ข้อมูล

การล้มลงของ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) - ทำอย่างไร?

การล้มลงของ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) - ทำอย่างไร?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันไม่ได้ทำงานในห้องแล็บเปียก และไม่รู้รายละเอียดทั้งหมดเกี่ยวกับเทคนิคการล้มลง
คำถามของฉันคือ:
lncRNA น็อคดาวน์ทำอย่างไร?
ตัวอย่างเช่น - คุณมี lncRNA นั่นคือ ทำงานในนิวเคลียส. เป็นไปได้อย่างไรที่จะทำน็อคดาวน์โดยใช้ iRNA if การรบกวนเกิดขึ้นเฉพาะในไซโตพลาสซึม?
ขออภัยหากมีความเข้าใจผิดเกี่ยวกับชีววิทยาในคำถามของฉัน


การล้มลงของ lncRNA ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมไม่ได้กระทำผ่าน RNAi แทนที่จะถ่ายโอน DNA oligos แอนติเซนซึ่งจับกับ RNA สิ่งนี้กระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ RNase H ซึ่งทำให้ดูเพล็กซ์ RNA-DNA เสื่อมโทรม มันทำให้ lncRNA เสื่อมลง

UPDATE: เพื่อเป็นข้อมูลอ้างอิง ฉันได้เรียนรู้เกี่ยวกับเรื่องนี้จากการสัมมนา และไม่ได้รับการจัดทำเป็นเอกสารที่ดีนัก แต่หลังจากค้นวรรณกรรม ฉันพบบทความนี้เพื่ออ้างอิง:

แม้ว่าเรา (รูปที่ 3A) และคนอื่นๆ (42, 49) ได้ใช้ siRNA เพื่อล้ม NEAT1 lncRNA และถึงแม้ว่าการล้มลงของ RNA นิวเคลียร์อย่างเคร่งครัดจะได้รับการอธิบายไว้อย่างดี (53, 54) เรายังคงกังวลว่าเพราะ NEAT1 ส่วนใหญ่เป็นนิวเคลียร์ RNA (55) อาจไม่ได้กำหนดเป้าหมายอย่างมีประสิทธิภาพโดยเครื่องจักร RNAi อย่างไรก็ตาม RNA นิวเคลียร์มีเป้าหมายอย่างเชี่ยวชาญโดยใช้ oligodeoxynucleotides เสริม antisense (AS) ที่รับสมัครกิจกรรมนิวเคลียร์ RNase H เพื่อลดระดับ RNA (56) ดังนั้นเราจึงใช้ AS oligodeoxynucleotides เสริมเพื่อลด NEAT1 lncRNA ในเซลล์ Jurkat ที่ติดเชื้อ HIV-1 NL4-3 (รูปที่ 4C, ซ้าย) วิธีการ AS ลด NEAT1 (รูปที่ 4C, ซ้าย) และเพิ่มการผลิต HIV-1 p24 (รูปที่ 4C, ขวา) ให้ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกับสิ่งเหล่านั้นจากการล้มลงที่อาศัย siRNA ของ NEAT1 (รูปที่ 4A และ B)


นิวเคลียร์ RNAi เกิดขึ้น... ตรวจสอบบทความเหล่านี้:

http://www.nature.com/nrg/journal/v14/n2/execsumm/nrg3355.html

http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2011/11/07/nar.gkr891.full

นอกจากนี้ยังมีหลักฐานว่า Ago2 ผูกกับ lncRNAs

อย่างไรก็ตาม คุณสามารถใช้เทคนิคอื่นๆ เพื่อลด lncRNAs เช่น ไรโบไซม์


นี่เป็นข้อขัดแย้ง แต่กลุ่มส่วนใหญ่ในสนามได้ข้อสรุปว่า RNAi ไม่ทำงานในนิวเคลียสแม้ว่าจะมี Ago อยู่ก็ตาม เมื่อ lncRNA ได้รับ KD กับ RNAi พวกมันมักจะแสดงว่ามีอยู่ทั้งในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม และคิดว่า KD จะเกิดขึ้นในไซโตพลาสซึม ไม่ใช่นิวเคลียส แน่นอนเช่นเคยในทางชีววิทยา เป็นไปได้ว่านิวเคลียร์ RNAi เกิดขึ้นในเซลล์บางประเภทหรือภายใต้เงื่อนไขพิเศษบางอย่าง Gapmer oligonucleotides ที่กระทำผ่าน RNAseH มักจะเป็นวิธีที่ยอดเยี่ยมในการ KD นิวเคลียร์ lncRNA แต่ฉันขอเสริมว่าคุณควรเตรียมพร้อมที่จะทดสอบว่า oligos ต่างกัน 6 ตัวหรือมากกว่านั้น เนื่องจากประสิทธิภาพนั้นคาดเดาไม่ได้ และตรงกันข้ามกับ RNAi ไม่มีอะไรดีเลย อัลกอริธึมที่ใช้ได้ทั่วไปสำหรับการออกแบบ antisense oligo


การล้มลงของ RNA CCAT2 ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาวจะยับยั้งการงอกขยายของเซลล์ การบุกรุก และเยื่อบุผิว‐Mesenchymal Transition ในเซลล์ Glioma

สังกัด: 1: แผนกควบคุมการติดเชื้อ โรงพยาบาลไท่เหอ มหาวิทยาลัยแพทยศาสตร์หูเป่ย ซื่อหยาน มณฑลหูเป่ย สาธารณรัฐประชาชนจีน 2: Department of Neurosurgery, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei Province, P.R. ประเทศจีน 3: ภาควิชา PET Center and Institute of Anesthesiology and Pain, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei Province, PR China

วันที่ตีพิมพ์: 5 เมษายน 2560 г.

บทความนี้เผยแพร่ทางออนไลน์เมื่อ 17 ноября 2016 г. เป็นบทความ Fast Track ที่มีชื่อเรื่องว่า "การล้มลงของ RNA CCAT2 ที่ไม่มีการเข้ารหัสเป็นเวลานาน ยับยั้งการเพิ่มจำนวนของเซลล์ การบุกรุก และ EMT ในเซลล์ glioma"

ก่อนหน้านี้: การวิจัยด้านเนื้องอกวิทยาที่ผสมผสานการออกแบบยาต้านมะเร็ง
การวิจัยด้านเนื้องอกวิทยาที่เน้นการรักษามะเร็งก่อนคลินิกและคลินิกเผยแพร่งานวิจัยที่มีคุณภาพสูงสุดที่ก่อให้เกิดความเข้าใจเกี่ยวกับมะเร็งในด้านชีววิทยาระดับโมเลกุล ชีววิทยาของเซลล์ ชีวเคมี ชีวฟิสิกส์ พันธุศาสตร์ ชีววิทยา ต่อมไร้ท่อวิทยา และภูมิคุ้มกันวิทยา ตลอดจนการศึกษาเกี่ยวกับกลไก ของการกระทำของสารก่อมะเร็งและสารบำบัด รายงานเกี่ยวกับการป้องกันมะเร็งและระบาดวิทยา และการทดลองทางคลินิกที่อธิบายสูตรการรักษาใหม่ที่มีประสิทธิภาพ

จากเล่มที่ 23 การวิจัยด้านเนื้องอกวิทยาที่มีการรักษามะเร็งก่อนคลินิกและทางคลินิกคือการเข้าถึงแบบเปิดภายใต้เงื่อนไขของใบอนุญาต Creative Commons CC BY-NC-ND


การล้มลงของ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) - ทำอย่างไร? - ชีววิทยา

คุณได้ร้องขอการแปลด้วยคอมพิวเตอร์สำหรับเนื้อหาที่เลือกจากฐานข้อมูลของเรา ฟังก์ชันนี้มีให้เพื่อความสะดวกของคุณเท่านั้นและไม่ได้มีวัตถุประสงค์เพื่อแทนที่การแปลโดยมนุษย์ ทั้ง BioOne หรือเจ้าของและผู้จัดพิมพ์เนื้อหาไม่ได้ทำ และพวกเขาปฏิเสธอย่างชัดแจ้ง การรับรองหรือการรับประกันใด ๆ โดยชัดแจ้งหรือโดยปริยายใด ๆ รวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียงการรับรองและการรับประกันเกี่ยวกับการทำงานของคุณสมบัติการแปลหรือความถูกต้องหรือความสมบูรณ์ของ การแปล

การแปลจะไม่ถูกเก็บไว้ในระบบของเรา การใช้คุณสมบัตินี้และการแปลของคุณอยู่ภายใต้ข้อจำกัดการใช้งานทั้งหมดที่มีอยู่ในข้อกำหนดและเงื่อนไขการใช้งานของเว็บไซต์ BioOne

การล้มลงของ RNA CCDC144NL-AS1 ที่ไม่มีการเข้ารหัสเป็นเวลานานจะลดทอนการโยกย้ายและการบุกรุกฟีโนไทป์ในเซลล์ stromal ของเยื่อบุโพรงมดลูกจาก endometriosis

Chen Zhang, 1 Wei Wu, 2 Honglan Zhu, 3 Xiaoming Yu, 4 Yinli Zhang, 5 Xue Ye, 1 Hongyan Cheng, 1 Ruiqiong Ma, 1 Heng Cui, 1 Jianjun Luo />https://orcid.org/0000- 0002-5550-9889 , 2,* Jing Guan, 4,* Xiaohong Chang />https://orcid.org/0000-002-9879-2266 1,**

1 1Center of Gynecologic Oncology, Peking University People's Hospital, Beijing, China
2 2Key Laboratory of RNA Biology, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China
3 3ภาควิชาสูติศาสตร์และนรีเวชวิทยา โรงพยาบาลประชาชนมหาวิทยาลัยปักกิ่ง ปักกิ่ง ประเทศจีน
4 4ศูนย์เวชศาสตร์การเจริญพันธุ์ โรงพยาบาลประชาชนมหาวิทยาลัยปักกิ่ง ปักกิ่ง ประเทศจีน
5 5ภาควิชาพยาธิวิทยา โรงพยาบาลประชาชนมหาวิทยาลัยปักกิ่ง ปักกิ่ง ประเทศจีน

* JL และ JG ร่วมกันกำกับงานนี้และควรได้รับการพิจารณาให้เป็นผู้เขียนร่วม
** การติดต่อ: ศูนย์เนื้องอกวิทยาทางนรีเวช, โรงพยาบาลประชาชนมหาวิทยาลัยปักกิ่ง, เลขที่ 11 Xizhimen South Str., เขต Xicheng, ปักกิ่ง 100044, จีน โทรศัพท์: +86-10-88324473 โทรสาร: +86-10-88324472 อีเมล: [email protected]

รวม PDF และ HTML เมื่อมี

บทความนี้ใช้ได้เฉพาะกับ สมาชิก.
ไม่สามารถขายแยกได้

Endometriosis (EM) เป็นโรคที่ลึกลับและซับซ้อนซึ่งพบว่ามีหลายปัจจัย การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่า RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสเป็นเวลานาน (lncRNAs) มีบทบาทสำคัญในการก่อโรคของ EM อย่างไรก็ตาม กลไกการทำงานและชีวภาพของ lncRNAs ใน EM ยังไม่ทราบ ที่นี่ เราทำการวิเคราะห์ microarray เพื่อเปรียบเทียบโปรไฟล์การแสดงออกของ lncRNA ของเนื้อเยื่อเยื่อบุโพรงมดลูกนอกมดลูก (EC) สี่คู่และเนื้อเยื่อเยื่อบุโพรงมดลูกยูโทปิก (EU) จากผู้ป่วยที่มี EM ของรังไข่ lncRNA นวนิยาย CCDC144NL-AS1 ถูกระบุว่าอาจใช้งานได้ การแสดงออกของ CCDC144NL-AS1 ถูกปรับเพิ่มในเนื้อเยื่อ EC เมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อของเยื่อบุโพรงมดลูกปกติของสหภาพยุโรปและ (NE) การแสดงออกในเนื้อเยื่อ EC สูงกว่าในเนื้อเยื่อของสหภาพยุโรปในผู้ป่วยที่มี EM 86.7% (26/30) แม้จะไม่มีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญตามระยะ American Fertility Society (rAFS) ที่แก้ไขแล้ว แต่ประมาณ 60% ของกรณี EM ระยะ VI ก็มีระดับ CCDC144NL-AS1 ที่สูงกว่า ซึ่งมากกว่าในกรณีระยะ II–III การแยกส่วนย่อยของเซลล์แสดงให้เห็นว่า CCDC144NL-AS1 ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในไซโทพลาสซึมและนิวเคลียสของ hEM15A ของสายเซลล์สตรอมในเยื่อบุโพรงมดลูกของมนุษย์ที่ได้รับ EM การสูญเสีย CCDC144NL-AS1 ยับยั้งการโยกย้ายและการบุกรุกของเซลล์ hEM15A แต่ไม่มีผลต่อการยึดเกาะ การเพิ่มจำนวน การตายของเซลล์ หรือวัฏจักรของเซลล์ การล้มลงของ CCDC144NL-AS1 ได้เปลี่ยนแปลงการกระจายของเส้นใยความเครียดของแอคตินใยแมงมุม (F-actin) อย่างมากเมื่อเปรียบเทียบกับการรักษากลุ่มควบคุมเชิงลบ การวิเคราะห์ Western blot พบว่าการล้มลงของ CCDC144NL-AS1 ได้ลดระดับโปรตีนของเส้นใยวิเมนตินและ MMP-9 แต่ไม่ใช่ N-cadherin หรือ β-คาเทนิน โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า CCDC144NL-AS1 อาจเกี่ยวข้องกับการเกิดโรคของ EM และเป็นเป้าหมายใหม่สำหรับ EM ของรังไข่

ระดับ lncRNA CCDC144NL-AS1 ที่เพิ่มขึ้นมีส่วนในการปรับโครงสร้างโครงร่างใหม่ การย้ายถิ่น และการบุกรุกในเซลล์สตรอมในเยื่อบุโพรงมดลูกผ่านการควบคุมไวเมนตินและ MMP-9

© The Author(s) 2018 จัดพิมพ์โดย Oxford University Press ในนามของ Society for the Study of Reproduction สงวนลิขสิทธิ์. สำหรับการอนุญาต โปรด e-mail: [email protected]

Chen Zhang, Wei Wu , Honglan Zhu , Xiaoming Yu , Yinli Zhang , Xue Ye , Hongyan Cheng , Ruiqiong Ma , Heng Cui , Jianjun Luo , Jing Guan และ Xiaohong Chang "การล้มลงของ RNA CCDCDC144NL-AS1 ที่ไม่มีการเข้ารหัสเป็นเวลานาน ลดทอนการอพยพและการบุกรุกฟีโนไทป์ ในเซลล์เยื่อบุโพรงมดลูกจาก endometriosis ," Biology of Reproduction 100(4), 939-949, (28 พฤศจิกายน 2018). https://doi.org/10.1093/biolre/ioy252

ได้รับ: 25 สิงหาคม 2018 ยอมรับ: 27 พฤศจิกายน 2018 เผยแพร่: 28 พฤศจิกายน 2018


ผลลัพธ์และการอภิปราย

NS แมลงหวี่ จีโนมเข้ารหัส lncRNAs จำนวนมากซึ่งแสดงการแสดงออกเฉพาะของเนื้อเยื่อและเพศ (16, 17) อย่างไรก็ตาม หน้าที่ของการถอดเสียงส่วนใหญ่ยังไม่ทราบ เราให้เหตุผลว่าการปราบปรามการถอดรหัส lncRNA โดย CRISPRi จะเอาชนะข้อจำกัดของวิธีการปัจจุบันที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ และตัดสินใจประเมินประสิทธิภาพของ dCas9 อีกครั้งในการปราบปรามการถอดรหัสจากตำแหน่ง lncRNA ภายนอกใน แมลงหวี่ เซลล์. ระบบ CRISPR/Cas9 ถูกใช้อย่างกว้างขวางสำหรับการแก้ไขยีนใน แมลงหวี่ ( 11, 13–14, 18–26). อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการใช้ CRISPRi จนถึงวันที่ใน แมลงหวี่.

เพื่อนำ CRISPRi ไปใช้ใน แมลงหวี่ เซลล์ ขั้นแรก เราสร้างเวกเตอร์การถ่ายทรานส์เฟกชันเดียวที่ช่วยให้สามารถแสดงออกร่วมกันของโปรตีน Cas9 และ sgRNA ที่กลายพันธุ์ได้ คล้ายกับที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 14) กลยุทธ์นี้ขจัดความแปรปรวนระหว่างการทดลองที่เกิดขึ้นจากการทรานส์เฟกชันของพลาสมิดสองตัว เวกเตอร์การทรานส์เฟกชัน pGTL-1 (รูปที่ 1B) ที่ได้มาจาก multicistronic vector pAc5-STABLE2-neo ( 12) มียีน Bla R ซึ่งช่วยให้สามารถเลือกเซลล์ที่ทรานส์เฟกได้อย่างมีประสิทธิภาพ และลดเวลาในการสร้างสายพันธุ์ของเซลล์ที่เสถียร (27 ). นอกจากนี้ การมี GFP ยังช่วยให้ตรวจสอบเซลล์ที่แปลงสภาพได้ง่าย ยีน Cas9 ที่ปรับให้เหมาะสมกับโคดอนของมนุษย์ซึ่งไม่มีกิจกรรมของนิวคลีเอส (dCas9) ขนาบข้างด้วยลำดับ NLS และติดแท็กด้วย FLAG epitope ที่ปลาย N ถูกแสดงออกภายใต้ Actin5C โปรโมเตอร์ เพื่อการแสดงออกที่เหมาะสมที่สุดของ RNA ไกด์ ตลับเทป U6:3–sgRNA ถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์ โปรโมเตอร์นี้มีกิจกรรมการแก้ไขยีน CRISPR/Cas9-mediated ที่สูงขึ้นใน แมลงหวี่เมื่อเทียบกับโปรโมเตอร์ U6:2 ที่ใช้กันทั่วไป ( 13)

ในฐานะที่เป็นยีนของผู้สมัคร เราเลือก roX ( R NA o n X โครโมโซม) ซึ่งเข้ารหัส lncRNAs ที่เกี่ยวข้องกับการชดเชยขนาดยาใน แมลงหวี่ ผู้ชาย ( 28). เฉพาะผู้ชาย roX อาร์เอ็นเอ roX1 และ roX2สร้างรูปแบบที่ซับซ้อนด้วยโปรตีน MSL ( m ale- เฉพาะเจาะจง l ethal) และอำนวยความสะดวกในการกำหนดเป้าหมายของคอมเพล็กซ์บนโครโมโซม X ซึ่งจำเป็นสำหรับการกระตุ้น hyperactivation 2 เท่าของยีน X-linked ในเพศชาย การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมแสดงให้เห็นว่า roX1 roX2 มนุษย์กลายพันธุ์สองครั้งนั้นเป็นตัวผู้ถึงตายซึ่งได้รับการช่วยเหลือจากทั้งสอง roX1 หรือ roX2 cDNA บ่งบอกถึงการทำงานซ้ำซ้อนในกิจกรรมของพวกเขา (29, 30) ปัจจุบัน อัลลีลที่ใช้ในการวิเคราะห์การสูญเสียฟังก์ชันคือการลบจีโนมของตำแหน่งหรือการจัดโครโมโซมที่ซับซ้อน นอกจากนี้ ไซต์เริ่มต้นการถอดความและเอกลักษณ์ขององค์ประกอบด้านกฎระเบียบยังไม่ชัดเจน เราออกแบบ sgRNA หลายตัวที่กำหนดเป้าหมายไปที่ roX1 และ roX2 โลคัส (รูปที่ 2A และ 3A) เพื่อตรวจสอบว่าการปิดเสียงที่มีประสิทธิภาพของ roX RNA ขึ้นอยู่กับความจำเพาะของสาระ เราเลือกลำดับที่เสริมให้กับทั้งสายแม่แบบ (rT) และสายที่ไม่ใช่แม่แบบ (rNT) และในบริเวณใกล้เคียงของไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสที่คาดการณ์ไว้ สำหรับการทดสอบ เราสร้างเส้นเซลล์ที่เสถียรโดยใช้ แมลงหวี่ โคลน 8 เซลล์ซึ่งแสดงออกทั้งสองอย่าง roX RNA (31).

NS roX1 การแสดงออกถูกปิดเสียงอย่างมีประสิทธิภาพโดย CRISPRi (NS) การแสดงแผนผังของ แมลงหวี่ roX1 โลคัสและตำแหน่งสัมพัทธ์ของ roX1-กำหนดเป้าหมาย sgRNAs มีสองไซต์เริ่มต้นการถอดความของ roX1 ยีน (ห่างกัน 270 nt) ซึ่งผลิตไอโซฟอร์ม RA และ RB (ฟลายเบส). sgRNAs ที่กำหนดเป้าหมายแม่แบบ RNA polymerase (rT, สีแดง) และสายที่ไม่ใช่แม่แบบ (rNT, สีม่วง) จะแสดงขึ้น บริเวณ intergenic 5′ ระหว่าง roX1 RA และยีนต้นน้ำ หยิน แสดงเป็นเส้นสีดำทึบ หัวลูกศรทำเครื่องหมายตำแหน่งของไพรเมอร์ที่ใช้ในการตรวจจับ roX1 RNA (สีดำ) และ roX1 RA isoform (สีน้ำเงิน) สำหรับการวิเคราะห์ RT-qPCR (NS) การวิเคราะห์ RT-PCR โดยใช้เซลล์โคลน 8 เซลล์แสดงว่ามี roX1 RA และ RB ใบรับรองผลการเรียน ไพรเมอร์จำเพาะสำหรับลำดับในบริเวณอินเตอร์เจนิก roX1 RA และ roX1 RB ไอโซฟอร์มถูกใช้สำหรับการขยาย PCR (C, D, E) การวัด RT-qPCR ความอุดมสมบูรณ์ของ roX1 และ roX2 การถอดเสียงในสายเซลล์ที่แสดงออกถึงมนุษย์ (C, D) หรือ แมลงหวี่ (E) โปรตีน dCas9 และ sgRNAs (ดังแสดงบนแกน x) ประกอบกับสายดีเอ็นเอ rT หรือ rNT ที่ภายใน roX1 โลคัส เส้นเซลล์ที่แสดง sgRNA เดี่ยว (C) หรือ RNA ตัวนำสองตัวพร้อมกัน (D, E) ถูกแสดง gRNAs rNT7, rT8 และ rT9 เป็นสื่อกลางในการทำให้ล้มลงอย่างมีประสิทธิภาพของ roX1 การถอดเสียงไม่ว่าจะคนเดียวหรือร่วมกับผู้อื่น อย่างไรก็ตาม การรวมกันของ rT1+rT3 และ rT4+rNT5 ซึ่งกำหนดเป้าหมายไปที่ roX1 RA ไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสมีผลเฉพาะคู่เมื่อมี dCas9 ของมนุษย์และ แมลงหวี่ dCas9 ตามลำดับ แกน y แสดงการเสริมสมรรถนะของ RNA ที่สัมพันธ์กับ rp49 การถอดเสียงและทำให้เป็นมาตรฐานไปยังเซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย pGTL-1 ที่มีลำดับที่ไม่ใช่การกำหนดเป้าหมาย (Ctrl) ข้อมูลแสดงจากการทำซ้ำทางชีวภาพสองครั้ง โดยแต่ละครั้งทำเป็นสามเท่า แถบข้อผิดพลาดระบุ SEM % แสดงการล้มลงเป็นเปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับ Ctrl

NS roX1 การแสดงออกจะถูกปิดเสียงอย่างมีประสิทธิภาพโดย CRISPRi (NS) การแสดงแผนผังของ แมลงหวี่ roX1 โลคัสและตำแหน่งสัมพัทธ์ของ roX1-กำหนดเป้าหมาย sgRNAs มีสองไซต์เริ่มต้นการถอดความของ roX1 ยีน (ห่างกัน 270 nt) ซึ่งผลิตไอโซฟอร์ม RA และ RB (ฟลายเบส). sgRNAs ที่กำหนดเป้าหมายแม่แบบ RNA polymerase (rT, สีแดง) และสายที่ไม่ใช่แม่แบบ (rNT, สีม่วง) จะแสดงขึ้น บริเวณ intergenic 5′ ระหว่าง roX1 RA และยีนต้นน้ำ หยิน แสดงเป็นเส้นสีดำทึบ หัวลูกศรทำเครื่องหมายตำแหน่งของไพรเมอร์ที่ใช้ในการตรวจจับ roX1 RNA (สีดำ) และ roX1 RA isoform (สีน้ำเงิน) สำหรับการวิเคราะห์ RT-qPCR (NS) การวิเคราะห์ RT-PCR โดยใช้เซลล์โคลน 8 เซลล์แสดงว่ามี roX1 RA และ RB ใบรับรองผลการเรียน ไพรเมอร์จำเพาะสำหรับลำดับในบริเวณอินเตอร์เจนิก roX1 RA และ roX1 RB ไอโซฟอร์มถูกใช้สำหรับการขยาย PCR (C, D, E) การวัด RT-qPCR ความอุดมสมบูรณ์ของ roX1 และ roX2 การถอดเสียงในสายเซลล์ที่แสดงออกถึงมนุษย์ (C, D) หรือ แมลงหวี่ (E) โปรตีน dCas9 และ sgRNAs (ดังแสดงบนแกน x) ประกอบกับสายดีเอ็นเอ rT หรือ rNT ที่ภายใน roX1 โลคัส เส้นเซลล์ที่แสดง sgRNA เดี่ยว (C) หรือ RNA ตัวนำสองตัวพร้อมกัน (D, E) ถูกแสดง gRNAs rNT7, rT8 และ rT9 เป็นสื่อกลางในการทำให้ล้มลงอย่างมีประสิทธิภาพของ roX1 การถอดเสียงไม่ว่าจะคนเดียวหรือร่วมกับผู้อื่น อย่างไรก็ตาม การรวมกันของ rT1+rT3 และ rT4+rNT5 ซึ่งกำหนดเป้าหมายไปที่ roX1 RA ไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสมีผลเฉพาะคู่เมื่อมี dCas9 ของมนุษย์และ แมลงหวี่ dCas9 ตามลำดับ แกน y แสดงการเสริมสมรรถนะของ RNA ที่สัมพันธ์กับ rp49 การถอดเสียงและทำให้เป็นมาตรฐานไปยังเซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย pGTL-1 ที่มีลำดับที่ไม่ใช่การกำหนดเป้าหมาย (Ctrl) ข้อมูลแสดงจากการทำซ้ำทางชีวภาพสองครั้ง โดยแต่ละครั้งทำเป็นสามเท่า แถบข้อผิดพลาดระบุ SEM % แสดงการล้มลงเป็นเปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับ Ctrl

NS roX2 การถอดเสียงถูกควบคุมโดย CRISPRi อย่างมีประสิทธิภาพ (NS) การแสดงแผนผังของ แมลงหวี่ roX2 โลคัสแสดงตำแหน่งสัมพัทธ์ของ roX2 การกำหนดเป้าหมาย sgRNA ไซต์เริ่มต้นการถอดความถูกทำเครื่องหมายด้วยลูกศรในขณะที่อินตรอนภายใน roX2 ยีนจะแสดงด้วยเส้นสีเทาทึบ บริเวณ intergenic ระหว่าง roX2 ไซต์เริ่มต้นการถอดความและยีนที่อยู่ติดกัน (cg11695) แสดงเป็นเส้นทึบสีดำ sgRNAs ที่กำหนดเป้าหมายไปยังสาย rT และ rNT จะแสดงเป็นสีแดงและสีม่วงตามลำดับ หัวลูกศรทำเครื่องหมายตำแหน่งของไพรเมอร์ที่ใช้ในการตรวจจับ roX2 RNA สำหรับการวิเคราะห์ RT-qPCR (NS และ ) การวัด RT-qPCR ความอุดมสมบูรณ์ของ roX1 และ roX2 การถอดเสียงในสายเซลล์ที่แสดงออกถึงมนุษย์ (B) หรือ แมลงหวี่ (C) โปรตีน dCas9 และ sgRNA สองตัว (ดังแสดงบนแกน x) ในขณะที่ sgRNAs rTb+rTc จะไม่ส่งผลกระทบ roX1 หรือ roX2 ระดับเมื่อมี dCas9 ของมนุษย์ พวกมันจะล้มลงโดยเฉพาะ roX2 ระดับการถอดเสียงในเซลล์ที่แสดงออกร่วมกัน แมลงหวี่ ดีคาส9. แกน y แสดงการเสริมสมรรถนะของ RNA ที่สัมพันธ์กับ rp49 การถอดเสียงและทำให้เป็นมาตรฐานไปยังเซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย pGTL-1 ที่มีลำดับที่ไม่ใช่การกำหนดเป้าหมาย (Ctrl) ข้อมูลแสดงจากการทำซ้ำทางชีวภาพสองครั้ง โดยแต่ละครั้งทำเป็นสามเท่า แถบข้อผิดพลาดระบุ SEM % แสดงการล้มลงเป็นเปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับ Ctrl

NS roX2 การถอดเสียงถูกควบคุมโดย CRISPRi อย่างมีประสิทธิภาพ (NS) การแสดงแผนผังของ แมลงหวี่ roX2 โลคัสแสดงตำแหน่งสัมพัทธ์ของ roX2 การกำหนดเป้าหมาย sgRNA ไซต์เริ่มต้นการถอดความถูกทำเครื่องหมายด้วยลูกศรในขณะที่อินตรอนภายใน roX2 ยีนจะแสดงด้วยเส้นสีเทาทึบ บริเวณ intergenic ระหว่าง roX2 ไซต์เริ่มต้นการถอดความและยีนที่อยู่ติดกัน (cg11695) แสดงเป็นเส้นทึบสีดำ sgRNAs ที่กำหนดเป้าหมายไปยังสาย rT และ rNT จะแสดงเป็นสีแดงและสีม่วงตามลำดับ หัวลูกศรทำเครื่องหมายตำแหน่งของไพรเมอร์ที่ใช้ในการตรวจจับ roX2 RNA สำหรับการวิเคราะห์ RT-qPCR (NS และ ) การวัด RT-qPCR ความอุดมสมบูรณ์ของ roX1 และ roX2 การถอดเสียงในสายเซลล์ที่แสดงออกถึงมนุษย์ (B) หรือ แมลงหวี่ (C) โปรตีน dCas9 และ sgRNA สองตัว (ดังแสดงบนแกน x) ในขณะที่ sgRNAs rTb+rTc จะไม่ส่งผลกระทบ roX1 หรือ roX2 ระดับเมื่อมี dCas9 ของมนุษย์ พวกมันจะล้มลงโดยเฉพาะ roX2 ระดับการถอดเสียงในเซลล์ที่แสดงออกร่วมกัน แมลงหวี่ ดีคาส9. แกน y แสดงการเสริมสมรรถนะของ RNA ที่สัมพันธ์กับ rp49 การถอดเสียงและทำให้เป็นมาตรฐานไปยังเซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย pGTL-1 ที่มีลำดับที่ไม่ใช่การกำหนดเป้าหมาย (Ctrl) ข้อมูลแสดงจากการทำซ้ำทางชีวภาพสองครั้ง โดยแต่ละครั้งทำเป็นสามเท่า แถบข้อผิดพลาดระบุ SEM % แสดงการล้มลงเป็นเปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับ Ctrl

อันดับแรก เราพยายามที่จะระงับการถอดความของ roX1 RNA โดยการแสดงร่วม RNA ไกด์เดี่ยวกับโปรตีน dCas9 โมเดลยีน FlyBase (http://flybase.org/) สำหรับ roX1 คาดการณ์ไซต์เริ่มต้นการถอดความที่แตกต่างกันสองแห่งซึ่งส่งผลให้มีความยาวมากขึ้น roX1 RA และสั้นลง roX1 RB ไอโซฟอร์ม ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการถอดเสียงทั้งสองมีอยู่ในโคลน 8 เซลล์ (รูปที่ 2B) ซึ่งตรวจสอบความถูกต้องของไซต์เริ่มต้นทั้งสองแห่ง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง roX1 RB บริเวณยีนเพียงอย่างเดียวถูกใช้ในโครงสร้างแปลงพันธุ์สำหรับการวิเคราะห์การกู้ภัย ( 30) ผลลัพธ์ของเราแสดงว่าการรับสมัคร dCas9 ที่ติดกับ roX1 RB การเริ่มต้นการถอดความส่งผลให้ทั้งคู่เงียบอย่างมีประสิทธิภาพ RA และ RB ไอโซฟอร์ม (รูปที่ 2C, รูปที่ S1A) สิ่งที่น่าสนใจคือ sgRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปยังสายที่ไม่ใช่แม่แบบ (rNT7) และแม่แบบ (rT8) มีประสิทธิภาพที่คล้ายคลึงกัน (95% และ 85% ตามลำดับ) ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีอคติของแม่แบบ DNA สำหรับการปิดเสียงตามที่สังเกตพบในเซลล์ของมนุษย์ ( 7) อย่างสม่ำเสมอ rT9 ซึ่งกำหนดเป้าหมายกลุ่มเทมเพลตและทับซ้อนบางส่วนกับ rNT7 จะแสดงกิจกรรมการปราบปรามที่คล้ายกัน การล้มลงขึ้นอยู่กับ roX1 ลำดับการกำหนดเป้าหมายและมีความเฉพาะเจาะจงเป็นเซลล์ที่มีการลดลงอย่างมาก roX1 ระดับไม่ได้แสดงการลดลงพร้อมกันของ roX2 ระดับอาร์เอ็นเอ การกำหนดเป้าหมายของ dCas9 ไปยังภูมิภาคต้นน้ำของ roX1 ไซต์เริ่มต้นการถอดความ (TSS) ไม่ส่งผลต่อระดับ RNA การวิเคราะห์แบบตะวันตกแสดงการแสดงออกอย่างมีประสิทธิภาพของโปรตีน dCas9 ในสายพันธุ์ของเซลล์เหล่านี้ (รูปที่ S2A เสริม) ที่เน้นบทบาทที่สำคัญของลำดับ RNA ไกด์ในการปราบปราม ความแปรปรวนในการแสดงออกของโปรตีน dCas9 อาจเกิดจากผลกระทบของตำแหน่งโครโมโซมและ/หรือการเปลี่ยนแปลงหมายเลขสำเนาโครโมโซมในสายเซลล์นี้ (31) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราเผยให้เห็น sgRNAs ที่มีศักยภาพสำหรับ roX1 การปิดเสียงและแสดงให้เห็นว่าการประกอบของ dCas9-sgRNA เชิงซ้อนบนสาย DNA ใดสายหนึ่งสามารถปิดเสียงการแสดงออกของ lncRNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพ อาจเป็นไปได้โดยการป้องกันการจับและ/หรือการยืดตัวของ RNA polymerase

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าประสิทธิภาพของ CRISPRi สามารถปรับปรุงได้โดยใช้ sgRNA สองตัวที่กำหนดเป้าหมายยีนเดียวกันในแบคทีเรีย (9) เพื่อทดสอบสิ่งนี้ใน แมลงหวี่ เซลล์ เราแทรก U6:1-sgRNA cassette ในเวกเตอร์ pGTL-1 ทันทีที่อัพสตรีมของ U6:3 cassette ดังนั้นจึงสร้างเวกเตอร์ pGTL-2 (รูปที่ 1B) ซึ่งช่วยให้สามารถแสดงออกของ sgRNA ที่สองภายใต้การควบคุมของ U6: 1 โปรโมเตอร์ที่แสดงกิจกรรมที่แข็งแกร่งใน แมลงหวี่ ( 13). สำหรับการแสดงออก เราเลือกชุดค่าผสม sgRNA ซึ่งอยู่ห่างกัน >30 bp เพื่อให้จับโปรตีน dCas9 ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2D, sgRNAs ประกอบกับลำดับต้นน้ำของ (rNT6+rNT7) และขนาบข้าง roX1 RB isoform (rNT7+rT8, rT8+rT9) แสดงการลดลงที่แข็งแกร่งของ roX1 การถอดเสียง นี่เป็นสิ่งที่คาดหวังและสามารถนำมาประกอบกับประสิทธิภาพของ rNT7, rT8 และ rT9 sgRNA ตามที่สังเกตได้ก่อนหน้านี้ (รูปที่ 2C) แม้ว่า rNT7 และ rT8 จะแสดงภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ U6:1 ที่น่าสังเกตคือ เราสังเกตการปิดเสียงที่มีประสิทธิภาพของ roX1 RNA โดย sgRNAs ที่กำหนดเป้าหมาย roX1 RA ภูมิภาคการถอดความ แม้ว่าจะไม่ได้ผลแยกกัน แต่ชุดค่าผสม sgRNA ที่กำหนดเป้าหมายกลุ่มแม่แบบ (rT1+rT3) หรือทั้งสายแม่แบบและสายที่ไม่ใช่แม่แบบ (rT4+rNT5) ก็แสดงการสูญเสียที่โดดเด่นใน roX1 ระดับ RNA (50% และ 90% ตามลำดับ) เราไม่ได้สังเกตความสัมพันธ์ที่ชัดเจนระหว่างระดับ dCas9 และการยับยั้งการถอดรหัส (รูปที่ S2B เพิ่มเติม) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการจับกันของโปรตีน dCas9 หลายตัวที่ไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสสามารถเพิ่มประสิทธิภาพของการปิดเสียงการถอดรหัสได้

ต่อไปเราจะพิจารณาว่าการเพิ่มประสิทธิภาพ codon ของโปรตีน dCas9 สามารถเพิ่มกิจกรรมการรวมตัวของ CRISPRi ได้หรือไม่ NS แมลงหวี่ Cas9 ที่ปรับให้เหมาะสม codon ถูกใช้เมื่อเร็ว ๆ นี้สำหรับ ในร่างกาย อย่างไรก็ตาม การแก้ไขยีน การแสดงออกของโปรตีนด้วยตัวขับ Gal4 ที่แข็งแรงและแพร่หลายทำให้เกิดการตายอย่างมากโดยไม่ทราบสาเหตุ (13) เราสร้างตัวเร่งปฏิกิริยาที่ไม่ใช้งาน แมลงหวี่ Cas9 โดยการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนที่จำเป็นสำหรับการออกฤทธิ์ของนิวคลีเอส (D10A และ H841A) และแทนที่ dCas9 ของมนุษย์ในเวกเตอร์ pGTL-2 ดังแสดงในรูปที่ 2E การแสดงออกร่วมของ sgRNAs และ แมลงหวี่ dCas9 สรุปกิจกรรมการปิดเสียงของ sgRNAs ในระดับใกล้เคียงกันที่สังเกตได้จากโปรตีน dCas9 ของมนุษย์ (rNT6+rNT7, rNT7+rT8 และ rT8+rT9) การวิเคราะห์แบบตะวันตกพบว่าการแปล .มีประสิทธิภาพ แมลงหวี่ โปรตีน dCas9 (รูปเสริม S2B) เส้นเซลล์ไม่แสดงฟีโนไทป์ที่เปิดเผยซึ่งบ่งชี้ว่า แมลงหวี่ การแสดงออกของ dCas9 ไม่เป็นพิษ และโปรตีนก็มีบทบาทในการปิดเสียงการแสดงออกของยีน อย่างไรก็ตาม เมื่อเทียบกับ dCas9 ของมนุษย์ เราสังเกตเห็นการลดลงอย่างเห็นได้ชัด (97% สำหรับ แมลงหวี่ dCas9 เทียบกับ 50% สำหรับ dCas9) ของมนุษย์ของ roX1 RA และ RB RNA ที่มี sgRNAs ที่กำหนดเป้าหมายภูมิภาค 5′ ของ roX1 RA TSS (rT1+rT3) (รูปที่ 2E, รูปที่ S1B) ผลกระทบที่เพิ่มขึ้นของชุดค่าผสม RNA คู่มือนี้ แม้ว่าจะไม่ได้ผลเป็นรายบุคคล แต่ก็อาจเกิดจากการกำหนดเป้าหมายขององค์ประกอบด้านกฎระเบียบที่ซ้ำซ้อนใน roX1 ภูมิภาคอินเทอร์เจนิก นอกจากนี้เรายังตั้งข้อสังเกตว่าเซลล์ที่แสดง rT4+rNT5 แสดง ∼ลดลง 40% ใน roX2 ระดับอาร์เอ็นเอ (รูปที่ 2E) – ไม่น่าจะเกิดขึ้นได้เนื่องจากผลกระทบนอกเป้าหมาย เนื่องจากระดับ RNA ของ Gapdh และ CTPsyn จะไม่ได้รับผลกระทบในทำนองเดียวกัน (รูปที่ S3A เพิ่มเติม) ที่สำคัญ การจัดลำดับ DNA เปิดเผยว่าผลของการเงียบของ แมลงหวี่ คอมเพล็กซ์ dCas9-sgRNA ที่ตำแหน่งภายนอกไม่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงในลำดับดีเอ็นเอ (รูปที่ S4) เสริม

ตั้งแต่ roX1 การกำหนดเป้าหมาย sgRNAs แสดงผลแบบผสมผสานในการปิดเสียงของยีนและมีศักยภาพในการมีอยู่ของ แมลงหวี่ dCas9 เราทดสอบว่าสามารถใช้กลยุทธ์ที่คล้ายกันเพื่อยกเลิกได้หรือไม่ roX2 การถอดความ สำหรับการวิเคราะห์ เราเลือกลำดับการกำหนดเป้าหมายสามลำดับรอบ roX2 RA TSS เสริมทั้งสายที่ไม่ใช่แม่แบบ (rNTa) และแม่แบบ (rTb และ rTc) (รูปที่ 3A) การแสดงออกร่วมกันของ sgRNAs กับ dCas9 ของมนุษย์ไม่ส่งผลกระทบต่อ roX2 ระดับการถอดเสียงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3B) อย่างไรก็ตาม เมื่อแสดงการรวมกันของ sgRNAs ที่เหมือนกันกับ แมลงหวี่ dCas9 เราสังเกตเห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (การล้มลง 90%) ของ roX2 การถอดเสียงใน sgRNAs ขนาบข้างไซต์เริ่มต้นการถอดรหัส (rTb+rTc, รูปที่ 3C) ที่สำคัญ roX1 การถอดเสียงไม่ได้รับผลกระทบในเซลล์เดียวกัน ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความจำเพาะของการล้มลง อย่างสม่ำเสมอ ระดับ Gapdh และ CTPsyn RNA ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ S3B เพิ่มเติม) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ระดับโปรตีน dCas9 ไม่สอดคล้องกับระดับการกดขี่ (รูปที่ S2C เสริม) ข้อมูลเหล่านี้ร่วมกับการสังเกตครั้งก่อนของเรากับ roX1, รองรับกิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของ แมลงหวี่ dCas9 ในการไกล่เกลี่ยการปราบปรามการถอดรหัสผ่าน CRISPRi

จนถึงปัจจุบัน CRISPRi ยังไม่ถูกนำมาใช้ในสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์ เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของ CRISPRi ในการปราบปรามการถอดความของ roX RNAs ในร่างกาย, เราสร้างแมลงวันดัดแปรพันธุกรรมสองตัวที่แสดง แมลงหวี่ dCas9 และ sgRNAs ภายใต้โปรโมเตอร์ที่ใช้งานอยู่ สำหรับการวิเคราะห์ เราเลือก RNA ไกด์ที่แสดงกิจกรรมที่มีศักยภาพในการลดค่าที่สอดคล้องกัน roX ยีนใน แมลงหวี่ สายเซลล์ – rT8+rT9 ไปยังเป้าหมาย roX1 และ rTb+rTc สำหรับ roX2. สำหรับการดัดแปลงพันธุกรรม เราดัดแปลง pAct5c-Cas9 vector ( 13) เพื่อสร้างเวกเตอร์ pGTL-3 – ยีน Cas9 ถูกแทนที่ด้วย แมลงหวี่ dCas9 และ U6:1-sgRNA-U6:3-sgRNA cassettes ถูกแทรกระหว่าง มินิ-ขาว ยีนและ Act5c โปรโมเตอร์ (รูปที่ 4A) เวกเตอร์นี้ช่วยให้สามารถผสานรวมเฉพาะไซต์ได้อย่างมั่นคงใน แมลงหวี่ จีโนม ดังนั้นการขจัดตำแหน่ง-ผลกระทบและความแปรปรวนในการแสดงออกของยีน อันที่จริง dCas9-roX1 และ dCas9-roX2 เส้นบินแสดงระดับที่คล้ายคลึงกันของ .ได้อย่างมีประสิทธิภาพ แมลงหวี่ โปรตีน (รูปที่เสริม S2D) และสามารถดำรงชีวิตได้ซึ่งบ่งชี้ว่าการแสดงออกของทรานส์ยีนเหล่านี้ไม่เป็นพิษ RT-qPCR แสดงให้เห็นการลดลงที่แข็งแกร่งและเฉพาะเจาะจงใน roX1 และ roX2 ระดับอาร์เอ็นเอ (รูปที่ 4B) ซึ่งสอดคล้องกับการวิเคราะห์ของเราในสายเซลล์และด้วยเหตุนี้จึงตรวจสอบการปราบปรามของ แมลงหวี่ dCas9 ในร่างกาย. น็อคดาวน์น่าจะประเมินต่ำไปเช่น Actin5c ไม่แสดงออกในเนื้อเยื่อของผู้ใหญ่ (32) และไม่ถูกแยกออกจากเจิร์มไลน์ อย่างน่าทึ่ง เมื่อเทียบกับเพศหญิง เราสังเกตเห็นการลดลงอย่างมากในศักยภาพของเพศชายที่แสดงออกมาร่วมกัน roX1 และ roX2 คู่มือ RNAs (7.6% dCas9-roX1/dCas9-roX2 เพศชายกับเพศชายประเภท wild-type 52.1%, รูปที่ 4C) ตัวผู้หนีรอดมีภาวะเจริญพันธุ์และไม่มีข้อบกพร่องทางฟีโนไทป์ที่ชัดเจน สิ่งนี้สอดคล้องกับการสูญเสียหน้าที่อย่างมากของ roX (33). ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าการรับสมัครของ แมลงหวี่ dCas9 ที่ roX1 และ roX2 โลคัสขัดขวางการแสดงออกโดยการระงับการถอดความ ส่งผลให้ผู้ชายเสียชีวิต

ล้มลงของ roX1 และ roX2 RNAs ในร่างกาย. (NS) การแสดงแผนผังของ แมลงหวี่ ทรานส์เจเนซิสเวกเตอร์ pGTL-3 เครื่องหมายการเลือกที่โดดเด่น มินิ-ขาว ตามด้วย RNA ไกด์คู่ที่แสดงเทปภายใต้การควบคุมของ U6:1 และ U6:3 โปรโมเตอร์ในขณะที่การแสดงออกของ แมลงหวี่ dCas9 ถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ที่ใช้งานเป็นส่วนประกอบ Actin5c. เรซิดิวกรดอะมิโนที่กลายพันธุ์ (D10 > A และ H841 > A) ใน dCas9 จะถูกทำเครื่องหมายด้วยเครื่องหมายดอกจันสีแดง (*) N = ลำดับ NLS, F = FLAG epitope, pA = โพลีอะดีนิเลชัน (NS) การวิเคราะห์ RT-qPCR แสดงการพร่องของ . ที่แข็งแกร่ง roX1 และ roX2 RNAs ในตัวผู้ของฟลายไลน์แสดง RNA ไกด์ที่สอดคล้องกัน (แสดงบนแกน x) แกน y แสดงการเสริมสมรรถนะของ RNA ที่สัมพันธ์กับ rp49 การถอดเสียงและทำให้เป็นมาตรฐานเป็นไวด์-type (y,w) ผู้ชาย ข้อมูลแสดงจากการทำซ้ำทางชีวภาพสองครั้ง โดยแต่ละครั้งทำเป็นสามเท่า แถบข้อผิดพลาดระบุ SEM % แสดงการล้มลงเป็นเปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับประเภทไวด์ () ตารางแสดงการลดลงอย่างรุนแรงในลูกหลานชายพร้อม ๆ กันแสดงออก roX1 และ roX2 คู่มือ RNAs (rT8+rT9-Act:dCas9/rTb+rTc-Act:dCas9) เปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตของผู้ชายคำนวณจากจำนวนลูกหลานทั้งหมดของยีนเดียวกันที่กู้คืนจากการผสมข้ามพันธุ์เดียวกัน NS y,w สายพันธุ์ถูกใช้เป็นพันธุ์ป่า

ล้มลงของ roX1 และ roX2 RNAs ในร่างกาย. (NS) การแสดงแผนผังของ แมลงหวี่ ทรานส์เจเนซิสเวกเตอร์ pGTL-3 เครื่องหมายการเลือกที่โดดเด่น มินิ-ขาว ตามด้วย RNA ไกด์คู่ที่แสดงเทปภายใต้การควบคุมของ U6:1 และ U6:3 โปรโมเตอร์ในขณะที่การแสดงออกของ แมลงหวี่ dCas9 ถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ที่ใช้งานเป็นส่วนประกอบ Actin5c. เรซิดิวกรดอะมิโนที่กลายพันธุ์ (D10 > A และ H841 > A) ใน dCas9 จะถูกทำเครื่องหมายด้วยเครื่องหมายดอกจันสีแดง (*) N = ลำดับ NLS, F = FLAG epitope, pA = โพลีอะดีนิเลชัน (NS) การวิเคราะห์ RT-qPCR แสดงการพร่องของ . ที่แข็งแกร่ง roX1 และ roX2 RNAs ในตัวผู้ของฟลายไลน์แสดง RNA ไกด์ที่สอดคล้องกัน (แสดงบนแกน x) แกน y แสดงการเสริมสมรรถนะของ RNA ที่สัมพันธ์กับ rp49 การถอดเสียงและทำให้เป็นมาตรฐานเป็นไวด์-type (y,w) ผู้ชาย ข้อมูลแสดงจากการทำซ้ำทางชีวภาพสองครั้ง โดยแต่ละครั้งทำเป็นสามเท่า แถบข้อผิดพลาดระบุ SEM % แสดงการล้มลงเป็นเปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับประเภทไวด์ () ตารางแสดงการลดลงอย่างรุนแรงในลูกหลานชายพร้อม ๆ กันแสดงออก roX1 และ roX2 คู่มือ RNAs (rT8+rT9-Act:dCas9/rTb+rTc-Act:dCas9) เปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตของผู้ชายคำนวณจากจำนวนลูกหลานทั้งหมดของยีนเดียวกันที่กู้คืนจากการผสมข้ามพันธุ์เดียวกัน NS y,w สายพันธุ์ถูกใช้เป็นพันธุ์ป่า

ในรายงานนี้ เราอธิบายวิธีการสูญเสียการทำงานที่มีประสิทธิภาพสำหรับการศึกษายีน lncRNA ใน แมลงหวี่ โดยระบบ CRISPRi ขั้นต่ำที่ไม่ต้องการการรวมโดเมนเอฟเฟกต์กับ dCas9 ด้วยวิธีการที่ตรงไปตรงมานี้ เราประสบความสำเร็จในระดับสูงของ roX RNA (มากถึง 50 เท่า) โดยกำหนดเป้าหมายที่ตำแหน่งภายนอกใน แมลงหวี่ เซลล์. กลยุทธ์ของเราเอาชนะข้อจำกัดก่อนหน้านี้ของแนวทางทางพันธุกรรมที่ใช้สำหรับการประเมินการทำงานของ lncRNA โดยไม่ได้ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงใน DNA และกำจัดการสรรหาสารเชิงซ้อนของโครมาตินในการปิดเสียงนอกมดลูก ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการกำหนดเป้าหมาย sgRNA หลายตัวที่ขนาบข้างไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสของยีนช่วยเพิ่มศักยภาพในการล้มลงของ CRISPRi ในเรื่องนี้ การพัฒนาเมื่อเร็ว ๆ นี้ของโปรตีน Cas9 ที่ออกแบบโดยมีคุณสมบัติการรู้จำ PAM ที่ยืดหยุ่นและความจำเพาะที่เพิ่มขึ้นควรเพิ่มทางเลือกของลำดับที่กำหนดเป้าหมายได้ในขณะที่ลดผลกระทบนอกเป้าหมาย (34, 35) เนื่องจากกิจกรรม RNA ไกด์ยังคงคาดเดาได้ยาก และการกำหนดลักษณะของโปรโมเตอร์และองค์ประกอบควบคุมการถอดรหัสของ lncRNA ยังคงไม่สมบูรณ์ เราจึงแนะนำให้ทดสอบ RNA ไกด์หลายตัวเพื่อเลือกแนวทางที่มีศักยภาพสำหรับการวิเคราะห์ การออกแบบทรานส์เฟกชันเวคเตอร์และการทดสอบตามเซลล์ช่วยให้ประเมินประสิทธิภาพของ sgRNA หลายตัวได้อย่างรวดเร็วก่อนนำไปใช้ ในร่างกาย การศึกษา ตั้งแต่การปรับขนาดจนถึงการปิดเสียงของการแสดงออกของยีน ตลอดจนการทดลองทำแผนที่โปรโมเตอร์และ/หรือเอนแฮนเซอร์ กลยุทธ์นี้ ร่วมกับวิธีการล้มลงแบบดั้งเดิม ควรอนุญาตให้มีการสำรวจการทำงานและกลไกของ lncRNAs ใน metazoa ดังนั้นจึงทำให้กระจ่างในการถอดเสียงที่ลึกลับเหล่านี้ซึ่งประกอบเป็น 'สสารมืด' ของจีโนม

ขอขอบคุณ Fillip Port และ Simon Bullock สำหรับของขวัญที่เป็นพลาสมิด, ศูนย์ทรัพยากร Drosophila Genomics Resource Center ที่ได้รับการสนับสนุนจาก NIH ให้สิทธิ์ 2P40OD010949–10A1 สำหรับสายเซลล์, Yong Huang สำหรับความช่วยเหลือในการวิเคราะห์ข้อมูล, Stuart Grice สำหรับการอ่านต้นฉบับอย่างมีวิจารณญาณและสมาชิกของ Liu ห้องปฏิบัติการสำหรับการอภิปรายที่เป็นประโยชน์ เรายังขอขอบคุณ University Of Cambridge Department Of Genetics Fly Facility สำหรับการสร้างสายบินดัดแปลงพันธุกรรม


บทความ

การค้นพบ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสที่ใช้งานได้ยาวนาน (lncRNAs) ได้ท้าทายกระบวนทัศน์ที่ RNA ส่วนใหญ่เข้ารหัสโปรตีน LncRNAs เป็นคลาสที่มีความยาวมากกว่า 200 nt ของ RNA ซึ่งก่อนหน้านี้สันนิษฐานว่าเป็นสัญญาณรบกวนจากการถอดรหัส ตอนนี้เป็นที่ยอมรับกันอย่างกว้างขวางว่า lncRNAs เหล่านี้บางส่วนมีบทบาทในการกำกับดูแลที่หลากหลายในการแสดงออกของยีน สามารถทำหน้าที่เป็นส่วนประกอบโครงสร้างสำหรับการกำหนดโครงสร้างองค์กรนิวเคลียร์ และยังสามารถทำหน้าที่เป็นตัวล่อสำหรับ RNA หรือโปรตีนอื่นๆ 1-3 ในขณะที่การถอดรหัส lncRNA นับหมื่นรายการได้รับการจัดหมวดหมู่แล้ว หน้าที่ทางชีววิทยาของ lncRNA ส่วนใหญ่ยังคงเป็นปริศนา การระบุการทำงานส่วนบุคคลของสมาชิกในกลุ่ม RNA ที่เพิ่งค้นพบนี้มีความสำคัญต่อความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับชีววิทยาพัฒนาการ วิวัฒนาการ และโรคทางพันธุกรรม

คล้ายกับโปรตีน lncRNAs แต่ละตัวมีการกระจายตัวของ subcellular จำเพาะที่มีความสำคัญต่อหน้าที่ของพวกมัน 4 . lncRNAs บางตัวมีความอุดมสมบูรณ์ในนิวเคลียสและมีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมกระบวนการทางนิวเคลียร์ เช่น การถอดรหัสและการประมวลผลอาร์เอ็นเอ lncRNAs อื่นๆ ถูกทำให้สมบูรณ์ในไซโตพลาสซึม ซึ่งพวกมันสามารถส่งผลกระทบต่อการแปลตำแหน่งโปรตีนหรือปรับความคงตัวของ mRNA และการแปล lncRNAs บางตัวมีการกระจายอย่างเท่าเทียมกันระหว่างนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม ตำแหน่งของแหล่งกักเก็บหลักของ lncRNA อาจส่งผลต่อความสามารถในการลดระดับการแสดงออกของสปีชีส์นั้น

โดยทั่วไปจะใช้กลยุทธ์สามอย่างเพื่อทำให้ lncRNA ล้มลงหรือทำให้ล้มลง ซึ่งรวมถึง: การเสื่อมสภาพของ RNA โดยการแทรกแซง RNA (RNAi) การเสื่อมสลายของ RNA โดย RNase H เปิดใช้งาน antisense oligonucleotides (ASOs) หรือการลบ/การเปลี่ยนแปลงโดยรวมที่ระดับ DNA โดยใช้ CRISPR/ วิธีการแก้ไขจีโนม Cas9 (รูปที่ 1) เครื่องมือเหล่านี้แต่ละอย่างมีข้อดีและข้อเสียของตัวเอง และความสำเร็จอาจได้รับอิทธิพลจากการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ lncRNA และภูมิทัศน์การถอดความภายในที่เครื่องมือเหล่านี้อาศัยอยู่

รูปที่ 1: แผนผังของวิธีการทั่วไปสามวิธีที่ใช้ในการทำให้ล้มลงหรือทำให้ล้มลง lncRNAs การรบกวนของ RNA (RNAi) ใช้คอมเพล็กซ์การระงับเสียงที่เกิดจาก RNAi ที่มีโปรตีนหลายตัวซึ่งมี siRNA เพื่อลดระดับ RNA ที่เป็นเป้าหมายโดยเฉพาะ Antisense oligonucleotides (ASOs) จับกับ RNA ที่เป็นเป้าหมายของพวกมัน และใช้ RNase H1 ภายนอก ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่แยก RNA ใน RNA/DNA heteroduplex การแก้ไขจีโนม CRISPR-Cas9 ทำให้การเปลี่ยนแปลงในระดับจีโนมโดยใช้ crRNA เฉพาะเป้าหมายที่ผสมพันธุ์กับ tracrRNA ซึ่งซับซ้อนกับโปรตีน Cas9

RNAi เป็นเทคนิคการน็อคดาวน์ที่ใช้กันทั่วไปซึ่งใช้โปรตีนหลายตัวที่ทำให้เกิด RNAi ทำให้เกิดเสียงที่ซับซ้อน (RISC) เพื่อยับยั้ง mRNA 5 คอมเพล็กซ์การโหลด RISC ของมนุษย์ (RLC) ประกอบด้วยโปรตีนสามชนิด (Dicer, TRBP และ Ago2) ที่รับผิดชอบในการประมวลผล dsRNA ที่ยาวกว่าลงใน siRNA ที่เจริญเต็มที่และโหลด siRNA เหล่านี้ลงใน Ago2 ก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่าการย่อยสลาย mRNA ที่อาศัย RNAi เป็นสื่อกลางเกิดขึ้นในไซโตพลาสซึม 6 ในชุดการทดลองการแยกส่วนและการสร้างภูมิคุ้มกันร่วม Stalder et al. แสดงให้เห็นอย่างเจาะจงมากขึ้นว่าการโหลด RISC แบบบัญญัติ การผูกมัดภายหลังกับ mRNA ที่เป็นเป้าหมายและความแตกแยกของ mRNA ที่เป็นสื่อกลาง Ago2 เกิดขึ้นที่เอ็นโดพลาสมิกเรติคิวลัมแบบหยาบเป็นหลัก โดยที่ mRNA ถูกแปลเป็นโปรตีน 7 RNase H-mediated antisense RNA น็อคดาวน์ใช้ประโยชน์จากเอ็นไซม์ RNase H1 ภายนอกซึ่งมีอยู่มากในนิวเคลียสซึ่งเชื่อกันว่าทำงานในการจำลองดีเอ็นเอและซ่อมแซม 8-11 อีกทางหนึ่ง สามารถใช้ ASO ที่บล็อก steric เพื่อบล็อกรอยต่อรอยต่อเพื่อลดการสะสมของทรานสคริปต์ lncRNA ที่โตเต็มที่ หรือบล็อกการเข้าถึงโดเมนที่ใช้งานได้หลักโดยไม่ทำให้เกิดการเสื่อมสภาพของ RNA เป้าหมาย 12,13 ASO ที่ขัดขวาง Steric ทำจากเรซิดิวดัดแปลงทางเคมีที่ไม่รองรับการตัดแยก RNase H1 เช่น ไรโบสที่ดัดแปลง 2’ หรือแบ็คโบนมอร์โฟลิโน 14 ทั้ง RNAi และ RNase H-active ASOs พึ่งพาโมเลกุลของเอฟเฟกเตอร์ที่มีอยู่ตามธรรมชาติในการย่อยสลาย lncRNA ในทางตรงกันข้าม วิธีแก้ไขจีโนม CRISPR/Cas9 อาศัยเอ็นไซม์เอนโดนิวคลีเอสของแบคทีเรียที่สามารถกำหนดเป้าหมายไปยังไซต์ที่ต้องการในจีโนมโดย RNA ไกด์เฉพาะไซต์ ซึ่งจะสร้าง DNA แบบสองเกลียวที่หรือรอบๆ ไซต์เป้าหมาย 15,16 เครื่องจักรซ่อมแซมเซลล์รักษาการแตกของเกลียวสองเส้น ทิ้ง "รอยแผลเป็น" เล็กๆ ไว้ในจีโนม หรือแม้แต่ใช้เพื่อลบ DNA จำนวนมาก และด้วยเหตุนี้จึงกำจัด lncRNA ที่ระดับจีโนม เมธอด CRISPR/Cas9 ยังสามารถใช้เพื่อแนะนำลำดับใหม่ที่ตำแหน่งเป้าหมาย เช่น ตัวสิ้นสุดการถอดรหัสที่จะป้องกันการผลิต lncRNA แบบเต็มความยาว การทำความเข้าใจธรรมชาติของ lncRNA ที่น่าสนใจสามารถช่วยในการเลือกเทคนิคการล้มลงที่เหมาะสมได้ดียิ่งขึ้น

ด้วยภูมิหลังที่กว้างขวางของประสบการณ์การล้มลงของ mRNA เราคาดว่าการใช้รายการเดียวกันของรีเอเจนต์เพื่อปราบปราม lncRNAs จะทำสำเร็จได้อย่างง่ายดาย อย่างไรก็ตาม เราพบว่า lncRNA บางตัวปราบปรามได้ยาก และในที่สุดก็สังเกตเห็นสิ่งที่ดูเหมือนจะสัมพันธ์กันกับวิธีการที่ใช้ RNAi (RNA ที่รบกวนขนาดเล็ก, siRNAs หรือ RNA ของสารตั้งต้น Dicer, DsiRNAs) มีประสิทธิภาพน้อยกว่ากับเป้าหมาย lncRNA ที่จำกัดด้วยนิวเคลียร์ เราตั้งสมมติฐานว่า lncRNA ของนิวเคลียร์เหล่านี้จะถูกระงับได้ง่ายกว่าโดยใช้การล้มลงของแอนติเซนส์ที่เป็นสื่อกลางของ RNase-H เนื่องจากพบ RNase H ส่วนใหญ่ในนิวเคลียส ในทางกลับกัน เราคิดว่า RNAi ซึ่งส่วนใหญ่เป็นกระบวนการไซโตพลาสซึม อาจมีประสิทธิภาพมากกว่าเมื่อกำหนดเป้าหมายกลุ่มไซโตพลาสซึมของ lncRNAs เพื่อทดสอบความเป็นไปได้นี้ ได้ทำการศึกษาอย่างเป็นระบบในการเพาะเลี้ยงเซลล์โดยเปรียบเทียบประสิทธิภาพของ ASO (20mer DNA-PS, 20mer 2'OMe-PS gapmers หรือ 16mer LNA-PS gapmers (Exiqon) โดยที่ PS = phosphorothioate linkages, LNA = ล็อค กรดนิวคลีอิกและ 2'OMe = 2'-O-Methyl RNA) หรือ RNAi (DsiRNAs, siRNA หรือ Silencer ® Select siRNAs (Thermo Fisher Scientific)) กับ lncRNA เจ็ดตัวที่มีรูปแบบการแปลเป็นภาษาท้องถิ่น 17 lncRNAs นิวเคลียร์ (MALAT1 และ NEAT1), lncRNAs ของไซโตพลาสซึม (DANCR และ OIP5-AS1) หรือ lncRNA ที่ปรับตำแหน่งคู่ (TUG1, CasC7 และ HOTAIR) ถูกกำหนดเป้าหมายโดย ASO (18 ไซต์/เป้าหมาย) หรือ RNAi (28 ไซต์/เป้าหมาย) เนื่องจากมีประสิทธิภาพที่หลากหลายระหว่างไซต์ขึ้นอยู่กับพารามิเตอร์ เช่น เนื้อหา GC และการเข้าถึงเป้าหมาย ไซต์จึงถูกเลือกโดยใช้อัลกอริธึมการออกแบบที่ปรับให้เหมาะสม (RNAi) หรือใช้เกณฑ์การออกแบบภายในองค์กร (ASO) ที่เข้มงวดที่กำหนดไว้อย่างดีเพื่อเพิ่มความน่าจะเป็นสูงสุด ของการเปรียบเทียบไซต์ที่มีการใช้งานสูงระหว่างสองกลยุทธ์การล้มลง ผลลัพธ์สอดคล้องกับสมมติฐานของเรา: นิวเคลียร์ lncRNAs ถูกทำให้ล้มลงได้ง่ายขึ้นเมื่อใช้ ASO ในขณะที่เป้าหมายไซโตพลาสซึมถูกทำให้ล้มลงได้ง่ายกว่าเมื่อใช้ RNAi (รูปที่ 2) เมื่อเปรียบเทียบศักยภาพของกลยุทธ์การปรับเปลี่ยนทางเคมีของ ASO แบบต่างๆ พบว่าในขณะที่ DNA-PS และ 2'OMe-PS ASO มีรูปแบบการล้มลงที่คล้ายคลึงกันมากระหว่างไซต์ต่างๆ ช่องว่าง 2'OMe-PS มีศักยภาพมากกว่าอย่างสม่ำเสมอ เป็นไปตามที่คาดไว้ เนื่องจากฐาน 2'OMe เพิ่มความสัมพันธ์ในการผูกมัดของ ASO กับเป้าหมาย 2'OMe-PS gapmer และ LNA-PS gapmer ASOs โดยทั่วไปแล้วจะแสดงให้เห็นศักยภาพที่คล้ายคลึงกันที่ขนาดยา 10 นาโนโมลาร์ อย่างไรก็ตาม LNA-PS gapmers มักจะมีศักยภาพมากกว่าที่ขนาดยาที่ต่ำกว่า ไม่มีความแตกต่างโดยรวมในกิจกรรมระหว่างรีเอเจนต์ RNAi ต่างๆ ที่ทดสอบ ระยะเวลาของการล้มลงไม่ได้ถูกกล่าวถึงในการศึกษานี้ โดยทั่วไปแล้ว การปราบปรามที่กินเวลา 3-7 วันมักจะเห็นได้ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ (ซึ่งการเจือจางจากการแบ่งเซลล์สามารถถูกจำกัดโดยการลดความเข้มข้นของ ASO หรือ siRNA) ในขณะที่การทำให้ล้มลงเป็นเวลาหลายสัปดาห์หรือหนึ่งเดือนสามารถทำได้ มองเห็นได้ในเซลล์ที่ไม่แบ่งตัว ในร่างกาย 18,19 . แม้ว่าการศึกษานี้จะตรวจสอบเฉพาะการล้มลงของ lncRNA ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ แต่คาดว่ากิจกรรมสัมพัทธ์ที่คล้ายคลึงกันระหว่างคลาสรีเอเจนต์ต่างๆ ในร่างกาย หากใช้เครื่องมือจัดส่งที่เหมาะสม สำหรับ ในร่างกาย การใช้ ความได้เปรียบด้านประสิทธิภาพที่ชัดเจนจะถูกคาดการณ์สำหรับ LNA-PS gapmers แบบสั้น หากบริหารโดยการฉีด IV เปล่า (โดยไม่มีเครื่องช่วยการคลอด) 20 การใช้เครื่องมือนำส่ง เช่น ลิปิดอนุภาคนาโน (LNP) หรือลิแกนด์คอนจูเกต (เช่น โคเลสเตอรอลหรือแอนติบอดี) สามารถปรับปรุงการนำส่ง ASO และจำเป็นสำหรับการใช้รีเอเจนต์ RNAi ใดๆ ในร่างกาย 18,19,21,22

จนถึงตอนนี้ เราได้ให้ความเห็นเกี่ยวกับ "ความสะดวกสัมพัทธ์" ของเทคนิคการล้มลงอย่างใดอย่างหนึ่งเพื่อปราบปรามเป้าหมายของพวกเขาโดยพิจารณาจากว่า lncRNA เป็นนิวเคลียร์หรือไซโตพลาสซึมอย่างเด่นชัด การดูข้อมูลอย่างละเอียดถี่ถ้วนแสดงให้เห็นว่า ASO ยังมีประสิทธิภาพในการย่อยสลาย RNA ของไซโตพลาสซึม (รูปที่ 2) ASO ไม่เพียงแต่มีความสามารถโดยธรรมชาติในการกำหนดเป้าหมาย RNA ที่กักเก็บนิวเคลียร์ไว้เท่านั้น แต่ยังสามารถย่อยสลาย RNA ที่พึ่งเกิดขึ้นได้ก่อนที่จะส่งออกไซโตพลาสซึม นอกจากนี้ ผลการศึกษาล่าสุดที่ตรวจสอบขั้นตอนการจำกัดอัตราการย่อยสลาย mRNA โดย ASOs พบว่า RNase H1 ยังมีอยู่ในระดับต่ำในไซโตพลาสซึม 23 ในขณะที่การสลายตัวของ mRNA ที่อาศัย ASO เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วในนิวเคลียส แต่ก็เกิดขึ้นในอัตราที่ช้าลงในไซโตพลาสซึม สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าหากไม่ทราบการแปล lncRNA การเลือก ASO ล้มลง (ตรงข้ามกับ RNAi) จะมีโอกาสประสบความสำเร็จมากที่สุด ที่น่าสนใจ การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าเมื่อกำหนดเป้าหมาย lncRNA แบบ dual-localized การทำให้ล้มลงได้ดีขึ้นสามารถทำได้โดยการรวม ASO และ siRNA เข้าด้วยกัน สิ่งนี้สามารถคาดการณ์ได้ เมื่อพิจารณาว่า ASO สามารถลดจำนวนประชากร lncRNA ของนิวเคลียร์ได้อย่างรวดเร็วที่สุด และ siRNA สามารถลดจำนวนประชากรของ lncRNA ของไซโตพลาสซึมได้อย่างรวดเร็วที่สุด

รูปที่ 2: ภาพรวมของผลลัพธ์การล้มลงของ lncRNA ที่เปรียบเทียบประสิทธิภาพของวิธีการกับการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ lncRNA (17) โอลิโกนิวคลีโอไทด์ Antisense (LNA-PS gapmers, 2’OMe-PS gapmers หรือ DNA-PS) หรือรีเอเจนต์ RNAi (siRNAs, DsiRNAs หรือ Silencer ® Select siRNAs) ถูกทรานส์เฟกไปในเซลล์ HeLa ด้วย Lipofectamine® 2000 เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ขนาดยา 10 นาโนโมลาร์ ASO = แอนติเซนส์ โอลิโกนิวคลีโอไทด์ PS = การเชื่อมโยงฟอสโฟโรไทโอเอต

lncRNAs บางตัวจะทนต่อการล้มลงโดย ASO หรือ RNAi สิ่งนี้อาจเกิดขึ้นได้หากการโลคัลไลซ์เซชั่นย่อยของ lncRNA ไม่สามารถเข้าถึงได้โดย RNase H หรือเครื่องจักร RNAi นอกจากนี้ยังอาจเกิดขึ้นได้หาก lncRNA มีโครงสร้างสูงหรือถูกปิดกั้นเนื่องจากการจับกับโปรตีนมากเกินไปหรือไฮบริไดซ์กับกรดนิวคลีอิกของเซลล์อื่นๆ เราทดสอบ ASO และรีเอเจนต์ RNAi ที่หลากหลายกับ NRON ซึ่งเป็น lncRNA ที่ทำหน้าที่เป็นฟองน้ำโปรตีน และไม่สามารถทำให้เกิดการล้มลงได้ในระดับสูง (ผลลัพธ์ที่ไม่ได้เผยแพร่) ในสถานการณ์เหล่านี้ อาจจำเป็นต้องใช้เทคนิค เช่น การแก้ไขจีโนม CRISPR/Cas9 การใช้เครื่องมือแก้ไขจีโนมเพื่อทำให้ lncRNA ล้มลงนั้นไม่ใช่เรื่องเล็กน้อย เนื่องจากการสร้างอินเดลเล็กๆ ใน lncRNA ที่เป็นเป้าหมายมักจะไม่รบกวนการถอดรหัส ไม่มี 'กรอบการอ่านแบบเปิด' ที่มีอยู่ซึ่งถูกรบกวนได้ง่ายจากเหตุการณ์อินเดลที่อยู่นอกกรอบ lncRNA ที่ถอดความแล้วซึ่งมีอินเดลที่เพิ่งเริ่มใช้ใหม่อาจยังคงรักษาโดเมนที่ใช้งานได้และ/หรือไซต์ที่มีผลผูกพันที่จะปิดบังการวิเคราะห์ฟีโนไทป์ สองกลยุทธ์ประสบความสำเร็จในการใช้การแก้ไขจีโนม CRISPR/Cas9 กับ lncRNA ที่น่าพิศวง กลยุทธ์หนึ่งใช้ RNA ไกด์คู่เพื่อทำลาย DNA ที่ตำแหน่งเฉพาะสองแห่งพร้อมกัน โดยแยกส่วนขนาดใหญ่ของตำแหน่งจีโนมที่เข้ารหัส lncRNA ออก การพิสูจน์แนวคิดสำหรับเทคนิคนี้ทำให้ lncRNA-21A, UCA1 และ AK023948 ล้มลงได้สำเร็จโดยการลบชิ้นส่วนขนาดใหญ่ตั้งแต่ 475 bp (lnRNA-21A) ถึง 5.6 kb (UCA1) 24 กลยุทธ์ที่สองใช้ CRISPR/Cas9 เพื่อสร้างองค์ประกอบที่ไม่เสถียรของ RNA (เช่น สัญญาณโพลี (A) ไซต์การจับ miRNA ไรโบไซม์ที่แยกตัวเอง ฯลฯ) ลงในลำดับจีโนม ทำให้เกิดการหมุนเวียน/การสลายตัวของ lncRNA เพิ่มขึ้น การใช้กลยุทธ์นี้ในขั้นต้นด้วยซิงก์ฟิงเกอร์นิวคลีเอส Gutschner et al ได้พัฒนาแบบจำลองที่น่าพิศวง MALAT1 โดยการรวมสัญญาณต้นน้ำ poly(A) ของไซต์เริ่มต้นการถอดรหัส ส่งผลให้ระดับ MALAT1 ลดลง >1000 เท่า 25,26 การถือกำเนิดของเทคโนโลยี CRISPR/Cas9 ทำให้แนวทางนี้ง่ายขึ้นอย่างมาก การยับยั้ง CRISPR (CRISPRi) เป็นเทคนิคที่ใช้โปรตีน Cas9 (dCas9) ที่ไม่ใช้งานตัวเร่งปฏิกิริยา (dCas9) ที่ไม่ใช้งานตัวเร่งปฏิกิริยาเพื่อขัดขวางการทำงานของ RNA polymerase หรือหากต้องการให้มีการกดการถอดรหัสที่สูงขึ้น ให้จับคู่ dCas9 กับตัวกดการถอดรหัส (เช่น KRAB) . Gilbert et al กำหนดเป้าหมาย lncRNA ที่แตกต่างกันหกตัวโดยใช้ dCas9-KRAB บรรลุ >80% ล้มลงสำหรับ 5/6 lncRNAs 27 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การใช้วิธี CRISPRi อย่างมีประสิทธิผลต้องการให้ทราบตำแหน่งของเอนแฮนเซอร์/องค์ประกอบโปรโมเตอร์ และหากองค์ประกอบควบคุมเหล่านี้ควบคุมการแสดงออกของ lncRNA เพียงอย่างเดียวหรือมีส่วนในการแสดงออกของการถอดเสียง (การเข้ารหัส) อื่นๆ การใช้วิธีการ CRISPR ใดๆ การถอดเสียงที่ทับซ้อนกัน ถูกคัดลอกจากสายตรงข้าม หรือถูกประมวลผลเพิ่มเติมเป็นไอโซฟอร์มที่ต่างกันก็อาจถูกเคาะออกโดยไม่ได้ตั้งใจ ซึ่งทำให้การตีความข้อมูลสับสน ในความเป็นจริง Goyal et al เพิ่งแสดงให้เห็นว่า 62% ของ 15,929 lncRNAs ที่วิเคราะห์ในการศึกษาของพวกเขาเป็นเป้าหมายที่ไม่ดีสำหรับการแก้ไขจีโนม CRISPR/Cas9 เนื่องจากมีโปรโมเตอร์แบบสองทิศทางหรือภายใน ดังนั้นสิ่งที่น่าพิศวงอาจส่งผลต่อยีนที่อยู่ใกล้เคียง ผู้เขียนได้เลือกตัวอย่างบางส่วนจากการวิเคราะห์นี้ และแสดงให้เห็นว่าการใช้ CRISPRi เพื่อทำให้ lncRNA น็อคเอาท์ด้วย loci ที่ทับซ้อนกับยีนอื่นๆ ส่งผลต่อยีนที่อยู่ใกล้เคียงอย่างแท้จริง ในทางตรงกันข้าม RNAi หรือ ASO การทำให้ล้มลงของเป้าหมาย lncRNA เดียวกันเหล่านี้มีความเฉพาะเจาะจงต่อการถอดรหัสที่เป็นเป้าหมาย 28

เทคนิคทั้งหมดที่ยับยั้งการแสดงออกของยีนมีความเสี่ยงที่จะเกิดผลกระทบนอกเป้าหมาย (OTE) โดยที่ยีนที่เกี่ยวข้องซึ่งมีลำดับที่เหมือนกันกับเป้าหมายที่ตั้งใจไว้จะถูกระงับโดยการผสมข้ามพันธุ์ด้วยกรดนิวคลีอิกที่กำหนดเป้าหมาย ความจำเพาะของ ASO ขึ้นอยู่กับการผสมกรดนิวคลีอิกของ Watson-Crick เพียงอย่างเดียวและ OTE นั้นคาดการณ์ได้ง่ายกว่าโดยการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศมากกว่าวิธีอื่นๆ ที่รีเอเจนต์เหล่านี้สามารถแสดงความจำเพาะแบบเบสเดียว โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้ ASO ที่มีสัมพรรคภาพสั้น 29 ในขณะที่วิธี RNAi สามารถแสดงความจำเพาะแบบเบสเดียวได้ วิธีการเหล่านี้มีความเสี่ยงสูงที่จะเป็น OTE ที่ไม่สงสัยเนื่องจากมีการครอสทอล์คกับวิถีทาง miRNA โดยที่ “บริเวณเมล็ดพันธุ์” ฐาน 6-7 อันสั้นจะกำหนดความจำเพาะของการปราบปราม ทำให้เกิดความเสี่ยงที่จะส่งผลกระทบต่อหลายๆ ยีนที่ไม่เกี่ยวข้อง 30 . อย่างไรก็ตาม องค์ประกอบขนาดใหญ่ของเส้นทาง OTE นี้เกิดจากการปราบปรามการแปล ซึ่งตามคำจำกัดความแล้ว ไม่สามารถส่งผลกระทบโดยตรงต่อฟังก์ชัน lncRNA วิธี CRISPR ก็มีความเสี่ยงต่อ OTE เช่นกัน การใช้วิธีการแก้ไขยีนไรโบนิวคลีโอโปรตีนโดยตรง (RNP) (โดยที่โปรตีน Cas9 และ RNA นำทางเพียงอย่างเดียวถูกใช้ในรูปแบบที่ปราศจาก DNA) แสดงโปรไฟล์ OTE ที่ต่ำกว่าวิธีการที่ใช้การแสดงออกมากเกินไปของ Cas9 และ RNA นำทาง ความเสี่ยง OTE 31 นอกจากนี้ยังมีการพัฒนาการกลายพันธุ์ของ Cas9 ซึ่งลดความเสี่ยงในการแสดงที่ไซต์นอกเป้าหมาย 32 อย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้น การใช้ 'วิธี CRISPR รุ่นใหม่' ที่ปรับปรุงแล้วจึงสามารถลดความเสี่ยงของ OTE ที่ส่งผลต่อผลลัพธ์ได้ ข้อกังวลเพิ่มเติม วิธี CRISPR ที่เปลี่ยนแปลง DNA ของเซลล์อย่างถาวรมักส่งผลให้เกิดการกลายพันธุ์ที่แตกต่างกันในแต่ละโครโมโซมในเซลล์หรือระหว่างเซลล์ในประชากร อาจจำเป็นต้องแยกสายพันธุ์เซลล์บริสุทธิ์ที่เป็นโคลนเพื่อการศึกษาก่อนที่จะสามารถสรุปผลจากการทดลองแก้ไขจีโนมประเภทนี้ได้

การค้นพบ lncRNAs นับพันและบทบาทที่คลุมเครือในกระบวนการเซลล์ได้เพิ่มความจำเป็นในการมีเทคนิคการทำให้ล้มลงที่เชื่อถือได้เพื่อช่วยกำหนดหน้าที่ของแต่ละตัว ความสามารถในการเลือกวิธีการทำให้ล้มลงซึ่งมีแนวโน้มว่าจะให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดจะช่วยประหยัดเวลาและค่าใช้จ่าย และยังช่วยให้การวิจัย lncRNA ดำเนินต่อไป ในที่นี้ เราอธิบายเทคนิคต่างๆ ที่สามารถใช้ได้โดยขึ้นอยู่กับการแปล lncRNA, lncRNA transcript (ใน) การเข้าถึงเอนไซม์ และภูมิทัศน์การถอดรหัสที่พวกมันอาศัยอยู่


การล้มลงของ Long Non-Coding RNA AFAP1-AS1 ส่งเสริมการมีชีวิตและการระงับการตายของ Cardiomyocytes ในการตอบสนองต่อ I/R ในหลอดทดลอง และใน Vivo

RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) มีบทบาทสำคัญในการพัฒนากล้ามเนื้อหัวใจตาย (MI) จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการศึกษาผลของ lncRNA actin filament-associated protein 1 antisense RNA 1 (AFAP1-AS1) ต่อวัฏจักรของเซลล์ การเพิ่มจำนวน และการตายของเซลล์ RT-qPCR ถูกใช้เพื่อตรวจหาระดับการแสดงออกของ AFAP1-AS1, miR-512-3p และเรติคูลอน 3 (RTN3) ในแบบจำลองหนูแรทของ I/R สภาพแวดล้อม MI จำลองถูกสร้างขึ้น การทดสอบ MTT และโฟลว์ไซโตเมทรีถูกใช้เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงในความมีชีวิตของคาร์ดิโอไมโอไซต์และวัฏจักรของเซลล์/การตายของเซลล์หลังจาก MI โดยการปิดเสียง AFAP1-AS1 หรือการปิดเสียง RTN3 ความสัมพันธ์การกำหนดเป้าหมายของ miR-512-3p และ AFAP1-AS1 และ RTN3 ใน cardiomyocytes ได้รับการยืนยันโดยการทดสอบนักข่าว luciferase แบบคู่ ระดับการแสดงออกของ AFAP1-AS1 และ RTN3 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในแบบจำลองหนูของ LAD ligation (หรือ MI) ligation ในขณะที่ระดับการแสดงออกของ miR-512-3p ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ AFAP1-AS1 และ RTN3 ที่แสดงออกมากเกินไปส่งเสริมการตายของเซลล์คาร์ดิโอไมโอไซต์และยับยั้งการเพิ่มจำนวนคาร์ดิโอไมโอไซต์ MiR-512-3p เป็นเป้าหมายโดยตรงของ AFAP1-AS1 และ RTN3 เป็นเป้าหมายโดยตรงของ miR-512-3p AFAP1-AS1 ส่งเสริมความก้าวหน้าของ MI โดยกำหนดเป้าหมายไปที่ miR-512-3p AFAP1-AS1 ส่งเสริมความก้าวหน้าของ MI โดยการปรับแกน miR-512-3p/RTN3 AFAP1-AS1 อาจเป็นเป้าหมายการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับ MI

บทบาทของ AFAP1-AS1 ในการควบคุมการบาดเจ็บของ MI ในร่างกาย (A) ผลของ AFAP1-AS1 ในการบาดเจ็บ MI ในร่างกาย (B) ระดับ mRNA ของ RTN3 ในการบาดเจ็บของ MI ในร่างกาย (C) ระดับโปรตีนของ RTN3 ในการบาดเจ็บของ MI ในร่างกาย (D) ผลกระทบของ miR-512-3p ในกลุ่มโมเดล MI (E) การทดสอบ TUNEL *NS < 0.05, **NS < 0.01 เทียบกับกลุ่มหลอกลวง #NS < 0.05, ##NS < 0.01 เทียบกับกลุ่ม MI


การล้มลงของ PU.1 AS lncRNA ยับยั้งการสร้าง adipogenesis โดยการเพิ่มการแปล PU.1 mRNA

ติดต่อกับ: Wei-Jun Pang, PhD., Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, 22 Xinong Road, Yangling, Shaanxi Province 712100, China

ศูนย์วิจัยโภชนาการเด็ก วิทยาลัยแพทยศาสตร์เบย์เลอร์ เมืองฮุสตัน รัฐเท็กซัส 77030

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ศูนย์วิจัยโภชนาการเด็ก วิทยาลัยแพทยศาสตร์เบย์เลอร์ เมืองฮุสตัน รัฐเท็กซัส 77030

ติดต่อกับ: Wei-Jun Pang, PhD., Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, 22 Xinong Road, Yangling, Shaanxi Province 712100, China

ศูนย์วิจัยโภชนาการเด็ก วิทยาลัยแพทยศาสตร์เบย์เลอร์ เมืองฮุสตัน รัฐเท็กซัส 77030

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

ห้องปฏิบัติการการสะสมไขมันสัตว์และการพัฒนากล้ามเนื้อ วิทยาลัยสัตวศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัย Northwest A&F เมืองหยางหลิง 712100 ประเทศจีน

บทคัดย่อ

PU.1 เป็นปัจจัยการถอดรหัสตระกูล Ets ที่เกี่ยวข้องกับความแตกต่างของ myelo-lymphoid ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่า PU.1 ยังแสดงออกในเชื้อสาย adipocyte อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกของ PU.1 mRNA และโปรตีนใน preadipocytes ไม่ตรงกับระดับใน adipocytes ที่เจริญเต็มที่ ระดับ PU.1 mRNA นั้นสูงกว่าใน preadipocytes ในขณะที่โปรตีนของมันถูกแสดงออกใน adipocytes แต่ไม่ใช่ใน preadipocytes กลไกพื้นฐานยังคงเข้าใจยาก ที่นี่ เราพบว่าการล้มลงของ miR-155 หรือการแสดงออกที่มากเกินไปไม่มีผลต่อระดับของ PU.1 mRNA และโปรตีนใน preadipocytes หรือ adipocytes MiR-155 ควบคุมการสร้างไขมันไม่ผ่าน PU.1 แต่ผ่าน C/EBPβ ซึ่งเป็นอีกเป้าหมายหนึ่งของ miR-155 เรายังตรวจสอบระดับการแสดงออกของ PU.1 mRNA และ antisense long non-coding RNA (AS lncRNA) น่าสนใจ เมื่อเปรียบเทียบกับระดับของ PU.1 mRNA ระดับของ PU.1 AS lncRNA นั้นสูงกว่ามากใน preadipocytes ในขณะที่อยู่ตรงข้ามใน adipocytes เราค้นพบเพิ่มเติมว่า PU.1 AS lncRNA จับกับ mRNA ของมันซึ่งก่อรูปสารประกอบ mRNA/AS lncRNA การทำให้ล้มลงของ PU.1 AS โดย siRNA ยับยั้งการสร้าง adipogenesis และส่งเสริมการแสดงออกของโปรตีน PU.1 ทั้งใน preadipocytes และ adipocytes นอกจากนี้ การยับยั้ง PU.1 AS ยังลดการแสดงออกและการหลั่งของ adiponectin นอกจากนี้เรายังพบว่าผลกระทบของการล้มลงของ PU.1 AS ที่อาศัยรีโทรไวรัสต่อการสร้างไขมันนั้นสอดคล้องกับผลของ PU.1 AS การทำให้ล้มลงโดย siRNA เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า PU.1 AS lncRNA ส่งเสริมการสร้างไขมันผ่านการป้องกันการแปล PU.1 mRNA ผ่านการผูกมัดกับ PU.1 mRNA เพื่อสร้าง mRNA/AS lncRNA duplex ใน preadipocytes เจเซลล์. ไบโอเคมี. 114: 2500–2512, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.

ข้อมูลสนับสนุนเพิ่มเติมสามารถพบได้ในเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่เว็บไซต์ของผู้จัดพิมพ์

ชื่อไฟล์ คำอธิบาย
jcb24595-sm-0001-SupFig-S1.tif14.7 MB มะเดื่อ S1 ตอบ: miRNAs ที่คาดการณ์ไว้กำหนดเป้าหมาย PU.1 mRNA โดยใช้ TargetScan Release 6.2 B: ข้อมูลสถิติของการจับคู่ผลลัพธ์ที่คาดการณ์ไว้ระหว่าง PU.1 mRNA และ miRNA-155
jcb24595-sm-0002-SupFig-S2.tif11.6 MB มะเดื่อ S2 ตอบ: miRNAs ที่คาดการณ์ไว้กำหนดเป้าหมาย C/EBPβ mRNA โดยใช้ TargetScan Release 6.2 B: ข้อมูลสถิติของการจับคู่ผลลัพธ์ที่คาดการณ์ไว้ระหว่าง C/EBPβ mRNA และ miRNA-155
jcb24595-sm-0003-SupFig-S3.tif3.1 MB มะเดื่อ S3 การแสดงออกในช่วงเวลาของ adiponectin ระหว่างการแยก preadipocyte

โปรดทราบ: ผู้จัดพิมพ์จะไม่รับผิดชอบต่อเนื้อหาหรือการทำงานของข้อมูลสนับสนุนใด ๆ ที่จัดทำโดยผู้เขียน คำถามใด ๆ (นอกเหนือจากเนื้อหาที่ขาดหายไป) ควรส่งไปยังผู้เขียนที่เกี่ยวข้องสำหรับบทความ


เครือข่ายการกำกับดูแลยีนควบคุมการพัฒนาเซลล์ประสาท

27.6.3 lncRNA—หลักฐานสำหรับการทำงาน

RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNAs) เป็นสปีชีส์ของการถอดรหัสที่เกิดจาก DNA ระหว่างยีน ซึ่งมีความยาวมากกว่า 200 นิวคลีโอไทด์ แต่สั้นกว่า mRNA ส่วนใหญ่ และโดยทั่วไปจะแสดงออกมาในระดับต่ำ ไม่มีหลักฐานว่ารหัสการถอดเสียงเหล่านี้สำหรับโปรตีน และ lncRNA ส่วนใหญ่ดูเหมือนจะไม่มีข้อจำกัดโดยการคัดเลือกโดยธรรมชาติเมื่อเทียบกับยีนที่เข้ารหัสโปรตีน ( Perry and Ulitsky, 2016 Ramos et al., 2016 ) การสังเกตว่าจีโนมส่วนใหญ่ถูกถอดความเรียกการทำงานของการถอดเสียงเหล่านี้เป็นคำถาม (Birney et al., 2007) อย่างไรก็ตาม lncRNA ประมาณ 1,000 ตัวมีการแสดงออกในระดับปานกลางถึงสูงในมนุษย์และแสดงสัญญาณของข้อจำกัดทางวิวัฒนาการ ซึ่งบ่งชี้อย่างชัดเจนว่าพวกมันใช้งานได้ ( Hezroni et al., 2015 )นอกจากนี้ยังมีคำแนะนำว่าฟังก์ชันนี้อาจมีความสำคัญต่อการพัฒนาสมอง เนื่องจาก ∼40% ของ lncRNAs ที่มีการแสดงออกเฉพาะเนื้อเยื่อมาจากสมอง และสิ่งเหล่านี้เป็นหนึ่งใน lncRNAs ที่แสดงออกอย่างแตกต่างที่สุด ( Derrien et al., 2012 ) นอกจากนี้ lncRNA ยังแสดงแบบไดนามิกในลักษณะเฉพาะของสมองในระหว่างการพัฒนาสมองและการสร้างความแตกต่างของต้นกำเนิดของระบบประสาท ( Aprea et al., 2013 Mercer et al., 2008 Ramos et al., 2013 )

มีสามหมวดหมู่ทั่วไปที่เสนอสำหรับกลไกของการกระทำโดย lncRNAs: การกดขี่ที่เกิดจากการถอดความ ซิส-, และ ทรานส์-ทำหน้าที่ lncRNAs ( รูปที่ 27.4B, C ) ส่วนหลังของบริเวณที่คัดลอกมาของจีโนมมักถูกทำเครื่องหมายโดย H3K36me3 สำหรับการกดขี่ สันนิษฐานว่าเพื่อลดการถอดรหัสภายนอกที่ปลายน้ำของโปรโมเตอร์ยีนที่จะรบกวนการแสดงออกหรือการทำงานของยีน ในลักษณะนี้ lncRNA ที่ทับซ้อนโปรโมเตอร์อาจส่งผลให้เกิดการปราบปรามของโปรโมเตอร์นั้น ( Carrozza et al., 2005 Fang et al., 2010 Wagner and Carpenter, 2012 ) ในกรณีนี้ การถอดความของโลคัสและไม่ใช่ lncRNA นั้นมีความสำคัญตามหน้าที่ กลไกหลักของการออกฤทธิ์ของ lncRNAs ดูเหมือนว่าจะผูกมัดกับปัจจัยทั้งที่ไซต์ของการถอดรหัสหรือในบริเวณใกล้เคียงของ DNA ( Kotake et al., 2011 Monnier et al., 2013 Nagano et al., 2008 Wang et al., 2011 Yang et al., 2014 Yap et al., 2010 ). การผูกปัจจัยสามารถนำไปสู่ตำแหน่งเป้าหมาย ( Sigova et al., 2015 ) หรือแยกส่วนออกไป ( Krawczyk and Emerson, 2014 ) นอกจาก cis ผลกระทบ lncRNAs ได้รับการเสนอให้ทำหน้าที่ใน ทรานส์ เพื่อคัดเลือกโปรตีนดัดแปลงโครมาตินไปยังลำดับเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจง คล้ายกับ TFs ( Koziol และ Rinn, 2010 ) แต่กลไกระดับโมเลกุลของการรู้จำลำดับไม่เป็นที่ทราบ และมีการถกเถียงกันว่า lncRNAs ที่มีปริมาณน้อยโดยทั่วไปสามารถดำเนินการกับตำแหน่งได้อย่างมีประสิทธิภาพหรือไม่ ทรานส์ เนื่องจากความกังวลเกี่ยวกับปริมาณสัมพันธ์ ( Perry and Ulitsky, 2016 ). ทรานส์-การแสดง lncRNAs อาจมีบทบาทสำคัญในการรักษาโครงสร้างนิวเคลียร์ ( Batista and Chang, 2013 ) และในการควบคุมการแปลในไซโตพลาสซึม ( Lee and Bartolomei, 2013 Memczak et al., 2013 Tichon et al., 2016 ).

โดยไม่คำนึงถึงกลไก lncRNAs บางอย่างดูเหมือนจะมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาสมองและมีส่วนทำให้เกิดสาเหตุของโรคทางระบบประสาท อันตราย เป็น lncRNA ที่จำเป็นซึ่งแสดงออกในเซลล์ต้นกำเนิดประสาทและสมองของผู้ใหญ่ อันตราย หนู KO แสดงการควบคุมยีนของวัฏจักรเซลล์ที่ผิดพลาดซึ่งมีความสำคัญต่อการสร้างความแตกต่างของต้นกำเนิดของระบบประสาทและครึ่งหนึ่งของหนูเหล่านี้ตาย 2-20 วันหลังคลอด (Goff et al., 2015 Sauvageau et al., 2013) อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ Sox2, ยีนที่ใกล้ที่สุดถึง อันตราย และปัจจัย pluripotency ที่สำคัญไม่ได้รับผลกระทบ ( Sauvageau et al., 2013 ) Evf2 เป็น lncRNA ที่อยู่ระหว่าง Dlx5 และ Dlx6 ยีน TFs สองตัวที่สำคัญสำหรับการพัฒนา interneuron ใน forebrain และ Evf2 การถอดเสียงจะควบคุมการแสดงออกของ TFs เหล่านี้บางส่วนโดยการปรับ methylation ของ Dlx5/6 เอนแฮนเซอร์ ( Berghoff et al., 2013 Bond et al., 2009 ). Evf2 หนู KO ได้ลดจำนวนของเซลล์ประสาท GABAergic ในฮิบโปไม่นานหลังคลอดและขาดดุลถาวรในการยับยั้ง synaptic ในผู้ใหญ่ ( Bond et al., 2009 ) LncND เป็น lncRNA ที่ในไพรเมต catarrhine (ลิงโลกเก่า ลิง และมนุษย์) ได้รับองค์ประกอบการตอบสนอง 16 miRNA ที่ผูกมัดและยับยั้งการทำงานของ miRNA ที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนและความแตกต่างของเกลียในแนวรัศมี (Rani et al., 2016) การยับยั้งการทำงานของ miRNA นี้ ซึ่งนำไปสู่การขยายตัวของสระต้นกำเนิดประสาท อาจเป็นเหตุผลหนึ่งที่ทำให้การขยายเปลือกสมองในไพรเมตเหล่านี้ ในที่สุดก็มีหลักฐานจากการศึกษาหลายครั้งเกี่ยวกับการมีส่วนร่วมของ lncRNAs ใน SCZ พัฒนาการล่าช้าและ ASD ( Barry et al., 2014 Meng et al., 2018 Millar et al., 2004 Talkowski et al., 2012 Ziats and Rennert, 2557 ).


ผลลัพธ์

การระบุ lncRNA973 ในฝ้าย

การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราเกี่ยวข้องกับ lncRNA ที่เกี่ยวข้องกับเกลือ lncRNA973 [31] ซึ่งได้รับเลือกสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม มันถูกระบุว่าเป็นความรู้สึกระหว่างยีน lncRNA ระหว่างยีน Gh_D04G0659 และ Gh_D04G0660 ดูเหมือนว่าจะคัดลอกมาจาก RNA Pol II และมีปลายโพลิอะดีนิเลต 3′ เราวิเคราะห์โครงสร้างของ lncRNA973 ซึ่งมีอินตรอนและเอ็กซอน (รูปที่ 1a) คล้ายกับ mRNA นอกจากนี้ lncRNA973 ยังอยู่บนสายความรู้สึกของโครโมโซม 4 ในจีโนม D และมีการถอดเสียงสองแบบ (lncRNA973 X1 และ lncRNA973 X2). บริเวณจีโนมที่สอดคล้องกันคือ

3.2 Kb พร้อม lncRNA973 X1 และ lncRNA973 X2 มีความยาว 2134 bp และ 2888 bp ตามลำดับ นอกจากนี้ lncRNA973 X2 มีเอ็กซอนยาวกว่า lncRNA973 X1 ดังนั้นไพรเมอร์สำหรับตรวจจับการแสดงออกของ lncRNA973 X2 ได้รับการออกแบบสำหรับ exon นี้ ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบที่ตำแหน่ง exon นี้เพื่อแยกความแตกต่างจาก lncRNA973 X1. ระดับการแสดงออกของ lncRNA973 X1 และ X2 วิเคราะห์ในลำต้น ราก และใบเลี้ยงโดยใช้ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR) และระดับการแสดงออกของ lncRNA973 X1 ในรากและใบเลี้ยงค่อนข้างสูง ในขณะที่ของ lncRNA973 X2 ค่อนข้างต่ำในเนื้อเยื่อเหล่านี้ (รูปที่ 1b) นอกจากนี้ เรายังตรวจพบระดับการแสดงออกของสองทรานสคริปต์ของ lncRNA973 ในใบจริงของฝ้ายที่บำบัดด้วย NaCl (250 มิลลิโมล/ลิตร) ที่จุดเวลาที่ต่างกัน (0, 1, 3, 6, 12 และ 24 ชั่วโมง) การแสดงออกของ lncRNA 973 X1 ถึงจุดสูงสุดที่ 6 และ 24 ชั่วโมงในขณะที่การแสดงออกของ lncRNA973 X2 ต่ำในช่วงเวลาต่างๆ (รูปที่ 1c) ดังนั้นเราจึงเลือก lncRNA973 X1 เพื่อศึกษาต่อ นอกจากนี้ ได้ทำการวิเคราะห์การอนุรักษ์ลำดับ เช่นเดียวกับ lncRNAs อื่น ๆ lncRNA973 ไม่มี homologs ในพืชชนิดอื่น ในการตรวจสอบที่มาของ lncRNA973 เราวิเคราะห์วิวัฒนาการและความคล้ายคลึงกันในสายพันธุ์อื่นและพบว่าเป็นยีนใหม่ที่มีต้นกำเนิดมาจาก G. raimondii. การจัดลำดับของมันใน G. hirsutum ไม่พบบริเวณที่คล้ายคลึงกันบนโครโมโซม 4 ของจีโนม A ซึ่งสอดคล้องกับต้นกำเนิดวิวัฒนาการ

ลักษณะของ lncRNA973 NS. แผนผังแสดงตำแหน่งของ lncRNA973 ในโครโมโซม กล่องสีเหลืองแสดง exon ของ lncRNA973 P1 และ P2 ระบุไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ qRT-PCR เพื่อตรวจจับระดับการแสดงออกของ lncRNA973 X1 และ lncRNA973 X2ตามลำดับ NS. ระดับการแสดงออกของการถอดเสียง lncRNA973 ในก้านสำลี ราก และใบเลี้ยง กำหนดโดย qPCR . ระดับการแสดงออกของ lncRNA973 X1 และ X2 ในใบจริงของฝ้ายที่บำบัดด้วย NaCl 250 mM ที่จุดเวลาที่ต่างกัน กำหนดโดย qPCR ระดับการแสดงออก lncRNA973 ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดย GhUBQ7 ระดับการแสดงออก ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ lncRNA973 ในก้านและ NaCl-0 ชั่วโมงถูกกำหนดเป็น 1 ตามลำดับ แถบค่าคลาดเคลื่อนระบุ ±SD ของการจำลองทางชีวภาพสามแบบ โดยแต่ละอันวัดเป็นสามเท่า ตัวอย่างที่ทำเครื่องหมายด้วยตัวอักษรต่างกันแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญที่ NS < 0.05. NS. การวิเคราะห์ศักยภาพการเข้ารหัสของ lncRNA973 การเข้ารหัสคะแนนที่เป็นไปได้ถูกสร้างขึ้นโดยใช้โปรแกรม CPC PHO2 และ GhActin ให้ไว้เป็นตัวอย่างการเข้ารหัส อากาศเย็น และ Xist เป็นตัวแทนของตัวอย่างที่ไม่เข้ารหัส

การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ (http://cpc.cbi.pku.edu.cn/) เปิดเผยว่า lncRNA973 ไม่มีความสามารถในการเข้ารหัส (รูปที่ 1d) เครื่องมือออนไลน์ ORF Finder ใช้เพื่อทำนาย ORF ห้าตัวบน lncRNA973 X1 (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S1a) ที่มีกรดอะมิโนตั้งแต่ 29 ถึง 107 ตัว นอกจากนี้ ตามการค้นหาแบบคล้ายคลึงกันของตระกูลโปรตีนขนาดใหญ่และฐานข้อมูลโดเมน (Pfam และ SMART ตามลำดับ) ไม่พบโดเมนที่ทำงานได้ตรงกับเปปไทด์ใดๆ

การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ lncRNA973

หน้าที่ของ lncRNAs นั้นสัมพันธ์กับการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของพวกมัน [32] เพื่อตรวจสอบการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ lncRNA973 การผสมพันธุ์แบบเรืองแสงในแหล่งกำเนิดในรากถูกดำเนินการโดยใช้โพรบที่ติดฉลาก DIG แบบปลายคู่ที่จำเพาะต่อ lncRNA973 เพื่อยืนยันการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ lncRNA973 นิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI และการดูแลทำความสะอาด mRNA (GhUBQ7) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก สำหรับ lncRNA973 และ GhUBQ7 โพรบ การวิเคราะห์ความจำเพาะของลำดับถูกดำเนินการในจีโนมของฝ้าย และเลือกโพรบที่จำเพาะสำหรับไฮบริไดเซชัน สัญญาณเรืองแสงของ lncRNA973 ส่วนใหญ่สามารถเห็นได้ในนิวเคลียสของเซลล์รากที่ถูกไฮบริไดซ์กับโพรบที่ติดฉลาก DIG และยังเป็นสัญญาณที่อ่อนแอในไซโตพลาสซึม (รูปที่ 2) สัญญาณเรืองแสงของตัวควบคุมเชิงบวก GhUBQ7 สามารถเห็นได้ในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึม นอกจากนี้ เรายังแยกและทำให้ RNA บริสุทธิ์จากไซโตพลาสซึมและนิวเคลียสตามลำดับ และใช้สำหรับ RT-PCR U6 ส่วนใหญ่แสดงออกในนิวเคลียสในขณะที่ tRNA ส่วนใหญ่อยู่ในไซโตพลาสซึม ดังนั้นการแยกนิวเคลียสและไซโตพลาสซึมจึงแตกต่างกัน ผลลัพธ์ RT-PCR แสดงให้เห็นว่า lncRNA973 ถูกทำให้สมบูรณ์อย่างสูงในนิวเคลียส (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S1b) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าทรานสคริปต์ของ lncRNA973 ส่วนใหญ่อยู่ในนิวเคลียสและมีสัญญาณเพียงเล็กน้อยในไซโตพลาสซึม

การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ lncRNA973 การผสมพันธุ์แบบเรืองแสงในแหล่งกำเนิดด้วยโพรบ lncRNA973 แอนติเซนส์ที่ติดฉลาก DIG ถูกดำเนินการในรากฝ้ายอายุ 10 วัน mRNA การดูแลทำความสะอาด (GhUBQ7) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก บาร์ = 20 μm

การแสดงออกของ lncRNA973 มากเกินไปจะเพิ่มการตอบสนองของความเครียดจากเกลือใน Arabidopsis

เพื่อระบุบทบาทของ lncRNA973 ในการตอบสนองของพืชต่อความเครียดจากเกลือ ได้ทำการโคลนการถอดเสียง lncRNA973 แบบเต็มความยาว (ไฟล์เพิ่มเติม 2: รูปที่ S2a) เวกเตอร์การแสดงออกมากเกินไปที่มีโปรโมเตอร์โปรตีนยูบิควิติน Ubi ถูกสร้างขึ้น (ไฟล์เพิ่มเติม 2: รูปที่ S2b) แล้ว อะโกรแบคทีเรียม ทูเมฟาเซียน (GV3101) - การแปลงที่เป็นสื่อกลางของชนิดไวด์ (WT) Arabidopsis (อีโคไทป์ Col-0) ถูกดำเนินการ ได้รับสายแปลงพันธุ์ที่เป็นอิสระห้าสาย และการแสดงออกที่มากเกินไป (OX-) สามรายการ (OX-lncRNA973–2, OX-lncRNA973–3 และ OX-lncRNA973–5) ถูกเลือกสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม (ไฟล์เพิ่มเติม 2: รูปที่ S2c) สายพันธุ์แปลงพันธุ์ไม่แตกต่างทางฟีโนไทป์จากกลุ่มควบคุมเมื่อไม่ถูกบำบัด ทำ PCR แบบเรียลไทม์เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของการถอดเสียง lncRNA973 ในการแปลงพันธุ์ Arabidopsis. ระดับการแสดงออกของ lncRNA973 ในพืชแปลงพันธุ์มีค่ามากกว่าใน WT อย่างมีนัยสำคัญ (ไฟล์เพิ่มเติม 2: รูปที่ S2d) เพื่อตรวจสอบความสามารถของพืชดัดแปรพันธุกรรมเพื่อควบคุมการตอบสนองต่อความเครียดจากเกลือ ชนิดพันธุ์ป่า (WT) และพันธุ์แปลงพันธุ์ Arabidopsis เมล็ด (OX-lncRNA973) ถูกวางบนอาหาร 1/2 MS ที่เป็นของแข็งที่เสริมด้วย NaCl 0 mM, 100 mM และ 150 mM จากนั้น เรากำหนดอัตราการงอกของเมล็ดที่ได้รับการบำบัดด้วยเกลือที่มีความเข้มข้นต่างกันตั้งแต่ 1 ถึง 7 วัน และลักษณะฟีโนไทป์หลังจากการงอกของเมล็ด บรรทัด OX-lncRNA973 ไม่แสดงฟีโนไทป์ที่ผิดปกติภายใต้สภาวะปกติ (0 มิลลิโมลาร์) อัตราการงอกของสายพันธุ์ OX-lncRNA973 ที่เติบโตภายใต้สภาวะปกติ (0 มิลลิโมลาร์) ส่งผลให้ไม่มีฟีโนไทป์ที่ผิดปกติเมื่อเปรียบเทียบกับของ WT (รูปที่ 3a) ที่ 3 วันหลังการบำบัดด้วย 100 มิลลิโมลาร์ NaCl อัตราการงอกของเมล็ดพันธุ์ OX-lncRNA973 เท่ากับ 55 ถึง 60% และมากกว่าของ WT ที่การบำบัดด้วยเกลือ 7 วัน อัตราการงอกเฉลี่ยของสายพันธุ์ OX-lncRNA973 เท่ากับ

95% ซึ่งสูงกว่า WT (

80%) (รูปที่ 3b) นอกจากนี้ น้ำหนักสด ความยาวราก และใบเลี้ยงสีเขียวของสายพันธุ์ WT และ OX-lncRNA973 เปลี่ยนแปลงภายใต้สภาวะการบำบัดด้วย NaCl การสัมผัสกับ NaCl 100–150 mM ยังยับยั้งการเขียวของใบเลี้ยงในต้นกล้า OX-lncRNA973 แต่ผลกระทบนั้นรุนแรงน้อยกว่าใน WT (รูปที่ 3c) ต้นกล้า OX-lncRNA973 มีน้ำหนักสดมากกว่ากลุ่มควบคุม (รูปที่ 3c) การยืดตัวของรากถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญโดย 100–150 mM NaCl ในขณะที่ต้นกล้า OX-lncRNA973 มีระดับความทนทานต่อความเค้นของเกลือมากกว่าตามที่ระบุโดยการเติบโตของราก (รูปที่ 3e-f) นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบตัวบ่งชี้ทางสรีรวิทยาหลายอย่างเพื่อหารือเกี่ยวกับความทนทานของพืช OX-lncRNA973 ต่อความเครียดจากความเค็ม เช่น มาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) โพรลีน (Pro) ปริมาณคลอโรฟิลล์และกิจกรรมคาตาเลส (CAT) ภายใต้สภาวะการเจริญเติบโตปกติ เนื้อหาของคลอโรฟิลล์ MDA และ Pro และกิจกรรม CAT ในสาย WT และ OX-lncRNA973 มีความคล้ายคลึงกัน อย่างไรก็ตาม หลังการบำบัดด้วย NaCl 200 mM ปริมาณคลอโรฟิลล์ทั้งหมดลดลง และปริมาณคลอโรฟิลล์ในพืช WT ลดลงมากกว่าพืช OX-lncRNA973 (รูปที่ 3g) ปริมาณ MDA และโพรลีนถูกยกระดับในพืชทั้ง WT และ OX-lncRNA973 และพืช WT เพิ่มขึ้นมากกว่าพืช OX-lncRNA973 (รูปที่ 3h-i) กิจกรรม CAT ของพืช WT ถูกยับยั้งหลังการบำบัดด้วย NaCl และกิจกรรม CAT ของพืช OX-lncRNA973 สูงขึ้น (รูปที่ 3j) ดังนั้น การวิเคราะห์ฟีโนไทป์และตัวบ่งชี้ทางสรีรวิทยาของพืช WT และ OX-lncRNA973 แสดงให้เห็นว่าพืช OX-lncRNA973 มีความทนทานต่อความเครียดจากเกลือมากกว่าพืชควบคุม

บรรทัด lncRNA973 ที่แสดงออกมากเกินไปจะทนต่อความเค้นของเกลือได้ดีกว่า NS-NS. เพาะเมล็ดบนอาหาร ½ MS ที่มีโซเดียมคลอไรด์ 0 และ 100 มิลลิโมลาร์ วัดอัตราการงอกในช่วงหนึ่งสัปดาห์ -อี. ใบเลี้ยงสีเขียว น้ำหนักสด และการยืดตัวของรากปฐมภูมิของต้นกล้าอายุ 7 วันที่มีโซเดียมคลอไรด์ 0–150 มิลลิโมลาร์ NS. ฟีโนไทป์ของการเจริญเติบโตของรากปฐมภูมิของต้นกล้าอายุ 7 วันที่มีโซเดียมคลอไรด์ 0–150 มิลลิโมลาร์ NS-ผม. ปริมาณคลอโรฟิลล์ MDA และ Pro ทั้งหมดในใบภายใต้ความเครียดจากเกลือ NS. กิจกรรมของ catalase (CAT) หลังการบำบัดด้วยเกลือและการจำลอง เยาะเย้ยด้วยการบำบัดน้ำ NaCl: การบำบัดด้วย NaCl 200 mM แท่งแนวตั้งแสดงถึง ±SD ของค่าเฉลี่ยที่มีการทำซ้ำสามแบบ เครื่องหมายดอกจันบ่งชี้ว่าค่าเฉลี่ยแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างพืชแปลงพันธุ์และ WT (NS < 0.05)

การปิดเสียง lncRNA973 ทำให้เกิดความไวต่อความเครียดจากเกลือ

เพื่อสำรวจบทบาทที่เป็นไปได้ของ lncRNA973 เพิ่มเติมในการต้านทานของฝ้ายต่อความเครียดจากเกลือ เราได้ปิดเสียง lncRNA973 ใน G. hirsutum ‘SN91–11’ โดยใช้การปิดเสียงของยีนที่เกิดจากไวรัส (VIGS) ซึ่งมักใช้ในการวิเคราะห์การทำงานของยีน ลำดับ VIGS ของ lncRNA973 และ CLOROPLASTOS ALTERADOS 1 (CLA1) ยีนถูกโคลนอย่างอิสระในเวกเตอร์ TRV2 (รูปที่ 4a) ซึ่งสร้าง TRV2:lncRNA973 และ TRV2:CLA1ตามลำดับ TRV2:CLA1 และเวกเตอร์ TRV2 เปล่า (TRV2) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกและเชิงลบ ตามลำดับ ชิ้นส่วน lncRNA973 ประมาณ 490 bp และ 465 bp ของ CLA1 ใช้ในระบบ VIGS ที่ประมาณ 2 สัปดาห์หลังการแทรกซึม ยีนมาร์กเกอร์ TRV2:CLA1-พืชที่ประกอบด้วยพืชเริ่มแสดงฟีโนไทป์เผือกในใบจริง (รูปที่ 4c) ระดับการแสดงออกของ lncRNA973 ในต้นฝ้ายที่มี TRV2:lncRNA973-(VIGS) และ TRV2 (เวกเตอร์เปล่า) ถูกประเมินโดยใช้ qRT-PCR ดังแสดงในรูปที่ 4b การแสดงออกที่ลดลงอย่างมากของ lncRNA973 ในโรงงาน VIGS แสดงให้เห็นว่ามันถูกทำให้ล้มลงได้สำเร็จ การแสดงออกของยีน lncRNA973-adjacent Gh_D04G0660 ในจีโนมไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญ (ไฟล์เพิ่มเติม 3: รูปที่ S3) เราเลือกพืช VIGS สองแห่งและพืช TRV2 (กลุ่มควบคุมที่ว่างเปล่า) หนึ่งแห่งสำหรับการบำบัดความเครียดด้วยเกลือ พืชได้รับการชลประทานด้วย NaCl 250 mM และที่ 3 วันหลังการบำบัดด้วยเกลือ พืช VIGS จะแสดงฟีโนไทป์การเหี่ยวแห้งและการผลัดใบที่รุนแรงกว่าพืชควบคุม และก้านของต้น VIGS ที่ขาดน้ำจะมีสีน้ำตาลอย่างรุนแรง ในขณะที่ลำต้นของ TRV2 พืชยังคงเป็นสีเขียว (รูปที่ 4c) ดังนั้น เส้น VIGS จึงไวต่อสภาวะที่เกิดความเครียดจากเกลือ

การระบุหน้าที่ของ lncRNA973 ที่มีต่อความเค้นของเกลือโดยใช้วิธีการปิดเสียงของยีนที่เกิดจากไวรัส (VIGS) NS. การก่อสร้าง TRV2:GhCLA1 และเวกเตอร์ lncRNA973 VIGS NOS ใช้เป็นค่าความต้านทาน NS. ระดับการถอดรหัส lncRNA973 สัมพัทธ์ในใบของ TRV2:lncRNA973 และพืชควบคุม (TRV2:00) GhUBQ7 ใช้เป็นตัวควบคุมภายใน ค่าแท่งแต่ละค่าแสดงถึงค่าเฉลี่ย± SD ของการทดลองอิสระสามรายการ . ฟีโนไทป์ของพืช lncRNA973 ที่ปิดเสียงที่การบำบัดด้วยเกลือ 3 มิติ ซึ่งแสดงฟีโนไทป์ที่เหี่ยวแห้ง ใบที่กำจัดแล้ว เยาะเย้ย: หมายถึงการเทน้ำปริมาณเท่ากัน ความเงียบจากภายนอก Cloroplastos alterados 1 (CLA1) ในฝ้ายผ่าน VIGS ที่มี TRV เป็นสื่อกลางถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ต้นกล้าฝ้ายอายุ 10 วัน (G. hirsutum ล., ประวัติย่อ SN91–11) ที่มีใบเลี้ยงสองใบถูกแทรกซึมด้วย TRV2:CLA1และพืชก็เริ่มแสดงฟีโนไทป์เผือกในใบจริงในเวลาประมาณ 2 สัปดาห์ต่อมา d-f. MDA น้ำสัมพัทธ์และปริมาณ Pro ในใบภายใต้ความเครียดจากเกลือ g-i. กิจกรรมของเอนไซม์กำจัด ROS หลังการบำบัดด้วยเกลือ: NS: คาตาเลส (CAT), ชม: ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD), ผม: เปอร์ออกซิเดส (POD) ตามลำดับ เจ-ล. การสะสมโซเดียม (Na + ) และโพแทสเซียม (K + ) และอัตราส่วน K + /Na + ใน TRV2:00 และ TRV2:lncRNA973 พืชใต้น้ำและสภาวะ NaCl เยาะเย้ยด้วยการบำบัดน้ำ NaCl: การบำบัดด้วย NaCl 250 mM *, NS < 0.05 และ **, NS < 0.01 โดย Student's NS- ทดสอบเปรียบเทียบกับต้นกล้า TRV2 ที่ไม่ผ่านการบำบัด (Mock) หรือเกลือ การแสดงข้อมูลหมายถึง ± SD

นอกจากนี้ เพื่อตรวจสอบความทนทานของฝ้าย VIGS ต่อความเครียดจากความเค็ม เราได้ตรวจสอบตัวชี้วัดทางสรีรวิทยา เช่น MDA ปริมาณ Pro ปริมาณน้ำสัมพัทธ์ กิจกรรมของเอนไซม์กำจัด ROS และปริมาณ Na + และ K + ไม่มีความแตกต่างในตัวบ่งชี้ทางสรีรวิทยาระหว่างพืช VIGS และ TRV2 ภายใต้สภาวะการเจริญเติบโตปกติ ปริมาณ MDA ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ความเครียดออกซิเดชัน มีค่ามากกว่าในพืช VIGS อย่างมีนัยสำคัญมากกว่าในพืช TRV2 ภายใต้สภาวะความเครียดจากเกลือ (รูปที่ 4d) ปริมาณน้ำแบบโปรและแบบสัมพัทธ์เป็นดัชนีความต้านทานความเครียดที่สำคัญสองค่า การสะสม Pro เพิ่มขึ้นในพืชทั้ง TRV2 และ VIGS ที่บำบัดด้วยเกลือ แต่การสะสมมีความสำคัญมากกว่าในพืช VIGS (รูปที่ 4e) ปริมาณน้ำสัมพัทธ์ในพืช VIGS มีค่าน้อยกว่าในพืช TRV2 อย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะความเครียดจากเกลือ ซึ่งบ่งชี้ว่าการสูญเสียน้ำในพืช VIGS นั้นมากกว่า ซึ่งสอดคล้องกับฟีโนไทป์ (รูปที่ 4f)

กิจกรรมของเอนไซม์กำจัด ROS เช่น superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) และ catalase (CAT) มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองต่อความเครียดต่อความทุกข์ยาก กิจกรรมของเอนไซม์กำจัด ROS ลดลงในพืชทั้ง TRV2 และ VIGS ที่บำบัดด้วยเกลือ อย่างไรก็ตาม ฝ้าย VIGS มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญมากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับพืช TRV2 (รูปที่ 4g) Na + ที่มากเกินไปเป็นพิษต่อพืช ในขณะที่ K + เป็นปฏิปักษ์กับ Na + ภายใต้สภาวะความเครียดจากเกลือ [33] ไม่มีความแตกต่างในความเข้มข้นของ Na + และ K + ในพืช TRV2 และ VIGS ภายใต้สภาวะปกติ อย่างไรก็ตาม เมื่อสัมผัสกับความเครียดจากเกลือ พืช VIGS จะสะสม Na + มากกว่า ในทางกลับกัน ความเข้มข้นของ Na + นั้นต่ำกว่าในพืช TRV2 เมื่อเปรียบเทียบกับในพืช VIGS (รูปที่ 4h)ระดับที่ต่ำกว่าของ K + ในพืช VIGS และระดับที่สูงกว่าในพืช TRV2 ถูกกำหนดหา (รูปที่ 4i) ความไม่สมดุลระหว่างระดับ Na + และ K + ทำให้อัตราส่วน K + /Na + ในพืช VIGS ลดลง (รูปที่ 4j) นอกจากนี้ เรายังตรวจพบคลอโรฟิลล์ MDA ปริมาณโพรลีน และกิจกรรม CAT ของต้นกล้าฝ้าย WT ที่ระยะการเจริญเติบโตเท่ากันโดยไม่ต้องฉีดเวกเตอร์ VIGS (ไฟล์เพิ่มเติม 4: รูปที่ S4) และพบว่าตัวบ่งชี้ทางสรีรวิทยาไม่แตกต่างกันใน ต้นกล้าฝ้าย WT และพืช TRV2 ดังนั้นจึงไม่รวมถึงอิทธิพลของพาหะนำโรค ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการปิดเสียงของ lncRNA973 ในฝ้ายเพิ่มเนื้อหา MDA และ Pro ลดปริมาณน้ำสัมพัทธ์และกิจกรรมของเอนไซม์กำจัด ROS นอกจากนี้ ยังส่งเสริมการส่งออก K + และการไหลของ Na + ภายใน ส่งผลให้เนื้อหา K + และ Na + ไม่สมดุล และความทนทานต่อเกลือของโรงงาน VIGS ลดลง ดังนั้น พืชล้มลง lncRNA973 จึงไวต่อความเครียดจากเกลือ และเปิดเผยว่า lncRNA973 สามารถตอบสนองต่อความเครียดจากเกลือโดยควบคุมการสะสมของตัวบ่งชี้ทางสรีรวิทยาที่เกี่ยวข้องบางอย่าง

LncRNA973 ควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อความเครียดของเกลือในฝ้าย

จากข้อมูลการถอดรหัสก่อนหน้านี้ ความสัมพันธ์ในการแสดงออกร่วมกันและการผูกมัดพลังงานอิสระระหว่าง lncRNA973 และยีนการเข้ารหัสคำนวณโดย RNAplex เพื่อทำนายยีนการแสดงออกร่วม ซึ่งรวมถึงปัจจัยการถอดรหัสและยีนที่เกี่ยวข้องกับความเครียด (ไฟล์เพิ่มเติม 6: ตารางที่ S1) ในการวิเคราะห์ฟังก์ชันที่เป็นไปได้ของ lncRNA973 เราเลือกยีนที่เข้ารหัสโปรตีนด้วยสัมประสิทธิ์การแสดงออกร่วมที่สูงกว่า 0.95 ด้วย lncRNA973 สำหรับการวิเคราะห์ เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่เป็นที่รู้จักซึ่งมีความสำคัญต่อการตอบสนองต่อความเครียดจากเกลือของพืช RNA ทั้งหมดจึงถูกสกัดจากใบของต้นกล้าความเครียดเกลือ TRV2 และ VIGS และใบของต้นกล้าที่ไม่ผ่านการบำบัด จากนั้นจึงวิเคราะห์โดย PCR แบบเรียลไทม์ ระดับการแสดงออกของการหายใจออกซิเดส B (ROBHB) และ D (ROBHD) ยีน NADPH ออกซิเดส 2 ยีนลดลงมากกว่า 30 และ 50% ตามลำดับในพืช VIGS ที่ได้รับเกลือ อย่างไรก็ตาม ไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับการแสดงออกในพืชที่ไม่ได้รับการรักษา พืช (รูปที่ 5a, b) การแสดงออกที่เหนี่ยวนำของ . 1 -PYRROLINE-5-คาร์บอกซีเลตซินเธเตส (P5CS) ภายใต้สภาวะความเครียดจากเกลือสามารถส่งเสริมการสะสมของ Pro [34] การแสดงออกของ P5CSเพิ่มขึ้นสองเท่าในพืช VIGS ที่บำบัดด้วยเกลือเมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ TRV2 (รูปที่ 5c) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับผลดัชนีทางสรีรวิทยา Pro เราประเมินยีนที่เกี่ยวข้องกับโซเดียม-โพแทสเซียมไอออนเพิ่มเติมเพื่อตอบสนองต่อความเครียดจากเกลือ เครื่องแลกเปลี่ยนโซเดียมไฮโดรเจน 7 (NHX7) เข้ารหัสแวคิวโอลาร์ Na + /H + antiporter ที่เกี่ยวข้องกับการต้านทานเกลือซึ่งทำหน้าที่ในการแลกเปลี่ยนอิเล็กตรอนของโปรตอนสำหรับไพเพอร์ เช่น Na + ข้ามเยื่อหุ้มพลาสมา [35] NHX7 ถูกแสดงออกในพืช VIGS มากกว่าพืช TRV2 ภายใต้สภาวะที่มีความเค้นจากเกลือ (รูปที่ 5d) ตอบสนองต่อภาวะขาดน้ำ 22 (RD22) ถูกกระตุ้นโดยการส่งสัญญาณกรดแอบไซซิก (ABA) ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของความเครียดจากเกลือ [36] การแสดงออกของมันยังลดลงในพืช VIGS ที่บำบัดด้วยเกลือ (รูปที่ 5e) นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์ระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับ ROS SOD, POD และ แมว. ระดับการแสดงออกของพวกมันถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญในพืช VIGS ที่สัมผัสกับความเครียดจากเกลือแต่เพิ่มขึ้นในพืชควบคุม (รูปที่ 5f-h) ในขณะเดียวกัน เราได้ตรวจสอบระดับการแสดงออกของยีนที่คล้ายคลึงกันของยีนเหล่านี้ใน WT และ OX-lncRNA973–2/5 Arabidopsis พืช. ภายใต้สภาวะที่ไม่ได้รับการรักษา ระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับความเครียดจากเกลือในพืช OX-lncRNA973 มีความคล้ายคลึงกับระดับใน WT Arabidopsis (ไฟล์เพิ่มเติม 5: รูปที่ S5) ยกเว้นว่า AtPOD ยีนแสดงการแสดงออกที่มีการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของยีนเหล่านี้เพิ่มขึ้นในพืชทั้ง WT และ OX-lncRNA973 หลังจากความเครียดจากเกลือ NS ที่RBOB, AtRBOHD, AtPOD, AtCAT, AtRD22, ที่RD29A, และ AtRD29B (ไฟล์เพิ่มเติม 5: รูปที่ S5a, b, f-j) ระดับการแสดงออกในพืช OX-lncRNA973 สูงกว่าระดับ WT อย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วยเกลือ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง AtPOD, ที่RD29A, และ AtRD29B. การแสดงออกของ ที่P5CS1 และ ที่NHX7 ในพืช OX-lncRNA973 มีค่าต่ำกว่าของ WT (ไฟล์เพิ่มเติม 5: รูปที่ S5c-d) ข้อมูลเหล่านี้ระบุว่า lncRNA973 สามารถควบคุมความทนทานของพืชต่อความเค้นของเกลือโดยการปรับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของความเครียดจากเกลือ

ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของยีนที่เลือกไว้ในต้นกล้าฝ้ายอบเกลือ RNA ถูกสกัดจากใบต้นกล้าฝ้าย VIGS และ TRV2 และระดับการแสดงออกของยีนถูกวัดโดย RT-qPCR ที่ทำให้เป็นมาตรฐานเทียบกับ GhUBQ7 ยีน. แสดงระดับนิพจน์สัมพัทธ์สำหรับ NS. RBOHB, NS. RBOHD, ค. P5CS, NS. NHX7, อี RD22, NS. SOD, NS. แมว, ชม. POD, ผม. MYB5, NS. WRKY46, เค NAC29, ล. ERF62. การเยาะเย้ยโดยไม่ใช้เกลือ NaCl: การบำบัดด้วย NaCl 250 mM *, NS < 0.05 และ **, NS < 0.01 โดย Student's NS- ทดสอบเปรียบเทียบกับต้นกล้า TRV2 ที่ไม่ผ่านการบำบัด (Mock) หรือเกลือ การแสดงข้อมูลหมายถึง ± SD

นอกจากนี้ ปัจจัยการถอดรหัสอาจเกี่ยวข้องกับการควบคุมของ lncRNA973 ปัจจัยการถอดรหัสเหล่านี้ ได้แก่ MYB5, WRKY46, NAC29 และปัจจัยการถอดรหัสที่ตอบสนองต่อเอทิลีน 62 (ERF62) ค่าสัมประสิทธิ์การแสดงออกร่วมระหว่างปัจจัยการถอดรหัสและ lncRNA973 โดยทั่วไปมีค่ามากกว่า 0.99 ซึ่งบ่งชี้ถึงความสัมพันธ์ด้านกฎระเบียบที่เป็นไปได้ระหว่างกัน RT-qPCR ถูกใช้เพื่อตรวจหาการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสเหล่านี้ในพืชที่บำบัดด้วยเกลือและพืชที่ไม่ผ่านการบำบัด ระดับการแสดงออกของ MYB5 และ WRKY46 ในพืช VIGS ต่ำกว่าพืชควบคุมภายใต้สภาวะที่มีความเค้นเกลือ (รูปที่ 5i-j) NAC29 และ ERF62 ถูกแสดงออกอย่างมากในพืชที่ได้รับการบำบัดด้วยเกลือเมื่อเปรียบเทียบกับพืชที่ไม่ผ่านการบำบัด (รูปที่ 5k-l) ในทำนองเดียวกัน เรายังตรวจสอบระดับการแสดงออกของยีนที่คล้ายคลึงกันของปัจจัยการถอดรหัสเหล่านี้ในพืช OX-lncRNA973 และ WT และพบว่าปัจจัยการถอดรหัส AtERF และ AtMYB5 ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญก่อนและหลังการรักษา (ไฟล์เพิ่มเติม 5: รูปที่ S5k-l) . การแสดงออกของ AtWRKY46 เพิ่มขึ้นในพืช OX-lncRNA973 ที่กำลังเติบโตตามปกติ และเห็นได้ชัดว่ามีการควบคุมที่เพิ่มขึ้นในพืช OX-lncRNA973 หลังการบำบัดด้วยเกลือ (ไฟล์เพิ่มเติม 5: รูปที่ S5 ม.) การแสดงออกของ AtNAC3 ไม่เปลี่ยนแปลงในพืชที่เติบโตตามปกติ เมื่อเทียบกับ WT การแสดงออกของ NAC3 ในพืช OX-lncRNA973 ถูกเหนี่ยวนำอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วยเกลือ และการแสดงออกนั้นสูงกว่าของ WT อย่างมีนัยสำคัญ (ไฟล์เพิ่มเติม 5: รูปที่ S5n) ดังนั้น lncRNA973 จึงดูเหมือนจะตอบสนองต่อความเครียดจากเกลือโดยการควบคุมยีนหลายตัวและกลไกที่ซับซ้อนหลายอย่าง

LncRNA973 ส่งผลกระทบต่อ miR399 และนิพจน์ PHO2 เป้าหมาย

ก่อนหน้านี้ เราคาดการณ์ว่า lncRNA973 อาจมีผลด้านกฎระเบียบกับ miR399 [31] บริเวณปฏิสัมพันธ์ของ lncRNA973 และ miR399 ตั้งอยู่ใน exon ที่สอง (รูปที่ 6a) ที่นี่ เพื่อกำหนดผลการกำกับดูแลของ lncRNA973 ต่อ miR399 เพิ่มเติม miR399 และการแสดงออกของยีนเป้าหมาย PHO2 ถูกตรวจพบใน OX-lncRNA973 Arabidopsis และ TRV2:lncRNA973 ต้นฝ้ายตามลำดับ เราตรวจพบการแสดงออกของ ghr-miR399 ในรากของต้นกล้าฝ้าย lncRNA973 ที่น่าพิศวง เมื่อประสิทธิภาพการล้มลงของ lncRNA973 เท่ากับ 60% หรือมากกว่า ระดับการแสดงออกของ ghr-miR399 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในขณะที่เป้าหมาย GhPHO2 การแสดงออกถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญ และเมื่อประสิทธิภาพการน็อคดาวน์น้อยกว่า 60% ghr-miR399 และ GhPHO2 ระดับการแสดงออกไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6b) อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่มากเกินไปของ lncRNA973 ไม่ได้ยับยั้งการแสดงออกของ ath-miR399 และการแสดงออกของ ที่PHO2 เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญใน OX-lncRNA973 Arabidopsis พืช (รูปที่ 6c) ดังนั้น lncRNA973 จึงควบคุมการแสดงออกของ ghr-miR399 และยีนเป้าหมาย GhPHO2 ในฝ้ายในขณะที่ไม่พบความสัมพันธ์ระหว่างพวกเขาใน Arabidopsis.

ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ miRNA399 และ lncRNA973 ใน VIGS และต้นกล้าที่แสดงออกมากเกินไป NS. แผนผังไดอะแกรมของไซต์ปฏิสัมพันธ์ระหว่างการถอดเสียง ghr-miR399 และ lncRNA973 NS. ระดับการแสดงออกของ lncRNA973, ghr-miR399 และ GhPHO2 ใน TRV2:00 และ TRV2:lncRNA973 รากของต้นกล้าฝ้าย . ระดับการแสดงออกของ lncRNA973, ath-miR399 และ ที่PHO2 ในพืช WT และ OX-lncRNA973 *, NS < 0.05 และ **, NS < 0.01 โดย Student's NS- ทดสอบเปรียบเทียบกับพืช TRV2 การแสดงข้อมูลหมายถึง ± SD


บทนำ

อุบัติการณ์ของมะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมาทั่วโลก ซึ่งเป็นรูปแบบที่รุนแรงที่สุดของมะเร็งผิวหนัง ได้เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วในทศวรรษที่ผ่านมา จำนวนผู้ป่วยมะเร็งผิวหนังรายใหม่ในสหรัฐอเมริกาคาดว่าจะสูงถึง 76,380 ราย โดยมีผู้เสียชีวิต 10,130 รายภายในสิ้นปี 2016 [1] Primary melanoma (PM) รักษาได้ด้วยการผ่าตัด อย่างไรก็ตาม หากตรวจไม่พบตั้งแต่เนิ่นๆ และต้องผ่าตัดออก มะเร็งผิวหนังมีแนวโน้มสูงที่จะแพร่กระจาย ดังนั้นการระบุกลไกที่ขับเคลื่อนทั้งการสร้างเนื้องอกและการแพร่กระจายและการพัฒนากลยุทธ์การรักษาเนื้องอกที่แปลกใหม่และมีประสิทธิภาพจึงมีความจำเป็นอย่างเร่งด่วน

RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNAs) ซึ่งมีความยาวเกิน 200 นิวคลีโอไทด์ เป็นการถอดเสียงคล้าย RNA ของผู้ส่งสาร (mRNA) ที่ไม่เข้ารหัสโปรตีน [2, 3] ต่างจาก microRNA ที่มีขนาดเล็กกว่า ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการก่อมะเร็งในมนุษย์ ความเข้าใจของเราเกี่ยวกับหน้าที่ทางชีววิทยาของ lncRNA นั้นยังอยู่ในช่วงเริ่มต้น lncRNA ที่ทำงานได้ครั้งแรก XIST ถูกค้นพบในช่วงต้นทศวรรษ 1990 XIST ยับยั้งการแสดงออกของยีนจากโครโมโซม X โดยการทำให้ปริมาณเท่ากัน [4, 5] รายงานหลายฉบับแสดงให้เห็นว่า lncRNAs ควบคุมการทำงานที่ซับซ้อนและหลากหลาย ซึ่งรวมถึง pluripotency ของเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน [6], การควบคุมยีน epigenetic [7], การตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA [8] และการเปลี่ยนแปลงของโครมาติน [9] นอกจากนี้ lncRNAs ยังมีส่วนร่วมในกระบวนการของเซลล์ที่หลากหลาย รวมถึงวัฏจักรเซลล์ การเพิ่มจำนวน การตายของเซลล์ และการบุกรุก [10]

ด้วยการเกิดขึ้นของการจัดลำดับรุ่นต่อไป โครงการขนาดใหญ่ได้ระบุ lncRNAs หลายตัวที่เกี่ยวข้องกับการก่อมะเร็งและการพัฒนาของมะเร็ง [11, 12] รวมถึง glioblastoma [13] มะเร็งรังไข่ [14] มะเร็งตับ [15] มะเร็งกระเพาะอาหาร [ 16] และมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก (CRC) [17] ความรู้นี้ชี้ให้เห็นถึงความเป็นไปได้ที่น่าสนใจสำหรับการประยุกต์ใช้ lncRNA ในการวินิจฉัยและการรักษา อย่างไรก็ตาม ไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับหน้าที่ของ lncRNA ในการเกิดเนื้องอกและการแพร่กระจายของเนื้องอก การศึกษาหลายชิ้นระบุหน้าที่หลายอย่างของ lncRNAs ในมะเร็งผิวหนัง การควบคุม SPRY4-IT1 อาจมีบทบาทสำคัญในเนื้องอกและเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพในระยะเริ่มแรกที่มีประโยชน์ในมนุษย์ [18, 19] Tang และคณะ [20] แสดงให้เห็นการแสดงออกของ HOTAIR มากเกินไปในการแพร่กระจายของต่อมน้ำเหลืองเมื่อเปรียบเทียบกับ PMs และแสดงให้เห็นบทบาทเชิงรุกในการเคลื่อนที่และการบุกรุกของเซลล์ ซึ่งเน้นว่า HOTAIR เป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการรักษามะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมา RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสระหว่างยีนที่มีความยาว CASC15 มีความสัมพันธ์กับการลุกลามของมะเร็งผิวหนังและมีส่วนเกี่ยวข้องกับการควบคุมการเปลี่ยนฟีโนไทป์ [21] lncRNA อีกตัวหนึ่งคือ SLNCR1 ส่งเสริมการบุกรุกของเนื้องอกโดยจับกับตัวรับแอนโดรเจนและโปรตีน homeobox เฉพาะสมอง 3a [22] อย่างไรก็ตาม ความจำเพาะและความไวต่ำของ lncRNAs ชี้ให้เห็นว่าเป้าหมายเดียวไม่น่าจะแสดงให้เห็นกลไกของ lncRNA ในมะเร็งผิวหนังได้อย่างเต็มที่ บทบาทที่เป็นไปได้ของ lncRNAs ระหว่างการเกิดเนื้องอกและการแพร่กระจายของเนื้องอกยังไม่ได้รับการศึกษาอย่างเต็มที่

เราเริ่มการศึกษาโดยการวิเคราะห์โปรไฟล์การแสดงออกของยีน melanoma ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้จากฐานข้อมูล Gene Expression Omnibus (GEO) และทำโปรไฟล์ lncRNA เพื่อระบุ lncRNA ที่มีนัยสำคัญ จากนั้นโปรไฟล์ lncRNA ที่ระบุถูกตรวจสอบโดยใช้ชุดการตรวจสอบความถูกต้องอิสระชุดอื่น จากนั้นจึงทำการวิเคราะห์ยีน Ontology (GO) สารานุกรมเกียวโตของการวิเคราะห์เส้นทางยีนและจีโนม (KEGG) และการวิเคราะห์เครือข่ายการแสดงออกร่วม lncRNA-mRNA เราทำการวิเคราะห์การอยู่รอดตามฐานข้อมูล TCGA การค้นพบของเราอาจเปิดเผยโปรไฟล์การแสดงออกของ lncRNA และ mRNA ที่เป็นไปได้ที่เกี่ยวข้องกับการลุกลามของมะเร็งผิวหนังและการแพร่กระจายของเนื้อร้าย และให้ข้อมูลเชิงลึกที่แปลกใหม่เกี่ยวกับการเกิดโรคระดับโมเลกุลของมะเร็งผิวหนัง


บทบาทของ RNA PCA3 ที่ไม่มีการเข้ารหัสเป็นเวลานานในการเกิดเนื้องอกของมะเร็งรังไข่เยื่อบุผิวและการลุกลาม

วัตถุประสงค์: มะเร็งรังไข่เป็นหนึ่งในอุบัติการณ์สูงสุดของเนื้องอกในสตรี และรุ่น การพัฒนา และการพยากรณ์โรคของมะเร็งรังไข่เยื่อบุผิว (EOC) ยังคงเป็นสาขาวิชาที่เปิดกว้าง บทบาทของ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสเป็นเวลานาน (lncRNAs) ในมะเร็งรังไข่เยื่อบุผิวเป็นพื้นที่ใหม่ของการวิจัย

วัสดุและวิธีการ: การแสดงออกของ LncRNA PCA3 ถูกกำหนดหาใน EOC และเนื้อเยื่อรังไข่ปกติโดย RT-PCR ฟีโนไทป์ที่บ่งบอกถึงการลุกลามของเนื้องอกและความก้าวร้าว ซึ่งรวมถึงการเพิ่มจำนวนเซลล์ การย้ายถิ่น การบุกรุก และการแสดงออกของโมเลกุลที่เกี่ยวข้อง ถูกวิเคราะห์ในเซลล์ EOC หลังจากการล้มลงของ lncRNA PCA3 โดยการถ่ายด้วย RNA ที่รบกวนขนาดเล็ก (siRNA)

ผลลัพธ์: การแสดงออกของ lncRNA PCA3 ในเนื้อเยื่อมะเร็งรังไข่เยื่อบุผิวสูงกว่าในเนื้อเยื่อรังไข่ปกติ เราค้นพบว่าการล้มลงของ lncRNA PCA3 ในเซลล์ EOC โดยการเปลี่ยนถ่าย siRNA ยับยั้งการเพิ่มจำนวน การย้ายถิ่น และการบุกรุกของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ การคาดคะเนทางชีวสารสนเทศและการทดสอบโดยนักข่าวแบบดูอัลลูซิเฟอเรสระบุว่า 3'UTR ของ PCA3 มีตำแหน่งที่มีผลผูกพันสำหรับ miR-106b-5p การล้มลงของ lncRNA PCA3 โดย siRNA ทำให้เกิดการแสดงออก miR-106b ที่มีการควบคุมขึ้น นอกจากนี้ การล้มลงของ PCA3 ยังลดการแสดงออกของโปรตีนของสมาชิกในครอบครัวยีน Ras homolog C (RhoC), Bcl/xl, P70 ribosomal S6 kinase (P70S6K) และเมทริกซ์ metallopeptidase 2 (MMP2) ซึ่งควบคุมโดย miR-106b

สรุป: ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่า lncRNA PCA3 อาจประสานการสร้างเนื้องอกของ EOC ผ่านการรบกวนการแสดงออกของยีนที่ควบคุมด้วย miR-106b PCA3 อาจเป็นไบโอมาร์คเกอร์ในการวินิจฉัยที่แปลกใหม่และมีความสำคัญและเป็นเครื่องหมายที่มีคุณค่าสำหรับการทำนายในการดูแลทางคลินิกของมะเร็งรังไข่เยื่อบุผิว

คำสำคัญ: มะเร็งรังไข่เยื่อบุผิว LncRNA PCA3 ความก้าวหน้าของเนื้องอก


ดูวิดีโอ: lncRNA (สิงหาคม 2022).