งสารสั้น
00:10:56.26 จากจุด 3'
00:10:58.24 เข้ามาที่ผนังของไรโบโซม
00:11:00.16 เราพบว่าอันที่จริงเป็นสารตั้งต้นทางชีวเคมีที่ต้องการ
00:11:03.02 สำหรับโปรตีนเหล่านี้
00:11:05.03 ทั้งหมดนี้สมเหตุสมผลอย่างไร
00:11:06.19 จากสิ่งที่เรารู้เกี่ยวกับ Dom34 และ Hbs1
00:11:08.19 อยู่ในกระบวนการที่เรียกว่าไม่ไปสลาย?
00:11:11.08 ในช่วงเวลาเดียวกัน
00:11:13.06 ว่าเรากำลังทำปฏิกิริยาทางชีวเคมี
00:11:14.26 มีห้องทดลองจำนวนหนึ่งที่ศึกษาสิ่งนี้ในร่างกาย
00:11:17.02 และพวกเขาได้ข้อคิดที่สำคัญหลายอย่าง
00:11:19.02 โดยเฉพาะ ห้องทดลองของโทชิ อินาดะ
00:11:20.27 และเข้ากับแบบจำลองที่เขานำเสนอ
00:11:22.16 ซึ่งเป็นแนวคิดที่ว่าไรโบโซมติดอยู่
00:11:24.22 ในสถานที่เฉพาะใน RNA ของผู้ส่งสาร
00:11:27.08 อาจเป็นตัวอย่าง โครงสร้างแบบวนรอบลำต้นขนาดใหญ่
00:11:30.18 มีความแตกแยกเอนโดนิวคลีโอลิติกที่เกิดขึ้นจริง
00:11:32.26 หลังไรโบโซม
00:11:34.06 และนั่นถูกบันทึกไว้ในห้องทดลองของโทชิ
00:11:36.14 ที่นำไปสู่ ​​RNA ของผู้ส่งสารที่ตัดด้วยเอ็นโดนิวคลีโอไลต์
00:11:39.24 และเนื่องจากมีไรโบโซมจำนวนมาก
00:11:42.22 ใน RNA ของผู้ส่งสารที่ให้มา
00:11:43.29 นั่นหมายความว่าไรโบโซมทั้งหมด
00:11:45.16 ที่อยู่เบื้องหลังจุดแตกแยกของเอ็นโดนิวคลีโอไลต์
00:11:48.02 พบกับปลายแยกเอ็นโดนิวคลีโอลิติค
00:11:51.18 และนั่นจะเป็นเป้าหมายในอุดมคติของโปรตีนเหล่านี้
00:11:53.17 Dom34 และ Hbs1.
00:11:55.02 หากไม่มีปัจจัยเหล่านี้
00:11:56.25 ไรโบโซมติดอยู่ที่ข้อความ
00:11:58.22 โดยไม่มีทางลงจากรถได้
00:12:00.06 และปัจจัยเหล่านี้อาจทำให้
00:12:03.02 สำหรับการรีไซเคิลไรโบโซมคอมเพล็กซ์เหล่านี้
00:12:04.24 กับ RNA ของผู้ส่งสารที่บกพร่อง
00:12:06.12 นำไปสู่ปฏิกิริยาการรีไซเคิล
00:12:08.04 และการนำไรโบโซมกลับมาใช้ใหม่
00:12:11.08 ดังนั้น ข้อมูลทางชีวเคมีของเราจึงเข้ากันได้ดี
00:12:14.07 กับผลลัพธ์อื่นๆ ในสนาม
00:12:15.20 ที่เกิดขึ้นในเซลล์ที่ไม่เสียหาย
00:12:17.25 และนั่นคือความคิดของเรา
00:12:19.19 ดังนั้นเราจึงต้องการถามคำถามทั่วไปต่อไป
00:12:22.02 เมื่อทราบกิจกรรมทางชีวเคมีของโปรตีนเหล่านี้
00:12:24.18 และความรู้เล็กน้อยเกี่ยวกับโปรตีนเหล่านี้
00:12:26.15 ประพฤติตามนักข่าวในเซลล์ต่างๆ
00:12:29.29 เราต้องการถามคำถามเกี่ยวกับ
00:12:32.04 ความสำคัญทางชีวภาพโดยทั่วไป
00:12:33.21 ของการตอบสนองกู้ภัย
00:12:35.04 โดยทั่วไปแล้ว RNA ของผู้ส่งสารใดที่กำหนดเป้าหมายในเซลล์
00:12:37.07 เหมือนกันในเงื่อนไขประเภทไวด์
00:12:39.20 หรืออยู่ในสภาวะเครียด?
00:12:41.04 แล้วเราจะคิดเรื่องนี้ได้อย่างไร?
00:12:43.08 เรารู้ตั้งแต่แรกแล้วว่า Dom34
00:12:45.02 เป็นยีนที่ไม่จำเป็นในยีสต์
00:12:47.14 แต่เรารู้ว่าจำเป็นสำหรับยูคาริโอตที่สูงกว่า
00:12:49.26 ยีนนี้เรียกว่า Pelota ในยูคาริโอตชั้นสูง
00:12:52.01 และเป็นตัวอ่อนที่ทำให้ตายได้ในหนู
00:12:55.14 ดังนั้นจึงเป็นยีนที่สำคัญในยูคาริโอตชั้นสูง
00:12:58.08 อย่างไรก็ตาม เรารู้ว่าการลบ Dom34 ในยีสต์
00:13:01.19 ถูกสังเคราะห์ด้วยสิ่งต่าง ๆ มากมาย
00:13:04.06 รวมถึง ตัวอย่างเช่น
00:13:05.26 การลบยีนโปรตีนไรโบโซม
00:13:07.12 และเป็นที่ทราบกันดีว่าเมื่อคุณลบยีนโปรตีนไรโบโซม
00:13:10.01 ตัวอย่างเช่น ยีนโปรตีนไรโบโซมหนึ่งสำเนา
00:13:12.24 ว่ามีไรโบโซมไม่เพียงพอในเซลล์
00:13:15.22 เพราะการกำเนิดทางชีวภาพไม่สามารถติดตามได้จริงๆ
00:13:17.24 กับสิ่งที่ต้องทำ
00:13:19.06 ความคิดก็อาจเป็นอย่างนั้น
00:13:21.02 ถ้าคุณลบปัจจัยช่วยเหลือสำหรับไรโบโซม
00:13:23.06 และประกอบเข้าด้วยกันด้วยความบกพร่องของไรโบโซมทางชีวภาพ
00:13:26.27 นั่นคือเวลาที่เซลล์ป่วยจริงๆ
00:13:28.17 และนั่นจะอธิบายการตายสังเคราะห์ได้
00:13:31.02 และคำถามต่อไปที่เราอยากจะถามจริงๆ
00:13:33.04 คือ "อะไรคือเป้าหมายของเซลลูลาร์
00:13:35.23 สำหรับหน้าที่ของ Dom34 และการช่วยเหลือ Dom34"
00:13:38.10 เราโชคดีเพราะตอนนั้น
00:13:40.16 เรากำลังคิดเกี่ยวกับแนวคิดเหล่านี้
00:13:41.29 มีแนวทางใหม่ที่เพิ่งเข้ามาในโลกออนไลน์
00:13:43.23 จากห้องทดลองของ Jonathan Weissman
00:13:45.07 และได้รับการพัฒนาโดยนิค อินโกเลีย
00:13:46.23 postdoc ในห้องทดลองของเขา
00:13:48.05 มันเป็นวิธีการที่เรียกว่าการทำโปรไฟล์ไรโบโซม
00:13:49.22 ที่ช่วยให้มองอย่างเป็นระบบ
00:13:52.03 ที่การครอบครองของไรโบโซมทั้งหมดในเซลล์
00:13:54.19 ในเทมเพลต mRNA ต่างๆ
00:13:56.26 และเราให้เหตุผลว่า
00:13:58.22 ถ้า Dom34 เป็นโปรตีนที่ทำหน้าที่
00:14:01.04 ในเซลล์ยีสต์ ตัวอย่างเช่น
00:14:02.26 ถ้าเรามีความเครียดแบบไวด์และแบบน็อคเอาท์
00:14:04.29 เราอาจจะถามได้
00:14:06.27 บทบาทของดอม34 ในเซลล์ยีสต์
00:14:08.12 โดยถามว่าไรโบโซมสะสมอยู่ที่ไหน
00:14:10.21 ในสายพันธุ์ที่ขาดโปรตีนนั้น
00:14:13.11 ดังนั้น แนวคิดพื้นฐานเบื้องหลังการทำโปรไฟล์ไรโบโซม
00:14:15.19 คุณสามารถเอาไรโบโซมทั้งหมดได้หรือไม่
00:14:17.13 ที่อยู่บน RNA ของผู้ส่งสารในเซลล์
00:14:18.28 และคุณสามารถแยก RNA ของผู้ส่งสารเหล่านั้นได้
00:14:20.14 โดยมีไรโบโซมจับกับพวกมัน
00:14:21.29 โดยใช้นิวคลีเอส
00:14:23.19 คุณสามารถแยกแยะ RNA ของผู้ส่งสารฟรีทั้งหมด
00:14:25.22 เหลือเพียง RNA ของผู้ส่งสารเพียงเล็กน้อย
00:14:27.29 ที่ได้รับการปกป้องโดยไรโบโซม
00:14:29.24 และนั่นปกป้อง mRNA บิต
00:14:31.26 มีความยาวประมาณ 30 นิวคลีโอไทด์
00:14:34.18 จากนั้น คุณสามารถแยกอาร์เอ็นเอที่มีความยาว 30 หรือมากกว่านั้นออกได้
00:14:38.19 จากไรโบโซมทั้งหมดในเซลล์
00:14:40.10 คุณสามารถส่งสำหรับลำดับสูงตลอด
00:14:43.20 คุณได้รับการอ่านหลายร้อยล้านครั้ง
00:14:45.14 ของรอยเท้าไรโบโซมจากเซลล์
00:14:47.01 และคุณสามารถถามสิ่งที่เข้าพัก
00:14:48.22 - การครอบครองไรโบโซมทั่วโลกในข้อความ -
00:14:51.08 อยู่ในเซลล์
00:14:53.20 คุณมักจะจับคู่การทดลองนี้
00:14:54.19 ด้วยการทดลองลำดับ mRNA
00:14:56.08 โดยที่คุณสุ่มแยกส่วน RNA ของผู้ส่งสารทั้งหมดในเซลล์
00:14:59.08 เพียงเพื่อให้แน่ใจว่าคุณสามารถบัญชีสำหรับการโคลนอคติ
00:15:01.14 และสิ่งประดิษฐ์ที่เป็นไปได้อื่นๆ จากเซลล์
00:15:03.16 แล้วคุณยังถามได้
00:15:05.11 ไรโบโซมจะครอบครอง RNA ของผู้ส่งสารได้อย่างมีประสิทธิภาพเพียงใด
00:15:07.20 เพราะคุณรู้ว่า RNA ของผู้ส่งสารแต่ละคนมีอยู่มากน้อยเพียงใด
00:15:10.12 และคุณรู้ว่าคุณมีไรโบโซมกี่รอย
00:15:13.24 นั่นคือการทดลองที่เราจินตนาการโดยใช้
00:15:16.10 เพื่อถามเกี่ยวกับบทบาทในร่างกาย
00:15:18.12 สำหรับปัจจัยกู้ภัย
00:15:20.02 เราเริ่มเหมือนคนอื่นๆ
00:15:21.18 ส่งตัวอย่างบางส่วนและถามว่าระบบทำงานได้ดีเพียงใด
00:15:24.08 และนี่ทำให้ฉันมีโอกาส
00:15:25.24 เพื่อแสดงให้คุณเห็นว่าข้อมูลประเภทนี้เป็นอย่างไร
00:15:27.26 สิ่งที่เราทำคือเราถูกบังคับ
00:15:30.16 จากยีสต์ธรรมชาติและจากยีสต์กลายพันธุ์ Dom34
00:15:32.19 - ดอมหายไป34 -
00:15:34.06 รอยเท้าไรโบโซมและข้อมูล mRNA-seq
00:15:36.26 สิ่งแรกที่คุณสามารถทำได้กับข้อมูลเหล่านั้น
00:15:38.24 คือคุณสามารถถามว่าพวกเขาจัดแนวการอ่านเฟรมอย่างไร
00:15:41.14 และคุณคงเห็นได้ง่ายๆ
00:15:42.29 ในแผงด้านบนนี้
00:15:45.07 ว่าถ้าเอารอยเท้าไรโบโซม
00:15:46.29 ส่วนใหญ่จะจับคู่กับกรอบการอ่านเดียว
00:15:50.05 ภายในกรอบการอ่านที่เปิดอยู่ทั้งหมด
00:15:52.22 แสดงว่าไรโบโซมนั้น
00:15:54.11 กำลังเคลื่อนนิวคลีโอไทด์สามตัวพร้อมกัน
00:15:56.22 ลงเทมเพลต RNA ของผู้ส่งสาร
00:15:58.08 และวิธีการนี้สามารถจับภาพได้
00:16:00.22 การเคลื่อนไหวของนิวคลีโอไทด์สามครั้ง
00:16:02.04 มีรอยเท้าเป็นระยะ
00:16:05.20 ในทางตรงกันข้าม คุณสามารถดูข้อมูล mRNA-seq ได้
00:16:07.28 และเห็นว่าการอ่านกระจายไปทั้งสามเฟรม
00:16:11.12 เพราะไรโบโซมไม่ได้กำหนดระยะเวลาใด ๆ
00:16:13.02 ไปยังเฟรมเหล่านั้น
00:16:14.20 ดังนั้นจึงกระจายไปทั่วกรอบการอ่านทั้งหมดเท่าๆ กัน
00:16:16.10 นั่นแสดงว่าเรากำลังจับภาพ
00:16:18.04 สิ่งที่เกี่ยวข้องกับการแปล
00:16:20.14 และการเคลื่อนไหวของนิวคลีโอไทด์สามครั้งตามเทมเพลต RNA ของผู้ส่งสาร
00:16:23.12 คุณจะเห็นว่ามันเป็นจริงตามกรอบการอ่านที่เปิดอยู่เช่นกัน
00:16:26.18 ถ้าคุณจัดตำแหน่ง codon เริ่มต้นทั้งหมด
00:16:28.22 ที่นี่ จนถึงจุดเริ่มต้นของยีน
00:16:31.16 และคุณจัด codon หยุดทั้งหมด
00:16:33.04 และคุณทำในสิ่งที่เราเรียกว่าการวิเคราะห์ยีนหรือเมทาจีนโดยเฉลี่ย
00:16:36.14 อย่างแรกเลย สิ่งที่คุณเห็นคือ mRNA-seq อ่านว่า
00:16:39.04 สีเขียว
00:16:40.22 กระจายไปตามกรอบการอ่านที่เปิดอยู่
00:16:42.11 เช่นเดียวกับในบริเวณที่ไม่ได้แปลของยีน ตรงนี้
00:16:45.06 และที่ปลาย 3' ของยีน
00:16:47.04 ดังนั้น พื้นที่เหล่านี้จึงกระจายไปตามข้อความ
00:16:49.07 ในทางตรงกันข้าม รอยเท้าไรโบโซม
00:16:51.05 กระจายไปตามกรอบการอ่านที่เปิดอยู่
00:16:53.07 เริ่มที่ 'เริ่มต้น' และสิ้นสุดที่ 'หยุด'
00:16:56.03 และที่จริงแล้ว ในข้อมูลเหล่านี้ที่นี่
00:16:57.23 คุณจะเห็นว่ามีนิวคลีโอไทด์สามคาบปรากฏขึ้น
00:16:59.23 เราเลยรู้สึกมั่นใจมาก
00:17:01.14 ว่านี่เป็นวิธีการที่อาจทำให้เรามีลายเซ็นของกิจกรรมไรโบโซม
00:17:04.14 ในห้องขัง
00:17:06.01 ที่อาจบอกเราถึงสิ่งใหม่ๆ เกี่ยวกับฟังก์ชันนี้
00:17:08.01 ของปัจจัยช่วยเหลือเหล่านี้
00:17:10.04 ฉันจะบอกคุณว่าเราได้เพิ่มสัมผัสอีกเล็กน้อย
00:17:12.14 ในการศึกษาเหล่านี้เพื่อขยายประเภทของการวิเคราะห์
00:17:15.14 ว่ารอยเท้าไรโบโซมเต็มตัว
00:17:17.28 อาจทำให้เราคิดได้
00:17:19.23 ที่เราให้เหตุผลก็คือ
00:17:21.25 ถ้ามีสิ่งกีดขวางขนาดใหญ่ในเซลล์ที่ป้องกันไรโบโซม
00:17:23.29 จากการผ่าน
00:17:25.22 อาจไม่ใช่แค่ไรโบโซมเพียงตัวเดียวที่ซ้อนกันบน RNA ของผู้ส่งสาร
00:17:27.20 แต่สอง
00:17:29.02 เราเรียกว่าไดโซมเหล่านี้ และจริงๆ แล้วคุณทำได้
00:17:30.26 หลังการรักษาด้วย RNAse เราจะเห็นรอยดำที่นี่
00:17:33.04 เราเห็นจุดพีคของความผิดปกติที่หลงเหลืออยู่นิดหน่อย
00:17:35.00 น. ดังนั้นเราจึงแยกจุดยอดที่น่าสยดสยองนั้นออกด้วย
00:17:36.24 ให้เหตุผลว่าแผงลอยขนาดใหญ่ในห้องขัง
00:17:40.04 นั่นเป็นปัญหาและอาจต้องได้รับการช่วยเหลือ
00:17:42.02 อาจถูกเติมเต็มในจุดสูงสุดนั้น
00:17:43.23 เรายังมีน้ำใจในการตัดชิ้นส่วน mRNA ของเราออกจากเจล
00:17:47.21 เพราะเรารู้ว่าเราอาจทำได้
00:17:49.05 ตามกิจกรรมทางชีวเคมีของ Dom34 และ Hbs1
00:17:52.08 เราให้เหตุผลว่ารอยเท้า mRNA สั้น
00:17:55.17 อาจจะลำเอียงก็ได้
00:17:58.28 ตามความชอบโดยเอนไซม์ Dom34
00:18:00.28 เพราะเรารู้ว่า Dom34 ชอบเทมเพลต RNA ของ Messenger แบบสั้น
00:18:03.15 ดังนั้นเราจึงแยกรอยเท้าที่สั้นลงและยาวขึ้นด้วย
00:18:06.02 ดังนั้นเราจึงมีความเอื้อเฟื้อในการหั่นชิ้นส่วนของเราจากเจล
00:18:08.27 แล้วข้อมูลเหล่านั้นมีลักษณะอย่างไร
00:18:11.08 ถ้าเราเอาจากสายพันธุ์ไวด์
00:18:13.11 หรือสายพันธุ์เดลต้า Dom34
00:18:14.19 ถ้าเราเอารอยเท้าเหล่านั้น
00:18:16.12 เราส่งพวกเขาออกไปเพื่อจัดลำดับปริมาณงานสูง
00:18:18.08 แล้วถามความยาวเฉลี่ย
00:18:20.25 ของชิ้นส่วนที่คุณได้รับ เช่น
00:18:22.27 จากไรโบโซมเดี่ยว จากพีคโมโนโซม
00:18:25.26 ชิ้นส่วนเหล่านั้นมีลักษณะอย่างไร
00:18:27.11 เราสามารถเห็นการแจกแจงตรงนี้
00:18:28.25 โดยเราดูที่ความยาวอ่านบนแกน x
00:18:31.02 และเราดูที่เศษส่วนของการอ่านที่มีความยาวอ่านนั้นบนแกน y
00:18:36.07 สิ่งที่เราเห็นก็คือการอ่านส่วนใหญ่ของเรา
00:18:39.01 อยู่ในช่วงนี้ตั้งแต่ 28-30 นิวคลีโอไทด์ที่มีความยาว
00:18:40.23 นั่นคือความยาวชิ้นส่วนเดิมที่ศึกษาโดยห้องทดลอง Weissman
00:18:43.14 และนั่นคือสิ่งที่เราคิดว่าเป็นไรโบโซมที่สมบูรณ์
00:18:45.06 โดยมีอาร์เอ็นเอผู้ส่งสารแบบยาวผูกติดอยู่กับมัน
00:18:48.04 เราเห็นจุดสูงสุดเล็กๆ ตรงนี้
00:18:49.26 ที่ความยาว 21 นิวคลีโอไทด์
00:18:51.08 นี่คือชิ้นส่วนที่มีลักษณะเฉพาะ
00:18:53.01 โดย เลียนา ลาโร
00:18:54.28 และสิ่งที่เธอระบุว่าเป็น
00:18:56.20 น่าจะแสดงถึงสถานะการหมุนหรือวงล้อของไรโบโซม
00:18:59.08 อยู่ระหว่างการโยกย้ายตาม RNA ของผู้ส่งสาร
00:19:03.05 และนั่นจะไม่ใช่จุดสนใจของการอภิปรายเพิ่มเติมที่นี่
00:19:05.20 สุดท้าย ชิ้นส่วนที่เราสนใจมากที่สุด
00:19:08.08 คือเศษที่ถูกตัดทอนลงตรงนี้
00:19:10.20 ที่มีความยาวสูงสุดประมาณ 16 นิวคลีโอไทด์
00:19:12.12 และเราเชื่อว่า
00:19:14.08 และฉันจะแสดงหลักฐานสนับสนุน
00:19:15.28 ว่านี่คือชิ้นส่วน RNA ของผู้ส่งสารสั้น ๆ
00:19:17.20 ผูกมัดกับไรโบโซมที่วิ่งไปที่ส่วนท้ายของเทมเพลต RNA ของผู้ส่งสาร
00:19:20.28 ดังนั้นจึงมีนิวคลีโอไทด์เพียง 16 ตัว
00:19:22.26 แต่สิ่งเหล่านี้เป็นเป้าหมายหลัก
00:19:25.04 ของการกระทำของ Dom34 ในห้องขัง
00:19:27.24 แล้วข้อมูลมีลักษณะอย่างไร
00:19:29.09 คุณได้อ่านลำดับ 100 ล้านครั้ง
00:19:30.20 จากสายพันธุ์ดุร้ายและสายพันธุ์กลาย
00:19:32.08 และคุณถามว่า พวกเขาแจกจ่ายการถอดเสียงของคุณอย่างไร
00:19:34.13 พวกเขาแจกจ่ายตาม RNA ของผู้ส่งสารอย่างไร
00:19:36.02 เราสามารถดูที่ยีนที่มีอยู่มากมาย
00:19:37.27 ที่นี่ PGK1
00:19:39.04 มันเป็นแค่ยีนวาไรตี้ของสวน
00:19:40.29 เราจะเห็นว่าไรโบโซมอ่านค่า
00:19:43.09 แจกตลอดความยาว
00:19:44.27 จากจุดเริ่มต้นของกรอบการอ่านที่เปิดอยู่จนถึงจุดสิ้นสุด
00:19:47.14 และสิ่งที่เราเห็นคือในสายพันธุ์ Dom34 น็อคเอาท์ (KO)
00:19:51.02 รูปแบบนั้นเทียบเท่ากันมากจริงๆ
00:19:52.24 นี่คือลักษณะของข้อมูลการทำโปรไฟล์ไรโบโซมทั่วไป
00:19:55.02 มันเด้งดึ๋งๆ
00:19:56.18 รวมอยู่ในการตีกลับนี้
00:19:58.08 อาจเป็นเพราะไรโบโซมหยุดนิ่งตามธรรมชาติ
00:19:59.18 เช่นเดียวกับการจัดลำดับอคติ
00:20:01.06 และอคติโคลนนิ่ง
00:20:02.26 และอคติการขยายเสียง
00:20:04.12 แต่สิ่งที่คุณเห็นคือในแง่ของสิ่งที่เราอยากรู้
00:20:07.19 อยู่ในยีนนี้โดยเฉพาะ
00:20:09.15 ไม่มีการหยุดชะงักที่เห็นได้ชัด
00:20:10.29 ไม่มีการหยุดชั่วคราวที่ชัดเจนในยีนนี้
00:20:12.29 หรือปัญหาที่นำไปสู่การดำเนินการของ Dom34
00:20:15.09 ไม่มีไรโบโซมกอง
00:20:16.26 ในกรณีที่ไม่มี Dom34 ที่สะสม
00:20:19.24 เมื่อเราเห็นข้อมูลเหล่านี้
00:20:21.00 เราเริ่มกังวลว่าเรามีเครื่องมือจริงหรือไม่ อย่างไรก็ตาม
00:20:23.20 เพื่อสังเกตการหยุดชั่วคราวที่สำคัญ
00:20:25.29 ดังนั้นเราจึงทำอุบายที่ดี
00:20:27.07 เราใส่ฮิสทิดีนอะนาล็อกลงในยีสต์
00:20:29.18 รู้จักกันในชื่อ 3-AT - 3-aminotriazole -
00:20:31.05 ที่ขัดขวางการสังเคราะห์ทางชีวเคมีของฮิสทิดีน
00:20:34.09 และทำให้คุณสามารถ
00:20:36.18 คุณขาดฮิสทิดีนในเซลล์
00:20:38.20 และเราคาดว่าจะมีการหยุดชั่วคราว
00:20:40.06 ไรโบโซมซ้อนที่ฮิสทิดีนโคดอน
00:20:42.26 ตลอดทั้งจีโนม
00:20:44.16 และที่จริงนั่นคือสิ่งที่เราเห็น
00:20:46.08 ในประเภทป่าหรือในสายพันธุ์ที่น่าพิศวงของ Dom34
00:20:47.22 ทันใดนั้น คุณเห็นกองไรโบโซม
00:20:50.14 ตรงที่มีโคดอนฮิสทิดีน
00:20:52.04 ตลอดทุกยีนในจีโนม
00:20:54.12 นี่เป็นตัวบ่งชี้ที่ดีมากสำหรับเรา
00:20:56.15 ว่าเราเข้าใจบางอย่างเกี่ยวกับฟังก์ชันไรโบโซม
00:20:59.23 - ไรโบโซมควรหยุดชั่วคราวที่ฮิสทิดีนโคดอนในกรณีที่ไม่มีฮิสทิดีน -
00:21:02.29 และจริงๆ แล้ว อย่างที่เราคาดไว้
00:21:05.00 ดอม34 ไม่ตอบสนองต่อความอดอยากของกรดอะมิโนทั่วไป
00:21:08.19 และเราไม่ได้คาดหวังว่ามันจะ
00:21:09.29 แต่มันทำให้เรารู้สึกถึงประเภทของผลลัพธ์
00:21:11.28 ว่าข้อมูลเหล่านี้สามารถให้ผลได้
00:21:13.28 - เพื่อให้เราเข้าใจบางอย่างเกี่ยวกับการหยุดชั่วคราว
00:21:15.22 และเราอาจจะถอดรหัสอะไรบางอย่างได้
00:21:17.21 เกี่ยวกับฟังก์ชัน Dom34
00:21:19.29 ดังนั้น ด้วยเครื่องมือเหล่านั้นในมือ
00:21:21.10 เราเริ่มมองทั่วโลกมากขึ้นที่การถอดเสียงของเรา
00:21:23.01 แล้วถามว่ามียีนไหม
00:21:25.02 ซึ่งมีจำนวนการอ่านเพิ่มขึ้น
00:21:26.24 ในสายพันธุ์การลบ Dom34 เทียบกับสายพันธุ์ไวด์
00:21:30.01 วิธีที่คุณทำการทดลองนี้
00:21:31.22 คือคุณสามารถอ่านยีนที่กำหนดได้ทั้งหมด
00:21:33.23 และคุณสามารถวางแผนได้
00:21:36.00 - จำนวนการอ่านโดย mRNA-seq
00:21:38.16 ในรอบน็อคเอาท์ เทียบกับสายพันธุ์ไวด์ไทป์
00:21:40.14 แล้ววางบนแกน x
00:21:42.04 หรือความแตกต่างของจำนวนไรโบโซมรอยเท้า
00:21:44.04 กับยีนที่กำหนดในสายพันธุ์น็อคเอาท์ เทียบกับสายพันธุ์ไวด์ -
00:21:48.01 และสิ่งที่คุณเห็นคือรูปแบบที่ไม่น่าสนใจมาก
00:21:50.02 จากมุมมองของการทดสอบที่มีปริมาณงานสูง
00:21:51.19 ที่ยีนของเราเกือบทั้งหมด
00:21:53.21 ไม่มีความแตกต่างของรูปแบบที่น่าสนใจ
00:21:55.09 พวกเขาทั้งหมดออกมาประมาณหนึ่ง
00:21:56.26 ซึ่งหมายถึงประเภทดุร้ายและความเครียดที่น่าพิศวง
00:21:59.11 เรามีจำนวนการอ่านเท่ากันโดยประมาณ
00:22:01.18 นั่นคือทั้งสองโดย mRNA-seq
00:22:03.07 ดังนั้น Dom34 อาจไม่ใช่ปัจจัยเสื่อม
00:22:05.26 และมันก็อยู่ในการครอบครองของไรโบโซมด้วย
00:22:09.06 มีข้อยกเว้นหนึ่งข้อ
00:22:10.26 ฉันจะกลับไป
00:22:12.02 เป็นยีนที่เรียกว่า Hac1
00:22:13.26 เป็นปัจจัยการถอดความที่น่าสนใจมาก
00:22:15.14 และจบลงด้วยการเป็นแง่บวกที่ยิ่งใหญ่ของเรา
00:22:17.05 ที่บอกเรา เราคิดว่า
00:22:19.02 Dom34 ทำงานอย่างไรในเซลล์
00:22:21.07 ฉันจะแสดงอีกโครงเรื่องที่คล้ายกันให้คุณดู
00:22:24.01 ที่แสดงให้เราเห็นสิ่งใหม่และน่าตื่นเต้น
00:22:25.25 เกี่ยวกับฟังก์ชัน Dom34 ในเซลล์
00:22:27.28 และเกี่ยวข้องกับการอ่านสั้นๆ เหล่านั้น
00:22:30.13 ที่จริงแล้ว ในสไลด์ที่แล้ว
00:22:32.01 สิ่งที่ฉันจดจ่ออยู่ที่การอ่านแบบเต็มเรื่อง
00:22:33.27 ที่สร้างขึ้นในการกลายพันธุ์การลบ Dom34
00:22:35.18 ไรโบโซมมาตรฐานยาว 30 นิวคลีโอไทด์อ่านค่าได้
00:22:40.18 และที่จริงแล้ว นั่นคือสิ่งที่แสดงบนแกน x
00:22:42.21 ซึ่งก็คือ ถ้าเราดูแบบไวด์
00:22:44.18 หรือดอม34 น็อกเอาต์ เทียบกับสายพันธุ์ไวด์
00:22:46.16 ที่ความยาวเต็มอ่านว่า
00:22:48.21 ค่อนข้างจะเหมือนกันตลอดทั้งยีนในจีโนม
00:22:51.04 การกระจายไม่มีความแตกต่าง
00:22:56.02 อย่างไรก็ตาม หากเราพิจารณาเฉพาะเรื่องสั้น
00:22:57.22 นิวคลีโอไทด์ 15-18 อ่านค่า
00:22:59.16 ใน Dom34 กับสายพันธุ์ไวด์
00:23:01.28 การกระจายนี้เบ้ค่อนข้างมาก
00:23:03.24 บ่งบอกว่าใน Dom34 น็อคเอาท์สายพันธุ์
00:23:06.18 การครอบครองไรโบโซมบนเศษแมร์สั้นเหล่านั้น
00:23:10.06 เพิ่มขึ้นอย่างมาก
00:23:12.18 สอดคล้องกับแนวคิดที่ว่า ดอม34
00:23:14.22 เป็นผู้รับผิดชอบโดยเฉพาะ
00:23:16.18 เพื่อล้างไรโบโซมเหล่านั้นภายใต้สถานการณ์ปกติ
00:23:18.14 และเมื่อ Dom34 หายไป
00:23:20.25 จริง ๆ แล้วคุณรวยมากในการอ่านสั้น ๆ เหล่านั้น
00:23:22.26 ในดอม34 น็อคเอาท์
00:23:24.23 นั่นเป็นความคิดที่น่าตื่นเต้น
00:23:26.08 และสอดคล้องกับชีวเคมีของเรา
00:23:27.26 และแนวคิดที่เรามีในโครงการนี้
00:23:30.12 เอาล่ะ เรามาต่อกันเลย
00:23:33.08 ฉันจะแสดงอะไรให้คุณดูต่อไป
00:23:34.22 คือสิ่งที่เราเรียนรู้เกี่ยวกับยีน HAC1
00:23:36.26 และการครอบครองไรโบโซมที่เพิ่มขึ้นของเรา
00:23:38.14 ใน Dom34 สายพันธุ์ที่น่าพิศวง
00:23:40.02 เพราะมันชัดเจนมาก
00:23:42.26 ผลบวกของ Dom34 ในยีสต์
00:23:44.18 และมันบอกเราบางอย่างเกี่ยวกับฟังก์ชัน Dom34
00:23:47.03 แต่ก่อนอื่น ฉันต้องบอกคุณเล็กน้อยเกี่ยวกับยีน HAC1
00:23:50.08 ยีน HAC1
00:23:54.16 มันเข้ารหัสปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของโปรตีนที่คลี่ออก
00:23:56.20 ที่ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางโดยห้องทดลองของปีเตอร์ วอลเตอร์
00:23:59.17 และในยีสต์ กลายเป็นยีนเดี่ยว
00:24:02.19 ว่าในเซลล์ยีสต์ส่งออกจากนิวเคลียส
00:24:05.16 ด้วยอินตรอนที่ไม่บุบสลาย - มันไม่ได้ต่อด้วย spliceosome ในนิวเคลียส
00:24:08.29 อันที่จริง มันต่อเข้ากับไซโตพลาสซึม
00:24:11.25 โดยเอนโดนิวคลีเอส ซึ่งเป็นวิถีที่ไม่ใช่บัญญัติ
00:24:15.03 ที่เรียกว่า IRE1
00:24:16.23 โดยเฉพาะเมื่อ IRE1 endonuclease
00:24:18.25 ถูกกระตุ้นโดยโปรตีนที่คลี่ออก
00:24:21.03 ในเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม
00:24:23.01 นั่นหมายความว่าในไซโตพลาสซึมของเซลล์ยีสต์
00:24:25.24 นั่งยีนที่ไม่ตัดต่อ
00:24:27.26 ที่มีลักษณะเช่นนี้ ยีน HAC1
00:24:29.16 ด้วยรหัสเริ่มต้นและรหัสหยุด
00:24:31.01 และกำลังรอลายเซ็นอยู่
00:24:32.24 จะถูกแยกออกโดยเส้นทางการประกบที่ไม่ธรรมดานี้
00:24:36.29 แต่สิ่งที่เรารู้คือความจริง
00:24:39.19 มีการประกบกันเป็นส่วนประกอบ
00:24:41.09 ที่เกิดขึ้นที่ไซต์ประกบ 5'
00:24:42.22 และเรารู้ว่ามันไม่เกิดผล เพราะสิ่งนี้ได้รับการบันทึกไว้แล้ว
00:24:44.28 และเรารู้ว่ามีประมาณนี้
00:24:47.15 RNA ของผู้ส่งสารที่ถูกตัดทอนซึ่งนั่งอยู่ในห้องขัง
00:24:49.05 แม้ในเซลล์ปกติ
00:24:51.04 สำหรับเรา ดูเหมือนว่ามันอาจจะเป็นสารตั้งต้นแบบ No-Go
00:24:54.04 เป็นกรอบการอ่านแบบเปิด
00:24:55.22 ที่จบลงโดยไม่มี codon หยุด
00:24:57.08 และอาจจำเป็นต้องได้รับการช่วยเหลือจาก Dom34
00:24:59.14 และก็จริง
00:25:01.17 เราสามารถดูข้อมูลการทำโปรไฟล์ไรโบโซมได้
00:25:03.18 จัดชิดตามยีน HAC1 โดยเฉพาะ
00:25:05.22 และเราเห็นที่ด้านล่างของแต่ละชุดของสองชุด
00:25:08.18 ที่นี่ ประเภทไวด์อ่านว่า
00:25:10.20 และรอยเท้าไรโบโซมชนิดป่า
00:25:12.14 และเหนือรอยเท้าที่น่าพิศวงของ Dom34
00:25:14.26 และสิ่งที่คุณเห็นก็คือ
00:25:17.05 ทั้งคู่สำหรับการอ่าน disome
00:25:18.18 - ดังนั้นพีคที่เราแยกออกมาเป็นสองไรโบโซมติดต่อกัน -
00:25:20.29 รวมไปถึงเรื่องสั้น
00:25:24.10 - 16-mer อ่านค่าสูงสุดของโมโนโซมเดียว
00:25:26.28 แค่ไรโบโซมตัวเดียว -
00:25:29.08 เราเห็นว่าเราได้รับการปรับปรุงอย่างมากในสายพันธุ์การลบ Dom34
00:25:32.12 เทียบกับสายพันธุ์ไวด์
00:25:34.20 สอดคล้องกับความคิด
00:25:36.16 ไรโบโซมนั้นแน่นอน
00:25:38.15 กองซ้อนกันที่ทางแยกที่แยกเอนโดนิวคลีโอลิติคนี้
00:25:40.04 ตอนนี้เราขาดอินตรอน
00:25:41.21 เพราะนี่คือการตัดแยกเอนโดนิวคลีโอลิติก
00:25:43.09 ไรโบโซมติดอยู่
00:25:45.03 ในสถานการณ์ปกติ
00:25:47.02 พวกมันถูกเคลียร์โดย Dom34
00:25:49.06 และในสายพันธุ์ delta-Dom34
00:25:51.19 คุณสะสมไรโบโซมที่ตำแหน่งเหล่านี้
00:25:53.22 นี่เป็นลายเซ็นที่สวยงาม
00:25:55.26 ของหน้าที่ของโปรตีนนี้ในเซลล์
00:25:57.28 ยิ่งกว่านั้น เมื่อเราดู จริงๆ แล้ว
00:25:59.20 ต้นน้ำของชุดไรโบโซมที่หยุดชั่วคราว
00:26:01.02 เราเห็นลายเซ็นอื่นของกิจกรรม Dom34 ในห้องขัง
00:26:04.20 ที่ดูคล้ายกันมาก:
00:26:06.10 ชุดข้อความสั้นใน Dom34 delta
00:26:09.05 และชุดค่าสูงสุดของ disome อ่านใน Dom34 delta
00:26:12.21 สอดคล้องกับความคิดที่ว่าจริงๆ แล้ว
00:26:15.05 เมื่อไรโบโซมหยุดชั่วคราวที่ตำแหน่งแรกนี้
00:26:17.01 ผ่านการแตกแยกเอ็นโดนิวคลีโอไลติกปกติโดย IRE1
00:26:20.12 มีความแตกแยกอีกอย่าง
00:26:22.20 น่าจะมาจากเอนโดนิวคลีเอส
00:26:24.14 ที่โดยทั่วไปแล้วจะเกี่ยวข้องกับกระบวนการนี้ที่เรียกว่าไม่โก-ดีเคย์
00:26:27.02 มันคือความแตกแยกของเอ็นโดนิวคลีโอไลต์ที่สอง
00:26:30.04 ที่นำไปสู่ไรโบโซมอีกชุดหนึ่ง
00:26:32.16 กองซ้อนที่เคลียร์โดยระบบนี้
00:26:35.16 ดังนั้น นี่คือ สำหรับเรา
00:26:37.06 เป็นตัวอย่างที่สวยงามของสิ่งที่ Dom34 ทำในห้องขัง
00:26:39.13 กับยีนเดี่ยวนี้
00:26:41.07 และย้อนหลัง
00:26:43.10 เราคิดว่าสิ่งนี้อาจจะสอดคล้องกัน
00:26:45.02 ด้วยความคิดที่ว่าในเซลล์ปกติ
00:26:46.27 เป้าหมายของ Dom34 น้อยมาก
00:26:48.19 นั่นคือวิกฤต
00:26:50.08 นั้นใหญ่ เป้าหมายใหญ่ที่ Dom34 ต้องดำเนินการ
00:26:52.27 แต่มันให้หลักฐานสำหรับแบบจำลอง
00:26:54.16 ซึ่งก็คือเมื่อไรโบโซมหยุดชั่วคราว
00:26:57.01 เอ็นโดนิวคลีโอไลต์แตกแยกเกิดขึ้น
00:26:59.00 น. และเมื่อความแตกแยกของเอ็นโดนิวคลีโอไลต์เกิดขึ้น
00:27:00.24 ระบบนี้เข้ามาช่วยไรโบโซม
00:27:03.19 และในกรณีที่ไม่มีระบบนี้
00:27:05.05 คุณสะสมไรโบโซมจำนวนมาก
00:27:07.01 ดังนั้น มันเป็นชุดข้อมูลที่สอดคล้องกันมาก
00:27:09.08 สำหรับโมเดล No-Go-Decay
00:27:11.12 และสำหรับสิ่งที่ไรโบโซมทำในช่วงวิกฤต
00:27:13.19 มันไม่ได้ทำให้เรามีเป้าหมายมากนัก
00:27:16.28 เอาล่ะ ฉันจะบอกคุณอีกเรื่องหนึ่ง
00:27:18.28 ที่เกี่ยวข้อง
00:27:20.26 และเกี่ยวข้องกับบทบาทของดอม34
00:27:22.11 Dom34 ก็มีส่วนเกี่ยวข้องเช่นกัน
00:27:24.10 ในเส้นทางที่ไม่หยุดยั้งนี้
00:27:26.13 ที่ฉันอธิบายไว้ในสองสไลด์แรก
00:27:28.29 ไม่หยุดหย่อน อย่างที่ฉันได้กล่าวไปแล้ว
00:27:30.26 คือสิ่งที่เกิดขึ้นเมื่อไรโบโซมเผชิญหน้า
00:27:33.16 หาง polyA และแปลเป็นโพลีไลซีน
00:27:36.00 และแนวคิดก็คือ พอลิ-ไลซีนคุยกับไรโบโซม
00:27:38.19 ผ่านอุโมงค์ทางออก
00:27:40.07 และพูดว่า "นี่เป็นปัญหา
00:27:41.19 เราต้องหยุดที่นี่และช่วยชีวิตไรโบโซมเหล่านี้
00:27:43.18 ลดทอนข้อความ
00:27:45.06 และย่อยสลายผลิตภัณฑ์โปรตีน
00:27:46.20 เพราะโพลี-ไลซีนไม่สมเหตุสมผล"
00:27:48.14 ดังนั้นโมเดลจึงค่อนข้างคล้ายกัน
00:27:49.28 ซึ่งแทนที่จะวิ่งเข้าไปในสเต็มลูปตรงนี้
00:27:51.20 ในการศึกษาของรอย ปาร์คเกอร์
00:27:53.08 ไรโบโซมวิ่งเข้าหาหางโพลีเอ
00:27:55.24 เอ็นโดนิวคลีโอไลต์แตกแยกเกิดขึ้น
00:27:57.10 และได้รับการบันทึกไว้
00:27:59.00 น. ดังนั้นอีกครั้ง ไรโบโซมต่อท้ายจะถูกล้าง
00:28:02.00 โดยโปรตีนเหล่านี้ Dom34 และ Hbs1
00:28:04.11 และเราไม่ค่อยแน่ใจว่าจะเกิดอะไรขึ้นกับไรโบโซมเหล่านี้
00:28:07.01 แต่สิ่งที่เราอยากรู้คือ:
00:28:08.23 มีหลักฐานของกิจกรรมประเภทนี้ไหม
00:28:11.00 ในเซลล์ยีสต์ของเรา
00:28:12.09 ว่าเราสามารถถอดรหัสจากข้อมูล Dom34 ที่มีอยู่ได้
00:28:15.29 ฉันจะบอกคุณอย่างแรกคือ
00:28:18.03 จริงๆ แล้ว เราสามารถสัมผัสได้ถึงสิ่งที่ไลซีนทำซ้ำในเซลล์ทำ
00:28:22.08 ไปยังไรโบโซมที่พบพวกมัน
00:28:24.02 และเราทำได้โดยการดูไรโบโซมทั้งหมดในจีโนมของยีสต์
00:28:27.08 หรือในทรานสคริปโทมของยีสต์
00:28:28.22 และเราสามารถสร้างยีนแบบเฉลี่ยได้จริงๆ
00:28:30.20 หรือเมทาเจนวิเคราะห์
00:28:32.08 ที่เรานำไลซีนเดี่ยวมาเรียงกัน
00:28:35.01 หรือยีนที่มีไลซีนสองตัวติดต่อกัน
00:28:37.01 และจัดแถวเข้าด้วยกัน
00:28:39.02 หรือสาม หรือ ห้า เป็นต้น
00:28:42.02 และคุณจะเห็นได้ทันที
00:28:44.02 อธิบายไว้อย่างไรในระดับของการวิเคราะห์จีโนม
00:28:46.08 ซึ่งเป็นไลซีนหลายตัวติดต่อกัน
00:28:48.24 อันที่จริงทำให้ไรโบโซมพูดติดอ่างนิดหน่อย
00:28:51.10 - คุณมียอดเขาที่ใหญ่กว่าที่นี่
00:28:52.24 ไรโบโซมติดอยู่ -
00:28:54.09 และแพร่กระจายไปตามความยาว
00:28:56.18 ของทางเดินโพลีไลซีน
00:28:58.05 นั่นคือการใช้ข้อมูลโปรไฟล์ไรโบโซม
00:29:01.14 เพื่อถามคำถามเกี่ยวกับการครอบครองไรโบโซม
00:29:03.16 ซึ่งสอดคล้องกับความคิด
00:29:05.10 ว่าโพลีไลซีนเป็นปัญหา
00:29:06.26 ฉันควรจะพูดว่า
00:29:08.14 ว่าโพลีไลซีนเหล่านี้อยู่ตรงกลางของยีน
00:29:09.28 - มันก็แค่ไลซีนเข้ารหัสปกติ
00:29:12.20 เรามีวิธีอื่นที่เราคิดว่าน่าจะหาได้
00:29:16.12 จะเกิดอะไรขึ้นเมื่อไรโบโซมพบโพลีไลซีน
00:29:18.15 และนั่นคือการจัดการเซลล์ยีสต์
00:29:20.09 ด้วยวิธีพิเศษ
00:29:22.17 และฉันจะบอกคุณเกี่ยวกับสิ่งนั้นในการทดลองนี้ ที่นี่
00:29:24.23 สิ่งที่คุณเห็นได้ เช่น
00:29:26.13 คือถ้าเราใช้ยีนแต่ละตัว -
00:29:28.23 ยีนนี้เรียกว่า ENT5
00:29:30.15 เป็นเพียงยีนของยีสต์ทั่วไป -
00:29:31.28 และเราสามารถเห็นได้ในประเภทป่าและความเครียดที่น่าพิศวงของ Dom34
00:29:34.14 นี่คือความยาวเฉลี่ยที่อ่านได้
00:29:35.28 เหล่านี้คือ 30 เมอร์ที่อ่านว่าห้องทดลองของ Jonathan Weissman
00:29:37.26 มีลักษณะเฉพาะแต่เดิม
00:29:39.08 และสิ่งที่เราเห็นคือสิ่งที่เราคาดหวัง
00:29:40.24 ซึ่งเป็นไรโบโซมที่อ่านในกรอบการอ่านแบบเปิด
00:29:43.06 แต่ไม่ได้อยู่ใน 3'UTR
00:29:44.28 และไม่ได้อยู่ที่หางของโพลีเอ
00:29:46.09 และนั่นก็สมเหตุสมผล เพราะนี่คือยีนปกติ
00:29:48.10 โดยมีโคดอนหยุดปกติ
00:29:49.27 และไรโบโซมรู้จัก codon หยุด
00:29:51.18 แต่การทดลองที่เราทำ
00:29:53.01 จริง ๆ แล้วเราใส่เข้าไปในยีสต์สายพันธุ์
00:29:55.03 ซับเพรสเซอร์ tRNA
00:29:56.22 และสิ่งที่ต้าน tRNAs ทำ
00:29:58.12 พวกเขาจำรหัสหยุดผิดหรือเปล่า
00:30:00.14 และพวกเขาอ่านโคดอนหยุด
00:30:02.24 อนุญาตให้ข้าม codon หยุด
00:30:04.20 ในระดับหนึ่ง
00:30:06.08 ดังนั้นจึงแปลเป็น 3'UTR
00:30:08.16 และในยีนที่ไม่มีโคดอนหยุดอีกตัวใน 3'UTR
00:30:10.29 เข้าไปในหาง polyA
00:30:13.18 และสิ่งที่เราเห็นที่นี่
00:30:15.02 นี่คือการอ่านแบบเต็มความยาวที่เรากำลังดูอยู่
00:30:16.25 ถ้าเราใส่ซับเพรสเซอร์ tRNA
00:30:18.19 เข้าไปในเชื้อยีสต์ และดูยีนเดียวกันนี้
00:30:22.02 เราอ่านโคดอนหยุดตรงนี้
00:30:24.15 เราสะสมการอ่านไรโบโซมใน 3'UTR
00:30:28.13 แต่เราได้ปรับปรุงการอ่านไรโบโซม
00:30:30.21 ในการกลายพันธุ์ของ Dom34
00:30:32.14 ดังนั้น นี่คือหลักฐานว่า
00:30:34.10 เมื่อคุณอ่าน codon หยุด
00:30:35.28 และอ่าน 3'UTR
00:30:37.16 และเข้าไปในหาง polyA
00:30:39.02 ไรโบโซมเหล่านี้ ภายใต้สถานการณ์ปกติ
00:30:40.29 นี่อยู่บนโพลีเอ
00:30:42.18 จะถูกล้างโดย Dom34
00:30:44.28 และในกรณีที่ไม่มี เราก็มีกองใหญ่
00:30:47.13 นี่คือสิ่งที่ Dom34 ทำในเซลล์อย่างแน่นอน
00:30:51.05 เรายิ่งดีใจมากขึ้นไปอีก
00:30:52.28 เมื่อเรามองดูเมอร์สั้น
00:30:54.14 เพื่อดูสัญญาณของการแตกแยกเอนโดนิวคลีโอไลต์
00:30:56.10 ที่ได้รับการเสนอให้อ่านเป็นโพลีไลซีน
00:30:59.11 เราเห็นว่าที่นี่เมื่อเราดูอีกครั้ง
00:31:01.10 อยู่ในสายพันธุ์เดียวกันกับ tRNA . ที่ยับยั้งเรื่องไร้สาระ
00:31:03.18 และอ่านไรโบโซมความยาวเต็มที่
00:31:05.20 นั่งตรงนี้ตรงทางแยกของหาง polyA
00:31:09.11 เราเห็นแล้วว่า ตามหลังลายเซ็นนั้น
00:31:11.02 เราเห็นสีเหลืองอ่าน
00:31:12.15 - นี่เป็นการอ่านระยะสั้น เหล่านี้คือ RNA ของผู้ส่งสารที่ถูกตัดทอน
00:31:16.10 และไรโบโซมได้วิ่งไปถึงจุดสิ้นสุดของ RNA ของผู้ส่งสารนั้น
00:31:18.28 และพวกเขาเดินตาม ที่จริงแล้ว
00:31:20.21 ยอดเขาสีเทานี้ เนื่องจากความแตกแยกของเอ็นโดนิวคลีโอไลต์
00:31:23.19 เราคิดว่า และมันก็แสดงให้เห็นแล้ว
00:31:24.27 เกิดขึ้นด้านหลังไรโบโซมที่อยู่ด้านหน้า
00:31:27.06 ดังนั้น ไรโบโซมนี้พบหางโพลีเอ
00:31:30.00 มันมีปัญหาบางอย่างกับมัน
00:31:31.18 ไรโบโซมอ่านว่าเป็นปัญหา
00:31:33.08 ความแตกแยกของเอ็นโดนิวคลีโอไลต์เกิดขึ้นเบื้องหลังนั้น
00:31:36.06 และคุณได้รับการอ่านสะสม
00:31:38.12 อีกครั้ง ระบุบทบาทที่ชัดเจนสำหรับ Dom34
00:31:41.20 เมื่อคุณอ่านหาง polyA
00:31:44.02 สิ่งนี้เกิดขึ้นในลักษณะใด
00:31:46.16 จะเป็นอย่างไรถ้าเรามองสิ่งนี้ในระดับโลกมากกว่านี้
00:31:48.04 เอาล่ะ ลายเซ็นแบบนี้ก็ได้
00:31:50.01 และเราสามารถทำได้ในรูปแบบการวิเคราะห์ที่เป็นสากลมากขึ้น
00:31:54.00 ที่เราจัดตำแหน่ง ตรงนี้ เวลา 0,
00:31:55.25 ทางแยกที่มีหาง polyA
00:31:58.08 และพวกเขาอยู่ที่นั่น
00:32:00.02 สิ่งเหล่านี้คือค่าความยาว 30 นิวคลีโอไทด์สีเทา
00:32:01.12 เราได้จัดหาง polyA ทั้งหมดเข้าด้วยกัน
00:32:03.01 ในทุกยีน
00:32:04.16 ที่มีรหัสไร้สาระที่ถูกระงับ
00:32:06.04 โดยตัวต้าน tRNA
00:32:07.18 ที่เราเห็นคือกองสีเทาอ่านตรงนี้
00:32:10.04 - นี่คือไรโบโซมที่อ่านค่าหาง polyA -
00:32:12.22 และนี่คือกองไรโบโซม
00:32:15.01 ตามหลัง RNA ของผู้ส่งสารที่ถูกตัดทอน
00:32:17.00 ซึ่งเป็นผลมาจากไรโบโซม
00:32:19.19 กำลังอ่านหาง polyA นี้
00:32:20.27 มันคือ 29 นิวคลีโอไทด์แล็ก
00:32:23.05 และนั่นก็สอดคล้องกับการเว้นวรรค
00:32:24.24 ที่เราคาดหวังว่าจะมีไรโบโซมติดอยู่ข้างหน้า
00:32:26.22 และเอ็นโดนิวคลีเอสตามมา
00:32:28.20 นี่คือภาพรวมของสิ่งที่
00:32:31.12 ที่เรียกว่า Non-Stop-Decay ดูเหมือน
00:32:33.14 ไรโบโซมเป็นสัญลักษณ์สำหรับเรา
00:32:35.24 ระบุ Non-Stop-Decay
00:32:37.14 ในสายพันธุ์ Dom34-delta นี้
00:32:40.06 ดังนั้น คุณอาจเถียงว่า
00:32:41.19 ว่านี่ไม่ได้กว้างเป็นพิเศษ
00:32:43.14 และกว้างขวาง
00:32:45.25 เพราะเราใส่ตัวยับยั้งเรื่องไร้สาระ tRNA
00:32:47.19 ลงในยีสต์สายพันธุ์นี้
00:32:49.04 และนั่นอาจไม่ใช่ปรากฏการณ์ทั่วไป
00:32:50.19 แต่สิ่งที่ฉันจะเถียง
00:32:52.03 แท้จริงแล้วคือโพลิอะดีนิเลชันก่อนวัยอันควร
00:32:55.02 เป็นเหตุการณ์ที่เกิดขึ้นเป็นประจำในเซลล์ยูคาริโอต
00:32:58.26 และลายเซ็นของงานนี้
00:33:00.28 ส่วนใหญ่ถูกลบโดยเส้นทางการควบคุมคุณภาพที่หลากหลาย
00:33:04.18 ที่เกิดขึ้นเสมอ
00:33:06.10 สร้างลายเซ็นของโพลิอะดีนิเลชันก่อนวัยอันควร
00:33:08.22 มองไม่เห็นโดยการทดลองปกติ
00:33:11.04 และนี่คือสองตัวอย่าง
00:33:12.22 RNA14 เป็นยีนในยีสต์
00:33:14.14 และ YAP1
00:33:16.14 ที่ทราบกันว่ามีโพลิอะดีนิเลตก่อนเวลาอันควร
00:33:18.20 ผลลัพธ์ก่อนหน้าจาก Pelechano et al ในปี 2013
00:33:22.14 โดยใช้วิธีจัดลำดับอาร์เอ็นเอ
00:33:24.01 ระบุไซต์ polyadenylation ก่อนวัยอันควร
00:33:26.11 ในยีนสองตัวนี้
00:33:27.21 และสิ่งที่เราเห็นคือ
00:33:29.12 โดยใช้สายพันธุ์ Dom34-delta ของเรา
00:33:31.20 และมองหาการอ่านสีเทาและสีเหลือง
00:33:33.20 - การอ่านแบบยาวและแบบสั้น -
00:33:36.21 เราเห็นลายเซ็นชัดเจน
00:33:38.22 ไรโบโซมนั้นติดอยู่ในยีนนี้
00:33:40.28 เกี่ยวกับ RNA ของผู้ส่งสารที่ตัดด้วยเอ็นโดนิวคลีโอลิติค
00:33:43.08 มันต้องเป็นผล
00:33:46.00 ของการอ่านไรโบโซมเป็นพอลิไลซีน
00:33:47.26 ที่ฉันบอกคุณได้คือถ้าเราดูยีสต์ในวงกว้าง
00:33:50.14 ในสายพันธุ์เหล่านี้ - สายพันธุ์ Dom34-delta -
00:33:53.06 และใช้ลักษณะของการอ่านดังกล่าว
00:33:55.20 ระหว่างกรอบการอ่านที่เปิดอยู่
00:33:57.06 เป็นลายเซ็นของกระบวนการนี้
00:33:59.23 ของการเกิด Non-Stop-Decay
00:34:01.13 ฉันบอกคุณได้ว่ามันกว้างมาก
00:34:03.17 ยีนจำนวนมาก มากมาย มากมายที่เราดู
00:34:06.10 มากถึง 50% ของยีนที่เราดู
00:34:08.02 มีไรโบโซมกองอยู่ตรงกลาง
00:34:10.22 ถ้า Dom34 ถูกเขี่ยออกจากห้องขัง
00:34:12.26 บอกว่านี่คือความจริง
00:34:15.10 เป็นเหตุการณ์ปกติที่เกิดขึ้นในเซลล์ยีสต์
00:34:17.26 และฉันสงสัยว่ามันจะเกิดขึ้นในยูคาริโอตที่สูงขึ้น
00:34:20.10 ฉันจะกลับไปที่สไลด์นี้
00:34:22.08 ที่ฉันพูดถึงการกระจายขนาดแฟรกเมนต์
00:34:24.10 เป็นวิธีจบและบอกคุณ
00:34:26.10 เราคิดว่า Dom34 อาจมีความสำคัญแค่ไหนในห้องขัง
00:34:28.29 ฉันแสดงให้คุณเห็นในตอนเริ่มต้น
00:34:31.00 น. ว่าถ้าเราเพียง ในทางที่เป็นกลาง
00:34:32.22 ตัดเจลชิ้นใหญ่ออก
00:34:34.18 และถามว่ามีไรโบโซมกี่ตัวในการอ่านไรโบโซมแบบเต็มความยาว
00:34:37.22 เทียบกับการอ่านแบบสั้น
00:34:39.08 สิ่งที่คุณเห็นคือ มีการอ่านประมาณ 5%
00:34:42.23 บางที ที่อยู่ในบริเวณนี้ข้างล่างนี้
00:34:44.13 หากเราสรุปเป็นหลายช่วง
00:34:46.16 คุณอาจจะพูดได้ว่า สิ่งเหล่านี้เป็นเป้าหมายของ Dom34 ทั่วไป
00:34:48.24 เป็นข้อความสั้นๆ
00:34:50.16 และโดยทั่วไปอาจถูกกำหนดเป้าหมายโดยระบบ Dom34
00:34:53.15 และสิ่งที่ฉันบอกคุณได้คือถ้าเราล้ม Dom34
00:34:55.29 จริงๆ แล้วนี่เป็นสายพันธุ์ที่ดุร้าย
00:34:57.18 ที่เรากำลังดูอยู่
00:34:59.01 ถ้าเราล้ม Dom34 ขนาดสูงสุดนี้จะเพิ่มเป็นสองเท่า
00:35:01.13 อย่างน้อย 5% ของการอ่านในกรณีนั้น
00:35:04.02 เราพูดได้อย่างมั่นใจว่า
00:35:06.01 อาจเป็นผลมาจากการกระทำของ Dom34 ในเซลล์
00:35:08.26 บ่งบอกว่าจริงๆ แล้ว
00:35:10.16 มีข้อความสั้นๆ มากมายในห้องขัง
00:35:12.16 และคุณคงนึกออกว่ามีตัวย่อ
00:35:14.08 ที่เกิดจากกระบวนการขั้นกลาง
00:35:16.01 ของการสลายตัวภายนอกของ RNA ของผู้ส่งสาร
00:35:19.20 และเราจะเถียงว่าสิ่งนี้ช่วยให้เราเข้าใจ
00:35:22.07 เหตุใดยีนนี้จึงจำเป็นในยูคาริโอตชั้นสูง
00:35:24.17 และฉันสงสัยว่าเราจะได้เรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับเรื่องนี้ในไม่ช้า
00:35:27.09 และไม่จำเป็นในยีสต์
00:35:29.02 แต่มันจำเป็นในกรณีที่ไรโบโซมถูกจำกัด
00:35:31.29 ฉันคิดว่ามันช่วยให้เราเข้าใจ
00:35:33.25 บทบาทในร่างกายของ Dom34
00:35:35.14 มันมีบทบาทสำคัญ
00:35:37.00 นั่นเป็นสาเหตุที่ทำให้ตัวอ่อนตายในยูคาริโอตที่สูงขึ้น
00:35:38.26 และเราได้เปิดเผยบทบาทนั้นแล้ว
00:35:40.16 โดยการทำงานในระบบที่ดัดแปลงพันธุกรรม
00:35:42.08 ซึ่งเราสามารถลบยีนได้จริง
00:35:44.06 และศึกษากระบวนการแบบเรียลไทม์
00:35:47.05 ดังนั้นฉันจะหยุดและสรุป
00:35:53.14 โดยบอกว่าฉันหวังว่าคุณจะเข้าใจ
00:35:55.11 บางอย่างเกี่ยวกับการเฝ้าระวัง mRNA โดยทั่วไป
00:35:57.04 และฉันคิดว่าข้อความกลับบ้าน
00:35:59.16 อยู่ตรงกลางจริงๆ
00:36:01.12 ของกระบวนการเฝ้าระวัง mRNA ใดๆ
00:36:03.02 เป็นไรโบโซม
00:36:04.17 ไรโบโซมอ่าน RNA ของผู้ส่งสาร
00:36:06.12 และมันคือคุณสมบัติของไรโบโซม
00:36:08.06 และเครื่องจักรไรโบโซม
00:36:09.23 ที่มีหน้าที่รับรู้และคัดเลือกปัจจัยต่างๆ
00:36:12.07 ให้เข้าใจ
00:36:14.20 เมื่อ RNA ของผู้ส่งสารมีข้อบกพร่องในทางใดทางหนึ่ง
00:36:16.01 และจำเป็นต้องตกเป็นเป้าหมายของความเสื่อม
00:36:19.14 โดยทางเดินปกติ
00:36:20.26 ว่าผลิตภัณฑ์โปรตีนที่ไม่สมบูรณ์จำเป็นต้องมีการกำหนดเป้าหมายเพื่อการย่อยสลาย
00:36:23.27 และไรโบโซมเอง
00:36:25.20 จำเป็นต้องได้รับการช่วยเหลือโดยเส้นทางที่ไม่ขึ้นกับกระบวนการเลิกจ้างตามปกติ
00:36:29.08 เพื่อนำกลับเข้าไปในสระเพื่อปรับสมดุลของไรโบโซม
00:36:33.14 และด้วยเหตุนี้ ฉันจะพูดถึงผู้เล่นหลักในห้องแล็บของฉัน
00:36:35.26 ใครเป็นคนทำงาน
00:36:37.06 งานชีวเคมีที่เก่าแก่ที่สุดในห้องปฏิบัติการ
00:36:39.10 ทำโดย Chris Shoemaker
00:36:41.07 และงานโปรไฟล์ไรโบโซมทั้งหมด
00:36:42.20 นิค กายดอชทำสำเร็จจริงๆ
00:36:44.22 postdoc ล่าสุดในห้องทดลอง
00:36:47.03 และฉันอยากจะขอบคุณแหล่งเงินทุนของฉันด้วย
00:36:49.01 จาก NIH และสถาบันการแพทย์ Howard Hughes
00:36:51.13 ขอบคุณ

  • ส่วนที่ 1: การสังเคราะห์โปรตีน: เหตุการณ์ระดับโมเลกุลที่มีความเที่ยงตรงสูง

การค้นพบทางชีววิทยาสังเคราะห์เป็นอีกก้าวที่เข้าใกล้การปฏิวัติอุตสาหกรรมครั้งใหม่

นักวิทยาศาสตร์รายงานว่าพวกเขาได้พัฒนาวิธีการที่ช่วยลดเวลาในการผลิตชิ้นส่วนใหม่สำหรับโรงงานชีวภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์

วิธีการนี้ลดเวลาจาก 2 วันเหลือเพียง 6 ชั่วโมง นักวิทยาศาสตร์จาก Imperial College London กล่าวว่างานวิจัยของพวกเขาทำให้พวกเขาเข้าใกล้การปฏิวัติอุตสาหกรรมรูปแบบใหม่อีกขั้น ซึ่งชิ้นส่วนสำหรับโรงงานชีวภาพเหล่านี้สามารถผลิตได้ในปริมาณมาก โรงงานเหล่านี้มีการใช้งานที่หลากหลาย รวมถึงการบำบัดการนำส่งยาที่ดีขึ้นสำหรับผู้ป่วย การปรับปรุงวิธีการขุดแร่จากใต้ดินลึก และความก้าวหน้าในการผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ

แบคทีเรียที่ไม่เป็นอันตรายสามารถออกแบบใหม่ให้เป็นโรงงานขนาดเล็กที่สามารถปรับปรุงการดูแลสุขภาพของผู้ป่วยได้

ศาสตราจารย์ Paul Freemont ผู้อำนวยการศูนย์ชีววิทยาสังเคราะห์และนวัตกรรมที่ Imperial College London และผู้ร่วมวิจัยหลักของการศึกษา ซึ่งตีพิมพ์ในวารสาร Nucleic Acids Research ในวันนี้ กล่าวว่า:

&ldquoก่อนการปฏิวัติอุตสาหกรรม สินค้าส่วนใหญ่ทำด้วยมือ ซึ่งหมายความว่าผลิตได้ช้ากว่า มีราคาแพงกว่าในการผลิต และมีจำนวนจำกัด เราอยู่ในจุดเชื่อมต่อที่คล้ายกันในชีววิทยาสังเคราะห์ โดยต้องทดสอบและสร้างแต่ละส่วนตั้งแต่เริ่มต้น ซึ่งเป็นกระบวนการที่ใช้เวลานานและช้า เราแสดงให้เห็นในการศึกษาของเราถึงวิธีการใหม่ที่สามารถช่วยขยายการผลิตและทดสอบชิ้นส่วนทางชีววิทยาได้อย่างรวดเร็ว&rdquo

ชิ้นส่วนที่ประกอบด้วย DNA นั้นถูกออกแบบใหม่โดยนักวิทยาศาสตร์และใส่เข้าไปในเซลล์เพื่อสร้างโรงงานทางชีววิทยา อย่างไรก็ตาม ปัญหาคอขวดที่สำคัญในชีววิทยาสังเคราะห์คือการขาดชิ้นส่วนที่จะสร้างโรงงานรูปแบบใหม่ ในการสร้างชิ้นส่วนโดยใช้วิธีการที่ใช้เวลานานในปัจจุบัน นักวิทยาศาสตร์ต้องปรับโครงสร้าง DNA ในเซลล์ใหม่และสังเกตว่ามันทำงานอย่างไรหากทำงานตามข้อกำหนด นักวิทยาศาสตร์จะจัดเก็บข้อมูลจำเพาะของชิ้นส่วนไว้ในแค็ตตาล็อก

ตอนนี้ นักวิทยาศาสตร์จากอิมพีเรียลคอลเลจลอนดอนได้คิดค้นวิธีการที่เร็วกว่ามาก โดยไม่จำเป็นต้องปรับโครงสร้างเซลล์ใหม่ทุกครั้งที่ต้องการสร้างส่วนใหม่ ทีมงานกล่าวว่างานของพวกเขาอาจนำไปสู่ห้องสมุดใหม่มากมายของส่วนประกอบนอกชั้นวางที่สามารถใช้เพื่อสร้างโรงงานชีวภาพที่มีความซับซ้อนมากขึ้น

James Chappell ผู้ร่วมวิจัยจากศูนย์ชีววิทยาสังเคราะห์และนวัตกรรมที่ Imperial College London กล่าวว่า:

&ldquoเป้าหมายหลักประการหนึ่งในชีววิทยาสังเคราะห์คือการหาวิธีที่จะทำให้กระบวนการของเราเป็นอุตสาหกรรม เพื่อให้เราสามารถผลิตโรงงานชีวภาพเหล่านี้ได้เป็นจำนวนมากในลักษณะเดียวกับที่อุตสาหกรรมต่างๆ เช่น ผู้ผลิตรถยนต์ผลิตยานพาหนะในสายการผลิตจำนวนมาก สิ่งนี้สามารถปลดล็อกศักยภาพของวิทยาศาสตร์สาขานี้ และทำให้เราสามารถพัฒนาอุปกรณ์ที่ซับซ้อนมากขึ้น ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการปรับปรุงด้านต่างๆ ของสังคมได้ การวิจัยของเรานำเราเข้าใกล้ความเป็นจริงนี้ไปอีกขั้นหนึ่ง โดยให้วิธีที่รวดเร็วในการพัฒนาชิ้นส่วนใหม่&rdquo

เมื่อเซลล์ถูกปรับโครงสร้างใหม่ DNA ที่ตั้งโปรแกรมใหม่ไว้ในเซลล์จะเข้ารหัสข้อความที่ส่งผ่านโดยโมเลกุลที่เรียกว่ากรดไรโบนิวคลีอิก (mRNA) ของผู้ส่งสารไปยังโรงงานผลิตเซลล์ที่เรียกว่าไรโบโซม ไรโบโซมแปลข้อมูลทางพันธุกรรมเป็นคำสั่งที่สั่งให้เซลล์ทำหน้าที่ ตัวอย่างเช่น นักวิทยาศาสตร์สามารถสร้างเซลล์ใหม่ในโรงงานตรวจจับการติดเชื้อ ซึ่งผลิตโปรตีนที่ตรวจจับสัญญาณทางเคมีจากแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคในมนุษย์และเปลี่ยนสีเพื่อบ่งบอกถึงการปรากฏตัวของพวกมัน

ในการศึกษานี้ นักวิจัยของ Imperial ได้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าวิธีการเดียวกันนี้สามารถทำได้ในหลอดทดลองนอกเซลล์ สิ่งนี้เกี่ยวข้องกับการสกัดเครื่องจักรที่ผลิต mRNA และโปรตีนออกจากเซลล์ และจัดหาพลังงานและหน่วยการสร้างเพื่อช่วยให้พวกมันอยู่รอดในหลอดทดลอง จากนั้นทีมงานได้เพิ่ม DNA ที่ตั้งโปรแกรมใหม่ของพวกเขาลงในสารละลายและสังเกตว่ามันทำงานอย่างไร

ข้อดีของวิธีนี้คือ นักวิทยาศาสตร์สามารถพัฒนาลิตรของสภาพแวดล้อมที่เหมือนเซลล์นี้ เพื่อให้สามารถทดสอบ DNA ที่ตั้งโปรแกรมใหม่ได้หลายครั้งพร้อมกัน ซึ่งจะช่วยเร่งกระบวนการผลิตของชิ้นส่วนต่างๆ

ขั้นต่อไปของการวิจัยคือการขยายประเภทของชิ้นส่วนและอุปกรณ์ที่สามารถพัฒนาโดยใช้วิธีนี้ได้ พวกเขายังตั้งเป้าที่จะพัฒนาวิธีการโดยใช้หุ่นยนต์เพื่อเร่งความเร็วและทำให้กระบวนการทั้งหมดเป็นแบบอัตโนมัติ

ศาสตราจารย์ Richard Kitney ผู้อำนวยการศูนย์ชีววิทยาสังเคราะห์และนวัตกรรมที่ Imperial College London กล่าวว่า &ldquo รัฐบาลอังกฤษมองว่าชีววิทยาสังเคราะห์มีศักยภาพในการสร้างอุตสาหกรรมและงานใหม่ๆ เพื่อประโยชน์ต่อเศรษฐกิจของสหราชอาณาจักร งานนี้เป็นส่วนหนึ่งของโครงการวิจัยที่สำคัญในวงกว้างขึ้นภายในศูนย์เพื่อพัฒนาเทคโนโลยีที่สามารถนำมาใช้ในงานอุตสาหกรรมได้หลากหลาย&rdquo


12.18: ไรโบโซม - ชีววิทยา

การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมส่งผลกระทบต่อลักษณะฟีโนไทป์อย่างไร ทั้งในระดับสิ่งมีชีวิตและระดับเซลล์ (รวมถึงการเน้นที่การควบคุมยีน) อะไรคือวิถีทางโมเลกุลจากการแปรผันทางพันธุกรรมไปจนถึงฟีโนไทป์ของเซลล์และสิ่งมีชีวิต? เหตุใดจีโนมจำนวนมากจึงมีส่วนทำให้เกิดพื้นฐานทางพันธุกรรมของลักษณะที่ซับซ้อน?

ห้องปฏิบัติการของเราประกอบด้วยบุคลากรที่ได้รับการฝึกอบรมในสาขาต่างๆ โดยใช้วิธีการคำนวณและการทดลองเพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้ เรามักจะแก้ไขปัญหาที่ไม่มีวิธีการทางสถิติแบบสำเร็จรูป ดังนั้น ส่วนสำคัญของงานของเราคือการพัฒนาวิธีการทางสถิติและการคำนวณที่เหมาะสม ซึ่งสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่ๆ เกี่ยวกับข้อมูลทางชีววิทยา

ลิงค์ที่มีประโยชน์

ข่าวแล็บ

และยินดีต้อนรับนักศึกษาปริญญาเอกใหม่ของเรา Alyssa Fortier และ Roshni Patel และ postdocs ใหม่: ซาฮิน นักวี, เจฟฟ์ สเปนซ์, Hakhamanesh Mostafavi และ Clemens Weiss!

อาจ: เอกสารใหม่รวมถึงงานล่าสุดของเราเกี่ยวกับการทำความเข้าใจสถาปัตยกรรมทางพันธุกรรมของลักษณะที่ซับซ้อน (กระดาษ "Omnigenic 2") ด้วย ซวนเหยา หลิวและ หยาง Li: [Link] และบทความของเรากับห้องทดลอง Criswell, Marson และ Greenleaf เกี่ยวกับโครงสร้างโครมาตินของเซลล์ภูมิคุ้มกัน (นำโดย ดิเอโก ในห้องแล็บของเรา ร่วมกับ Michelle Nguyen และ Anja Mezger): [Link] ขอแสดงความยินดีกับ Diego, Xuanyao, Yang และทีมที่เหลือ!

มกราคม: ยินดีต้อนรับสู่ ไชลา มูชารอฟ ที่เข้าร่วมกับเราในเดือนนี้!

ธันวาคม: ลาก่อน เดวิด และ Emily! พวกเขาทั้งสองจะพลาดอย่างมาก เดวิดจะเริ่มห้องปฏิบัติการของตัวเองที่ NY Genome Center และเอมิลี่จะนำความเชี่ยวชาญด้านจีโนมของเธอมาสู่โลกแห่งการให้คำปรึกษา

9/18/2018. สรุปข่าว:

มาและไป:
สิงหาคม: ยินดีต้อนรับสู่ postdocs ใหม่ของเรา เจค ไฟร์เมอร์ และ ยูวัล ไซมอนส์!

Eilon รับงานเป็นหนึ่งในนักวิทยาศาสตร์คนแรกที่บริษัทใหม่ Insitro ซึ่งก่อตั้งโดย Daphne Koller Bon Voyage สู่ Eilon!

Emily ปกป้องวิทยานิพนธ์ของเธอ! ขอแสดงความยินดีเอมิลี่! เธอจะอยู่ในห้องแล็บจนถึงสิ้นปีเพื่อทำเอกสารให้เสร็จ

ขอแสดงความยินดีกับ นาตาลี และ เบ็นศิษย์เก่าแล็บทั้งคู่ ร่วมงานแต่งที่น่ารัก

กรกฎาคม: ศิษย์เก่าแล็บ อเล็กซิส แบทเทิล ได้รับรางวัลการดำรงตำแหน่งในช่วงต้นด้านวิศวกรรมชีวการแพทย์ที่ Johns Hopkins ข่าวเด็ด!

มิถุนายน: ฮันนาห์ เอ็ม ได้รับรางวัล Robert Baynard Textor จากภาควิชามานุษยวิทยาสำหรับ 'ความคิดสร้างสรรค์ในมานุษยวิทยา' ทำได้ดีและสมควรได้รับ Hannah!

อาจ: Arbel จบการศึกษาและย้ายไปยังตำแหน่งหลังปริญญาเอกในห้องทดลองของมอลลี่ พรีเซวอร์สกี้ ที่โคลัมเบีย ในเดือนสิงหาคม เขาและภรรยา มายา ได้ต้อนรับลูกชายฝาแฝด! ยินดีด้วย! นี่เป็นคู่แฝดที่สามในห้องแล็บในรอบ 7 ปีที่ผ่านมา นี่เป็นการเพิ่มคุณค่าที่สำคัญหรือไม่?

โจนาธานการพูดคุยแบบเต็มของจาก PEQG เกี่ยวกับโมเดล Omnigenic (กับ Evan, Yang และ Xuanyao) ออนไลน์อยู่ที่นี่

มีนาคม: นาตาลี เรียนจบและย้ายมาดำรงตำแหน่งเป็นพนักงานนักวิทยาศาสตร์ที่ Ancestry ขอแสดงความยินดีนาตาลี! พวกเราคิดถึงคุณ!

มกราคม: เคลลี่ ได้ย้ายไปเปิดห้องปฏิบัติการของเธอเองในภาควิชา Genome Sciences ที่มหาวิทยาลัย Washington เรารู้สึกตื่นเต้นที่จะติดตามความคืบหน้าของเธอในวอชิงตัน!

10/25/2017. สรุปข่าว:

ตุลาคม: แอชจี: นาตาลี ให้การเสวนาเต็มรูปแบบแก่ผู้คน 7000 คนในโครงการข้างเคียงของเธอเรื่องการเปลี่ยนแปลงทางเพศในการประชุมและ นาซ่า หยาง เอมิลี่ และเดวิด ยังให้การนำเสนอแพลตฟอร์มที่ดีมาก ทำได้ดีทุกคน!

อัปเดต: นาซ่า ได้รับรางวัล ASHG's คำพูดของนักเรียนที่ดีที่สุด (สำหรับการทำงานกับ Melina Claussnitzer) ทำได้ดี!!

เรามีผลงานตีพิมพ์หรือกำลังจะตีพิมพ์ในวารสารหลายฉบับ: Eilon เกี่ยวกับการใช้ cfDNA เพื่อวัดการปฏิเสธการปลูกถ่าย หยางและเดวิด บน LeafCutter (ประกบ) ดิเอโก การประเมินชนิดเซลล์ที่ขับเคลื่อนลักษณะที่ซับซ้อน Arbel เกี่ยวกับ NAGC ในยีนที่ซ้ำกัน เจสสิก้า เกี่ยวกับไตรโคลซานและไมโครไบโอม (ทำงานร่วมกับห้องปฏิบัติการของอามิ)

ขอแสดงความยินดีกับ Ziyue ในงานแต่งงานของเธอ!

กันยายน: หยาง และ ซุน ย้ายไปตั้งห้องปฏิบัติการของตัวเอง เดินทางปลอดภัย!!

ขอแสดงความยินดีกับ ฮาโรลด์ ผู้ได้รับรางวัลมิตรภาพหลังปริญญาเอกอันทรงเกียรติ Hannah Grey จาก HHMI

มิถุนายน: ยินดีต้อนรับ นาซ่า ฮันนาห์ และมาร์กาเร็ต ไปที่ห้องปฏิบัติการ!

6/22/2017. สรุปข่าวช่วงไม่กี่เดือนที่ผ่านมา:

มิถุนายน: การเปิดตัวมุมมองของเราในเรื่อง 'omnigenic' แบบจำลองของลักษณะที่ซับซ้อนกับผู้เขียนนำ อีวาน บอยล์ และ หยางลี่ [ลิงค์ PDF]. บทความของเรากระตุ้นการอภิปรายมากมายในโซเชียลมีเดียและที่อื่นๆ รวมถึงบทความของ Ed Yong ในมหาสมุทรแอตแลนติกและในข่าวของ Stanford

อาจ: ขอแสดงความยินดีกับ คณาจารย์ 3 ท่าน ที่รับตำแหน่งผู้ช่วยศาสตราจารย์สำหรับปีการศึกษาที่จะมาถึง: Kelley Harris (U Washington, วิทยาศาสตร์จีโนม), หยางลี่ (U ชิคาโก พันธุศาสตร์) และ ซุนหลาน (Tsinghua U, วิทยาศาสตร์การแพทย์ขั้นพื้นฐาน).

และ เคลลี่ ยังได้รับรางวัลการเปลี่ยนย้ายคณะอันทรงเกียรติผ่านโปรแกรม CASI ที่ Burroughs Wellcome Fund

นาตาลี และ Arbel ได้รับทุนบัณฑิตจาก CEHG ทำได้ดี! และ โจนาธาน จะเป็นผู้อำนวยการร่วมของ CEHG ตั้งแต่เดือนมิถุนายน

ดิเอโกเอกสารเกี่ยวกับการอนุมานชนิดเซลล์ที่ขับเคลื่อนโรคนั้นขึ้นอยู่กับ bioRxiv

เมษายน: เคลลี่ มีการสร้างเอกสารที่ดีมากเกี่ยวกับผลงานที่โดดเด่นจากงานปริญญาเอกของเธอ: วิวัฒนาการอย่างรวดเร็วของสเปกตรัมการกลายพันธุ์ของมนุษย์ออกเดือนนี้ใน eLife [Link]

ฮาโรลด์, อีวาน และ เดวิด แต่ละคนมีเอกสารใหม่เกี่ยวกับการทำงานร่วมกับห้องปฏิบัติการอื่น: Sleuth [Harold] และ Cas9 Binding [Evan] และ ASE สำหรับการตรวจจับ GxE [David]

มีนาคม: อานันท์ได้ย้ายมาทำงานตำแหน่งนักวิทยาศาสตร์ข้อมูลบนเฟซบุ๊ก เราจะพลาดความเชี่ยวชาญด้านเทคนิคที่น่าทึ่งของเขาและการมีส่วนร่วมอย่างไม่เป็นทางการในโครงการต่างๆ ในห้องปฏิบัติการ! บอน โวยาจ อานันท์!

ธันวาคม 2559 Arbel และ อานันท์การทำงานของการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นซ้ำๆ ที่เปลี่ยนแปลงสเปกตรัมความถี่ไซต์ในตัวอย่างขนาดใหญ่ ออกมาแล้วใน PLOS Genetics: [Link] ยินดีด้วย!

นาตาลี ได้มีบทความสนุกๆ ที่ได้นำวิธีการคำนวณมาศึกษาประวัติศาสตร์วารสารฯ พันธุศาสตร์ ตั้งแต่ พ.ศ. 2460 [Link]. [พล็อตไทม์แลปส์ของตำแหน่งผู้แต่ง]

พฤศจิกายน. ยายเอ๋อ, อีวาน, และ นาตาลีเอกสารของ SDS และการปรับ polygenic: การตรวจจับการปรับตัวของมนุษย์ในช่วง 2000 ปีที่ผ่านมา ออกมาแล้วใน Science [Link] ยินดีด้วย!

9/20/2016. ยินดีต้อนรับสู่ Harold Pimentel ที่เข้าแล็บเมื่อเดือนที่แล้ว!

อีกด้วย, Eilon มีกระดาษใน Nature Genetics แสดง ปฏิกิริยาระหว่างทรานส์ (เช่น trans-eQTL) ระหว่างอัลลีลโปรตีน MHC และการแสดงออกของยีนตัวรับทีเซลล์. ด้วยความช่วยเหลือจาก Leah Sibener และ Chris Garcia เราสามารถตีความสิ่งเหล่านี้ในแง่ของปฏิสัมพันธ์ทางกายภาพในโครงสร้างโปรตีน [Link]

6/1/2016. ข่าวที่น่าตื่นเต้นมากมายที่จะรายงานตั้งแต่เดือนเมษายนและพฤษภาคม:

Anil's กระดาษบน ใช้ข้อมูลโปรไฟล์ไรโบโซมเพื่อตรวจจับเฟรมการอ่านแบบเปิดใหม่ ออนไลน์อยู่ที่ eLife [Link]

ซุน กระดาษบน วิวัฒนาการของยีนซ้ำ ถูกตีพิมพ์ใน Science [Link] สิ่งนี้ได้รับความสนใจเป็นอย่างดี รวมทั้งในบล็อกโพสต์ของฟรานซิส คอลลินส์

Yair, Evan และ Natalie's กระดาษบน การปรับตัว polygenic ล่าสุด ออกใน bioRxiv แล้ว [Link] สิ่งนี้ได้รับความสนใจมากมาย รวมถึงข่าวใน Nature and Science

ยายเอ๋อ และ หยาง ทั้งสองได้พูดคุยในการประชุม Biology of Genomes ของ Cold Spring ยังดีที่ได้เห็นการพูดคุยของศิษย์เก่าแล็บ อเล็กซิส แบทเทิล, Joe Pickrell และ Dan Gaffneyและได้พบปะสังสรรค์กับเพื่อนร่วมงาน เพื่อนฝูง และศิษย์เก่าในห้องปฏิบัติการคนอื่นๆ

ที่นี่คุณสามารถเห็นภาพสเก็ตช์ที่ยอดเยี่ยมของ Yang และ Yair ซึ่งวาดโดย Alex Cagan

4/28/2016. ทำได้ดี หยาง, ซึ่งกระดาษ การประกบอาร์เอ็นเอเป็นการเชื่อมโยงหลักระหว่างความผันแปรทางพันธุกรรมและโรค วางจำหน่ายแล้ววันนี้ [Link] เอกสารนี้ใช้ข้อมูลจากโครงการร่วม 7 ปีระหว่างห้องปฏิบัติการของเรากับห้องปฏิบัติการของ Yoav เพื่อให้การทำบัญชีโดยละเอียดเกี่ยวกับความเชื่อมโยงระหว่างความผันแปรทางพันธุกรรม ความแปรผันในการควบคุมยีนและโรค

3/29/2016. ขอแสดงความยินดีกับ อีวาน (NSF predoc!). ยังเพื่อ หยาง และ เดวิด เค บนกระดาษ Leafcutter ของพวกเขาเกี่ยวกับการหาปริมาณของ RNA splicing ที่ออกตอนนี้บน bioRxiv

1/4/2016. อำลาและขอส่งกำลังใจให้ ไบรซ์ (postdoc, Alkes Price lab, Harvard) และถึง เกรแฮม และ ไคล์โดยเริ่มห้องปฏิบัติการของตนเองที่ Salk Institute และ UCSD ตามลำดับ

11/20/2015. ขอแสดงความยินดีกับ ไบรซ์ สำหรับการป้องกันปริญญาเอกที่เชี่ยวชาญของเขาในชิคาโก มันเป็นโอกาสที่หวานอมขมกลืน เป็นการสิ้นสุดยุค U Chicago

9/14/2015. กระดาษ WASP ของ Bryce และ Graham (การทำแผนที่ QTL พร้อมการอ่านเฉพาะอัลลีล) เผยแพร่ใน Nature Methods แล้ววันนี้

8/18/2015. เราเพลิดเพลินกับอาหารค่ำอำลาที่เคาน์เตอร์ในวันศุกร์สำหรับ ออเดรย์ และ Towfique (เริ่มห้องปฏิบัติการของตนเองที่ U of Idaho และ Mt Sinai ตามลำดับ) เดินทางปลอดภัย!

ยินดีต้อนรับสู่ Kelley Harris และ Ziyue Gao ที่เข้าร่วมกับเราในฐานะ postdocs ใหม่จากห้องทดลองของ Rasmus Nielsen และ Molly Przeworski!

ยินดีต้อนรับสู่ผู้เยี่ยมชมระยะสั้น Dan Lawson และ Alexis Battle ที่จะกลับมาเยี่ยมเราในช่วงสั้น ๆ ในเดือนนี้

ขอแสดงความยินดีกับ Eilon และ Michal ที่เกิด Yuval ลูกชายของพวกเขา!

ในแผนกทุน ทำได้ดีมากกับ Kelley (NRSA), David G (EMBO/LLHF), Yang (CEHG), Jessica (NSF predoc)! และนาตาลีกับอีวานได้รับทุนวิจัยภายในหนึ่งทุน ทุนหนึ่งจากพันธุศาสตร์และอีกทุนหนึ่งจากชีววิทยาระบบ รุ่งโรจน์

5/22/2015. JKP เกือบจะสอนเสร็จแล้ว การติดตามข่าวสาร: ขอแสดงความยินดีกับ เกรแฮม ที่กำลังรับ งานคณาจารย์ที่สถาบันซอล์ค!!

และขอแสดงความยินดีกับ Towfique ที่กำลังรับ งานคณาจารย์ที่ภูเขาซีนาย.

และขอแสดงความยินดีเพิ่มเติมกับ หยาง ผู้ได้รับรางวัลมิตรภาพ CEHG postdoc ในปีหน้า!

และ กระดาษของซุน เกี่ยวกับวิวัฒนาการของการทำซ้ำยีนบน bioRxiv

4/2/2015. ขอแสดงความยินดีกับ เดวิด จี. ผู้ได้รับรางวัลทุนการศึกษา Dan David Prize!

3/31/2015. ขอแสดงความยินดีกับอดีตสมาชิกแล็บ Melissa Hubisz ซึ่งตอนนี้อยู่ที่ Cornell สำหรับการได้รับรางวัล an NSF predoc รางวัล! ทำได้ดีมากกับเจสสิก้า เอมิลี่ และอีวานสำหรับการกล่าวถึงอย่างมีเกียรติ

12/18/2014. บทความของ Alexis, Zia และ Sidney เกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างความผันแปรทางพันธุกรรมและความแปรผันของฟีโนไทป์ใน RNA, ไรโบโซมและโปรตีนออกมาแล้ว ยินดีด้วย!

12/16/2014. ขอแสดงความยินดีกับ Cristina ที่จบการป้องกันตัวระดับปริญญาเอกใน CS เมื่อวานนี้!!

12/04/2014. บทความของ Anil และ Heejung เกี่ยวกับการใช้วิธีหลายระดับเพื่อสร้างแบบจำลองข้อมูล DNase ที่ไซต์การผูก TF นั้นเผยแพร่บน bioRxiv

11/11/2014. เว็บไซต์ใหม่ของเรา SciReader สำหรับคำแนะนำทางวิทยาศาสตร์จะออกในรุ่นเบต้า คุณสามารถตรวจสอบได้ที่นี่: SciReader.org ทำได้ดีมาก ปรียา นาตาลี ยงกัน!

11/11/2014. กระดาษและซอฟต์แวร์ของ Bryce and Graham บน การทำแผนที่การอ่านเฉพาะอัลลีลที่ไม่เอนเอียงและการทำแผนที่ QTL อันทรงพลัง ออกใน bioRxiv และซอฟต์แวร์ WASP ที่เกี่ยวข้องอยู่บน GitHub

9/22/2014. ผู้มาใหม่จำนวนมากในเดือนนี้: David, Yang, Anand และ Emily มาเยี่ยมนักวิชาการ: Audrey, Towfique และ Kyle ยินดีต้อนรับ!

8/07/2014. สัปดาห์นี้เรากำลังจะย้ายเข้าไปอยู่ในพื้นที่ห้องปฏิบัติการระยะยาวของเราในคลาร์กเซ็นเตอร์! เรามีความสุขมากที่ได้อยู่ในพื้นที่ใหม่ ในข่าวอื่นๆ อานันท์ ได้รับรางวัลมิตรภาพ CEHG ในปีหน้า ทำได้ดีมาก อานันท์!

6/24/2014. อเล็กซิสจะเปิดห้องทดลองของเธอเอง เดือนหน้าที่ Johns Hopkins ในแผนก CS และ Biostats [Link] ขอให้เธอโชคดีกับตำแหน่งใหม่ของเธอ!!

6/24/2014. ทำได้ดีมาก Eilon ในการชนะการคบหา EMBO อันทรงเกียรติ! เดวิด Golan ซึ่งจะเข้าร่วมในเดือนกันยายนได้รับรางวัลทุน Rothschild และ Fulbright ยินดีด้วยทั้งคู่!!

6/24/2014. กระดาษของซุนและนิคบน อิทธิพลทางพันธุกรรมต่อ DNA methylation ออกใน bioRxiv [ลิงก์]

4/29/2014. Anil's fastSTRUCTURE ตอนนี้กระดาษออกมาในพันธุศาสตร์: ลิงค์

อเล็กซิสจะพูดในสัปดาห์หน้าที่ ชีววิทยาของจีโนม เกี่ยวกับงานของเธอกับเซียและซิดนีย์ในการทำความเข้าใจผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมต่อ mRNA การแปลและโปรตีน

4/2/2014. กระดาษของดาร์เรน คูซาโนวิช เรื่อง การล้มลงของ TFs ใน LCL (พร้อมแล็บของ Yoav) วางจำหน่ายแล้วใน PLOS Genetics: ลิงก์ กระดาษของ Choongwon Jeong บน การแนะนำการปรับตัวของการดัดแปลงระดับความสูงจากเชอร์ปาสู่ชาวทิเบต (ความร่วมมือกับห้องทดลองของ Anna Di Rienzo) ออกมาแล้วใน Nature Communications: Link

4/1/2014. Bon เดินทางไป Heejung Kim เธอใช้เวลาช่วงฤดูหนาวมาเยี่ยมเราจากห้องทดลองของ Matthew ในชิคาโก

3/1/2014. ยินดีต้อนรับสู่ Yair ที่ตอนนี้มาจากชิคาโกพร้อมครอบครัวแล้ว!

2/10/2014. กระดาษของเราเกี่ยวกับ ภาระทางพันธุกรรมในประชากรมนุษย์ร่วมกับห้องทดลองของ Guy Sella วางจำหน่ายแล้วใน Nature Genetics ทำได้ดีมากกับ Yuval Simons (ในห้องทดลองของ Guy) และ Michael Turchin (ตอนนี้อยู่ในห้องทดลองของ Matthew Stephens)! ลิงค์.

2/10/2014. ยินดีต้อนรับสู่ postdoc Eilon Sharon ใหม่ของเรา ซึ่งย้ายมาจากห้องทดลองของ Eran Segal ที่นี่ Eilon จะร่วมมือกับห้องทดลองของ Hunter Fraser ขอต้อนรับสู่นักศึกษาหมุนเวียนเทอมนี้: Peyton Greenside, Natalie Telis, Diego Calderon, Arbel Harpak และ Emily Glassberg!

12/6/2013. Joe Davis ได้เขียนบล็อกโพสต์ที่ยอดเยี่ยมเกี่ยวกับบทความล่าสุดของ Graham และ Bryce เกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและการปรับเปลี่ยนฮิสโตน

12/4/2013. fastSTRUCTURE ออกแล้ว! ลิงก์ไปยังต้นฉบับของ Anil และซอฟต์แวร์รุ่นเบต้าอยู่ที่นี่

12/4/2013. ขอบคุณ Christine Vogel สำหรับมุมมองของเธอเกี่ยวกับวิวัฒนาการของกระดาษ mRNA/โปรตีนของ Zia

11/12/2013. ยินดีต้อนรับสู่ Yonggan และ Priya ที่เข้าร่วมแล็บในเดือนนี้!

11/12/2013. ขอแสดงความยินดีกับ Jack/Athma/Roger ที่มีบทความเกี่ยวกับ DNase QTLs ได้รับเลือกให้เป็นหนึ่งในเอกสารอันดับต้นๆ ของปี 2012 ในด้าน Regulatory and Systems Genomics ในการประชุม RECOMB/ISCB

11/1/2013. มีมุมมองที่ดีใน NRG โดย Hannah Storey ในเอกสารล่าสุด 4 ฉบับ ซึ่งรวมถึงฉบับหนึ่งโดย Graham และ Bryce ที่ศึกษาผลกระทบของความแปรผันทางพันธุกรรมต่อม็อดฮิสโตน

10/30/2013. รุ่งโรจน์ถึง ชยัม สำหรับการชนะรางวัล Charles Epstein Trainee Research Award อันทรงเกียรติ (แผนก postdoc) สำหรับการพูดคุยของเขาที่ ASHG เกี่ยวกับการอนุมานทางประวัติศาสตร์สำหรับประชากรแอฟริกัน Graham Coop เป็นผู้ชนะคนก่อนจากห้องทดลองของเรา (ในปี 2550)

10/22/2013. ขอแสดงความยินดีกับแล็บสารส้ม Joe Pickrell ซึ่งเพิ่งรับตำแหน่งเป็นหนึ่งในคณะแรกที่ New York Genome Center นอกจากนี้, Zia Khan ตอนนี้อยู่ระหว่างการเปลี่ยนผ่านไปยังตำแหน่งคณาจารย์แรกของเขา - ใน CS ที่ U. Maryland ขอให้โชคดีทั้งคู่!

10/22/2013. บทความของ Darren เกี่ยวกับการทดลองล้มลงโดยมีเป้าหมาย 59 TFs เผยแพร่บน ArXiv

10/17/2013. Zia และ Graham/Bryce มีเอกสารเผยแพร่ใน Science วันนี้: วิวัฒนาการของการแสดงออกของโปรตีนในไพรเมตและผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมต่อการดัดแปลงฮิสโตน ขอแสดงความยินดีกับ Zia, Graham และ Bryce!

10/17/2013. บทความเกี่ยวกับการคัดเลือกปี 2549 ของ Ben Voight ได้รับการเน้นในบทความบล็อกที่ดีโดย Emma Ganley ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการฉลองครบรอบ 10 ปีที่ PLOS Biology

10/11/2013. ยินดีต้อนรับสู่นักศึกษาหมุนเวียน Stanford สองคนแรกของเรา: Ilana Arbisser จากแผนกชีววิทยาและ Michael Sikora จาก Genetics!

8/1/2013. เรามีความยินดีที่จะย้ายไปมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด นี่จะเป็นสภาพแวดล้อมทางวิชาการที่ยอดเยี่ยมและเป็นสถานที่ที่น่าอยู่ ที่กล่าวว่าเราจะคิดถึงเพื่อน ๆ ของเราหลายคนที่มหาวิทยาลัยชิคาโกซึ่งห้องทดลองนี้ตั้งอยู่เป็นเวลา 12 ปี

8/1/2013. ยินดีต้อนรับสู่ postdoc Alexis Battle ใหม่ล่าสุดของเรา! เป็นเรื่องดีที่มีเธออยู่บนเรือ

8/1/2013. ยินดีต้อนรับสู่ Anil, Stoyan และ Xun ที่จะมาถึง Stanford ในเดือนนี้ ห้องปฏิบัติการที่เหลือจะตามมาในไม่ช้าหรือทำงานจากชิคาโกในช่วงเปลี่ยนผ่าน

สวัสดีชาวโลก. ห้องทดลองย้ายไปสแตนฟอร์ดเมื่อวันที่ 1/8/2556 หลังจาก 12 ปีที่มหาวิทยาลัยชิคาโก


การเปลี่ยนแปลงเชิงปริมาณในการคัดเลือกโดยธรรมชาติในการใช้ codon ระหว่างภูมิภาคโปรตีน: แนวทางพันธุกรรมของประชากร

ความลำเอียงในการใช้งาน Codon (CUB) ซึ่งเป็นการใช้ codon ที่มีความหมายเหมือนกันที่ไม่สม่ำเสมอ เกิดขึ้นในทุกโดเมนของชีวิต Adaptive CUB ถูกตั้งสมมติฐานว่าเป็นผลมาจากการเลือกสำหรับการเคลื่อนที่ของไรโบโซมที่มีประสิทธิภาพและ/หรือการแปลที่แม่นยำ หลักฐานเชิงประจักษ์และเชิงคำนวณระบุว่าการเปลี่ยนแปลงอัตราความผิดพลาดและความเร็วในการแปลอาจส่งผลต่อความสามารถของโปรตีนในการเข้าถึงสถานะดั้งเดิม เนื่องจากการเชื่อมโยงที่สำคัญระหว่างการพับและการทำงาน การศึกษาจำนวนมากได้วิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างการใช้โคดอนกับโครงสร้างโปรตีน ผลลัพธ์มักขัดแย้งกันเนื่องจากมีวิธีการต่างๆ ในการหาค่าความแตกต่างของการใช้โคดอนและไม่ได้ควบคุมปัจจัยที่ทำให้เกิดความสับสนอย่างเหมาะสม (เช่น อคติของกรดอะมิโน) เพื่อหลีกเลี่ยงข้อบกพร่องเหล่านี้ เราใช้วิธีการทางพันธุศาสตร์ของประชากรอย่างชัดเจนเพื่อหาปริมาณการเปลี่ยนแปลงเฉพาะของโคดอนในการคัดเลือกโดยธรรมชาติที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างโปรตีน ผลลัพธ์ของเราเผยให้เห็นความสัมพันธ์ที่อ่อนแอระหว่างการใช้โคดอนกับโครงสร้างโปรตีน ซึ่งบ่งชี้ว่าความแตกต่างในการเลือกระหว่างโครงสร้างนั้นละเอียดอ่อนมากและ/หรือเกิดขึ้นเป็นระยะๆ แม้ว่าขนาดของความแตกต่างในการคัดเลือกจะดูเล็กน้อย แต่ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าความสัมพันธ์ระหว่างการใช้โคดอนกับโครงสร้างโปรตีนนั้นซับซ้อนกว่าที่เคยเชื่อกันงานของเราแสดงให้เห็นถึงพลังทางสถิติและประโยชน์ของการศึกษาการเปลี่ยนแปลงที่เลือกไว้เกี่ยวกับการใช้ codon หรือคุณลักษณะอื่นๆ ของจีโนมจากแนวทางวิวัฒนาการอย่างชัดเจน

งบดอกเบี้ยแข่งขัน

ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีส่วนได้เสียในการแข่งขัน


ผลลัพธ์และการอภิปราย

การวิเคราะห์ลูปปิดที่ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันและ 4E-BP เชิงซ้อน

โมเดลวงปิดแสดงถึงคำอธิบายที่สื่อสารกันอย่างกว้างขวางสำหรับการเลือก mRNA สำหรับการเริ่มต้นการแปล [12,18,19] เราได้ประเมินโปรไฟล์การผูก mRNA ทั่วโลกของส่วนประกอบของคอมเพล็กซ์วงปิดใน S. cerevisiae (รูปที่ 1A). เราใช้สายพันธุ์ที่มีแท็กการทำให้บริสุทธิ์ตามความสัมพันธ์แบบคู่ (TAP) ที่ปลายคาร์บอกซี-เทอร์มินอลที่ผสานเข้ากับจีโนมบนยีนภายในแต่ละยีนที่เข้ารหัสส่วนประกอบของคอมเพล็กซ์วงปิด และเติบโตภายใต้สภาวะการเติบโตแบบเลขชี้กำลังมาตรฐานในการเพาะเลี้ยงแบบแบตช์ เพื่อให้มีการวิเคราะห์อย่างเป็นระบบของกระบวนการคัดเลือก mRNA และกลไกการควบคุมที่อาจเกี่ยวข้อง เรายังได้ตรวจสอบโปรไฟล์การจับ mRNA สำหรับโปรตีนการจับ eIF4E ของยีสต์แต่ละตัว (4E-BPs), Caf20p และ Eap1p ซึ่งถือเป็นตัวยับยั้งการแปล (รูปที่ 1A) [40]

ในการตั้งค่าระบบทดลองสำหรับการสร้างภูมิคุ้มกัน (IP) ของ mRNA ที่เกี่ยวข้องกับแต่ละองค์ประกอบเหล่านี้ ปัจจัยหลายประการได้ให้ความสนใจเป็นพิเศษ ขั้นแรก ประเมินผลกระทบของการติดแท็ก TAP ต่อระดับของแต่ละปัจจัย เป็นผลให้เราสังเกตว่าใน CDC33-TAP ความเครียด โปรตีน eIF4E-TAP มีการแสดงออกมากเกินไป ดังนั้นเราจึงสร้างสายพันธุ์นี้ขึ้นใหม่เพื่อลบเครื่องหมายที่เลือกได้และคืนค่าระดับของ eIF4E เป็นประเภทไวด์ (ไม่แสดงข้อมูล) ประการที่สอง สายพันธุ์ที่ติดแท็ก TAP ทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ได้รับการประเมินทั้งในแง่ของการเติบโต (ไม่แสดงข้อมูล) และการแปล mRNA ทั่วโลกผ่านการทำโปรไฟล์โพลีโซม (ไฟล์เพิ่มเติม 1A) สายพันธุ์มีอัลลีลที่ติดแท็ก TAP เป็นสำเนาเดียวของยีนปัจจัยการเริ่มต้นการแปลที่จำเป็นเหล่านี้ ดังนั้น ข้อเท็จจริงที่ว่าโพรไฟล์การเจริญและโพรไฟล์โพลิโซมนั้นแยกไม่ออกจากสายพันธุ์ต้นกำเนิดจึงเป็นการชี้นำว่าโปรตีนที่แท็กนั้นทำงานได้อย่างสมบูรณ์ ประการที่สาม เราได้พัฒนาโปรโตคอลลูกปัดแม่เหล็กสำหรับ IP ที่รวดเร็วของโปรตีนที่น่าสนใจ เพื่อให้ IP ของเราสมบูรณ์ภายใน 20 นาที เพื่อลดผลกระทบต่อสารเชิงซ้อนไรโบนิวคลีโอโปรตีน นอกจากนี้ ยังใช้ความระมัดระวังเป็นพิเศษในการปรับการทำให้บริสุทธิ์ให้เหมาะสมเพื่อให้โปรตีนที่ติดแท็กส่วนใหญ่ถูกทำให้บริสุทธิ์และด้วยเหตุนี้จึงหมดไปจากสารสกัด (เปรียบเทียบปัจจัยการผลิต การไหลผ่าน และตัวชะในรูปที่ 1B) อันที่จริง IP เดียวที่โปรตีนที่ติดแท็ก TAP ใดๆ ตรวจพบได้ในโฟลว์ทรูนั้นอยู่ในตัวอย่าง Pab1p ด้วยเหตุนี้ แม้ว่า Pab1p จะเป็นโปรตีนที่จับกับ RNA ที่มีปริมาณมากที่สุดในเซลล์ [38] แต่เรายังคงสร้างภูมิคุ้มกันมากกว่า 80% ของโปรตีนนี้จากสารสกัดทั้งเซลล์ (รูปที่ 1B)

เพื่อให้แน่ใจว่า IPs มีโปรตีนที่สอดคล้องกับการก่อตัวของทั้งสารเชิงซ้อนแบบวงปิดและสารเชิงซ้อนในการปราบปราม 4E-BP ตัวอย่างที่ทำให้บริสุทธิ์ด้วยภูมิคุ้มกันถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีต่างๆ บน Western blots (รูปที่ 1C,D) บนจุดเหล่านี้ การย้ายถิ่นของโปรตีนที่ติดแท็ก TAP แต่ละตัวจะช้าลงเมื่อเทียบกับโปรตีนที่ไม่ติดแท็ก (ตัวอย่างเช่น Pab1p-TAP, eIF4E-TAP และ Caf20p-TAP ในรูปที่ 1C,D) สำหรับ eIF4G1-TAP และ eIF4G2-TAP โปรตีน A ในอีพิโทปของ TAP ถูกตรวจพบโดยแอนติบอดีทุติยภูมิ ดังนั้น แถบโปรตีน eIF4G2-TAP จะถูกสังเกต ถึงแม้ว่าจะใช้แอนติบอดีปฐมภูมิที่จำเพาะกับ eIF4G1 (รูปที่ 1C) อย่างไรก็ตาม เพื่อสรุปการวิเคราะห์นี้ ส่วนประกอบที่เกี่ยวข้องทั้งหมดของลูปปิดที่ซับซ้อน eIF4E, eIF4G1 และ Pab1p มีอยู่ใน IP ที่เหมาะสมของ eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 และ Pab1p (รูปที่ 1C) ในทำนองเดียวกันในแง่ของคอมเพล็กซ์การปราบปราม 4E-BP ทั้ง Eap1p และ Caf20p IP มี eIF4E แต่ไม่ใช่ eIF4G1 (รูปที่ 1D) ซึ่งสอดคล้องกับรูปแบบการแข่งขันที่ยอมรับโดยทั่วไปสำหรับการปราบปราม 4E-BP ที่แสดงในรูปที่ 1A [41] ในที่สุด ความสามารถของโปรตีนที่ติดแท็ก TAP เพื่อโต้ตอบอย่างเหมาะสมกับแคป mRNA ถูกประเมินโดยใช้โครมาโตกราฟีแบบสัมพันธ์กับแคป (ไฟล์เพิ่มเติม 1B) ส่วนประกอบที่ติดแท็ก TAP แต่ละตัวถูกแยกออกมาบนเรซินในลักษณะที่คล้ายคลึงกับโปรตีนที่ไม่ติดแท็กที่เกี่ยวข้อง ซึ่งบ่งชี้ว่าแท็ก TAP ในสายพันธุ์ไม่ได้ส่งผลกระทบอย่างเกินควรต่อความสามารถของโปรตีนที่แท็กในการโต้ตอบกับ RNA หรือโปรตีนที่จับกับ RNA

MRNA ที่เสริมสมรรถนะและความสำคัญเชิงหน้าที่ของสมาคม

mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ IP สำหรับ eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Pab1p, Caf20p และ Eap1p ในการทำซ้ำทางชีววิทยาทั้งสามแบบถูกหาปริมาณโดย RNA-seq (ดูวัสดุและวิธีการสำหรับรายละเอียด และไฟล์เพิ่มเติม 2 สำหรับสถิติการทำแผนที่และการนับ) ข้อมูลถูกประมวลผลเพื่อสร้างอัตราส่วนสำหรับ mRNA แต่ละสปีชีส์ที่สัมพันธ์กับตัวอย่าง RNA ทั้งหมดจากสายพันธุ์ที่แท็ก TAP เดียวกัน ห้องสมุดถูกจัดลำดับให้มีความลึกเฉลี่ย 7.8 ± 5.8 ล้านการอ่านที่ไม่ซ้ำแบบใคร และข้อมูลถูกใช้เพื่อสร้างรายการของการถอดรหัสที่เสริมสมรรถนะทางสถิติ (FDR) <0.05) ในตัวอย่างที่ตกตะกอนด้วยภูมิคุ้มกันโดยใช้แบบจำลองที่จับคู่ GLM ของ EdgeR (รายการทั้งหมดมีอยู่ในไฟล์เพิ่มเติม 2) การวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะเชิงฟังก์ชันที่สร้างจากข้อมูลลำดับ RIP แสดงไว้ในรูปที่ 2A ซึ่งจะเห็นได้จากแนวโน้มหลายประการ โปรตีนที่จับกับ eIF4E ทั้งสองชนิด ได้แก่ Caf20p และ Eap1p มีทรานสคริปต์ที่เสริมด้วย IP ซึ่งผลิตภัณฑ์โปรตีนมีส่วนร่วมในหน้าที่ทางนิวเคลียร์ทั้งหมด (เช่น การประมวลผล RNA และการถอดรหัส) อาจเผยให้เห็นถึงความเชื่อมโยงระหว่างการควบคุมการแปลและการควบคุมของเหตุการณ์ต้นน้ำ ในเส้นทางการแสดงออกของยีน ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เราประเมินความสำคัญเชิงหน้าที่ของ Caf20p และ Eap1p ผ่านการใช้ไมโครอาร์เรย์เพื่อวัดการเปลี่ยนแปลงใดๆ ในความสัมพันธ์ของ mRNA ในการไล่ระดับแบบหลายชั้นในประเภทไวด์ เทียบกับ caf20Δ และ eap1Δ สายพันธุ์กลายพันธุ์ [40]. สิ่งนี้เปิดเผยว่าอาจมีการควบคุมการถอดเสียงมากกว่าหนึ่งพันรายการที่ระดับการแปลโดยยีสต์ 4E-BPs ที่นี่ เราสามารถประเมินว่า mRNAs พบว่าเกี่ยวข้องกับ Caf20p และ Eap1p อย่างไรผ่านการเปลี่ยนแปลง RIP-seq ในแง่ของการเชื่อมโยง polysomal ในสายพันธุ์ที่น่าพิศวง การถอดเสียงที่สัมพันธ์กับ Caf20p และ Eap1p เป็นพิเศษจะถูกเลื่อนอย่างละเอียด แต่มีนัยสำคัญ (โดยใช้ช่วงตัด FDR) ขึ้นไปเป็นเศษส่วน polysome ใน caf20Δ ความเครียดที่สัมพันธ์กับประเภทไวด์ (ไฟล์เพิ่มเติม 3) สำหรับ eap1Δ สายพันธุ์กลายพันธุ์ที่สัมพันธ์กับแนวโน้มที่คล้ายคลึงกันของประเภทป่าพบได้ทั่วทั้ง eap1Δ พล็อตแม้ว่ามาตราส่วนผลกระทบจะเด่นชัดน้อยกว่าสำหรับ caf20Δ ข้อมูล (ไม่แสดงข้อมูล) อาจเนื่องมาจากความอุดมสมบูรณ์ในเซลล์ลดลงเมื่อเทียบกับ Caf20p [38] โดยรวมแล้ว การเปรียบเทียบข้อมูล RIP-seq กับการศึกษา microarray ก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการกลายพันธุ์นั้นสอดคล้องกับบทบาทที่อธิบายไว้สำหรับ 4E-BPs เป็นตัวยับยั้งการเริ่มต้นการแปล

คุณสมบัติของทรานสคริปต์ที่เกี่ยวข้องกับส่วนประกอบวงปิดและ 4E-BPs (NS) คำศัพท์เกี่ยวกับยีน Ontology ที่มีการแสดงมากเกินไป (สีแดง) หรือแสดงน้อยเกินไป (สีเขียว) อย่างมีนัยสำคัญสำหรับชุดการถอดเสียงแต่ละชุดที่เสริมคุณค่าในความสัมพันธ์แบบดึงลงของโปรตีนหกตัวที่แสดงที่ด้านบน (ข,ค) แผนภาพแบบกล่องและหนวดที่มีรายละเอียดการแปรผันในการครอบครองไรโบโซม [42] และความยาวหางโพลี (A) [43] สำหรับการถอดเสียงที่เสริมด้วยส่วนประกอบลูปปิดและ 4E-BPs การทดสอบทางสถิติอันดับของ Wilcoxon ระหว่างชุดการถอดเสียงเปิดเผยว่ามีความสัมพันธ์สูงสำหรับทั้งสองคุณสมบัติที่มีการถอดเสียงที่เสริมด้วย Pab1p บนแปลงเหล่านี้ กล่องสีจะพรรณนาขอบเขตของควอไทล์บนและควอไทล์ล่าง โดยมีรอยบากที่แสดงถึงค่ามัธยฐาน เส้นแนวตั้งที่มีจุดประกบแสดงถึงจุดสูงสุดและต่ำสุดในขณะที่วงกลมเป็นค่าที่อยู่นอก

เพื่อประเมินความสัมพันธ์อื่น ๆ สำหรับรายการยีนแต่ละตัว พวกมันถูกเปรียบเทียบกับโฮสต์ของพารามิเตอร์ต่าง ๆ รวมถึงความยาวหางโพลี (A) [43] และการครอบครองไรโบโซม [42] (รูปที่ 2B, C) น่าแปลกที่ mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ Caf20p และ Eap1p มีการครอบครองไรโบโซมที่สูงถึง mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ eIF4G1 หรือ eIF4G2 อาจมีสาเหตุหลายประการ: การโต้ตอบกับ eIF4E อาจไม่ใช่วิธีเดียวที่ Caf20p และ Eap1p สามารถเชื่อมโยงกับ mRNA ได้ หรือยีสต์ 4E-BPs อาจทำให้การแปลของ mRNA ที่มีการแปลสูง โดยเฉลี่ย , mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ 4E-BP ยังคงมีการครอบครองไรโบโซมสูง บางทีผลลัพธ์ที่โดดเด่นที่สุดจากการเปรียบเทียบเหล่านี้ก็คือ Transcripts ที่เสริมด้วย Pab1p ไม่เพียงแต่เกี่ยวข้องกับส่วนท้ายของโพลี (A) ที่ยาวกว่าเท่านั้น ตามที่คาดหวัง แต่ยังรวมถึงระดับการครอบครองไรโบโซมในระดับสูงด้วย (รูปที่ 2B,C) มีการสังเกตความสัมพันธ์ในระดับสูงระหว่างความยาวหางของโพลี (A) และความสัมพันธ์ของไรโบโซมมาก่อน [43] แต่ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าระดับการครอบครองไรโบโซมสำหรับการถอดเสียงที่เสริมด้วย Pab1p นั้นสูงกว่าการถอดเสียงที่เกี่ยวข้องกับส่วนประกอบอื่น ๆ ของ คอมเพล็กซ์วงปิด (รูปที่ 2C) ผลลัพธ์เหล่านี้เน้นให้ Pab1p เป็นผู้เล่นที่สำคัญสำหรับ mRNA ซึ่งการแปลนั้นมีประสิทธิภาพและแข็งแกร่งเป็นพิเศษ

โปรไฟล์การจับ RNA ของ Pab1p แตกต่างจากส่วนประกอบลูปปิดอื่น ๆ

เพื่อให้การประเมินเชิงปริมาณของความผันแปรระหว่างชุดข้อมูล RIP-seq ต่างๆ ในรูปแบบคู่ เราได้ใช้แบบจำลองการโต้ตอบที่ได้มาจากฟังก์ชัน Generalized Linear Model (GLM) ภายในชุดซอฟต์แวร์ EdgeR (Bioconductor) [44,45] . โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราเปรียบเทียบอัตราส่วนของระดับ mRNA ในตัวอย่าง IP ที่สัมพันธ์กับระดับในตัวอย่าง RNA ทั้งหมด (บันทึก2(IP/Total)) สำหรับแต่ละยีนในการทดลองการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันทั้งหกครั้ง และตรวจสอบความสัมพันธ์แบบคู่ระหว่างพวกมัน (รูปที่ 3A) ในที่นี้ ข้อมูลแบบเต็มของค่าการเสริมสมรรถนะ mRNA จะถูกนำเสนอ แทนที่จะเป็นค่าที่กำหนดโดยค่าตัดทางสถิติ ข้อมูลเหล่านี้ถูกนำเสนอในรูปแบบ scatterplot ที่เปรียบเทียบระหว่างชุดข้อมูล โดยเน้นสีแดงของการถอดเสียงที่พบว่าแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการทดลองตาม GLM แผนผังเหล่านี้เน้นให้เห็นถึงความสัมพันธ์สูงที่สังเกตได้จากโปรไฟล์การผูกมัดของสมาชิกทั้งสามของคอมเพล็กซ์ eIF4F (สหสัมพันธ์แบบเพียร์สันที่ 0.755, 0.753 และ 0.812) ในทำนองเดียวกัน โปรไฟล์การผูก 4E-BP สองโปรไฟล์ สำหรับ Caf20p และ Eap1p ก็แสดงความสัมพันธ์สูงเช่นเดียวกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในขณะที่ Pab1p แสดงความสัมพันธ์เชิงบวกกับส่วนประกอบของคอมเพล็กซ์ eIF4F มันเป็นปัจจัยเดียวที่ประเมินซึ่งแสดงความสัมพันธ์เชิงลบกับโปรไฟล์จากตัวกดการแปล Caf20p และ Eap1p

การเปรียบเทียบแบบคู่โดยตรงระหว่างการทดลอง RIP-seq สำหรับแต่ละส่วนประกอบลูปปิดและ 4E-BPs (NS) Scatterplots แสดงการเปลี่ยนแปลงในบันทึก2 การเปลี่ยนแปลงพับมัธยฐาน (IP/ทั้งหมด) สำหรับแต่ละโปรตีนหกตัวเมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนอื่น ไฮไลต์ด้วยสีแดงคือการถอดเสียงที่ได้รับการระบุว่าแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการทดลองทั้งสองตามแบบจำลอง GLM การโต้ตอบของ edgeR ที่ FDR <0.05 (NS) ตารางแสดงจำนวนการถอดเสียงทั้งหมดที่แตกต่างกันอย่างมากในการเปรียบเทียบแบบคู่ใน (NS). ตัวเลขแสดงถึงการถอดเสียงที่เป็นตัวแทนมากเกินไปใน IP ของโปรตีนที่แสดงในคอลัมน์ที่สัมพันธ์กับโปรตีนที่แสดงในแต่ละแถว

จำนวนการถอดเสียงที่ความแปรปรวนกับรูปแบบการโต้ตอบจะแสดงในรูปที่ 3B (รายละเอียดอยู่ในไฟล์เพิ่มเติม 4) ข้อมูลนี้แสดงจำนวนการถอดเสียงที่มีการเสริมสมรรถนะหรือแสดงผลน้อยเกินไปสำหรับการเปรียบเทียบแต่ละคู่ตาม GLM (จุดข้อมูลสีแดง) และสนับสนุนแนวโน้มทั่วไปที่สังเกตพบใน scatterplot (รูปที่ 3A) ตัวอย่างเช่น ไม่มีการระบุว่าทรานสคริปต์ใดที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการเชื่อมโยงกับไอโซฟอร์ม eIF4G สองตัว, eIF4G1 และ eIF4G2 การสังเกตนี้สอดคล้องกับข้อมูลล่าสุดที่บ่งชี้ว่าไอโซฟอร์มทั้งสองนี้มีแนวโน้มที่จะซ้ำซ้อนตามหน้าที่ [17] ผลลัพธ์เหล่านี้ เมื่อรวมกับข้อมูลข้างต้นแล้ว ชี้ให้เห็นว่า eIF4F complex อธิบายปฏิสัมพันธ์ส่วนใหญ่ของ eIF4E, eIF4G1 และ eIF4G2 กับ mRNA สิ่งนี้น่าสนใจเป็นพิเศษเนื่องจากตัวยับยั้งการแปล Caf20p และ Eap1p ยับยั้งการแปลผ่านการโต้ตอบกับ eIF4E แต่โปรไฟล์การผูกของพวกมันแสดงความสัมพันธ์น้อยที่สุดกับของ eIF4E คำอธิบายที่เป็นไปได้สำหรับสิ่งนี้คือ 4E-BPs อาจโต้ตอบกับ mRNA ในลักษณะที่ไม่ขึ้นกับ eIF4E หรือคอมเพล็กซ์ 4E-BP-eIF4E อาจสัมพันธ์กับ mRNA ที่เสถียรน้อยกว่า

เป็นที่ชัดเจนว่าถ้า Pab1p เป็นปริมาณสัมพันธ์กับ eIF4F เชิงซ้อนในทุก mRNA ดังนั้นโปรไฟล์การจับ mRNA สำหรับ Pab1p จะถูกคาดหวังให้คล้ายกับของ eIF4E, eIF4G1 และ eIF4G2 อย่างไรก็ตาม นี่ไม่ใช่กรณีอย่างชัดเจน ควรสังเกตว่า Pab1p ผูกปลาย mRNA 3 'และส่วนประกอบ eIF4F เชื่อมโยงกับปลาย 5' เป็นไปได้ว่าความแตกต่างนี้จะอธิบายรูปแบบบางส่วนที่ชัดเจนระหว่างชุดข้อมูล RIP-seq เหล่านี้ อีกทางหนึ่ง ข้อมูลเหล่านี้อาจเน้นว่าคอมเพล็กซ์วงปิดมีความเกี่ยวข้องกับการแปลของชุดย่อยของ mRNA เท่านั้น น่าแปลกที่โปรไฟล์ Pab1p มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับตัวยับยั้งการแปล Caf20p และ Eap1p (ที่จริงแล้ว โปรไฟล์ Pab1p นั้นต่อต้านความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งที่สุดกับโปรไฟล์ 4E-BP) และการถอดเสียงที่เสริมด้วย Pab1p ยังมีไรโบโซมที่สูงกว่า occupancy (รูปที่ 2B) โดยเน้นความสัมพันธ์ที่แน่นแฟ้นระหว่างการเชื่อมโยง Pab1p และการแปลที่ใช้งานอยู่

การจัดกลุ่มโปรไฟล์การเพิ่มประสิทธิภาพของ RIP-seq เผยให้เห็นถึงแนวโน้มระดับโลกในการควบคุมการแปลผ่านระบบลูปปิดที่ซับซ้อนและ Pab1p

ในขณะที่การเปรียบเทียบแบบคู่ของชุดข้อมูล RIP-seq ได้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญ การเปรียบเทียบโปรไฟล์การผูก RNA ระหว่างชุดข้อมูล RIP-seq ทั้งหมดสามารถมองเห็นได้พร้อมกันโดยใช้วิธีการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้น ดังนั้น ข้อมูล RIP-seq จึงแสดงในรูปแบบของแผนที่ความหนาแน่น โดยแสดงการจำลองทางชีววิทยาที่มีความสัมพันธ์กันอย่างมากสามชุดสำหรับสมาชิกวงปิดแต่ละตัวเป็นคอลัมน์ และการถอดเสียงแต่ละรายการเป็นแถว (รูปที่ 4) เพื่อให้แน่ใจว่าผลบวกลวงจำนวนน้อยที่สุด การตัดทอนทางสถิติที่ระมัดระวังมากขึ้นควบคู่ไปกับตัวกรองตามการนับจึงถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์การจัดกลุ่ม โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แผนที่ความหนาแน่นนั้นจำกัดเฉพาะการถอดเสียงที่แสดงการเสริมประสิทธิภาพที่สำคัญ (FDR <0.01) หรือการเป็นตัวแทนที่ต่ำกว่าตามแบบจำลอง GLM ของ EdgeR ใน IP อย่างน้อยหนึ่งรายการ ตลอดจนการถอดเสียงที่มีการอ่านมากกว่า 20 รายการในแต่ละ ตัวอย่างสารสกัดที่เกี่ยวข้องทั้งหมด โดยรวมแล้ว ยีนที่มีหมายเหตุประกอบ 3,173 ยีนในจีโนมของยีสต์มีคุณสมบัติตรงตามเกณฑ์เหล่านี้ ดังนั้น สัดส่วนที่สำคัญของทรานสคริปโทมของยีสต์จึงแสดงให้เห็นการเสริมสมรรถนะที่มีนัยสำคัญทางสถิติที่มีนัยสำคัญทางสถิติเพียงเล็กน้อยหรือการแสดงตนที่ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับ mRNA ทั้งหมด และแผนที่ความหนาแน่นจะเน้นไปที่สิ่งเหล่านั้นที่ทำ

คลัสเตอร์หลักสี่กลุ่มจะปรากฏให้เห็นในชุดข้อมูล RIP-seq แผนที่ความหนาแน่นที่ได้มาจากการจัดกลุ่มตามลำดับชั้นของโปรไฟล์การผูก mRNA (log2 พับเปลี่ยน IP/ทั้งหมด) ของโปรตีนหกตัวในการศึกษาสีแดงและสีน้ำเงินเป็นตัวแทนของ mRNA ที่เป็นตัวแทนมากเกินไปและต่ำกว่าตามลำดับ การวิเคราะห์ถูกจำกัดไว้ที่ 3,173 การถอดเสียงซึ่งถูกระบุว่าเป็นตัวแทนมากเกินไปหรือน้อยกว่าในชุดข้อมูลใด ๆ จากหกชุดและการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในส่วนวัสดุและวิธีการ แผนที่ความหนาแน่นที่นำเสนอประกอบด้วยการถอดเสียง 2,767 รายการโดยแยกจาก 7 กลุ่มที่ได้รับการจัดกลุ่มเป็นกลุ่ม I ถึง IV ตามความคล้ายคลึงกันของรูปแบบของการเชื่อมโยง

การใช้การจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นแบบมาตรฐาน (ดูวัสดุและวิธีการสำหรับรายละเอียด) ของโปรไฟล์การตกแต่งลำดับ RIP สามารถกำหนดกลุ่มกว้างๆ สี่กลุ่ม (I ถึง IV) ซึ่งครอบคลุม 2,767 การถอดเสียง (รูปที่ 4 ไฟล์เพิ่มเติม 5) กลุ่มที่มองเห็นได้ชัดเจนทั้งสี่กลุ่มนี้แสดงรูปแบบที่น่าสนใจของการเชื่อมโยงกับส่วนประกอบลูปปิดและตัวยับยั้งการแปล Caf20p และ Eap1p ส่วนใหญ่แสดงเป็นบล็อกของการเพิ่มคุณค่า/การเป็นตัวแทนในส่วนที่เกี่ยวกับ eIF4E/4G1/4G2/Pab1p และ Caf20p/Eap1p กลุ่มที่ 1 มี mRNA ที่ส่วนใหญ่เป็นตัวแทนใน IP จากส่วนประกอบทั้งหมดที่ทดสอบ ยกเว้น Pab1p Group II มี mRNA ที่เสริมด้วย IP ของตัวยับยั้งการแปล Caf20p และ Eap1p Group III ประกอบด้วยสองคลัสเตอร์ที่มี mRNA ที่เสริมใน IP ของคอมโพเนนต์ Closed Loop แต่แสดงน้อยกว่าในตัวอย่าง Caf20p และ Eap1p: โปรไฟล์ของการเชื่อมโยงที่อาจคาดหวังสำหรับ mRNA ที่การแปลมีการใช้งานสูงและเริ่มต้นอย่างแข็งแกร่งผ่านลูปปิด ซับซ้อน. สุดท้าย กลุ่ม IV เป็นกลุ่ม mRNA ขนาดใหญ่และกว้างที่ได้รับการเสริมสมรรถนะทั่วทั้งชุดข้อมูล eIF4F และ 4E-BP โดยมีคลัสเตอร์ย่อยสามกลุ่มที่กำหนดโดยระดับการเสริมสมรรถนะด้วย Pab1p หรือส่วนประกอบ eIF4F ที่นี่ อาจมีการแข่งขันที่ซับซ้อนระหว่างปฏิสัมพันธ์ของ ส่วนประกอบวงปิดและตัวยับยั้งการแปล เป็นเรื่องที่น่าสนใจอย่างยิ่งที่ประมาณครึ่งหนึ่งของ mRNA ในกลุ่ม IV นั้นได้รับการปรับปรุงให้ไม่เพียงพอสำหรับ Pab1p แม้ว่า mRNA เดียวกันเหล่านี้จะได้รับการเสริมสมรรถนะด้วย eIF4F ดูเหมือนว่าเป็นไปได้สำหรับ mRNAs เหล่านี้ หางโพลี (A) สามารถโต้ตอบกับโปรตีนการจับ RNA อื่น ๆ เช่น Nab2p หรือ Sgn1p ซึ่งได้รับการแนะนำให้แข่งขันกับ Pab1p ก่อนหน้านี้ [46] โดยรวมแล้ว กลุ่มเหล่านี้เน้นย้ำถึงความเป็นไปได้ที่การเริ่มต้นการแปลผ่านคอมเพล็กซ์วงปิดอาจมีความสำคัญมากกว่าสำหรับ mRNA บางตัวมากกว่าอย่างอื่น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กลุ่ม III กำหนด mRNA ที่ดูเหมือนว่าจะโต้ตอบอย่างพิเศษกับคอมเพล็กซ์วงปิด และ mRNA ของกลุ่ม II ที่โต้ตอบอย่างพิเศษกับ 4E-BPs

ก่อนที่จะพิจารณารายละเอียดเพิ่มเติมของกลุ่มการแปล mRNAs ทั่วโลกเหล่านี้ เป็นที่น่าสนใจที่จะสังเกตว่า ตามที่เคยพบ การใช้แบบจำลอง GLM และ scatterplots (รูปที่ 3) มีความสอดคล้องกันสูงระหว่างโปรไฟล์ IP eIF4E, eIF4G1 และ eIF4G2 ในขณะที่ รูปแบบสำหรับ Pab1p แตกต่างออกไป (ภาพที่ 4) นอกจากนี้ แม้ว่าโปรไฟล์สำหรับยีสต์ 4E-BPs, Caf20p และ Eap1p จะคล้ายกันมาก แต่ก็ต่างจากรูปแบบที่สังเกตได้จาก IP อื่นๆ สิ่งนี้ชัดเจนโดยเฉพาะอย่างยิ่งในคลัสเตอร์เดนโดรแกรมที่แสดงบนคอลัมน์ในรูปที่ 4 โดยแท้จริงแล้ว โปรไฟล์ eIF4G1 และ eIF4G2 มีความคล้ายคลึงกันมากจนไม่สามารถแยกแยะได้ทั่วทั้งภาพสามมิติ ความจริงที่ว่าส่วนประกอบ eIF4F eIF4E และ eIF4G แสดงโปรไฟล์การทำงานร่วมกันของ mRNA ที่คล้ายกัน ในขณะที่สำหรับ Pab1p นั้นมีความแตกต่างกันอีกครั้งชี้ไปที่แบบจำลองที่คอมเพล็กซ์วงปิดแบบเต็มมีความเกี่ยวข้องกับการแปลชุดย่อยของ mRNA เท่านั้น นอกจากนี้ เนื่องจากในกลุ่ม II 4E-BPs สามารถระบุได้ว่ามีปฏิสัมพันธ์อย่างพิเศษกับการถอดเสียงโดยที่ปัจจัยการแปลไม่ได้รับการเสริมสมรรถนะ ดูเหมือนว่าแบบจำลองที่ตรงไปตรงมาของการโต้ตอบ eIF4E-4E-BP บน mRNA ในการปราบปรามการแปลอาจเป็นการทำให้เข้าใจง่ายเกินไป .

เพื่อให้การตรวจสอบที่เป็นอิสระสำหรับคลัสเตอร์ที่ระบุในรูปที่ 4 และชุดข้อมูล RIP-seq โดยรวม ชุดของการวิเคราะห์ PCR แบบย้อนกลับเชิงปริมาณ (qRT-PCR) ได้ดำเนินการบน RNA ที่เตรียมจาก IP ของปัจจัยที่ติดแท็ก TAP และเปรียบเทียบกับระดับของอาร์เอ็นเอในเศษส่วนอินพุต (รูปที่ 5) ข้อมูลเหล่านี้แสดงความสัมพันธ์ที่ยอดเยี่ยมกับการวิเคราะห์ RIP-seq mRNA ของกลุ่ม III ได้รับการเสริมสมรรถนะด้วย eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 และ Pab1p แต่ไม่ใช่ 4E-BPs mRNA ของกลุ่ม II ส่วนใหญ่ได้รับการเสริมสมรรถนะด้วย 4E-BPsmRNA ของกลุ่ม IV ได้รับการเสริมประสิทธิภาพสำหรับส่วนประกอบที่ติดแท็ก TAP ส่วนใหญ่ และ mRNA ของกลุ่ม I ได้รับการเสริมประสิทธิภาพต่ำกว่าปกติสำหรับปัจจัยทั้งหมด ยกเว้น Pab1p การสังเกตครั้งสุดท้ายนี้มีความโดดเด่นเป็นพิเศษและเป็นการชี้นำว่า Pab1p มีบทบาทสำคัญในการแปล mRNA ที่มีความอุดมสมบูรณ์สูงเหล่านี้ ได้มีการแนะนำ Pab1p เพื่อปรับปรุงขั้นตอนต่างๆ ในกระบวนการแปล รวมถึงการเข้าร่วมหน่วยย่อยในระหว่างการเริ่มต้น [22] และการสิ้นสุดการแปล/การรีไซเคิลไรโบโซม [23] ดังนั้น ความเป็นไปได้อย่างหนึ่งคือ Pab1p ทำหน้าที่ปรับปรุงขั้นตอนเหล่านี้โดยไม่ขึ้นกับโปรตีนที่ทำปฏิกิริยากับหมวก อีกทางหนึ่ง Pab1p อาจแสดงในรูปแบบที่ไม่ปรากฏชื่อมาก่อน

การตรวจสอบความถูกต้องของกลุ่มการถอดเสียงโดย RT-PCR เชิงปริมาณ รูปแสดงสี่แปลง หนึ่งแปลงสำหรับแต่ละกลุ่มการถอดเสียง mRNA ที่ระบุถูกหาปริมาณในตัวอย่าง IP ที่สัมพันธ์กับ RNA ทั้งหมดสำหรับการควบคุมที่ไม่ติดแท็กและส่วนประกอบควบคุมแบบลูปปิด/4E-BP แถบค่าคลาดเคลื่อนคือ ± ข้อผิดพลาดมาตรฐานจากการทดลองซ้ำสามครั้ง

อีกแง่มุมของข้อมูลที่ถูกเน้นโดยการวิเคราะห์ qRT-PCR ก็คือแม้ว่าการถอดรหัสที่มีส่วนประกอบวงปิดต่างๆ และ 4EBPs ที่สัมพันธ์กับตัวอย่าง RNA ทั้งหมดจะไม่เพียงพอ แต่ mRNA ก็ยังคงปรากฏอยู่ใน IP เมื่อเทียบกับระดับ ของ mRNA ที่ได้รับจากสายพันธุ์ที่ไม่ได้ติดแท็ก (รูปที่ 5 เปรียบเทียบ BY4741 กับสายพันธุ์ที่แท็ก TAP) สิ่งนี้ยังชัดเจนจากข้อมูล RIP-seq ซึ่งวัดโดยค่า RPKM (การอ่านต่อกิโลเบสของการถอดเสียงต่อการอ่านหนึ่งล้านแมปที่แมป) ในการทดลอง IP (ไฟล์เพิ่มเติม 2) กล่าวคือ แม้แต่ mRNA เหล่านั้นที่เสริมด้วย eIF4F, Pab1p หรือ 4E-BPs น้อยเกินไปก็ยังถูกผูกมัดโดยส่วนประกอบเหล่านี้อย่างชัดเจน แม้ว่าจะอยู่ในระดับที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ

การวิเคราะห์หน้าที่ของ mRNA ที่เสริมสมรรถนะและคลัสเตอร์แบบวงปิด

ในการถอดรหัสบทบาทเชิงหน้าที่ของส่วนประกอบวงปิดในการเริ่มการแปลในยีสต์เพิ่มเติม เราได้ตรวจสอบกลุ่มของ mRNA ที่ได้มาจากแผนที่ความร้อนเพื่อดูแนวโน้มและรูปแบบในแง่ของการทำงานของยีน เริ่มแรกเราเน้นไปที่กลุ่ม III เนื่องจากกลุ่มนี้แสดงรูปแบบที่ชัดเจนที่สุดของการเชื่อมโยงกับส่วนประกอบที่ซับซ้อนแบบวงปิด เราพบว่า mRNA ของกลุ่ม III แสดงการครอบครองไรโบโซมสูง และผลิตภัณฑ์โปรตีนของพวกมันโดยเฉลี่ยแล้วมีปริมาณมาก (รูปที่ 6B,C) สิ่งนี้สอดคล้องกับการเริ่มต้นการแปลที่ขึ้นกับความซับซ้อนแบบวงปิดซึ่งทำหน้าที่เป็นเส้นทางที่มีประสิทธิภาพสำหรับการผลิตโปรตีนที่มีความเสถียรและอุดมสมบูรณ์สูง การวิเคราะห์เชิงหน้าที่ของ mRNA ที่มีอยู่ในกลุ่มนี้ให้น้ำหนักเพิ่มเติมแก่แนวคิดนี้ เนื่องจากแสดงให้เห็นการเสริมสมรรถนะอย่างมากใน mRNA สำหรับโปรตีนไรโบโซม (รูปที่ 6A) 115 ของยีน 395 ยีนในกลุ่ม III เข้ารหัสโปรตีนไรโบโซม ความจริงที่ว่า mRNAs สำหรับโปรตีนไรโบโซมนั้นได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมากด้วยเครื่องจักรแบบปิด ทำให้เกิดความน่าสนใจควบคู่ไปกับสถานการณ์ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โดยที่ mRNAs จำนวนมากที่เข้ารหัสโปรตีนไรโบโซมแสดงรูปแบบการกำกับดูแลที่ไม่ต่อเนื่องโดยอาศัยขั้วโอลิโกไพริมิดีนขนาด 5' (TOP) ลวดลาย [47]. ไม่มี cisลำดับการแสดงมีความชัดเจนในโปรตีน mRNA ของยีสต์ไรโบโซมหรือข้ามชุด mRNA ของกลุ่ม III (ไม่แสดงข้อมูล) อย่างไรก็ตาม ดูเหมือนว่าองค์ประกอบดังกล่าวจะต้องกำหนดระดับความสัมพันธ์ที่สูงมากที่เราสังเกตด้วยส่วนประกอบที่ซับซ้อนแบบวงปิด ความคล้ายคลึงกันระหว่างคุณสมบัติของ mRNA ของกลุ่ม III กับคุณสมบัติของ TOP mRNA ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมีความลึกมากขึ้น ตัวอย่างเช่น TOP mRNAs มีความอ่อนไหวเป็นพิเศษต่อการควบคุมโดยเป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของราพามัยซิน (mTOR) และหลักฐานล่าสุดบ่งชี้ว่าสิ่งนี้เกิดขึ้นผ่านตัวยับยั้งการแปล 4E-BP1 [48] ระเบียบเฉพาะของ mRNA ระดับบนสุดในลักษณะนี้ชี้ให้เห็นว่า mRNA เหล่านี้มีความไวสูงต่อการยับยั้งแคปที่ซับซ้อนและอาจเป็นไปได้ว่าการยับยั้งเชิงซ้อนแบบวงปิด [48] ดังนั้นการเพิ่มคุณค่าเฉพาะของ mRNAs โปรตีนไรโบโซมที่มีส่วนประกอบของยีสต์วงปิดที่ซับซ้อนจึงเน้นย้ำถึงความเป็นไปได้ที่กลไกคู่ขนานอาจมีอยู่ในยีสต์

การวิเคราะห์หน้าที่ของโปรตีนที่เข้ารหัสโดยกลุ่มการถอดรหัส (NS) คำศัพท์เกี่ยวกับยีน Ontology (GO) ที่เป็นตัวแทนมากเกินไป (สีแดง) หรือแสดงน้อยเกินไป (สีน้ำเงิน) สำหรับการถอดเสียงที่มีอยู่ในสี่กลุ่มที่กำหนดไว้ในรูปที่ 4 เฉพาะคำศัพท์ GO ที่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (ผ่านการทดสอบ Fisher ที่เปรียบเทียบ คลัสเตอร์นั้นที่มี FDR ของจีโนมที่เหลือ <0.01) สำหรับคลัสเตอร์อย่างน้อยหนึ่งคลัสเตอร์และยังมีความแตกต่างระหว่างคลัสเตอร์ (Chi-square test FDR <0.01) มาตราส่วนสีแสดงถึงนัยสำคัญทางสถิติของการเพิ่มคุณค่าคำศัพท์ GO หรือการเติมแต่งที่น้อยเกินไปตามที่วัดโดย log10เอฟดีอาร์ เพื่อความสะดวก บันทึกการตกแต่งคำศัพท์ GO10ค่า FDR ถูกคูณด้วย -1 (ข,ค) แผนภาพแบบกล่องและมัสสุ ดังในรูปที่ 2 ซึ่งให้รายละเอียดการแปรผันในการครอบครองไรโบโซม [42] และความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนตามฐานข้อมูล PaxDb [49] สำหรับการถอดเสียงที่เสริมด้วยส่วนประกอบวงปิดและ 4E-BPs การทดสอบอันดับของ Wilcoxon ระหว่างชุดการถอดเสียงแบบคู่พบว่ามีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (NS < 1 × 10-7 ) ในทุกกรณีสำหรับทั้งสองแปลง ข้อยกเว้นเพียงอย่างเดียวคือระหว่างกลุ่ม I และกลุ่ม III สำหรับการเข้าพักของไรโบโซม ซึ่งมีความสำคัญที่ NS < 0.03

คล้ายกับกลุ่ม III mRNA จากกลุ่มที่ 1 มีการครอบครองไรโบโซมสูงและผลิตภัณฑ์โปรตีนของพวกมันมีอยู่มากมาย (รูปที่ 6B,C) อย่างไรก็ตาม รูปแบบการเชื่อมโยงกับส่วนประกอบแบบวงปิดนั้นแตกต่างกันมากสำหรับกลุ่ม I เทียบกับกลุ่ม III โดยทั่วไปแล้ว mRNA ของกลุ่ม I จะแสดงน้อยกว่าสำหรับ eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p และ Eap1p อันที่จริง IPs ของ Pab1p เป็นเพียงกลุ่มเดียวที่กลุ่ม mRNA นี้ไม่ได้เป็นตัวแทนน้อยกว่าเมื่อเทียบกับจำนวนทั้งหมด (รูปที่ 4 และ 5) การวิเคราะห์หน้าที่ของผลิตภัณฑ์โปรตีนของ mRNAs ภายในกลุ่มนี้เน้นย้ำถึงการเผาผลาญของกรดอะมิโนและนิวคลีโอไทด์ เมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรต/การสร้างพลังงาน tRNA อะมิโนเอซิเลชันและการแปล (รูปที่ 6A ไฟล์เพิ่มเติม 5) ที่น่าสนใจคือ กลุ่มนี้รวมถึง mRNA ที่เข้ารหัสปัจจัยไกลโคไลติก เช่น ENO2, TDH3 และ PGK1และปัจจัยการแปล เช่น TEF1, TEF2, EFB1, TIF1 และ TIF2ซึ่งเป็นหนึ่งในโปรตีนที่แสดงออกมากที่สุดและมีปริมาณมากในเซลล์ การแสดงภายใต้ตัวแทนของ mRNA ในกลุ่มนี้ที่มีส่วนประกอบ eIF4F รวมกับผลิตภัณฑ์โปรตีนที่มีความอุดมสมบูรณ์สูง เป็นการชี้นำว่าคอมเพล็กซ์วงปิดมีความเกี่ยวข้องน้อยกว่ามากสำหรับการเริ่มต้นการแปลที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับ mRNA ในกลุ่มนี้ มากกว่าสำหรับ mRNA ของกลุ่มที่สาม ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่ mRNA ดังกล่าวต้องการทางเลือกอื่นแทนกลไกลูปปิดสำหรับการเริ่มต้นการแปลที่มีประสิทธิภาพสูง ความเป็นไปได้อย่างหนึ่งก็คือ Pab1p มีส่วนเกี่ยวข้องกับกลไกทางเลือกที่มีประสิทธิภาพสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อพิจารณาว่า mRNA ของกลุ่ม I นั้นไม่ได้เป็นตัวแทนกับส่วนประกอบโปรตีนลูปปิดทั้งหมดยกเว้น Pab1p ที่น่าสนใจ เกี่ยวกับโมเดลดังกล่าว mRNAs ที่มีการแสดงเกินทางสถิติใน Pab1p IPs มีการจัดแสดงโดยเฉลี่ย poly(A) tails ที่ยาวกว่าและการครอบครองไรโบโซมที่สูงกว่าค่าเฉลี่ย (รูปที่ 2B,C) ก่อนหน้านี้ Pab1p ได้รับการแนะนำให้ดำเนินการหลายขั้นตอนในกระบวนการแปล: การเริ่มต้นภายใน, การรวมหน่วยย่อยไรโบโซม 60S และการยกเลิกการแปล ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่หนึ่งในกิจกรรมเหล่านี้อธิบายการสังเกตว่า mRNA ของกลุ่ม I ดูเหมือนจะได้รับการแปลอย่างหนัก แม้ว่าจะโต้ตอบกับส่วนประกอบ eIF4F ได้ไม่ค่อยดีนัก การสังเกตสำหรับกลุ่ม mRNA นี้รวมกับความสัมพันธ์แบบผกผันระหว่าง Pab1p และ 4E-BPs ในแง่ของโปรไฟล์การจับ mRNA ของพวกมันจะเพิ่มรูปภาพที่การโต้ตอบของ Pab1p แสดงถึงตัวทำนายหลักของประสิทธิภาพการแปล

mRNA ของกลุ่ม II จากแผนที่ความร้อนรวมถึง mRNA ที่มีความเกี่ยวข้องอย่างพิเศษกับ 4E-BPs และด้วยเหตุนี้จึงควรถูกกดขี่แบบแปลผล ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น แม้ว่าการถอดเสียงเหล่านี้ดูเหมือนจะไม่ได้รับการเสริมคุณค่าสำหรับ eIF4E แต่ mRNA นั้นยังคงปรากฏอย่างชัดเจนในการทดลอง IP แต่ไม่ได้รับการเสริมประสิทธิภาพเมื่อเทียบกับการถอดเสียงที่มีพันธะหนักอื่นๆ การวิเคราะห์เชิงหน้าที่ของ mRNA จากกลุ่ม II ระบุถึงการเสริมสมรรถนะที่แข็งแกร่งสำหรับวิถีสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของกรดอะมิโนบางชนิด รวมถึงเส้นทางสำหรับกรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำและกรดอะมิโนพื้นฐาน (รูปที่ 6A ไฟล์เพิ่มเติม 5) แม้ว่าควรสังเกตว่ายีนสังเคราะห์ทางชีวภาพของกรดอะมิโนจำนวนมากก็มีอยู่ด้วย ในกลุ่ม I และ IV อย่างไรก็ตาม มีการระบุการเชื่อมต่อที่น่าสนใจระหว่างวิถี Gcn ที่ควบคุมการสังเคราะห์กรดอะมิโนและยีสต์ 4E-BPs [50] โดยรวมแล้ว การค้นพบว่า mRNA จำเพาะนั้นเสริมด้วย 4E-BPs นั้นสอดคล้องกับสมมติฐานที่ว่า mRNA ดังกล่าวไม่สำคัญในการเติบโตแบบทวีคูณอย่างไม่จำกัด ดังนั้นการแปลจึงถูกระงับโดยอาศัยตัวกด 4EBP การวิเคราะห์นี้ยังสอดคล้องกับสมมติฐานที่ว่ายีสต์ 4E-BPs ไม่ใช่หน่วยงานกำกับดูแลระดับโลกของการเริ่มต้นการแปล แต่ทำหน้าที่ควบคุมในลักษณะเฉพาะของ mRNA [40,51,52]

สุดท้าย กลุ่มใหญ่ที่แสดงโดยกลุ่ม IV มีลักษณะปฏิสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งกับทั้ง eIF4F และ 4E-BPs ที่กดขี่ โปรตีนที่เข้ารหัสโดย mRNA กลุ่มนี้แสดงหน้าที่กว้างมาก กลุ่มนี้ได้รับการเสริมสมรรถนะในหน้าที่ที่เชื่อมโยงกับการถอดรหัส ฟอสโฟรีเลชันของโปรตีน และวัฏจักรของเซลล์ และถูกเสริมให้ไม่เพียงพอสำหรับหน้าที่ที่เชื่อมโยงกับการแปลและไรโบโซม กลุ่มนี้ประกอบด้วยโปรตีนไคเนสที่เข้ารหัส mRNAs 79 ตัวจาก 127 ตัว ในขณะที่ไม่มีกลุ่มอื่นใดที่มีโปรตีนไคเนส mRNAs ดังนั้น ปรากฏว่ากลุ่มนี้มี mRNA สำหรับกระบวนการที่มีการควบคุมอย่างเข้มงวดในเซลล์ รวมถึงการส่งสัญญาณและการกระตุ้นเส้นทางและการตอบสนองต่อสิ่งเร้า ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่าสิ่งเหล่านี้บางส่วนปรากฏที่ระดับการแปล เราขอแนะนำว่ากระบวนการเหล่านี้อยู่ภายใต้การควบคุมอย่างจำกัดซึ่งมีความสมดุลที่ละเอียดอ่อนในระดับของ mRNA แต่ละตัวที่ถูกผูกไว้โดยลูปปิดที่สัมพันธ์กับ 4E-BPs อาจเป็นความจริงเช่นกันที่กลุ่มนี้ทรงตัวในลักษณะที่การกดขี่ของการแปลผ่านการบรรเทาการกดขี่ 4E-BP จะเป็นตัวแทนของวิธีการปล่อย 'เบรกมือระดับโมเลกุล'

การประมาณค่าปริมาณสัมพันธ์ของปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับ eIF4E . ที่จับกับ mRNA

การค้นพบว่า mRNAs กลุ่มใหญ่มีบทบาทมากเกินไปในการตกตะกอนของภูมิคุ้มกันของทั้ง eIF4G และ 4E-BPs (รูปที่ 4, mRNA ของกลุ่ม IV) เน้นย้ำถึงศักยภาพในการปฏิสัมพันธ์เชิงแข่งขันกับ eIF4E บน mRNAs ระหว่างโปรตีนการจับ eIF4E ต่างๆ การทำงานจากสมมติฐานที่ว่าผลรวมของการโต้ตอบของโปรตีนการจับ eIF4E สี่ตัวควรใกล้เคียงกับโปรไฟล์การจับ RNA สำหรับ eIF4E ในฐานะผู้รักษาประตูสำหรับการเริ่มต้น (และด้วยเหตุนี้การแปลรูปที่ 7A,B) เราสามารถแสดงทางคณิตศาสตร์นี้ผ่านการรวมกันเชิงเส้นอย่างง่าย ของโปรไฟล์ทั้งสี่ (รูปที่ 7C)

แบบจำลองปริมาณสัมพันธ์สำหรับการผูก eIF4E เน้นที่ CAF20 และ EAP1 mRNAs เป็นค่าผิดปกติที่มีนัยสำคัญ (NS) แผนภาพแสดงพื้นฐานทางทฤษฎีสำหรับแบบจำลองปริมาณสัมพันธ์ที่ซึ่งโปรตีนสี่ชนิด, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p และ Eap1p ทั้งหมดจับกับโปรตีนการจับหมวก eIF4E ซึ่งในทางกลับกันจับ mRNA ในสภาวะสมดุลที่ซับซ้อน โมเดลนี้สันนิษฐานว่าโปรไฟล์การจับ eIF4E mRNA สามารถจำลองได้ผ่านทางการรวมเชิงเส้นของโปรไฟล์โปรตีนวงปิดอื่นๆ (NS) แผนที่ความหนาแน่นของการเสริมสมรรถนะ mRNA สำหรับโปรตีนการจับ eIF4E สี่ตัว และแผนที่ความร้อนสำหรับการเสริมสมรรถนะ mRNA ที่คาดการณ์ไว้สำหรับ eIF4E โดยอิงจากแบบจำลองที่เหมาะสมที่สุดกับข้อมูลลำดับ RIP ซึ่งสามารถเปรียบเทียบได้กับการเพิ่มสมรรถนะ mRNA ที่สังเกตพบสำหรับ eIF4E มีการสังเกตความสัมพันธ์ที่ดีเยี่ยมระหว่างโปรไฟล์แผนที่ความร้อนที่คาดการณ์ไว้และที่สังเกตได้ โดย R 2 = 0.75 (ค) สมการที่ให้รายละเอียดการยืนยันว่าโปรไฟล์การจับสำหรับ eIF4E เท่ากับผลรวมของโปรไฟล์ที่สังเกตพบสำหรับโปรตีนการจับ eIF4E ทั้งหมด โดยมีค่าสัมประสิทธิ์ β ที่สอดคล้องกันซึ่งแสดงถึงการมีส่วนร่วมของแต่ละโปรไฟล์ต่อแบบจำลองโดยรวม (มีนัยสำคัญทั้งหมด NS < 0.002). (NS) พล็อตแสดงค่าแบบจำลองที่พอดีและค่าคงเหลือที่สอดคล้องกันจากแบบจำลองการถดถอยเชิงเส้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง CAF20 และ EAP1 mRNA เป็นค่าผิดปกติที่มีนัยสำคัญจากแบบจำลองเมื่อวางแผนส่วนที่เหลือจากค่าการเสริมสมรรถนะ eIF4E ที่คาดการณ์ไว้

ในที่นี้ ค่า β คือสัมประสิทธิ์ที่แสดงถึงการมีส่วนร่วมเล็กน้อยของโปรตีนการจับ eIF4E แต่ละตัวกับโปรไฟล์การจับของ eIF4E โดยใช้โปรไฟล์ eIF4E เป็นพร็อกซีทั่วไปสำหรับการเริ่มต้นที่ขึ้นกับหมวก เราสามารถประมาณค่าสัมประสิทธิ์ β ในสมการข้างต้นได้โดยใช้การถดถอยพหุเชิงเส้นมาตรฐานเพื่อสร้างแบบจำลองสำหรับบันทึก2(การเปลี่ยนแปลงแบบพับ (IP/ทั้งหมด)) สำหรับ eIF4E ที่สร้างจากบันทึก2(การเปลี่ยนแปลงแบบพับ (IP/Total)) ของโปรตีนอีกสี่ตัว สิ่งนี้สร้างแบบจำลองที่ดีด้วย R 2 = 0.75 ค่าสัมประสิทธิ์ β สำหรับคู่การจับ eIF4E ที่เทียบเท่ากับโปรไฟล์การจับ mRNA ของ eIF4E จากแบบจำลองนี้แสดงไว้ในรูปที่ 7C โปรตีนแต่ละชนิดมีส่วนสนับสนุนอย่างมากต่อแบบจำลองด้วย NS-ค่าที่ประเมินจะต่ำกว่า 0.002 ในทุกกรณี ค่าสัมประสิทธิ์ β สำหรับ eIF4G1 และ eIF4G2 มีขนาดใหญ่และเป็นค่าบวก ในขณะที่ค่าสัมประสิทธิ์ของ Caf20p ต่ำ และค่าของ Eap1p เป็นค่าลบ สิ่งเหล่านี้สะท้อนถึงค่าความสัมพันธ์ GLM แบบคู่ระหว่าง eIF4E และโปรตีนอื่นๆ ที่แสดงในรูปที่ 3 และความคล้ายคลึงกันในแผนที่ความร้อนในรูปที่ 4 ตัวอย่างเช่น โปรไฟล์การจับ RNA ของ eIF4G1 และ eIF4G2 มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับของ eIF4E ในขณะที่โปรไฟล์การจับ RNA ของ 4EBPs, Caf20p และ Eap1p มีความสัมพันธ์ไม่ดีกับ eIF4E เราต้องการชี้แจงให้ชัดเจนว่าสัมประสิทธิ์ β จากแบบจำลองไม่ได้อธิบายง่ายๆ ด้วยความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของส่วนประกอบวงปิด: การประมาณการของความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนสัมพัทธ์จากชุดข้อมูลโปรตีนเชิงปริมาณที่ผสานรวม PaxDb [49] ระดับของโปรตีนยีสต์สี่ตัว คือ: eIF4E = 1,011 ppm, eIF4G1 = 444 ppm, eIF4G2 = 118 ppm, Caf20p = 306 ppm, Eap1p = 57 ppm การวิเคราะห์ในลักษณะนี้ซับซ้อนโดยมีความเป็นเชิงเส้นร่วมในระดับสูงเมื่อเปรียบเทียบโปรไฟล์การจับ mRNA จาก eIF4G1 กับ eIF4G2 หรือของ Caf20p กับ Eap1p ความเป็นเชิงเส้นร่วมนี้อาจอธิบายค่าสัมประสิทธิ์ที่มากขึ้นสำหรับ eIF4G2 เมื่อเทียบกับ eIF4G1 แม้ว่าปริมาณโปรตีนจำนวนมากจะแนะนำว่า eIF4G1 ควรมีบทบาทที่โดดเด่นกว่า อย่างไรก็ตาม ความเชิงเส้นร่วมดังกล่าวไม่สามารถอธิบายค่าสัมประสิทธิ์ที่ค่อนข้างต่ำของ Caf20p และค่าสัมประสิทธิ์เชิงลบของ Eap1p ได้ ค่าสัมประสิทธิ์ต่ำและค่าลบสำหรับ Caf20p และ Eap1p ตามลำดับ มีแนวโน้มที่จะบ่งบอกถึงเครือข่ายที่ซับซ้อนมากขึ้นของการโต้ตอบกับ mRNA หรือโปรตีนการจับ RNA อื่นๆ ที่ไม่พึ่งพา eIF4E และโครงสร้างแคป mRNA

การสังเกตที่โดดเด่นที่สุดจากการสร้างแบบจำลองแสดงไว้ในแผนภาพของเศษที่เหลือของมีดแม่แรงเทียบกับค่าที่ติดตั้งไว้ (รูปที่ 7D) นี่คือพล็อตการวินิจฉัยทั่วไปในการถดถอยเชิงเส้น โดยที่ค่าคงเหลือมาตรฐานสำหรับการถอดเสียงแต่ละรายการควรอยู่กึ่งกลางที่ค่าเฉลี่ย 0 สำหรับแบบจำลองที่ได้รับการอธิบายอย่างดี ดังที่เห็นในรูปที่ 7D ข้อมูลเกือบทั้งหมดเข้ากับโมเดลนี้ได้ดี อย่างไรก็ตาม mRNA สองตัวที่อยู่นอกโมเดลนี้มีขอบเขตสูงสุดคือการเข้ารหัส 4E-BPs, Caf20p และ Eap1p ข้อสังเกตนี้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าภายในขอบเขตของวงปิดที่ซับซ้อน การเริ่มต้นการแปลของ CAF20 และ EAP1 mRNA อยู่นอกโมเดลนี้และถูกควบคุมในลักษณะที่แตกต่างกัน

Caf20p มีปฏิสัมพันธ์เป็นพิเศษกับและควบคุมการถอดเสียงของตัวเอง

การเปรียบเทียบแบบคู่ทางสถิติโดยตรงระหว่างการดึงโปรตีนออก (รูปที่ 3) ยังชี้ให้เห็นถึงพฤติกรรมที่ผิดปกติจาก CAF20 และ EAP1 mRNA โปรไฟล์การจับ mRNA ของ eIF4E และ eIF4G1 มีความสัมพันธ์สูงกับการถอดเสียงเพียงไม่กี่รายการที่ได้รับการเสริมสมรรถนะเป็นพิเศษในการดึงลง eIF4E (รูปที่ 3B) อย่างไรก็ตาม ในบรรดาใบรับรองผลการเรียนที่มีการปรับปรุงทางสถิติทั้ง 6 ฉบับนั้นน่าสังเกตคือ CAF20, EAP1 และ TIF4632 mRNA ซึ่งเข้ารหัส 4E-BPs Caf20p และ Eap1p และ eIF4G2 ตามลำดับ (รูปที่ 8A) ในทำนองเดียวกัน เมื่อเปรียบเทียบการดึงลงของ eIF4E และ eIF4G2 เราสังเกตเห็นการถอดเสียง 24 รายการที่แสดงมากเกินไปในการดึงลง eIF4E ที่สัมพันธ์กับการดึงลง eIF4G2 (รูปที่ 3B) อีกครั้ง mRNAs สำหรับ CAF20 และ EAP1และครั้งนี้ TIF4631การเข้ารหัส eIF4G1 มีความเกี่ยวข้องอย่างพิเศษกับ eIF4E (รูปที่ 8A) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CAF20/EAP1 mRNA ถูกเสริมด้วย eIF4E แต่ไม่ใช่กับ eIF4G1

Caf20p ควบคุมการถอดเสียงด้วยตนเอง (NS) การถอดเสียงประกอบมากเกินไปในเมนูแบบเลื่อนลง eIF4E ที่สัมพันธ์กับ eIF4G1 (สีฟ้าอ่อน) หรือ eIF4G2 (สีชมพู) ข้อมูลนำมาจากแบบจำลอง GLM ที่แสดงในรูปที่ 3B (NS) พล็อตพื้นผิวสามมิติของ NS-values ​​รายละเอียดระดับของนัยสำคัญสำหรับการเพิ่มคุณค่าของการถอดเสียงแบบ Closed Loop/eIF4E-BP แต่ละรายการในการทดลอง RIP-seq ทั้งหกรายการ (ค) การตรวจสอบ RT-PCR กึ่งเชิงปริมาณของความสัมพันธ์ของโปรตีน Caf20p กับการถอดเสียงของมันเองโดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบสำหรับภูมิภาค 1 ถึง 6 ที่แสดงในรูป (รายละเอียดในไฟล์เพิ่มเติม 6) ระดับจากภูมิภาคเหล่านี้ของ CAF20 การถอดเสียงถูกกำหนดในตัวอย่างที่ทำให้บริสุทธิ์ตามความสัมพันธ์ของ TAP จาก CAF20-TAP สายพันธุ์ที่สัมพันธ์กับสายพันธุ์ป่า (WT) (NS) แผนภาพแสดงแบบจำลองที่เป็นไปได้สองแบบโดยที่ Caf20p สามารถโต้ตอบกับการถอดเสียงของตัวเองเพื่อควบคุมการผลิตโปรตีน (จ) การทำให้บริสุทธิ์ตามความชอบของ TAP และการวิเคราะห์ western blot จากสายพันธุ์ที่ติดแท็ก eIF4E-TAP การตรวจสอบความสัมพันธ์ของ eIF4E กับโปรตีน Caf20p ภายนอกและ Caf20p แบบ wild-type ที่ติดแท็กแฟล็กหรือ Caf20 m2 ที่ติดแท็กด้วยแฟล็ก (ซึ่งมีการกลายพันธุ์ของบริเวณการจับ eIF4E) (NS) การตรวจสอบความจำเพาะของไพรเมอร์ RT-PCR โดยใช้ RNA ทั้งหมดจากสายพันธุ์ที่แสดงอยู่ใต้แผนภูมิแท่งสำหรับทั้งภายนอกและภายใน CAF20 ใบรับรองผลการเรียนหรือติดแท็กธง CAF20 การถอดเสียง (ไฟล์เพิ่มเติม 6) แถบค่าคลาดเคลื่อนคือ ± ข้อผิดพลาดมาตรฐานจากการทดลองซ้ำสามครั้ง (NS) qRT-PCR สำหรับ endogenous และ Flag-tagged CAF20 การถอดเสียงจากการทำให้บริสุทธิ์ของความสัมพันธ์ eIF4E-TAP โดยใช้ไพรเมอร์ที่ได้รับการตรวจสอบข้างต้น NS CAF20 หรือ CAF20-fl การถอดเสียงจะถูกวัดในตัวอย่าง IP ที่สัมพันธ์กับ RNA ทั้งหมดสำหรับสายพันธุ์ที่ระบุไว้ แถบค่าคลาดเคลื่อนคือ ± ข้อผิดพลาดมาตรฐานจากการทดลองซ้ำสามครั้ง (ชม) การวิเคราะห์ Western blot โดยใช้สารสกัดจาก caf20 สายพันธุ์การลบที่แปลงด้วยพลาสมิดแบบ centromeric (สำเนาต่ำ) ที่มีชนิด wild-type CAF20-fl ยีนหรือการกลายพันธุ์ m2 ของ CAF20-fl. ทรานส์ฟอร์มแทนท์เดี่ยวที่ต่างกันสามตัวถูกวิเคราะห์สำหรับแต่ละสายพันธุ์ และบลต์ถูกโพรบด้วยแอนติบอดีต้านแฟลกเพื่อตรวจหา Caf20-fl ที่สัมพันธ์กับการควบคุมแอนติบอดีต้าน eIF4A

เพื่อสำรวจเพิ่มเติมถึงความเป็นไปได้ที่ส่วนประกอบโปรตีนของระบบวงปิดจะเกี่ยวข้องกับการควบคุมของ mRNAs ที่เข้ารหัสส่วนประกอบอื่น ๆ ของระบบ การวิเคราะห์ทางสถิติโดยพิจารณาจากความสำคัญของการเพิ่มคุณค่าใดๆ สำหรับแต่ละทรานสคริปต์ที่เข้ารหัสโปรตีนที่สร้างภูมิคุ้มกันให้บริสุทธิ์ทั้งหกตัวทั่วทั้ง RIP - มีการทดลองภาคต่อ ข้อมูลเหล่านี้ถูกนำเสนอเป็นแผนผังพื้นผิวสามมิติในรูปที่ 8B โดยที่พีค (สีม่วง) แสดงถึงความสำคัญของการเพิ่มประสิทธิภาพของการถอดรหัสใน IP เฉพาะ ในขณะที่ราง (สีน้ำเงิน) แสดงถึงความสำคัญของการเป็นตัวแทนใดๆ ความสัมพันธ์ที่โดดเด่นที่สุดในพล็อตนี้เกี่ยวข้องกับการผูก Caf20p และ eIF4E ของ CAF20 การถอดเสียง (รูปที่ 8B) อย่างแท้จริง, CAF20 เป็นการถอดเสียงที่มีการแสดงมากเกินไปที่สุดใน Caf20p immunoprecipitation เมื่อเทียบกับ mRNA ทั้งหมดจากการวิเคราะห์ EdgeR GLM ด้วย FDR <10 -30 ที่แก้ไขแล้ว

จากผลลัพธ์ข้างต้น เราตั้งทฤษฎีว่าปฏิสัมพันธ์ของ Caf20p และ eIF4E กับ CAF20 การถอดเสียงอาจแสดงถึงกลไกการควบคุมอัตโนมัติ (รูปที่ 8D) ที่น่าสนใจในเรื่องนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้ระบุถึงความยากลำบากในการแสดงออกมากเกินไปของยีน Caf20p: การแสดงออกของส่วนประกอบอื่น ๆ ทั้งหมดของคอมเพล็กซ์วงปิดจากพลาสมิดสำเนาสูงในยีสต์ทำให้ระดับเพิ่มขึ้นสองถึงห้าเท่า ของโปรตีนในขณะที่พลาสมิดสำเนาสูงที่มี CAF20 ยีนไม่สร้างการแสดงออกมากเกินไป อย่างไรก็ตาม พลาสมิดดังกล่าวสร้างระดับ Caf20p ชนิดไวด์ใน a caf20Δ ความเครียด [52] เพื่อตรวจสอบการสังเกตโดยตรงว่า Caf20p มีปฏิสัมพันธ์กับการถอดเสียงของมันเอง การทำให้บริสุทธิ์ตามความสัมพันธ์ของ TAP ได้ดำเนินการในสายพันธุ์ไวด์และสายพันธุ์ Caf20p-TAP และ RNA ที่เกี่ยวข้องถูกแยกส่วนโดยการบำบัดด้วย RNase III การทดสอบ RT-PCR แบบกึ่งปริมาณถูกดำเนินการกับตัวอย่างเหล่านี้เพื่อประเมินประสิทธิภาพของการเพิ่มสมรรถนะของหกภูมิภาคที่แตกต่างกันของ CAF20 การถอดเสียง (รูปที่ 8C) ผลิตภัณฑ์ RT-PCR ถูกระบุจากทั่วทั้ง CAF20 mRNA ในตัวอย่างที่มีภูมิคุ้มกัน ในขณะที่ไม่พบผลิตภัณฑ์ในตัวอย่างจากสายพันธุ์ที่มีป้ายกำกับ CAF20. การเสริมสมรรถนะเฉพาะถูกสังเกตพบสำหรับคู่ไพรเมอร์ซึ่งครอบคลุมส่วนท้าย 3' ของกรอบการอ่านแบบเปิด (รูปที่ 8C) ดังนั้น โดยการใช้การทดสอบอิสระ ข้อมูลเหล่านี้ยืนยันว่า Caf20p สามารถโต้ตอบกับ CAF20 เอ็มอาร์เอ็นเอ

แม้ว่าข้อมูลข้างต้นจะเน้นถึงความเป็นไปได้ที่ Caf20p จะควบคุมการแปลข้อความถอดเสียงของตัวเองโดยอัตโนมัติ แต่ก็เป็นไปได้ที่ Caf20p ที่เพิ่งแปลบางส่วนที่เพิ่งแปลนั้นมีปฏิสัมพันธ์ผ่านโดเมนการจับ eIF4E ของขั้วอะมิโนที่มี eIF4E ที่ผูกไว้กับ CAF20 ฝาครอบ mRNA 5’ (รูปที่ 8D) นี้สามารถอธิบายการเพิ่มคุณค่าของ CAF20 mRNA พร้อม eIF4E และ Caf20p การทำงานร่วมกันระหว่างการแปลความหมายดังกล่าวของสารเชิงซ้อนโปรตีนกับโปรตีนได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ และสามารถอธิบายการเสริมคุณค่าร่วมของ mRNA ที่เข้ารหัสหน่วยย่อยเฉพาะกับหน่วยย่อยโปรตีนอื่นๆ ของสารเชิงซ้อนเดียวกัน [53]

เพื่อสำรวจความเป็นไปได้นี้เพิ่มเติม เราได้ทดสอบว่าการเพิ่มคุณค่าของ CAF20 mRNA ที่มี eIF4E ขึ้นอยู่กับการเชื่อมโยงโปรตีน Caf20p กับ eIF4E เราใช้กลยุทธ์ที่ Caf20p ที่ติดแท็กธงหรือ Caf20 ที่ติดแท็กธง Caf20 m2 p (โดยที่บริเวณ Caf20p ซึ่งโต้ตอบกับ eIF4E ถูกรบกวนผ่านการกลายพันธุ์ที่เข้าใจผิดสองครั้ง) แสดงออกจากพลาสมิดในสายพันธุ์ eIF4E-TAP ที่พำนักอยู่ในประเภทไวด์ จีโนมภายนอก CAF20 อัลลีล สิ่งนี้ทำให้ mRNA ที่ติดแท็กธงแข่งขันกับภายนอก CAF20 mRNA และอนุญาตให้วิเคราะห์ผลกระทบของการกลายพันธุ์ที่มีผลผูกพัน eIF4E ในการแข่งขันครั้งนี้ เพื่อควบคุมระบบ eIF4E ที่ทำการซับแบบตะวันตกของ TAP ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์จับทั้ง Caf20p ภายนอกและ Caf20p ที่ติดแท็กธง (รูปที่ 8E) ในขณะที่เมื่อวางโปรตีนกลายพันธุ์ Flag-Caf20 m2 p ในการแข่งขันกับ Caf20p ภายนอก eIF4E โต้ตอบเท่านั้น ด้วยโปรตีนภายในร่างกาย (รูปที่ 8E) ซึ่งยืนยันว่าการกลายพันธุ์ m2 ขัดขวางการจับ eIF4E [52]

qRT-PCR ถูกใช้เพื่อแยกแยะความแตกต่างจากภายนอก CAF20 mRNA จากแฟล็ก-tagged CAF20 เอ็มอาร์เอ็นเอ ควบคุมปฏิกิริยา qRT-PCR จากตัวอย่าง RNA ทั้งหมดแสดงให้เห็นความจำเพาะของคู่ไพรเมอร์ (รูปที่ 8F) ในสายพันธุ์ป่าเท่านั้น ภายนอก CAF20 ตรวจพบ mRNA ในขณะที่ระบุรูปแบบที่แท็กของ mRNA เท่านั้นในสายพันธุ์ที่มีเฉพาะการติดแท็กธง CAF20 ยีน (caf20Δ ธง-CAF20 รูปที่ 8F) สุดท้ายในสายพันธุ์ที่มีทั้งภายนอก CAF20 และติดแท็กธง CAF20 ยีน mRNA ทั้งสองถูกตรวจพบ (รูปที่ 8F) ดังนั้นเราจึงใช้ระบบนี้เพื่อวัดระดับของทั้งที่ติดแท็กธงและภายนอก CAF20 mRNA ที่มี eIF4E ที่สร้างภูมิคุ้มกันบกพร่อง และตรวจพบ mRNA ทั้งสองในการตกตะกอนของภูมิคุ้มกัน eIF4E วิกฤตที่ติดแท็กธง CAF20 mRNA ที่เกี่ยวข้องกับ eIF4E โดยไม่คำนึงถึงว่าผลิตภัณฑ์โปรตีนของ mRNA นี้สามารถโต้ตอบกับ eIF4E ได้หรือไม่ (เปรียบเทียบผลลัพธ์สำหรับสายพันธุ์ที่มี pCAF20-Fl เทียบกับ pCAF20 m2 -Fl รูปที่ 8G) ดังนั้น ปฏิสัมพันธ์ของ eIF4E กับ CAF20 mRNA ไม่ได้อาศัยความสามารถของโปรตีน Caf20p ในการโต้ตอบกับ eIF4E จากข้อมูลเหล่านี้ เราตั้งข้อสังเกตว่าไม่น่าเป็นไปได้อย่างยิ่งที่เหตุผลหลักสำหรับการเลือกเสริมคุณค่าของ CAF20 mRNA ที่มี eIF4E หรือโปรตีน Caf20p เป็น 'ปฏิสัมพันธ์ระหว่างการแปล' ของ Caf20p ที่เพิ่งตั้งไข่ผ่านโดเมนการจับ eIF4E ของขั้วอะมิโน แต่เรากลับชอบรูปแบบที่โปรตีน Caf20p ที่โตเต็มที่จะเสริมคุณค่า CAF20 mRNA น่าจะเป็นผ่านปฏิสัมพันธ์ Caf20p กับโปรตีนการจับ RNA อื่น ๆ รวมทั้งอันตรกิริยากับ eIF4E (รูปที่ 8D) อันที่จริง Caf20p ได้รับการพิสูจน์ก่อนหน้านี้ว่ามีปฏิสัมพันธ์กับทั้งโปรตีนที่จับกับ Puf4p และ Puf5p RNA [40]

การคาดการณ์ของแบบจำลองการควบคุมตนเองของ Caf20p คือในสายพันธุ์ที่มีการกลายพันธุ์ที่มีผลผูกพัน eIF4E (Caf20 m2 ) เป็นแหล่งเดียวของ Caf20p การควบคุมตนเองจะเกิดการลัดวงจรและ Caf20p จะสะสมในระดับที่สูงกว่าในสายพันธุ์ที่เกิดตามธรรมชาติ - พิมพ์ Caf20p. อันที่จริงแล้ว ในรูปที่ 8H การคาดคะเนนี้พบว่าถูกต้อง: ใน caf20Δ กลายพันธุ์แบกpCAF20 m2 -Fl พลาสมิด Caf20p สะสมได้ถึง 7.05 (±1.25) - ระดับที่สูงกว่าในพลาสมิดที่กลายพันธุ์ซึ่งมีพลาสมิดชนิดไวด์ เมื่อรวมกันแล้ว ข้อมูลเหล่านี้เน้นย้ำถึงวงจรควบคุมอัตโนมัติที่ควบคุมนิพจน์ Caf20p ในวงจรป้อนกลับเชิงลบ ซึ่งใช้เบรกแบบจำกัดตัวเองเพื่อปรับการแสดงออกของตัวยับยั้งการแปลระดับเซลล์ทั่วไป


12.3 กลไกอื่นๆ ของวิวัฒนาการ

แรงขับเคลื่อนวิวัฒนาการที่สำคัญที่สุดสี่ประการที่จะเปลี่ยนประชากรของสิ่งมีชีวิตเมื่อเวลาผ่านไป ได้แก่ การคัดเลือกโดยธรรมชาติ การกลายพันธุ์ การเคลื่อนตัวของยีน และการอพยพหรือการไหลของยีนเข้าหรือออกจากประชากร การคัดเลือกโดยธรรมชาติได้อธิบายไว้โดยละเอียดในหัวข้อก่อนหน้านี้ ส่วนนี้จะครอบคลุมถึงกลไกที่เหลือของวิวัฒนาการ

12.3.1 การกลายพันธุ์: ที่มาของรูปแบบใหม่ทั้งหมด

การกลายพันธุ์คือการเปลี่ยนแปลงในลำดับดีเอ็นเอ อาจเป็นการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อย เช่น การเปลี่ยนแปลงคู่เบสเดียว โดยผ่านการเปลี่ยนแปลงที่กว้างขวางมากขึ้น เช่น การเพิ่มหรือการลบคู่เบส แม้ว่าจะมีการเปลี่ยนแปลงครั้งใหญ่ในระดับโครโมโซม แม้แต่การเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยก็สามารถสร้างความแตกต่างอย่างมากในโปรตีนที่รหัสดีเอ็นเอหาได้ ดังตัวอย่างข้างต้นในตัวอย่างของโรคโลหิตจางชนิดเคียว

การกลายพันธุ์เปลี่ยนหนึ่งอัลลีลให้เป็นอัลลีลใหม่ อัลลีลใหม่นั้นมีความถี่น้อยมากในช่วงรุ่นแรก ในหลายชั่วอายุคน ความถี่ของความถี่จะเพิ่มขึ้นอย่างช้าๆ ในจำนวนประชากร หากไม่มีแรงวิวัฒนาการอื่นใดทำปฏิกิริยากับอัลลีล หากการคัดเลือกโดยธรรมชาติต่อต้านอัลลีล อัลลีลจะถูกลบออกจากประชากร นี่เป็นเหตุผลหนึ่งที่โรคทางพันธุกรรมยังคงอยู่ในประชากรมนุษย์ที่ความถี่ต่ำมาก หากอัลลีลเป็นที่ชื่นชอบของการเลือก อัลลีลจะเพิ่มขึ้นในความถี่ หากการกลายพันธุ์เป็นกลาง – ไม่เพิ่มหรือลดสมรรถภาพการเจริญพันธุ์ – ความถี่ของมันจะยังคงคงที่ในประชากรรุ่นต่อรุ่น

12.3.2. การไหลของยีน/การย้ายถิ่น

หากประชากรของสปีชีส์สองชนิดมีความถี่อัลลีลต่างกัน การย้ายถิ่นของบุคคลจากประชากรหนึ่งไปยังอีกประชากรหนึ่งจะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงความถี่ในประชากรทั้งสอง ประชากรใหม่จะมีจำนวนอัลลีลเพิ่มขึ้นในขณะที่จำนวนอัลลีลก่อนหน้าจะมีจำนวนอัลลีลลดลง (รูปที่ 12.23)

รูปที่ 12.23 ในตัวอย่างนี้ แมลงสีน้ำตาลตัวหนึ่งอพยพจากประชากรหนึ่งไปยังอีกกลุ่มหนึ่ง ความถี่อัลลีลสำหรับสีน้ำตาลจึงเพิ่มขึ้นในประชากรทางด้านซ้าย เครดิต: “ไฟล์:Gene flow.jpg” โดย Tsaneda ได้รับอนุญาตภายใต้ CC BY 3.0

หลังจากย้ายถิ่น บุคคลใหม่จะแต่งงานกับบุคคลในท้องถิ่นและอัลลีลที่แปลกใหม่จะกลายเป็นส่วนหนึ่งของกลุ่มยีนของประชากร

แม้ว่าประชากรบางกลุ่มจะค่อนข้างคงที่ สัตว์บางชนิดไม่ได้เดินทางอย่างกว้างขวางในช่วงชีวิตของมัน ในขณะที่บางชนิดมีการอพยพย้ายถิ่นสูงและการไหลของยีนเป็นเรื่องปกติมาก สปีชีส์ของพืชอาจดูเหมือนอยู่กับที่ แต่พวกมันก็มีการไหลของยีนเช่นกัน พืชหลายชนิดสามารถส่งเมล็ดไปได้ไกลและกว้างโดยลมหรือในลำไส้ของสัตว์ที่กินเมล็ดพืชแล้วนำไปวางในตำแหน่งอื่นเมื่อถ่ายอุจจาระ เมล็ดพันธุ์ที่เดินทางอย่างกว้างขวางเหล่านี้อาจแนะนำอัลลีลทั่วไปในประชากรต้นทางให้กับประชากรใหม่ที่หายาก

12.3.3 การดริฟท์ทางพันธุกรรม

อีกวิธีหนึ่งที่ความถี่อัลลีลของประชากรสามารถเปลี่ยนแปลงได้คือความเบี่ยงเบนทางพันธุกรรม (รูปที่ 11.7) ซึ่งเป็นเพียงผลกระทบของโอกาส การเบี่ยงเบนทางพันธุกรรมเป็นสิ่งสำคัญที่สุดในกลุ่มประชากรขนาดเล็ก การล่องลอยจะหายไปอย่างสมบูรณ์ในประชากรที่มีบุคคลที่ไม่มีที่สิ้นสุด แต่แน่นอนว่าไม่มีประชากรจำนวนมากขนาดนี้ การเบี่ยงเบนทางพันธุกรรมเกิดขึ้นเนื่องจากอัลลีลในรุ่นลูกหลานเป็นตัวอย่างแบบสุ่มของอัลลีลในรุ่นแม่ อัลลีลอาจจะหรือไม่อาจกลายเป็นคนรุ่นต่อไปเนื่องจากเหตุการณ์ที่บังเอิญรวมถึงการเสียชีวิตของบุคคล เหตุการณ์ที่ส่งผลต่อการหาคู่ครอง และแม้แต่เหตุการณ์ที่ส่งผลต่อเซลล์สืบพันธุ์ที่ลงเอยด้วยการปฏิสนธิ หากมีคนคนหนึ่งในประชากรสิบคนเสียชีวิตก่อนที่มันจะทิ้งลูกหลานให้คนรุ่นต่อไป ยีนทั้งหมดของมัน—หนึ่งในสิบของกลุ่มยีนของประชากร—จะสูญเสียไปอย่างกะทันหัน ในประชากร 100 คน บุคคล 1 คนเป็นตัวแทนของกลุ่มยีนเพียง 1 เปอร์เซ็นต์ ดังนั้นจึงมีผลกระทบต่อโครงสร้างทางพันธุกรรมของประชากรน้อยกว่ามาก และไม่น่าจะลบสำเนาของอัลลีลที่ค่อนข้างหายากทั้งหมดออกทั้งหมด

ลองนึกภาพประชากรสิบคน ครึ่งหนึ่งมีอัลลีล A และอีกครึ่งหนึ่งเป็นอัลลีล a (บุคคลเป็นเดี่ยว) ในประชากรที่มั่นคง คนรุ่นต่อไปจะมีสิบคนเช่นกัน เลือกรุ่นนั้นแบบสุ่มโดยการพลิกเหรียญสิบครั้งแล้วปล่อยให้หัวเป็น A และก้อยเป็น A ไม่น่าเป็นไปได้ที่คนรุ่นต่อไปจะมีอัลลีลเพียงครึ่งเดียว อาจมีหกในหนึ่งและสี่ของอื่น ๆ หรือชุดความถี่ที่แตกต่างกัน ดังนั้นความถี่อัลลีลจึงเปลี่ยนไปและวิวัฒนาการได้เกิดขึ้น เหรียญจะไม่สามารถเลือกรุ่นต่อไปได้อีกต่อไป (เพราะอัตราต่อรองไม่ใช่ครึ่งหนึ่งของแต่ละอัลลีลอีกต่อไป) ความถี่ในแต่ละรุ่นจะเลื่อนขึ้นและลงในสิ่งที่เรียกว่าการเดินสุ่มจนกระทั่งถึงจุดหนึ่งที่ A ทั้งหมดหรือ a ทั้งหมดจะถูกเลือกและอัลลีลนั้นจะถูกกำหนดจากจุดนั้นเป็นต้นไป อาจใช้เวลานานมากสำหรับประชากรจำนวนมาก การทำให้เข้าใจง่ายนี้ไม่ใช่ทางชีววิทยามากนัก แต่สามารถแสดงให้เห็นได้ว่าประชากรจริงมีพฤติกรรมเช่นนี้ ผลกระทบของการดริฟท์ต่อความถี่จะยิ่งมากขึ้นเมื่อมีประชากรน้อยลง ผลของมันยังมีมากขึ้นในอัลลีลที่มีความถี่ห่างจากครึ่งหนึ่ง การดริฟท์จะส่งผลต่อทุกอัลลีล แม้กระทั่งอัลลีลที่ได้รับการคัดเลือกโดยธรรมชาติ

การเคลื่อนตัวของยีนยังสามารถขยายได้ด้วยเหตุการณ์ตามธรรมชาติหรือที่มนุษย์สร้างขึ้น เช่น ภัยพิบัติที่สุ่มฆ่าประชากรส่วนใหญ่ ซึ่งเรียกว่าผลกระทบคอขวดที่ส่งผลให้ส่วนใหญ่ของจีโนมถูกกำจัดออกไปอย่างกะทันหัน (รูปที่ 11.8). ในคราวเดียว โครงสร้างทางพันธุกรรมของผู้รอดชีวิตกลายเป็นโครงสร้างทางพันธุกรรมของประชากรทั้งหมด ซึ่งอาจแตกต่างอย่างมากจากประชากรก่อนเกิดภัยพิบัติ ภัยพิบัติจะต้องเป็นการฆ่าด้วยเหตุผลที่ไม่เกี่ยวข้องกับลักษณะของสิ่งมีชีวิต เช่น พายุเฮอริเคนหรือลาวาไหล การสังหารหมู่ที่เกิดจากอุณหภูมิที่เย็นผิดปกติในเวลากลางคืน มีแนวโน้มที่จะส่งผลกระทบต่อบุคคลที่แตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับอัลลีลที่พวกเขามีซึ่งให้ความหนาวเย็น

สถานการณ์สมมติอีกประการหนึ่งที่ประชากรอาจได้รับอิทธิพลอย่างมากจากความเหลื่อมล้ำทางพันธุกรรมคือถ้าประชากรบางส่วนออกไปเริ่มต้นประชากรใหม่ในที่ตั้งใหม่ หรือหากประชากรถูกแบ่งโดยสิ่งกีดขวางทางกายภาพบางประเภท ในสถานการณ์เช่นนี้ บุคคลเหล่านั้นไม่น่าจะเป็นตัวแทนของประชากรทั้งหมดซึ่งส่งผลให้เกิดผลกระทบของผู้ก่อตั้ง ผลกระทบของผู้ก่อตั้งเกิดขึ้นเมื่อโครงสร้างทางพันธุกรรมตรงกับพ่อและแม่ผู้ก่อตั้งกลุ่มประชากรใหม่ เชื่อกันว่าผลกระทบของผู้ก่อตั้งนั้นเป็นปัจจัยสำคัญในประวัติศาสตร์ทางพันธุกรรมของประชากรชาวแอฟริกาเนอร์ของผู้ตั้งถิ่นฐานชาวดัตช์ในแอฟริกาใต้ ซึ่งเห็นได้จากการกลายพันธุ์ที่พบได้ทั่วไปในแอฟริกา แต่พบได้ยากในประชากรอื่นๆ ส่วนใหญ่ อาจเป็นเพราะสัดส่วนที่สูงกว่าปกติของอาณานิคมผู้ก่อตั้ง ซึ่งเป็นกลุ่มตัวอย่างเล็กๆ ของประชากรดั้งเดิม มีการกลายพันธุ์เหล่านี้ เป็นผลให้ประชากรแสดงอุบัติการณ์สูงผิดปกติของโรคฮันติงตัน (HD) และโรคโลหิตจาง Fanconi (FA) ซึ่งเป็นโรคทางพันธุกรรมที่ทราบว่าทำให้เกิดไขกระดูกและความผิดปกติ แต่กำเนิดและแม้กระทั่งมะเร็ง


ดูวิดีโอ: ชววทยา เฉลย 9 วชาสามญป 61 ขอ 12: การทำงานของ enzyme ยอยโปรตน (มิถุนายน 2022).