ข้อมูล

การออกแบบรองพื้นด้วย Primer-BLAST บนไซต์เฉพาะ

การออกแบบรองพื้นด้วย Primer-BLAST บนไซต์เฉพาะ



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันกำลังพยายามออกแบบไพรเมอร์โดยใช้ Primer-BLAST เพื่อให้ไพรเมอร์ส่งต่อครอบคลุมไซต์คู่ฐานเฉพาะ

ฉันกำลังดู KRAS ซึ่งฉันเชื่อว่า รหัส RefSeq เป็น NG_007524.1 และไพรเมอร์ไปข้างหน้าควรขยาย chr12:25398285.

อย่างไรก็ตาม ฉันไม่แน่ใจว่าจะจำกัดการออกแบบให้สำเร็จได้อย่างไร ขอบคุณ.


ฉันคิดว่าสามารถใช้หลายวิธี แต่วิธีที่ง่ายที่สุดคือการระบุช่วงที่จะตั้งค่าไพรเมอร์ไปข้างหน้า

กำหนดความยาวของไพรเมอร์ที่คุณจะได้รับ

สมมติว่าคุณต้องการ 25 mer

คุณสามารถตั้งค่าช่วงจาก chr12:25398261 ถึง chr12:25398309.

เมื่อคุณระบุว่าที่ไหน chr12:25398285 อยู่ใน NG_007524.1คุณก็พร้อมที่จะออกแบบไพรเมอร์ของคุณแล้ว


การออกแบบรองพื้นด้วย Primer-BLAST บนไซต์เฉพาะ - ชีววิทยา

นโยบายการใช้งาน PrimerBank

PrimerBank เป็นแหล่งข้อมูลสาธารณะสำหรับไพรเมอร์ PCR ไพรเมอร์เหล่านี้ออกแบบมาสำหรับการตรวจจับการแสดงออกของยีนหรือการหาปริมาณ (PCR แบบเรียลไทม์) มีหลายวิธีในการค้นหาไพรเมอร์: โดย GenBank Accession, การเข้าถึงโปรตีน NCBI, LocusLink ID, PrimerBank ID หรือคำหลัก (คำอธิบายยีน) PrimerBank มีไพรเมอร์ประมาณ 180,000 ที่ครอบคลุมยีนของมนุษย์และเมาส์ที่เป็นที่รู้จักมากที่สุด

Polymerase Chain Reaction Amplification (PCR) เป็นหนึ่งในเทคนิคที่มีการใช้งานมากที่สุดในอณูชีววิทยา ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา PCR มีการใช้มากขึ้นสำหรับการตรวจจับการแสดงออกของยีนหรือการหาปริมาณ เป็นวิธีที่สะดวกกว่าในการศึกษาการแสดงออกของยีนเมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิคอื่นๆ เช่น Northern Blot ปัญหาทั่วไปอย่างหนึ่งใน PCR คือการขยายพันธุ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงของผลิตภัณฑ์ยีนอื่นๆ เนื่องจากไลบรารี cDNA ของพันยีนมักถูกใช้เป็นเทมเพลต PCR ดังนั้นเราจึงต้องออกแบบไพรเมอร์ PCR อย่างรอบคอบเพื่อขยายยีนที่น่าสนใจโดยเฉพาะ น่าเสียดายที่โปรแกรมการออกแบบไพรเมอร์ที่มีอยู่ส่วนใหญ่มุ่งเน้นเฉพาะคุณสมบัติทางเคมีของไพรเมอร์ เช่น อุณหภูมิหลอมเหลว ปริมาณ GC โครงสร้างทุติยภูมิ ฯลฯ โดยเน้นเพียงเล็กน้อยกับไพรเมอร์ที่ทำให้ไพรเมอร์ผิดพลาดกับยีนอื่นๆ ในทางตรงกันข้าม ไพรเมอร์ทั้งหมดใน PrimerBank ได้รับการออกแบบมาอย่างดีเพื่อให้แน่ใจว่ามีความจำเพาะของยีน

อัลกอริธึมการออกแบบไพรเมอร์ได้รับการทดสอบอย่างกว้างขวางโดยการทดลอง PCR แบบเรียลไทม์สำหรับความจำเพาะและประสิทธิภาพของ PCR เราได้ทดสอบไพรเมอร์ 26,855 คู่ที่สอดคล้องกับยีนของเมาส์ 27,681 ยีนโดย Real Time PCR ตามด้วย agarose gel electrophoresis และการจัดลำดับของผลิตภัณฑ์ PCR อัตราความสำเร็จในการออกแบบคือ 82.6% (คู่ไพรเมอร์ที่ประสบความสำเร็จ 22,187 คู่) โดยอิงจากอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส

คุณสามารถค้นหา PrimerBank โดย GenBank Accession, ภาคยานุวัติโปรตีน NCBI, LocusLink ID, สัญลักษณ์ยีน NCBI หรือ PrimerBank ID

ข้อความค้นหาจะถูกรวมโดยอัตโนมัติหากคั่นด้วยการเว้นวรรค ตัวอย่างเช่น การค้นหา "kinase s6" จะส่งกลับระเบียนทั้งหมดที่มีทั้งคำหลัก "kinase" และ "s6" อาจใช้ตัวดำเนินการ AND และ OR บูลีน นี่คือตัวอย่างบางส่วน:

คำสำคัญ การตีความ
kinase s6 ค้นหาทั้ง kinase และ s6
kinase และ s6 ค้นหาทั้ง kinase และ s6
Cytochrome หรือ cyp กำลังค้นหา Cytochrome หรือ cyp

ปัจจุบัน สามารถค้นหาได้เฉพาะชุดคำหลัก (คำหลักที่กำหนดไว้ในคำจำกัดความของโปรตีน) เท่านั้นที่สามารถค้นหาได้ ตัวอย่างเช่น คุณไม่สามารถค้นหาด้วยสัญลักษณ์ยีนได้ หากคุณไม่พบยีนของคุณ โปรดค้นหารหัสยีนที่เกี่ยวข้อง (การเข้าถึงดีเอ็นเอ การเข้าถึงโปรตีน หรือรหัส LocusLink) และค้นหาด้วยรหัส

เนื่องจากความซ้ำซ้อนของลำดับใน GenBank ยีนแต่ละตัวมักจะแสดงด้วยระเบียน NCBI มากกว่าหนึ่งรายการ PrimerBank บางครั้งใช้ไฟล์ดัชนี NCBI LocusLink เพื่อจับคู่เร็กคอร์ดหลายลำดับกับโลคัสของยีนเดียวกัน ด้วยเหตุนี้ อาจมีการเรียกหมายเลขภาคยานุวัติอื่นนอกเหนือจากที่ส่งมาในตอนแรก อย่างไรก็ตาม ภาคยานุวัติทั้งสองเป็นตัวแทนของยีนเดียวกัน หากบันทึกที่ดึงมามีภาคยานุวัติ GenBank อื่น LocuLink ID จะปรากฏในช่องคำอธิบายยีน

คุณสามารถใช้ฟังก์ชันบันทึกของเบราว์เซอร์เพื่อบันทึกหน้าเว็บในเครื่องคอมพิวเตอร์ของคุณ ตัวเลือกการบันทึกอื่นๆ จะถูกนำมาใช้ในภายหลัง

ไพรเมอร์ทั้งหมดใน PrimerBank ได้รับการออกแบบโดยใช้โปรแกรมที่เรียกว่า uPrimer ได้รับการดูแลอย่างดีเพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้ไพรเมอร์ผิดพลาดกับยีนอื่นที่รู้จักในจีโนม นี่คือรายการเกณฑ์สำหรับการออกแบบไพรเมอร์เฉพาะของยีน:

  1. ช่วงความยาวไพรเมอร์: 19 - 23 nt โดยมีความยาวที่เหมาะสมที่ 21 nt
  2. ช่วงเปอร์เซ็นต์ไพรเมอร์ GC: 35% - 65%
  3. ค่า delta G สำหรับเบสปลาย 3&rsquo ห้าตัวคือ -9 kcal/mol เป็นอย่างน้อย
  4. ช่วงไพรเมอร์ Tm: 60 - 63 °C กำหนดโดยวิธีเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด
  5. ช่วงความยาวผลิตภัณฑ์ PCR คือ 100 - 250 bp หากไม่สามารถปฏิบัติตามข้อกำหนดนี้ได้ จะมีการใช้ช่วงทางเลือก
  6. จำนวนคู่ไพรเมอร์เริ่มต้นที่ออกแบบมาสำหรับแต่ละลำดับคือ 3
  7. ไม่มีไพรเมอร์ได้รับการออกแบบจากบริเวณที่มีความซับซ้อนต่ำ
  8. ไพรเมอร์ไม่มีนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกันติดกัน 6 ตัวขึ้นไป
  9. ไพรเมอร์ไม่มีนิวคลีโอไทด์ที่คลุมเครือ
  10. ไม่มีการทำซ้ำ 15 เมอร์จากลำดับยีนอื่นในจีโนม (สำหรับทั้งสองสาย) ที่ใดก็ได้ในไพรเมอร์
  11. ไม่มีการทำซ้ำ 13 เมอร์จากลำดับ RNA ที่ไม่ได้เข้ารหัส (สำหรับทั้งสองสาย) ที่ใดก็ได้ในไพรเมอร์
  12. คะแนน BLAST ทั่วโลกสำหรับไพรเมอร์ใด ๆ น้อยกว่า 30 (เทียบเท่ากับการจับคู่ที่สมบูรณ์แบบ 15-mer)
  13. Tm สูงสุดสำหรับการจับคู่ที่สมบูรณ์แบบ 3&rsquo กับลำดับยีนอื่น ๆ ไม่เกิน 46 °C ไม่เกิน 42 °C เมื่อเปรียบเทียบกับลำดับ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัส (Tm กำหนดโดยวิธีเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด)
  14. สำหรับโครงสร้างรองของไพรเมอร์ (ไพรเมอร์-ไพรเมอร์ self-annealing)
    1. ไม่อนุญาตให้มี 5-mer ซ้ำกันที่ใดก็ได้เมื่อเปรียบเทียบลำดับไพรเมอร์กับสายคู่สม
    2. เบส 3&rsquo-end สี่ตัวควรไม่ซ้ำกันเมื่อเปรียบเทียบกับเส้นใยเสริมของไพรเมอร์
    1. ไม่อนุญาตให้ใช้ 9-mer ซ้ำกันเมื่อเปรียบเทียบลำดับไพรเมอร์กับสายเสริมของลำดับโคเนทของมัน
    2. คะแนน BLAST น้อยกว่า 18 เมื่อเปรียบเทียบลำดับไพรเมอร์กับสายเสริมของลำดับโคเนทของมัน

    ไพรเมอร์ทั้งหมดใน PrimerBank มีอุณหภูมิหลอมเหลว (Tm) 60 - 63 °C อุณหภูมิการหลอมที่สูงขึ้นส่งผลให้เกิดการลงสีรองพื้นที่จำเพาะเจาะจงมากขึ้น การศึกษาก่อนหน้านี้บ่งชี้ว่าควรไพรเมอร์ที่เพียงพอที่ไพรเมอร์ Tm ดังนั้น แนะนำให้ใช้อุณหภูมิการหลอม 60 °C สำหรับไพรเมอร์ PrimerBank ทั้งหมด ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ไม่เฉพาะเจาะจงมักจะเกิดขึ้นที่อุณหภูมิการหลอมที่ต่ำกว่า เราได้ทดสอบไพรเมอร์สองสามร้อยตัวภายใต้อุณหภูมิการหลอม 60 °C และการทดลอง PCR ก็ทำงานได้ดีมาก

    ค่าไพรเมอร์ Tm คำนวณโดยใช้ Nearest Neighbor Method พร้อมพารามิเตอร์ทางอุณหพลศาสตร์ที่เป็นปัจจุบัน ค่า Tm ยังขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของไพรเมอร์และเกลืออีกด้วย ไพรเมอร์และเกลือที่มีความเข้มข้นสูงกว่ามักจะทำให้ Tm สูงขึ้น ค่า Tm ที่รวมอยู่ใน PrimerBank ใช้สำหรับไพรเมอร์ 0.25 uM, 1.5 mM Mg2+, 50 mM Na+ และ 0.8 mM dNTP ซึ่งโดยทั่วไปจะใช้ในการทดลอง PCR เงื่อนไข PCR ทั่วไปอื่นๆ มีผลกับ Tm เพียงเล็กน้อยเท่านั้น

    เพื่อรับประกันประสิทธิภาพของ PCR ขอแนะนำให้ใช้ผลิตภัณฑ์ PCR ขนาดเล็ก ไพรเมอร์ PrimerBank ส่วนใหญ่นำไปสู่แอมพลิคอนในช่วงขนาด 100 - 250 bp ประสิทธิภาพ PCR ใกล้เคียงกับ 100% ในช่วงนี้ (รองรับโดยการทดลอง PCR แบบเรียลไทม์) อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพ PCR อาจลดลงสำหรับผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีขนาดใหญ่กว่ามาก ไพรเมอร์ PrimerBank น้อยกว่า 1% นำไปสู่แอมพลิคอน >400 bp โปรดใช้ความระมัดระวังเกี่ยวกับประสิทธิภาพของ PCR เมื่อต้องใช้ไพรเมอร์เหล่านี้

    บางครั้งควรเลือกไพรเมอร์คู่ที่มีช่วงอินตรอน ด้วยวิธีนี้ สามารถตรวจสอบการปนเปื้อนของ DNA ของจีโนมได้อย่างใกล้ชิด โดยปกติคู่ไพรเมอร์ของ PrimerBank จะครอบคลุมช่วงอินตรอนเนื่องจาก exon ทั่วไปมีขนาดค่อนข้างเล็ก ข้อมูลการขยายขอบเขตของไพรเมอร์จะรวมอยู่ในการอัปเดตเวอร์ชันถัดไป หากเป็นสิ่งสำคัญสำหรับคุณที่จะต้องแน่ใจว่าคู่ไพรเมอร์ครอบคลุมช่วงอินทรอน คุณอาจเพียงทำการค้นหา BLAST ของลำดับคู่ไพรเมอร์ หรือลำดับแอมพลิคอนให้ดีขึ้น (แสดงอยู่ในหน้ารายละเอียดไพรเมอร์) กับลำดับจีโนม

    อิเล็กโตรโฟรีซิสเจล Agarose หรือการวิเคราะห์เส้นโค้งการหลอมเหลวอาจไม่สะท้อนความจำเพาะของ PCR อย่างน่าเชื่อถือเสมอไป จากประสบการณ์ของเรา จะมีการสังเกตกราฟการหลอมละลายแบบไบโมดอลเป็นครั้งคราวสำหรับแอมพลิคอนแบบยาว แม้ว่า PCR จะมีความเฉพาะเจาะจงก็ตาม ความแตกต่างที่สังเกตได้ในอุณหภูมิหลอมเหลวเกิดจากความไม่เป็นเนื้อเดียวกันของลำดับภายใน (เช่น บล็อกการหลอมเหลวอย่างอิสระที่มีปริมาณ GC สูงและต่ำ) มากกว่าการปนเปื้อนของแอมพลิคอน ในอีกทางหนึ่ง สำหรับแอมพลิคอนแบบสั้น แถบที่อ่อนแอมากที่เคลื่อนไปข้างหน้าของแถบเฉพาะหลักจะสังเกตเห็นได้เป็นครั้งคราวบนเจลอะกาโรส แถบที่อ่อนแอเหล่านี้เป็นแอมพลิคอนเฉพาะรุ่นที่มีโครงสร้างสูงหรือแบบเกลียวเดี่ยวในสภาวะสมดุล แม้ว่าเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสหรือการวิเคราะห์เส้นโค้งการหลอมละลายเพียงอย่างเดียวอาจไม่น่าเชื่อถือ 100% แต่การรวมกันทั้งสองอย่างสามารถเปิดเผยความจำเพาะ PCR จากประสบการณ์ของเราได้เสมอ

    แม้ว่าไพรเมอร์ PrimerBank ทั้งหมดได้รับการออกแบบให้จำเพาะต่อยีน แต่เราก็ยังต้องระวังให้มากเกี่ยวกับสภาวะ PCR

    การขยายไพรเมอร์แบบไม่จำเพาะต่อเบสเพียงไม่กี่เบสที่อุณหภูมิต่ำโดย DNA polymerase สามารถนำไปสู่การขยาย PCR แบบไม่จำเพาะได้อย่างง่ายดาย ดังนั้นจึงขอแนะนำให้ใช้ PCR แบบ hot-start อันที่จริงฉันทำ PCR แบบ hot-start เท่านั้นในการทดลองของฉัน ฉันใช้ AmpliTaq Gold polymerase (Applied Biosystems) เป็นประจำสำหรับ PCR แบบ hot-start

    อุณหภูมิการหลอมอาจส่งผลต่อความจำเพาะของ PCR เพื่อหลีกเลี่ยงผลิตภัณฑ์ PCR ที่ไม่เฉพาะเจาะจง ขอแนะนำให้ใช้อุณหภูมิการหลอมที่สูง (ค่า Tm ที่น้อยกว่าจากค่า Tm สองค่าจากคู่ไพรเมอร์) และระยะเวลาการหลอมที่สั้น

    หากคุณยังคงเห็นแถบที่ไม่เจาะจง อาจหมายความว่าคู่ไพรเมอร์ที่ใช้อยู่เป็นปัญหา แม้ว่าการออกแบบ PrimerBank primer จะได้รับการดูแลอย่างดี แต่อัตราความสำเร็จนั้นยังไม่ถึง 100% ไพรเมอร์น้อยกว่า 1% อาจมีปัญหาในการออกแบบ (ดูบทความของเราสำหรับการอภิปรายโดยละเอียด) ในกรณีนี้ โปรดลองใช้ไพรเมอร์คู่อื่นสำหรับยีนเดียวกัน คลิกที่นี่ หากคุณต้องการรายงานปัญหาไพรเมอร์

    แม่แบบ PCR ไพรเมอร์ หรือรีเอเจนต์คุณภาพต่ำอาจทำให้ PCR ล้มเหลว ขั้นแรก โปรดรวมการควบคุมที่เหมาะสมเพื่อขจัดความเป็นไปได้เหล่านี้

    ยีนบางตัวแสดงเฉพาะในเนื้อเยื่อบางชนิดเท่านั้น โปรดอ่านวรรณกรรมก่อนเพื่อให้แน่ใจว่ายีนของคุณรวมอยู่ในเทมเพลต cDNA จากประสบการณ์ของเรา นี่เป็นสาเหตุที่เป็นไปได้มากที่สุดสำหรับผลลัพธ์ PCR ในเชิงลบ หากคุณแน่ใจว่ายีนแสดงออกมาแล้ว ให้ลองลดอุณหภูมิการอบอ่อนลง (เป็น Tm - 5 °C) และเพิ่มเวลาการหลอมเพื่อให้แน่ใจว่ามีการอบอ่อนของไพรเมอร์เพียงพอ

    หากคุณยังไม่เห็นแถบ PCR ใดๆ อาจหมายความว่าคู่ไพรเมอร์ที่ใช้อยู่เป็นปัญหา แม้ว่าการออกแบบ PrimerBank primer จะได้รับการดูแลอย่างดี แต่อัตราความสำเร็จนั้นยังไม่ถึง 100% ไพรเมอร์น้อยกว่า 1% อาจมีปัญหาในการออกแบบ (ดูบทความของเราสำหรับการอภิปรายโดยละเอียด) ในกรณีนี้ โปรดลองใช้ไพรเมอร์คู่อื่นสำหรับยีนเดียวกัน คลิกที่นี่ หากคุณต้องการรายงานปัญหาไพรเมอร์

    อัลกอริทึมและการทดสอบเบื้องต้นของ PrimerBank สร้างขึ้นโดย Wang and Seed, Xiaowei Wang และ Brian Seed (2003) ธนาคารไพรเมอร์ PCR สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเชิงปริมาณ การวิจัยกรดนิวคลีอิก 31(24): e154 pp.1-8. และการปรับแต่งเพิ่มเติมและการตรวจสอบความถูกต้องของคอลเลกชั่นเมาส์ทั้งหมดดำเนินการโดย Spandidos และเพื่อนร่วมงาน Athanasia Spandidos, Xiaowei Wang, Huajun Wang, Stefan Dragnev, Tara Thurber และ Brian Seed (2008) คอลเลกชันที่ครอบคลุมของไพรเมอร์ที่ผ่านการตรวจสอบการทดลองแล้วสำหรับการหาปริมาณปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสของความอุดมสมบูรณ์ของการถอดรหัสของมิวรีน BMC จีโนมิกส์ 2008, 9:633


    Primer-BLAST: เครื่องมือในการออกแบบไพรเมอร์เฉพาะเป้าหมายสำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส

    การเลือกไพรเมอร์ที่เหมาะสมอาจเป็นปัจจัยเดียวที่สำคัญที่สุดที่ส่งผลต่อปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) การขยายเฉพาะของเป้าหมายที่ต้องการกำหนดให้ไพรเมอร์ไม่มีการจับคู่กับเป้าหมายอื่นในทิศทางที่แน่นอนและภายในระยะทางที่กำหนดซึ่งอนุญาตให้มีการขยายเสียงที่ไม่ต้องการ ขั้นตอนการออกแบบไพรเมอร์เฉพาะมักประกอบด้วยสองขั้นตอน ขั้นแรก ไพรเมอร์ขนาบข้างที่สนใจจะถูกสร้างขึ้นด้วยตนเองหรือใช้เครื่องมือซอฟต์แวร์ จากนั้นจึงค้นหาฐานข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมาะสมโดยใช้เครื่องมือ เช่น BLAST เพื่อตรวจสอบเป้าหมายที่เป็นไปได้ อย่างไรก็ตาม ขั้นตอนหลังไม่ใช่กระบวนการที่ง่าย เนื่องจากจำเป็นต้องตรวจสอบรายละเอียดมากมายระหว่างไพรเมอร์กับเป้าหมาย เช่น จำนวนและตำแหน่งของฐานที่ตรงกัน การวางแนวของไพรเมอร์ และระยะห่างระหว่างไพรเมอร์เดินหน้าและถอยหลัง ความซับซ้อนของการวิเคราะห์ดังกล่าวมักทำให้เป็นงานที่ใช้เวลานานและยากมากสำหรับผู้ใช้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อไพรเมอร์มีจำนวนครั้งมาก นอกจากนี้ ถึงแม้ว่าโปรแกรม BLAST จะใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการตรวจจับเป้าหมายไพรเมอร์ แต่อันที่จริงแล้วไม่ใช่เครื่องมือในอุดมคติสำหรับจุดประสงค์นี้ เนื่องจาก BLAST เป็นอัลกอริธึมการจัดตำแหน่งในพื้นที่และไม่จำเป็นต้องส่งคืนข้อมูลการจับคู่ที่สมบูรณ์ตลอดช่วงไพรเมอร์ทั้งหมด


    หลักการพื้นฐานของ RT-qPCR

    PCR การถอดรหัสย้อนกลับเชิงปริมาณ (RT-qPCR) ถูกใช้เมื่อวัสดุเริ่มต้นคือ RNA ในวิธีนี้ RNA จะถูกแปลงเป็น DNA เสริม (cDNA) ครั้งแรกโดย reverse transcriptase จาก RNA ทั้งหมดหรือ messenger RNA (mRNA) จากนั้น cDNA จะถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับปฏิกิริยา qPCR RT-qPCR ถูกนำมาใช้ในการใช้งานที่หลากหลาย รวมถึงการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การตรวจสอบ RNAi การตรวจสอบไมโครอาร์เรย์ การตรวจหาเชื้อโรค การทดสอบทางพันธุกรรม และการวิจัยโรค

    RT-qPCR . แบบขั้นตอนเดียวเทียบกับแบบสองขั้นตอน

    RT-qPCR สามารถทำได้ในการทดสอบแบบขั้นตอนเดียวหรือสองขั้นตอน (รูปที่ 1 ตารางที่ 1). การสอบวิเคราะห์แบบขั้นตอนเดียวรวมการถอดรหัสแบบย้อนกลับและ PCR ในหลอดเดียวและบัฟเฟอร์ โดยใช้การถอดรหัสแบบย้อนกลับร่วมกับดีเอ็นเอโพลีเมอเรส RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวใช้ไพรเมอร์เฉพาะลำดับเท่านั้น ในการสอบวิเคราะห์แบบสองขั้นตอน ขั้นตอนการถอดรหัสแบบย้อนกลับและ PCR ถูกดำเนินการในหลอดที่แยกจากกัน โดยมีบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมที่สุด สภาวะของปฏิกิริยา และกลยุทธ์การไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน

    รูปที่ 1 RT-qPCR แบบขั้นตอนเดียวและแบบสองขั้นตอน

    ตารางที่ 1. ข้อดีและข้อเสียเมื่อใช้การทดสอบแบบขั้นตอนเดียวเทียบกับแบบสองขั้นตอนใน RT-qPCR

    • ความผันแปรในการทดลองน้อยกว่าเนื่องจากปฏิกิริยาทั้งสองเกิดขึ้นในหลอดเดียวกัน
    • ขั้นตอนการปิเปตน้อยลงช่วยลดความเสี่ยงของการปนเปื้อน
    • เหมาะสำหรับการขยาย/คัดกรองปริมาณงานสูง
    • รวดเร็วและทำซ้ำได้สูง
    • เป็นไปไม่ได้ที่จะเพิ่มประสิทธิภาพปฏิกิริยาทั้งสองแยกกัน
    • มีความไวน้อยกว่าสองขั้นตอนเนื่องจากเงื่อนไขของปฏิกิริยาเป็นการประนีประนอมระหว่างปฏิกิริยาทั้งสองรวมกัน
    • การตรวจจับเป้าหมายต่อตัวอย่างน้อยลง
    • พูล cDNA ที่เสถียรถูกสร้างขึ้นซึ่งสามารถเก็บไว้ได้เป็นเวลานานและใช้สำหรับปฏิกิริยาหลายอย่าง
    • ยีนเป้าหมายและยีนอ้างอิงสามารถขยายจากพูล cDNA เดียวกันโดยไม่ต้องมัลติเพล็กซ์
    • สามารถใช้บัฟเฟอร์ของปฏิกิริยาและสภาวะของปฏิกิริยาที่เหมาะสมกับแต่ละปฏิกิริยาได้
    • ตัวเลือกรองพื้นแบบยืดหยุ่น
    • การใช้ท่อหลายท่อและขั้นตอนการปิเปตทำให้ปฏิกิริยาเสี่ยงต่อการปนเปื้อนดีเอ็นเอมากขึ้น
      เสียเวลา
    • ต้องการการเพิ่มประสิทธิภาพมากกว่าขั้นตอนเดียว

    การเลือก RNA ทั้งหมดเทียบกับ mRNA

    เมื่อออกแบบการทดสอบ RT-qPCR สิ่งสำคัญคือต้องตัดสินใจว่าจะใช้ RNA ทั้งหมดหรือ mRNA ที่บริสุทธิ์เป็นเทมเพลตสำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับ mRNA อาจให้ความไวเพิ่มขึ้นเล็กน้อย แต่มักใช้ RNA ทั้งหมด เนื่องจากมีข้อได้เปรียบที่สำคัญกว่า mRNA เป็นวัสดุตั้งต้น ขั้นแรก ต้องมีขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์น้อยลง ซึ่งช่วยให้มั่นใจถึงการกู้คืนในเชิงปริมาณมากขึ้นของเทมเพลต และความสามารถที่ดีขึ้นในการทำให้ผลลัพธ์เป็นปกติตามจำนวนเซลล์เริ่มต้น ประการที่สอง โดยการหลีกเลี่ยงขั้นตอนการเสริมสมรรถนะ mRNA ใดๆ เราหลีกเลี่ยงความเป็นไปได้ของผลลัพธ์ที่บิดเบือนเนื่องจากผลตอบแทนการฟื้นตัวที่แตกต่างกันสำหรับ mRNA ที่แตกต่างกัน เมื่อนำมารวมกันแล้ว RNA ทั้งหมดมีความเหมาะสมที่จะใช้ในกรณีส่วนใหญ่ เนื่องจากการหาปริมาณสัมพัทธ์ของเป้าหมายมีความสำคัญต่อการใช้งานส่วนใหญ่มากกว่าความไวสัมบูรณ์ของการตรวจจับ 1

    สีรองพื้นสำหรับการถอดความแบบย้อนกลับ

    สามวิธีที่แตกต่างกันสามารถนำมาใช้สำหรับการเตรียมปฏิกิริยา cDNA ในการสอบวิเคราะห์สองขั้นตอน: ไพรเมอร์ oligo(dT) ไพรเมอร์สุ่ม หรือไพรเมอร์เฉพาะลำดับ (รูปที่ 2 ตารางที่ 2). มักใช้ส่วนผสมของ oligo(dT)s และไพรเมอร์แบบสุ่ม ไพรเมอร์เหล่านี้จะหลอมเข้ากับเส้นใย mRNA แม่แบบและให้เอนไซม์ทรานสคริปเทสแบบย้อนกลับเป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการสังเคราะห์

    รูปที่ 2 วิธีการเตรียมอาหารที่แตกต่างกันสี่วิธีสำหรับขั้นตอนการถอดความแบบย้อนกลับในการสอบวิเคราะห์แบบสองขั้นตอนของ RT-qPCR

    ตารางที่ 2 ข้อพิจารณาไพรเมอร์สำหรับขั้นตอนการสังเคราะห์ cDNA ของ RT-qPCR การรวมไพรเมอร์แบบสุ่มและไพรเมอร์ oligo(dT) ที่ยึดเข้าด้วยกันช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการถอดรหัสย้อนกลับและความไวของ qPCR

    • การสร้าง cDNA แบบเต็มความยาวจาก mRNA . แบบโพลี (A)-tailed
    • ใช้ได้ดีถ้าวัสดุเริ่มต้นมีน้อย
    • Anchor ช่วยให้แน่ใจว่าไพรเมอร์ oligo(dT) จับที่ปลาย 5′ ของหาง poly(A) ของ mRNA
    • ขยายยีนด้วยหางโพลี (A) เท่านั้น
    • cDNA ที่ถูกตัดทอนจากตำแหน่งรองพื้นภายใน poly(A)*2
    • อคติต่อปลาย 3′*
    • หลอมรวม RNA ทั้งหมด (tRNA, rRNA และ mRNA)
    • เหมาะสำหรับใช้สำหรับการถอดเสียงที่มีโครงสร้างรองที่สำคัญ หรือหากมีวัสดุเริ่มต้นเพียงเล็กน้อย
    • ผลผลิต cDNA สูง
    • cDNA ถูกสร้างขึ้นจาก RNA ทั้งหมดซึ่งไม่เป็นที่ต้องการเสมอไปและสามารถเจือจางสัญญาณ mRNA ได้
    • cDNA . ที่ถูกตัดทอน
    • พูล cDNA เฉพาะ
    • เพิ่มความไว
    • ใช้ไพรเมอร์ qPCR ย้อนกลับ
    • การสังเคราะห์นั้น จำกัด อยู่ที่ยีนที่น่าสนใจเพียงตัวเดียว

    เอนไซม์ทรานสคริปเทสย้อนกลับ

    Reverse Transcriptase เป็นเอนไซม์ที่สร้าง DNA จาก RNA เอ็นไซม์บางตัวมีกิจกรรม RNAse ในการทำให้สาย RNA เสื่อมโทรมในไฮบริด RNA-DNA หลังจากการถอดรหัส หากเอนไซม์ไม่มีกิจกรรม RNase อาจมีการเพิ่ม RNaseH เพื่อประสิทธิภาพของ qPCR ที่ดีขึ้น เอนไซม์ที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase และ Avian myeloblastosis virus reverse transcriptase สำหรับ RT-qPCR เหมาะที่จะเลือก reverse transcriptase ที่มีความเสถียรทางความร้อนสูง เนื่องจากช่วยให้ทำการสังเคราะห์ cDNA ได้ในอุณหภูมิที่สูงขึ้น ทำให้มั่นใจได้ว่าการถอดรหัส RNA ที่ประสบความสำเร็จด้วยโครงสร้างทุติยภูมิในระดับสูง ในขณะที่ยังคงกิจกรรมทั้งหมดไว้ตลอดปฏิกิริยา ให้ผลผลิต cDNA สูงขึ้น

    กิจกรรม RNase H ของ Reverse Transcriptase

    กิจกรรมของ RNase H ย่อยสลาย RNA จาก RNA-DNA ดูเพล็กซ์เพื่อให้สามารถสังเคราะห์ DNA ที่มีเกลียวคู่ได้อย่างมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม ด้วยเทมเพลต mRNA แบบยาว RNA อาจเสื่อมสภาพก่อนเวลาอันควร ส่งผลให้ cDNA ถูกตัดทอน ดังนั้นจึงเป็นประโยชน์โดยทั่วไปที่จะลดกิจกรรม RNase H เมื่อมุ่งหมายที่จะสร้างสำเนายาวสำหรับการโคลน cDNA ในทางตรงกันข้าม reverse transcriptases ที่มีกิจกรรม RNase H ที่แท้จริงมักได้รับการสนับสนุนในแอปพลิเคชัน qPCR เนื่องจากช่วยเพิ่มการละลายของ RNA-DNA duplex ในระหว่างรอบแรกของ PCR (รูปที่ 3).

    รูปที่ 3 กิจกรรม RNase H ของทรานสคริปต์แบบย้อนกลับ ใน qPCR ใช้ reverse transcriptase ที่มีกิจกรรม RNAse


    วัสดุและวิธีการ

    การค้นหา PubMed ดำเนินการโดยใช้ข้อความค้นหา 'ChIP-seq', 'ChIP-qPCR' และ 'Chromatin Immunoprecipitation' และสิ่งพิมพ์ได้รับการคัดกรองด้วยตนเองสำหรับการทดลอง ChIP-qPCR ไพรเมอร์ ChIP-qPCR ถูกรวมไว้เมื่อโปรโตคอลการทดลองและคำอธิบายไพรเมอร์ไม่คลุมเครือ และการศึกษาแสดงการเสริมสมรรถนะ qPCR เหนือการควบคุมที่ถูกต้องอย่างน้อย 5 เท่า ชื่อยีนได้รับการตรวจสอบด้วยฐานข้อมูล NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) สำหรับการตั้งชื่อที่ถูกต้อง ในกรณีที่มีการใช้ชื่อยีนหรือนามแฝงแบบเก่า ชื่อยีนจะถูกแทนที่ด้วยชื่อที่ถูกต้อง และมีการจดบันทึกในรายการฐานข้อมูลที่ระบุชื่อยีนดั้งเดิมที่ผู้เขียนใช้ นอกจากนี้ ได้มีการเพิ่มชื่อยีนที่สมบูรณ์ ('คำอธิบาย') ควบคู่ไปกับแอนติบอดีที่ใช้ สปีชีส์ และสายเซลล์หรือเนื้อเยื่อที่ใช้ในการทดลอง หากผู้เขียนรายงานการเสริมสมรรถนะเฉพาะเมื่อเซลล์หรือสัตว์ที่ไม่ใช่ชนิดพันธุ์ป่า (เช่น บำบัด กระตุ้น ยีนล้มลง) เราจะระบุเงื่อนไขในหมายเหตุของรายการฐานข้อมูลที่เกี่ยวข้อง รวม PubMed ID และแสดงเป็นลิงก์ที่คลิกได้โดยตรงในอินเทอร์เฟซผู้ใช้ที่เปิดหน้าต่างเบราว์เซอร์ใหม่ซึ่งนำไปสู่สิ่งพิมพ์ต้นฉบับบนเว็บไซต์ NCBI อุณหภูมิหลอมเหลว (NSNS) คำนวณด้วย OIigoCalc ( 23) สมมติว่าไพรเมอร์ 50 nM และเกลือ 50 mM (Na + ) รายการทั้งหมดได้รับการตรวจสอบซ้ำโดยนักวิจัยอิสระสองคน


    วิธีการ

    สภาพการเจริญเติบโตของพืชตลอดจนวิธีการทางอณูชีววิทยาที่ใช้สำหรับการสร้างข้อมูลที่ใช้ในการศึกษานี้ได้อธิบายไว้ใน [3] ลักษณะของฐานข้อมูลทั่วไปได้อธิบายไว้ใน [9, 21] FST ทั้งหมดที่สร้างใน GABI-Kat นั้นเปิดเผยต่อสาธารณะผ่าน ENA/GenBank และ SimpleSearch

    คำศัพท์

    เราใช้คำว่า “แอมพลิคอน” เพื่ออ้างถึงชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ก่อตัวขึ้นทางร่างกายหลังจาก PCR และสามารถจัดลำดับได้ คำว่า “แอมพลิเมอร์” หมายถึงโครงสร้างทางทฤษฎี ซึ่งประกอบด้วยไพรเมอร์คู่ (ตั้งอยู่บนเส้นตรงข้ามและมีปลาย 3′- หันเข้าหากัน) และลำดับต้นทางที่สอดคล้องกัน ตัวอย่างเช่น เราสามารถสร้างแอมพลิเมอร์หลายตัวเพื่อระบุตำแหน่งการแทรก T-DNA ที่คาดการณ์ไว้ แต่เฉพาะคู่ไพรเมอร์ที่อิงตามการคาดการณ์ที่ถูกต้องและ/หรือสมมติฐานเกี่ยวกับการกำหนดค่าของการหลอมรวมของ T-DNA กับจีโนม DNA ของอัลลีลการแทรกที่ศึกษา จะช่วยให้สามารถสร้างแอมพลิคอนได้สำเร็จ

    การจัดหมวดหมู่ของไซต์แทรก

    การประเมิน FST เพื่อทำนายไซต์การแทรกขึ้นอยู่กับการเข้าชม (ความคล้ายคลึงของลำดับแบบถ่วงน้ำหนัก) ที่สร้างโดย BLAST [8] และโดยการใช้ลำดับจีโนม TAIRv10 และชุดข้อมูลคำอธิบายประกอบ [22] เริ่มแรก เก็บเฉพาะการโจมตี BLAST ที่ดีที่สุดสำหรับแต่ละ FST เท่านั้น [18] เพื่อจัดการกับการคาดการณ์ที่คล้ายคลึงกันและ "FST แบบผสม" ที่มีส่วนลำดับที่ได้มาจากไซต์แทรกอิสระอย่างน้อยสองแห่ง เราได้เปลี่ยนฐานข้อมูล GABI-Kat ภายในเพื่ออนุญาตให้จัดเก็บการคาดการณ์ไซต์แทรกหลายรายการสำหรับ FST แต่ละรายการ การคาดการณ์ใหม่ได้รับการจัดประเภทตามค่า e-value ของการโจมตี BLAST หมวดหมู่ 0 ถูกกำหนดให้กับการคาดการณ์ที่อนุมานจาก BLAST-hit ที่ดีที่สุด ตราบใดที่ค่าอิเล็กทรอนิกส์ต่ำกว่า (ดีกว่า) 1e-3 Hit ที่ “ดีที่สุด” ที่มีค่า e-value ที่มากกว่า (สำคัญน้อยกว่า) ถูกกำหนดให้กับหมวดหมู่ 2 มีได้เพียงหนึ่ง Hit ที่ดีที่สุดสำหรับแต่ละ FST และ Hit นี้จะถูกเลือกโดยใช้ Hit อันดับต้น ๆ ของรายการในเอาต์พุต BLAST ซึ่งส่งผลให้เกิดการคาดคะเนของหมวดหมู่ 0 โปรดทราบว่าการตีที่ดีที่สุดอาจจบลงที่ตำแหน่งบนสุดโดยบังเอิญหากภูมิภาค FST ที่เกี่ยวข้องเข้าถึงส่วนต่างๆ ของจีโนมด้วยค่า e-value และคะแนนที่เหมือนกัน หากมี Hit เพิ่มเติมจาก FST เดียวกันโดยมีค่า e-value ต่ำกว่า 1e-3 การคาดคะเนที่อนุมานได้จะถูกจัดประเภทเป็นหมวดหมู่ 1 หากภูมิภาคต่างๆ ของ FST เดียวกันมี Hit ในส่วนต่างๆ ของจีโนม พื้นที่เหล่านี้จะได้รับการจัดการเป็นรายบุคคลเพื่อให้ครอบคลุม กรณีของการแทรกหลายครั้งถูกอนุมานจาก FST คอมโพสิตเดียว จากแต่ละภูมิภาคเหล่านี้ (และนอกเหนือจากการคาดคะเนหมวดหมู่ 0 เดียวสำหรับ FST ที่สมบูรณ์) จะมีการใช้ Hit สูงสุด 3 รายการเพื่อสร้างการคาดการณ์เกี่ยวกับการโจมตี BLAST หมวด 1 เพิ่มเติมจะถูกละเว้น ข้อจำกัดนี้จำเป็นในการลดปริมาณงานในห้องปฏิบัติการที่เกิดจากภูมิภาค FST ที่ไม่เพียงแต่ทำให้เกิดความเหลื่อมล้ำแต่ซ้ำซาก สำหรับการกรองเพิ่มเติม ไซต์การแทรกที่อนุมาน (i) ต้องมีระยะห่าง 1000 bp ซึ่งกันและกันจึงจะถือเป็นการคาดคะเนการแทรกแบบใหม่ หากไซต์เหล่านั้นอยู่ใกล้กันมากขึ้น ไซต์ดังกล่าวจะถูกกำหนดให้เป็นการคาดคะเนเดียวกัน และ (ii) จะถูกละทิ้งหากความแตกต่างของค่า e-value กับ Hit ที่ดีที่สุดสำหรับภูมิภาค FST หนึ่งแห่งนั้นมากกว่าปัจจัยของ 1e10 โดยทั่วไป การวิเคราะห์ที่ตามมาของเราจะพิจารณาเฉพาะการคาดคะเนของหมวดหมู่ 0 และ 1

    คำจำกัดความของกลุ่มพาราล็อก

    สำหรับการจัดการอย่างเป็นระบบของการคาดคะเนการแทรกที่กระทบถึงขอบเขตที่คล้ายคลึงกัน เราจัดกลุ่มพวกมันออกเป็นกลุ่มโดยใช้วิธีการจัดกลุ่มตามลำดับชั้นสำหรับการคาดคะเนทั้งหมดที่สร้างขึ้นสำหรับบรรทัด GABI-Kat ที่กำหนด (เห็นได้ชัดว่าดำเนินการนี้กับทุกบรรทัดแล้ว) เริ่มต้นด้วยกลุ่มที่มีการคาดการณ์แต่ละกลุ่ม แต่ละกลุ่มจะรวมกันหากเงื่อนไขใดเงื่อนไขหนึ่งต่อไปนี้เป็นจริงสำหรับชุดค่าผสมที่เป็นไปได้ของการทำนายระหว่างสองกลุ่มที่แตกต่างกัน: (i) การทำนายสำหรับ loci ที่ต่างกันขึ้นอยู่กับส่วนเดียวกันของลำดับ FST ( โดยมีการเหลื่อมกันน้อยที่สุด 30 bp) (ii) ลำดับ 400 bp ถัดจากไซต์การแทรกที่คาดการณ์จะมีเอกลักษณ์มากกว่า 79% สำหรับสมาชิกทุกคนในกลุ่ม การจัดกลุ่มหยุดลงเมื่อไม่สามารถรวมกลุ่มเพิ่มเติมได้ กลุ่มทั้งหมดที่มีการคาดคะเนอย่างน้อยสองรายการสำหรับการแทรกที่แตกต่างกัน (เช่น พวกเขาต้องแสดงระยะทางมากกว่า 1,000 bp) ถูกเก็บไว้

    การออกแบบสีรองพื้นเพื่อหลีกเลี่ยงจุดหลอมเหลวหลายจุดสำหรับ 3′-end

    ไพรเมอร์ถือเป็น "เอกลักษณ์" หากปลาย 12 bp-3′-end มีเพียงหนึ่งครั้งในลำดับจีโนม จำนวนครั้งที่เกิดขึ้นของลำดับ 12 bp ภายในจีโนมได้รับการคำนวณล่วงหน้าและจัดเก็บไว้ในฐานข้อมูลของเรา โดยใช้ดัชนีนี้ จำนวนตำแหน่งที่ตรงกันที่เป็นไปได้สำหรับไพรเมอร์แต่ละตัวสามารถระบุได้อย่างง่ายดายโดยการสืบค้นฐานข้อมูลที่ง่ายและรวดเร็ว

    เราได้พัฒนาวิธีการออกแบบไพรเมอร์สองวิธี หนึ่งอิงจากเครื่องมือออกแบบไพรเมอร์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย Primer3 [23] พร้อมการกรองเพิ่มเติม อีกส่วนหนึ่งใช้อัลกอริธึมที่พัฒนาขึ้นเองซึ่งค้นหาความไม่ตรงกันภายในการจัดแนวหลายโซนของโซนเป้าหมายที่เกี่ยวข้องกับลำดับ สำหรับการยืนยันภายในที่ GABI-Kat ไพรเมอร์สำหรับการแทรกที่ไม่อยู่ในขอบเขตที่คล้ายคลึงกันได้รับการออกแบบโดยใช้วิธีแรก ในขณะที่วิธีที่สองใช้กับการแทรกในบริเวณที่เป็นพาราโลกัส เครื่องมือออกแบบไพรเมอร์สาธารณะใช้ได้กับทุกตำแหน่งภายใน ก. ธาเลียนา จีโนมไม่ได้ขึ้นอยู่กับ (คาดการณ์) ไซต์แทรก GABI-Kat และเลือกวิธีที่ดีที่สุดสำหรับตำแหน่งของจีโนมที่กล่าวถึงโดยอัตโนมัติ เพื่อตัดสินใจว่าวิธีใดเหมาะสมที่สุดสำหรับโซนเป้าหมายที่เป็นปัญหา จะใช้ BLAST ของลำดับของโซนนี้ (นั่นคือ ลำดับที่อยู่รอบๆ ตำแหน่งเป้าหมายที่จำกัดโดยค่าที่ตั้งไว้สำหรับระยะทางไปยังตำแหน่งเป้าหมาย) NS ก. ธาเลียนา ลำดับจีโนมที่มีจุดตัดค่า e-value ที่ 1e-5 ซึ่งสูงพอที่จะตรวจจับการชนที่ 24 bp หากมีส่วนของซีเควนซ์ภายในโซนเป้าหมายที่ไม่มีการตีอื่นๆ ใน ก. ธาเลียนา จีโนมและมีความยาวอย่างน้อย 100 bp ปัญหาเกี่ยวกับภูมิภาคที่คล้ายคลึงกันไม่ควรเกิดขึ้นและใช้วิธีการแบบ Primer3 หากไม่สามารถกำหนดส่วนของลำดับเฉพาะดังกล่าวในลำดับโซนเป้าหมายได้ จะเลือกวิธีการออกแบบพาราล็อกไพรเมอร์

    วิธีการตาม Primer3

    เพื่อค้นหาตัวเลือกไพรเมอร์ภายในโซนเป้าหมาย ส่วนของโซนเป้าหมายที่ไม่มีขอบเขตที่คล้ายคลึงกันเพิ่มเติมในจีโนม (ระบุในระหว่างการตัดสินใจว่าควรใช้วิธีการออกแบบไพรเมอร์ใด) ก่อน ส่วนนี้ของลำดับโซนเป้าหมายแบ่งออกเป็นหน้าต่างที่ซ้อนทับกันอย่างน้อย 80 bp และสำหรับหน้าต่างแต่ละบานเหล่านี้ Primer3 ออกแบบโดย Primer3 Windows ทับซ้อนกับ 30 bp เพื่อให้แน่ใจว่าไพรเมอร์ที่เป็นไปได้ที่ปลายหน้าต่างได้รับการพิจารณาเช่นกัน เพื่อเพิ่มจำนวนไพรเมอร์ที่เป็นไปได้เพิ่มเติม อุณหภูมิหลอมเหลวที่เลือกจะเปลี่ยนแปลงในขั้นตอนที่ 0.4°C เป็นสูงสุด 1.2°C ต่ำกว่าหรือสูงกว่าอุณหภูมิหลอมเหลวที่กำหนดไว้ ไพรเมอร์ทั้งหมดได้รับการตรวจสอบความเป็นเอกลักษณ์ของปลาย 3′-end ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ทันทีที่ตรวจพบไพรเมอร์ที่มีเพียง 12 bp-hit ภายในจีโนม การออกแบบไพรเมอร์ก็เสร็จสิ้นลงได้สำเร็จ หากการค้นหาเริ่มต้นภายในส่วนที่ไม่ซ้ำของโซนเป้าหมายไม่ได้ผลลัพธ์ ขั้นตอนจะถูกทำซ้ำภายในลำดับโซนเป้าหมายทั้งหมดด้วยขนาดหน้าต่างอย่างน้อย 110 bp และอุณหภูมิหลอมเหลวสลับกันในลักษณะเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้น หากไม่พบไพรเมอร์ที่ไม่ซ้ำใคร ไพรเมอร์ที่มี 12 bp-hits น้อยที่สุดในบรรดาไพรเมอร์ทั้งหมดที่ออกแบบมาในระหว่างกระบวนการทั้งหมดจะถือเป็นไพรเมอร์ที่ดีที่สุดสำหรับโซนเป้าหมายนี้

    วิธีพาราล็อกไพรเมอร์

    ในโซนเป้าหมายที่มีขอบเขตที่คล้ายคลึงกันตลอดลำดับของพวกมันที่ใดที่หนึ่งในจีโนม วิธีการที่ใช้ Primer3 มักจะไม่นำไปสู่ผลลัพธ์ที่น่าพอใจ ขั้นแรก อัลกอริธึมของเราจะระบุขอบเขตที่เป็นไปได้ทั้งหมดภายในจีโนมโดย BLAST เริ่มต้นที่มีการตัดค่า e-value ที่ 1e-5 และความยาวขั้นต่ำที่ต้องการคือ 50 bp การตีทั้งหมดจะถูกยืดออกเพื่อให้พอดีกับความยาวของโซนเป้าหมาย และคำนวณการจัดตำแหน่งหลายจุดโดยใช้ ClustalW [24] เพื่อลดรันไทม์ของ ClustalW จะใช้แนวทางหน้าต่างบานเลื่อนที่มีหน้าต่างซ้อนทับกันซึ่งมีขนาดประมาณ 220 bp (และซ้อนทับกัน 30 bp) เพื่อคำนวณการจัดตำแหน่งหลายตำแหน่ง ในการจัดเรียงหลายตำแหน่งเหล่านี้ อัลกอริธึมจะค้นหาตำแหน่งที่มีจำนวนไม่ตรงกันสูงสุดกับลำดับของโซนเป้าหมาย ตำแหน่งนี้ถูกกำหนดให้เป็น 3′-end ของไพรเมอร์ที่เป็นไปได้และถูกยืดให้ตรงกับอุณหภูมิหลอมเหลวที่ต้องการ หลังจากนั้น ผู้สมัครไพรเมอร์จะได้รับการตรวจสอบหา GC-clamp (1–3 G/C ใน 5 นิวคลีโอไทด์สุดท้าย) การทำซ้ำของเบส (นิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกันน้อยกว่า 5 ตัวติดต่อกัน) ปริมาณ GC (ระหว่าง 40 ถึง 60%) และ โครงสร้างทุติยภูมิ (นิวคลีโอไทด์ 5 ตัวสุดท้ายไม่ควรปรากฏเป็นส่วนประกอบย้อนกลับในไพรเมอร์) ยิ่งมีเงื่อนไขเหล่านี้มาก ไพรเมอร์ก็จะยิ่งดีขึ้น – ไพรเมอร์ที่ไม่ตรงตามเกณฑ์เหล่านี้จะถูกละทิ้ง (ดูรูปที่ 3) อุณหภูมิการหลอมของไพรเมอร์คำนวณโดยใช้สูตรเดียวกับที่ใช้ใน Primer3 (ตาม [25]) เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่เทียบเท่ากับวิธีการที่ใช้ Primer3:

    มีการสร้างผู้สมัครจำนวนมากและตรวจสอบความเป็นเอกลักษณ์เพิ่มเติมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หากพบไพรเมอร์เฉพาะตัวจะถูกส่งกลับตามผลลัพธ์ หากไม่สามารถทำได้ ไพรเมอร์ที่มีการจับคู่น้อยที่สุดในบรรดาไพรเมอร์ที่ตรวจสอบทั้งหมดจะถูกส่งคืน


    PrimerCE: การออกแบบไพรเมอร์สำหรับการโคลนและการแสดงออกของยีน

    โปรแกรมออกแบบไพรเมอร์จำนวนหนึ่งได้รับการพัฒนาสำหรับการใช้งานที่หลากหลาย อย่างไรก็ตาม ไม่มีโปรแกรมใดที่สามารถใช้ออกแบบไพรเมอร์สำหรับการโคลนยีนที่มุ่งเป้าไปที่การแสดงโปรตีน เรารายงานการออกแบบ PrimerCE ซึ่งสามารถใช้เพื่อครอบคลุมกระบวนการทั้งหมดของการโคลนและการแสดงออกของยีน คุณสมบัติหลักของ PrimerCE รวมถึงการตรวจสอบลำดับการรู้จำเอ็นไซม์จำกัด การตรวจสอบเฟรมการอ่านแบบเปิด หยุดการตรวจสอบโคดอน การปรับฐาน การเพิ่มประสิทธิภาพไพรเมอร์ การประกอบลำดับ และการวิเคราะห์โปรตีน นอกจากนี้ โปรแกรมยังสามารถปรับเปลี่ยนตามความต้องการที่แตกต่างกันของผู้ใช้ เช่น ลำดับเวกเตอร์ใหม่และลำดับการรู้จำเอ็นไซม์จำกัดสามารถรวมเข้าด้วยกันได้ ด้วยการใช้ PrimerCE คุณสามารถออกแบบไพรเมอร์ได้ภายในไม่กี่นาที โปรแกรมนี้ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีประสิทธิภาพในการออกแบบไพรเมอร์ในการทดลองโคลนและการแสดงออกของยีนที่มีปริมาณงานสูง ซอฟต์แวร์นี้มีให้ใช้ฟรีที่ http://tch.hebau.edu.cn/shengm/download/down.html

    นี่คือตัวอย่างเนื้อหาการสมัครสมาชิก เข้าถึงผ่านสถาบันของคุณ


    เพรียวลมการออกแบบไพรเมอร์?

    Hallo Community ขณะนี้ฉันมีงานในการออกแบบไพรเมอร์สำหรับวิธีการวินิจฉัย ดังนั้นข้อกำหนดจึงยากขึ้นเล็กน้อยเมื่อเทียบกับอย่างอื่น:

    ต้องขนาบข้าง Pointmutation (duh)

    สร้างผลิตภัณฑ์ PCR ประมาณ. 200-600 bp (การจัดลำดับแซงเจอร์)

    จำเป็นต้องมีความเฉพาะเจาะจงสูง (duh) -> ปัญหาน่าจะเป็นว่าลำดับขนาบข้างนั้นได้รับการอนุรักษ์ไว้มากหรือน้อยในยีนและโครโมโซมอื่น ๆ ฉันทำงานที่ Canis fam (สุนัข) และเนื่องจากเป็นสิ่งที่วินิจฉัย ฉันต้องการกำจัดโอกาสที่การปนเปื้อนของมนุษย์อาจทำให้เกิดผลิตภัณฑ์ PCR ปลอม

    ปฏิกิริยา PCR จะต้องแข็งแกร่งมาก! ดังนั้นจึงไม่มี (หรือน้อยที่สุด) โครงสร้างทุติยภูมิ การหลอมด้วยตนเอง หรือการเกิดไพรเมอร์ไดเมอร์!

    ตอนนี้ฉันเปลี่ยนเวิร์กโฟลว์สองสามครั้งโดยหวังว่าคราวนี้ฉันจะหาวิธีที่ดีที่สุด แต่ก็ไม่เป็นเช่นนั้น และฉันก็ลองใช้ซอฟต์แวร์อื่นด้วย

    เวิร์กโฟลว์ล่าสุดของฉันมีลักษณะดังนี้: -ฉันโหลด gene.fasta ของฉันลงในตัวออกแบบไพรเมอร์ NCBI (Primer Blast) -ฉันเลือกขนาดผลิตภัณฑ์ จีโนมที่จะต่อต้าน (Canis fam. และ Homo sapiens) ขนาดไพรเมอร์ ฯลฯ - กด ระเบิดและได้ผลลัพธ์ -Now I have a couple of primer pairs that I then check for unwanted binding (all of them look quite good)

    Here comes the unoptimized, inefficient part: -copy them either into an excel sheet (manually, cause I see no option to export, save or otherwise output the data) including some helpful info (length, Tm etc), or directly in OligoAnalyzer -I check for secondary structures and self annealing (bad) and mark the good ones -Then I try the different combinations of the „good“ primers and check for primer dimers.

    As you can see this is not very elegant and a lot of work and in the end I’m left with 1, maybe 2 suitable primer pairs.

    I hope there is an alternative and a better way to do this all, and that you may help me and point me in the right direction.


    The Li Lab

    MethPrimer is a program for designing bisulfite-conversion-based Methylation PCR Primers. Currently, it can design primers for two types of bisulfite PCR: 1) Methylation-Specific PCR (MSP) and 2) Bisulfite-Sequencing PCR (BSP) or Bisulfite-Restriction PCR. MethPrimer can also predict CpG islands in DNA sequences

    Input Sequence: A DNA sequences in any format. No editing is required before input.>

    เอาท์พุต: MethPrimer returns results in both text and graphic view including results of primer picking and CpG island prediction.

    How to cite MethPrimer: Li LC and Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002 Nov18(11):1427-31. PMID: 12424112.

    MethPrimer has been cited over 1900 times as of June 2019 according to Google Scholar. Click here to see who has used the MethPrimer program.

    Submit your paper to Journal of Biological Methods (ISSN 2326-9901) - an open access journal


    Detection of Macrophomina phaseolina, NS. pseudophaseolina และ M. euphorbiicola using the primer sets MpCalF/MpCalR, MsCalF/MsCalR and MeCalF/MeCalR, respectively. Lane M: DNA marker lanes 2 to 6: M. phaseolina (MP) isolates CMM-2748, CMM-3540, CMM-3615, CMM-4048 and CMM-4149, respectively lanes 7 to 11: NS. pseudophaseolina (MS) isolates CMM-4029, CMM-4131, CMM-4155, CMM-4161, CMM-4231, respectively lanes 12 to 16: M. euphorbiicola (ME) isolates CMM-2158, CMM-2718, CMM-4045, CMM-4134 and CMM-4145, respectively (PNG 938 kb)

    Detection of Macrophomina phaseolina, NS. pseudophaseolina และ M. euphorbiicola using the primer sets MpTefF/MpTefR, MsTefF/MsTefR and MeTefF/MeTefR, respectively. Lane M: DNA marker lanes 2 to 6: M. phaseolina (MP) isolates CMM-2748, CMM-3540, CMM-3615, CMM-4048 and CMM-4149, respectively lanes 7 to 11: NS. pseudophaseolina (MS) isolates CMM-4029, CMM-4131, CMM-4155, CMM-4161, CMM-4231, respectively lanes 12 to 16: M. euphorbiicola (ME) isolates CMM-2158, CMM-2718, CMM-4045, CMM-4134 and CMM-4145, respectively (PNG 454 kb)

    Evaluation of the specificity of the primer sets MpTefF/MpTefR, MsTefF/MsTefR and MeTefF/MeTefR in PCR assays using forty-two fungal isolates of the different genera (negative control). Lanes 1 to 42 Isolates in Table S3. Mp: M. phaseolina Ms.: M. pseudophoseolina Me: M. euphorbiicola (PNG 435 kb)


    ดูวิดีโอ: Primer Designing. Using NCBI Primer Blast. Tutorial 3a (สิงหาคม 2022).