ข้อมูล

การใช้กระดาษซับแบบตะวันตก

การใช้กระดาษซับแบบตะวันตก


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันวิ่งข้ามกระดาษนี้เมื่อเร็ว ๆ นี้

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21151122

ฉันสับสนกับการใช้ Western blotting โปรตีนที่ไม่ผ่านการดัดแปลงของพวกมัน (ไม่มีกลุ่ม PTM) มีแถบและโปรตีนที่ถูกดัดแปลง (succinylation of Lys) ไม่มีแถบ แต่พวกเขาก็ใช้สิ่งนี้เป็นหลักฐานของการระบุ PTM ที่ประสบความสำเร็จ ใครสามารถเห็นสิ่งที่พวกเขากำลังทำอะไรที่นี่?


พวกเขากำลังทำการทดสอบการแข่งขันเปปไทด์ (ดูโปรโตคอล abcam)

แอนติบอดีถูกบ่มด้วยตัวอย่างแอนติเจนที่บริสุทธิ์และใช้ใน Western-Blot ของเซลล์ไลเสตปกติ ปฏิกิริยาข้ามใดๆ ของแอนติบอดีจะยังคงมองเห็นได้เนื่องจากเฉพาะอันตรกิริยากับอีพิโทปที่สนใจเท่านั้นที่ถูกขัดขวาง ดังนั้นแถบทั้งหมดที่หายไปหลังจากการรักษาดังกล่าวจึงเป็นตัวบ่งชี้ถึงสารที่ใช้ในการปิดกั้น ปกติจะใช้ Western-Blot ที่มีแอนติบอดีที่ไม่ถูกบล็อกเพื่อเปรียบเทียบ

ในการทดลองที่คุณกล่าวถึง พวกเขาเปลี่ยนแปลงหลักการเล็กน้อย เนื่องจากพวกเขากำลังเปรียบเทียบสอง blots - หนึ่งบล็อกด้วยไลบรารี succinylated อีกอันหนึ่งกับอันที่ไม่ succinylated เมื่อวงดนตรีหายไปหลังการรักษาด้วยไลบรารี succinylated พวกเขายืนยันว่าแอนติบอดีของพวกมันจำเพาะต่อโปรตีน succinylated - อย่างน้อยในสามกรณีนี้


แบบฝึกหัด Western blot ที่คล่องตัว: แนวทางที่มีประสิทธิภาพและเป็นมิตรกับสิ่งแวดล้อมในห้องเรียนห้องปฏิบัติการ

SDS-PAGE และ Western blotting เป็นเทคนิคการตรวจหาโปรตีนสองแบบที่สอนกันทั่วไปในห้องเรียนทางชีวเคมีและชีววิทยาระดับโมเลกุล หลุมพรางที่เกี่ยวข้องกับการผสมผสานเทคนิคเหล่านี้เข้ากับห้องปฏิบัติการคือเวลารอที่สำคัญซึ่งไม่อนุญาตให้นักเรียนได้รับผลลัพธ์ที่ทันท่วงที การรอคอยที่เกี่ยวข้องกับ SDS-PAGE นั้นมาจากการย้อมสีและการย้อมสี ในขณะที่การซับแบบตะวันตกเป็นเวลาที่จำเป็นสำหรับการฟักตัวของแอนติบอดีและขั้นตอนการล้างจำนวนมาก แบบฝึกหัดในห้องปฏิบัติการนี้รวม 2,2,2-ไตรคลอโรเอทานอล (TCE) ไว้ในเจล SDS-PAGE ซึ่งช่วยให้มองเห็นโปรตีนที่อพยพได้ภายในเวลาไม่กี่นาที ซึ่งช่วยประหยัดเวลาและของเสียทางเคมีที่เกี่ยวข้องกับการย้อมแบบคูแมสซีแบบเดิม นอกจากนี้ การย้อมสี TCE จะไม่ส่งผลต่อการถ่ายโอนโปรตีน ซึ่งช่วยขจัดข้อกำหนดสำหรับเจลที่ทำซ้ำสำหรับโปรตีนทั้งหมดและการวิเคราะห์แบบตะวันตก สามารถยืนยันการถ่ายโอนโปรตีนได้ทันทีโดยไม่ต้องใช้การย้อมสี Ponceau S สุดท้ายนี้ กระบวนการ Western blot ถูกทำให้สั้นลงอีกโดยใช้แอนติบอดีปฐมภูมิที่ผสานกับ HRP ซึ่งกำจัดการฟักตัวของแอนติบอดีทุติยภูมิและการล้าง และใช้การตรวจจับสีเพื่อให้นักเรียนมองเห็นภาพได้โดยไม่ต้องใช้อุปกรณ์พิเศษ

คำสำคัญ: 2,2,2-ไตรคลอโรเอทานอล (TCE) SDS-PAGE ในห้องปฏิบัติการ ทำแบบฝึกหัด western blot


การใช้กระดาษซับแบบตะวันตก - ชีววิทยา

ในการตรวจหาแอนติเจนที่เปื้อนบนเมมเบรน แอนติบอดีปฐมภูมิ (ซีรัม) จะถูกเติมด้วยการเจือจางที่เหมาะสมและบ่มด้วยเมมเบรน หากมีแอนติบอดีใดๆ ที่มุ่งต่อต้านแอนติเจนที่ถูกบลัดอย่างน้อยหนึ่งตัว แอนติบอดีเหล่านั้นจะจับกับโปรตีนในขณะที่แอนติบอดีอื่นๆ จะถูกชะล้างออกไปเมื่อสิ้นสุดการฟักไข่ เพื่อตรวจหาแอนติบอดีที่มีพันธะ แอนติบอดีต้านอิมมูโนโกลบูลินที่รวมกับกลุ่มนักข่าว เช่น เอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟาเตสจะถูกเพิ่มเข้าไป (เช่น แพะต่อต้านมนุษย์ IgG- อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส) เอนไซม์ต้าน Ig นี้มักเรียกว่า "แอนติบอดีที่สอง" หรือ "คอนจูเกต" สุดท้ายหลังจากแอนติบอดีที่สองส่วนเกินถูกล้างโดยไม่ใช้ blot ซับสเทรตจะถูกเติมซึ่งจะตกตะกอนเมื่อทำปฏิกิริยากับคอนจูเกตซึ่งส่งผลให้เกิดแถบที่มองเห็นได้ในที่ซึ่งแอนติบอดีปฐมภูมิจับกับโปรตีน

สำหรับการทดสอบวินิจฉัยเฉพาะนี้ เซลล์ที่ติดเชื้อ HIV จะถูก lysed ภายใต้ SDS-PAGE และซับบนเมมเบรนตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เมมเบรนถูกปิดกั้น ตัดเป็นเส้น และบ่มด้วยตัวอย่างซีรัมจากผู้ป่วยแต่ละรายตามที่ระบุไว้

หน้าถัดไปจะแสดงตัวอย่าง Western blot และวิธีตีความ


ซับตะวันตก

ซับตะวันตก (ภูมิคุ้มกันบกพร่อง)
เทคนิคการตรวจจับโปรตีนจำเพาะ ส่วนผสมของโปรตีนแยกจากกันโดยโพลีอะคริลาไมด์-เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส ซับบนแผ่นพลาสติก (เช่น ไนโตรเซลลูโลส) แล้วสัมผัสกับอิมมูโนโกลบูลินที่ติดฉลากกัมมันตภาพรังสีโดยมุ่งเป้าไปที่โปรตีนที่ต้องการ

ไกล-ซับตะวันตก
ข้ามไปที่: การนำทาง, ค้นหา
ไกล-ซับตะวันตก เป็นวิธีการทางอณูชีววิทยาซึ่งใช้เทคนิคของ ซับตะวันตก เพื่อตรวจหาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนในหลอดทดลอง

ซับตะวันตก การวิเคราะห์
หลังการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (5 มก./มล., 10 มก./มล., 15 มก./มล., 20 มก./มล., 30 มก./มล., 40 มก./มล.) ของแทกเซนเป็นเวลา 16 ชั่วโมง หรือการบำบัดด้วยแทกเซน 10 มก./มล. สำหรับเวลาที่ต่างกัน (0 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 h, 36 h), SGC-7901 เซลล์ถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBS, .

ในขั้นแรก โปรตีนจะถูกแยกตามขนาด ในเจลบางๆ ที่ประกบระหว่างแผ่นแก้วสองแผ่นโดยใช้เทคนิคที่เรียกว่า SDS-PAGE จากนั้น โปรตีนในเจลจะถูกส่งไปยังพอลิไวนิลลิดีน ฟลูออไรด์ (PVDF), ไนโตรเซลลูโลส, ไนลอน หรือเมมเบรนรองรับอื่นๆ

เทคนิคนี้ออกแบบมาเพื่อตรวจจับโปรตีนจำเพาะที่มีอยู่ในตัวอย่างที่ต่างกัน โปรตีนถูกทำให้เสียสภาพและแบ่งขนาดโดยพอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ถ่ายโอนไปยังไนโตรเซลลูโลสหรือเยื่อสังเคราะห์อื่นๆ จากนั้นจึงตรวจสอบด้วยแอนติบอดีต่อโปรตีนที่สนใจ

เทคนิคการตรวจหาโปรตีนจำเพาะที่แยกจากกันโดยอิเล็กโตรโฟรีซิสโดยใช้แอนติบอดีที่ติดฉลาก (ภาพที่ 3-44)
ชนิดป่า.

การวิเคราะห์ เรียนรู้ว่าเหตุใด western blot จึงเป็นการตรวจหาเชื้อเอชไอวี ส่วนประกอบในซีรัมใดที่วัดได้ใน ELISA และวิธีดำเนินการ Western blot
ความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับภูมิคุ้มกัน เรียนรู้พื้นฐานเกี่ยวกับระบบภูมิคุ้มกัน

เป็นเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ในการตรวจหาโปรตีนจำเพาะในตัวอย่างเลือดหรือเนื้อเยื่อ วิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสเพื่อแยกโปรตีนของตัวอย่าง โปรตีนที่แยกจากกันจะถูกถ่ายโอนออกจากเจลไปยังพื้นผิวของเมมเบรน

การวิเคราะห์ -- เทคนิคที่ใช้ในการระบุโปรตีนจำเพาะที่โพรบคือแอนติบอดีที่ติดฉลากกัมมันตภาพรังสีที่ต่อต้านโปรตีนที่เป็นปัญหา

, การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ [ELISA]) และโฟลว์ไซโตเมตรีแบบหลายสีเพื่อระบุการแสดงออกของไบโอมาร์คเกอร์หรือโปรตีนทางพยาธิวิทยา

การสาธิตอิเล็กโตรโฟรีซิสในห้องปฏิบัติการเทคนิคชีวภาพ จากศูนย์การเรียนรู้วิทยาศาสตร์ทางพันธุกรรมของมหาวิทยาลัยยูทาห์
โปรตีนอิเล็กโตรโฟรีซิสและ

'"/
ดูเพิ่มเติมเกี่ยวกับ: เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส

ภายนอกเซลล์ แอนติบอดีที่ติดอยู่กับเม็ดบีดแก้วสามารถดึงโปรตีนออกจากเซลล์บดที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน ซึ่งช่วยให้แยกโปรตีนเพื่อการศึกษาต่อไปได้ ในเทคนิคหนึ่งที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเรียกว่า


ทิศใต้ ทิศเหนือ ทิศตะวันออกและทิศตะวันตก : เรื่องราวการปรากฏของรอยเปื้อนตะวันตก

Western blot อาจดูเหมือนเป็นเพียงเทคนิคหลักในห้องปฏิบัติการ อย่างไรก็ตาม มีบางเรื่องราวเกี่ยวกับสิ่งประดิษฐ์ของมันที่น่ารู้อย่างแน่นอน

นี่อาจเป็นข่าวสำหรับบางคน: นักวิทยาศาสตร์มีอารมณ์ขัน Western blotting ได้รับการตั้งชื่อตามประเพณีที่เริ่มต้นขึ้นโดยไม่ได้ตั้งใจเมื่อ Edwin Southern เขียนสิ่งประดิษฐ์ใหม่ของเขาว่า "Southern blot"

Western blotting คืออะไร?

ในปี 1975 Southern ได้คิดค้นวิธีการใหม่ที่ช่วยในการวิเคราะห์เอกลักษณ์ของ DNA ขนาดและความอุดมสมบูรณ์ มันเกี่ยวข้องกับการใช้อิเล็กโตรโฟรีซิสเพื่อแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอตามขนาด จากนั้นจึงถ่ายโอนไปยังเมมเบรนและการผสมพันธุ์ด้วยโพรบดีเอ็นเอที่ติดฉลากด้วยคลื่นวิทยุ เพื่อตรวจจับลำดับดีเอ็นเอเฉพาะภายในตัวอย่างดีเอ็นเอ ภาคใต้ตั้งชื่อเทคนิคนี้ตามชื่อตัวเอง

จากนั้นในปี 1977 James Alwin, David Kemp และ George Stark จาก Stanford University (CA, USA) ได้คิดค้นเทคนิคที่คล้ายกับ Southern blot อย่างไม่น่าเชื่อ เทคนิคนี้ยังใช้โพรบ DNA ที่ติดฉลากด้วยคลื่นวิทยุ แต่ถูกสร้างขึ้นเพื่อตรวจจับโมเลกุล RNA ที่เฉพาะเจาะจงภายในตัวอย่าง RNA นักวิทยาศาสตร์ตั้งชื่อวิธีนี้ว่า 'จุดเหนือ'

เอกสารโพสต์ที่ทำงานในห้องทดลองของ Robert Nowinski ที่ Fred Hutchinson Cancer Research Center (WA, USA), W Neal Burnette จากนั้นพยายามระบุแอนติเจนจำเพาะในส่วนผสมของโปรตีน เช่น สารสกัดจากเซลล์ เขาได้พยายามและล้มเหลวในการรวม radioimmunoassay กับ SDS-PAGE electrophoresis แต่ไม่สามารถเห็นภาพการทำงานร่วมกันระหว่างแอนติบอดีและโปรตีนที่แยกจากกันในเจลโพลีอะคริลาไมด์

Burnette ได้รับแรงบันดาลใจจากวิธีการเขียนแบบ Northern blot และสร้างเจลแบบโซลิดเฟสขึ้นมาแทน เขาตระหนักว่าอิเล็กโตรโฟรีซิสอำนวยความสะดวกในการซับโปรตีนจากเจล SDS-PAGE ลงบนกระดาษไนโตรเซลลูโลส ซึ่งดูเหมือนว่าจะทำงานได้ดีกว่ากระดาษดัดแปลงทางเคมี เขาใช้โปรตีน A ที่ติดฉลาก [125 I] เนื่องจากมันสามารถจับสารเชิงซ้อนของแอนติบอดีและแอนติเจนได้เกือบทุกชนิด และหลีกเลี่ยงความจำเป็นในการใช้แอนติบอดีที่ติดฉลากกัมมันตภาพรังสีตัวที่สอง การปิดกั้นตำแหน่งการจับที่ไม่จำเพาะของแอนติบอดีและโปรตีน A กับกระดาษไนโตรเซลลูโลสทำให้ได้ภาพเอ็กซ์เรย์ที่ชัดเจนของแอนติเจนที่จำเพาะของแอนติบอดีได้

เทคนิคนี้เรียกว่า 'western blot' (หรือที่เรียกว่า immunoblot) สิ่งนี้ไม่เพียงแค่เป็นที่ยอมรับในเทคนิคการซับซับในทางตอนใต้และทางเหนือเท่านั้น แต่ยังรวมถึงตำแหน่งทางภูมิศาสตร์ของห้องแล็บที่อยู่ทางชายฝั่งตะวันตกของสหรัฐอเมริกาด้วย

เมื่อ Burnette ส่งวิธีการของเขาไปที่ ชีวเคมีวิเคราะห์ ในปีพ.ศ. 2522 ไม่ได้รับการตอบรับเป็นอย่างดีและต้นฉบับของเขาถูกปฏิเสธ สาเหตุหลักมาจากความไม่ชอบใจในการตั้งชื่อแบบแผน อย่างไรก็ตาม เทคนิค Western blot ยังคงได้รับความนิยมจากคำบอกเล่าและการสนับสนุนจากเพื่อนนักวิทยาศาสตร์

สืบสานประเพณี

ตั้งแต่นั้นมา วิธีการซับแบบอื่นๆ ก็ได้ถูกคิดค้นขึ้น ซึ่งรวมถึงวิธีที่เหมาะเจาะว่าเป็นรอยเปื้อนทางทิศตะวันออกและทางตะวันตกเฉียงใต้

Eastern blot หมายถึงการตรวจจับการดัดแปลงโปรตีนหลังการแปลโดยใช้สารตั้งต้นที่แตกต่างกันในการตรวจจับไกลโคซิเลชัน ไลโปเลชัน และฟอสโฟรีเลชัน ได้รับการอธิบายและเผยแพร่ครั้งแรกในปี 2552 โดย Thomas et al นอกจากนี้ยังมีที่มาของเทคนิคอื่นๆ อีกมากมาย รวมถึงการซับในตะวันออกกลาง การซับแบบตะวันออกไกล และการซับแบบตะวันออก-ตะวันตก

Far-eastern blotting ซึ่งตีพิมพ์ในปี 1998 โดย Dai Ishikawa และ Takao Taki เป็นเทคนิคสำหรับการวิเคราะห์ไขมันที่แยกจากกันโดยโครมาโตกราฟีแบบชั้นบางที่มีประสิทธิภาพสูง เนื่องจากได้รับการพัฒนาในมหาวิทยาลัยการแพทย์และทันตกรรมแห่งโตเกียว (ประเทศญี่ปุ่น) ชื่อนี้จึงไม่ต้องสงสัยเลยว่าจะอ้างอิงถึงที่ตั้งทางภูมิศาสตร์ของพวกเขา

blot ตะวันตกเฉียงใต้ได้รับการตั้งชื่อตามองค์ประกอบของทั้ง blot ทางใต้และทางตะวันตก เทคนิคนี้เกี่ยวข้องกับการระบุและกำหนดลักษณะเฉพาะของโปรตีนที่จับกับดีเอ็นเอโดยใช้โพรบดีเอ็นเอ (ทางใต้) และซับโปรตีน (แบบตะวันตก) และได้รับการอธิบายครั้งแรกในปี 2523 วิธีนี้เผยแพร่ก่อนวิธีพิมพ์แบบตะวันตก กระนั้น มันยังคงพาดพิงถึงมันในชื่อของมัน เป็นการตอกย้ำถึงความนิยมของ blot ตะวันตก

ถูกต้องเช่นกันที่ควรใช้อักษรตัวพิมพ์ใหญ่เฉพาะ Southern blot และไม่ใช้เทคนิคอื่นใด เนื่องจาก Southern เป็นคำนามที่เหมาะสม

ผู้สร้าง

แบบแผนการตั้งชื่อไม่ได้เป็นเพียงความขัดแย้งรอบ ๆ blot ตะวันตก นอกจากนี้ยังมีเรื่องราวที่แตกต่างกันเกี่ยวกับผู้ที่ควรให้เครดิตกับการประดิษฐ์ blot

ควบคู่ไปกับการพัฒนาของ Burnette Harry Towbin และเพื่อนร่วมงานที่สถาบัน Friedrich Miescher (สวิตเซอร์แลนด์) ได้พัฒนาเทคนิคที่คล้ายกันมากซึ่งได้รับแรงบันดาลใจจาก Northern blot นอกจากนี้ยังเกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนโปรตีนจากเจล SDS-PAGE ไปยังเมมเบรนด้วย ทีมวิจัยได้ใช้แอนติบอดีเพื่อตรวจหาและเผยแพร่ในเดือนกันยายน พ.ศ. 2522

George Stark และเพื่อนร่วมงานที่ Stanford University (CA, USA) ยังได้พัฒนาเทคนิคที่คล้ายคลึงกัน แต่เกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนโปรตีนแบบพาสซีฟ เผยแพร่ในเดือนกรกฎาคม พ.ศ. 2522

Burnette ตระหนักถึงความพยายามของทั้ง Towbin และ Stark อย่างไรก็ตาม เชื่อว่าวิธีการของเขาจะเรียบง่ายและเป็นสากลมากขึ้น ในขณะที่ Burnette มองว่าเป็นแง่บวก ผู้ตรวจทานบทความของเขาในการส่งครั้งแรกได้แยกมันออกจากกันโดยระบุว่าเป็นคนเดินเท้า หลังจากการปฏิเสธวิธีการของเขา Burnette ยังคงแจกจ่ายงานพิมพ์ล่วงหน้าให้กับเพื่อนร่วมงาน

“งานพิมพ์ล่วงหน้าสองสามฉบับที่ฉันส่งให้เพื่อนร่วมงานดูเหมือนจะผ่านการคูณด้วย Xerox แบบลอการิทึม ฉันเริ่มรับโทรศัพท์จากนักวิจัยซึ่งไม่สามารถอ่านงานพิมพ์ล่วงหน้ารุ่นที่ 25 ได้ ” เขียนถึง Burnette

หลังจากการโน้มน้าวใจบางอย่างในส่วนของ Burnette วิธีการของเขาจึงได้รับการตีพิมพ์ใน ชีวเคมีวิเคราะห์ ในปี 1981 บล็อกตะวันตกของ Burnette ได้รับการอ้างถึงมากกว่า 5,000 ครั้งและนักวิจัยอ้างถึงทั้ง Towbin และ Burnette เมื่อพวกเขาอ้างถึง Western blotting ดังนั้น บางทีพวกเขาควรได้รับการยกย่องว่าเป็นสิ่งประดิษฐ์ของ Western blot

ในปี 2548 Michael Eisenstein เขียนว่า:

“ เป็นที่ถกเถียงกัน& #8230 ว่าการมีส่วนร่วมที่สำคัญที่สุดของ Burnette ต่อ immunoblotting เกิดขึ้นเมื่อเขาตั้งชื่อเทคนิคนี้ว่า ‘western blotting’”


ทำไมต้องใช้ Western Blotting

Western blotting ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่ประสบความสำเร็จในสาขาวิทยาศาสตร์และคลินิกที่หลากหลาย ด้วยความสามารถในการแสดงการมีอยู่ของโปรตีนจำเพาะอย่างชัดเจนทั้งโดยขนาดและผ่านการผูกมัดของแอนติบอดี จึงสามารถใช้อย่างมีประสิทธิภาพสำหรับการประเมินระดับการแสดงออกของโปรตีนในเซลล์ตลอดจนการตรวจสอบเศษส่วนเมื่อทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ นอกจากนี้ เทคนิคนี้ยังมีประโยชน์ในการระบุว่าโปรตีนบางชนิดตอบสนองต่อยาบางชนิดอย่างไร สำหรับการใช้งานที่กว้างขึ้น Western blotting ใช้ร่วมกับเทคนิคการตรวจหาแอนติบอดีแบบอื่น เช่น อิมมูโนฮิสโตเคมี หรือ ELISA


ไลเสตควบคุมภายในร่างกาย

เราขอแนะนำให้รวมกลุ่มควบคุมภายในร่างกายด้วยหากคุณกำลังทดสอบตัวอย่างโปรตีนลูกผสม นี่ควรเป็นส่วนสำคัญของแผนการทดลอง

มีปัญหาโดยธรรมชาติในการตรวจหาแอนติบอดีของโปรตีนลูกผสมที่ต้องพิจารณา การพับของโปรตีนลูกผสมอาจแตกต่างจากรูปแบบดั้งเดิมที่เกิดภายในและอาจป้องกันการเข้าถึงของแอนติบอดีไปยังอีพิโทป โดยเฉพาะอย่างยิ่งกรณีนี้กับโปรตีนที่ติดแท็ก

ตรวจสอบให้แน่ใจเสมอว่าได้วางแท็กไว้ที่ปลายขั้ว N หรือ C ของโปรตีนลูกผสม ที่สำคัญที่สุด ตรวจสอบให้แน่ใจเสมอว่าโปรตีนลูกผสมมีลำดับอิมมูโนเจนสำหรับแอนติบอดีที่คุณใช้อยู่ การควบคุมเชิงบวกภายในร่างกายมีความสำคัญในการตรวจสอบผลลัพธ์ เช่นเดียวกับการบ่งชี้ว่าสารทำปฏิกิริยา (เช่น แอนติบอดี) และขั้นตอนการทำงานทำงานได้ดีเพียงใด


ฉันควรใช้ PBS หรือ TBS สำหรับ Western blotting หรือไม่

PBS และ TBS มักใช้บัฟเฟอร์สำหรับขั้นตอนต่างๆ ในโปรโตคอล Western blotting และควรทราบว่าควรใช้แต่ละขั้นตอนเมื่อใด ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ใช้ระบบบัฟเฟอร์ที่กำหนดโดยขั้นตอนการปฏิบัติงานมาตรฐาน (SOPs) ที่มีมายาวนาน อย่างไรก็ตาม บัฟเฟอร์ที่คุณเลือกสำหรับ Western blotting จะขึ้นอยู่กับโปรตีนและแอนติบอดีที่คุณใช้ ดังนั้นจึงคุ้มค่าที่จะทำลายโปรโตคอลเพื่อสำรวจว่าบัฟเฟอร์ PBS หรือ TBS ให้สัญญาณสุดท้ายที่ดีที่สุดและพื้นหลังน้อยที่สุดหรือไม่ หากคุณประสบปัญหาเบื้องหลัง โปรดคลิกคำแนะนำในการแก้ไขปัญหา Western Blotting

นักวิจัยหลายคนใช้ PBS และ TBS เป็นบัฟเฟอร์การเจือจางสำหรับสารปิดกั้น และพวกเขามักจะพบว่า PBS และ TBS สามารถใช้แทนกันได้ อย่างไรก็ตาม ไม่ใช่สูตรผสมบัฟเฟอร์การปิดกั้นเมมเบรนทั้งหมดเหมาะสำหรับทุกสถานการณ์หรือแอนติบอดี และมีบางกรณีที่ไม่สามารถใช้ PBS ได้ ตัวอย่างเช่น PBS รบกวนแอนติบอดีทุติยภูมิคอนจูเกตที่เป็นอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (AP) และในกรณีนี้ คุณควรใช้ TBS แทน

บัฟเฟอร์การบล็อก TBS ยังเป็นตัวเลือกที่ดีที่สุดสำหรับการตรวจหาโมเลกุลโปรตีนที่มีฟอสโฟรีเลตด้วยแอนติบอดีจำเพาะฟอสโป ในกรณีนี้ แอนติบอดีปฐมภูมิจะไม่เพียงจับกับฟอสเฟตบนโปรตีนเป้าหมายเท่านั้น แต่ยังจับกับฟอสเฟตในบัฟเฟอร์ PBS ด้วย ซึ่งจะช่วยลดสัญญาณเป้าหมายของคุณได้อย่างมาก

Western blot: เมมเบรนล้างบัฟเฟอร์

หลังจากขั้นตอนของแอนติบอดีขั้นต้นแล้ว ให้ล้างเมมเบรนเพื่อขจัดแอนติบอดีส่วนเกินออก ส่วนเกินนี้อาจทำให้สัญญาณพื้นหลังสูงและทำให้อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนต่ำ

สารละลายผงซักฟอกที่มีความเข้มข้นต่ำ เช่น 0.05% ถึง 0.1% Tween™ 20 ในบัฟเฟอร์ PBS หรือ TBS มักใช้สำหรับขั้นตอนการล้างนี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากการบ่มด้วยสารละลายแอนติบอดีที่มีความเข้มข้นสูงหรือสารสกัดหยาบ

เหตุใดจึงใช้ Tween 20

ปกติแล้ว PBS-Tween นั้นเพียงพอสำหรับการใช้งานการล้าง Western blot ส่วนใหญ่ แต่สิ่งสำคัญคือต้องใช้ TBS-Tween โดยที่โปรตีนเป้าหมายถูก phosphorylated ด้วยเหตุผลที่กล่าวไว้ข้างต้น นี่คือสารซักฟอก (สารลดแรงตึงผิว) ที่มักเติมลงในบัฟเฟอร์สำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมี และจะช่วยคุณแก้ปัญหาที่เกิดขึ้นในการใช้งานของคุณ


เหตุใดจึงใช้ GAPDH ใน Western Blot

ใน Western blotting เรามักใช้ GAPDH เป็นตัวควบคุมการโหลด สิ่งนี้หมายความว่าโดยการตรวจสอบ GAPDH เราสามารถตรวจสอบว่าเรามีโปรตีนในปริมาณที่เท่ากันในเลนต่างๆ ของ blot

ตัวอย่างการใช้งาน สมมติว่าเรามีโรคที่เราคิดว่าทำให้เกิดการยกระดับของโปรตีนเฉพาะในเซลล์ เราจะสร้างตัวอย่างจากเซลล์ที่ "แข็งแรง" และอีกตัวอย่างหนึ่งจากเซลล์ที่ "ป่วย" จากนั้นเราจะโหลดปริมาณโปรตีนที่เท่ากันของตัวอย่างทั้งสองลงบนเจลสำหรับ Western blot

หลังจากตรวจสอบรอยเปื้อนสำหรับโปรตีนที่เราสนใจ เราพบว่าในเซลล์ที่เป็นโรคนั้นระดับโปรตีนนั้นสูงขึ้นจริง ๆ (นั่นคือแถบสีเข้มขึ้นบนรอยเปื้อน) เพื่อพิสูจน์ว่าโปรตีนที่เพิ่มขึ้นนี้เกิดจากการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกในเซลล์ แทนที่จะเป็นวัตถุโหลด (นั่นคือแถบที่มีความเข้มข้นมากขึ้นเกิดจากการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของโปรตีนในเซลล์ และไม่ใช่โดยเราบังเอิญโหลดมากขึ้น ของตัวอย่าง "โรค" มากกว่าตัวอย่าง "สุขภาพดี") เรายังจะตรวจสอบ blot สำหรับ GAPDH เพื่อแสดงว่าระดับโปรตีนทั้งหมดเท่ากันในทั้งสองเลน

ดังนั้น โดยการทำเช่นนี้ เราแสดงให้เห็นว่ามีการโหลดโปรตีนที่เท่ากันในสองเลน และการเปลี่ยนแปลงของความเข้มของแถบความถี่ที่เรากำลังสังเกตอยู่นั้นเกิดจากการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของโปรตีนสำหรับโปรตีนที่สนใจ


วิธีการสำหรับ Western blotting เชิงปริมาณที่ช่วยขจัดข้อผิดพลาดจากการใช้โปรตีนทำความสะอาด

เทคนิคการซับแบบตะวันตกที่เริ่มเป็นวิธีการตรวจหาโปรตีนที่น่าสนใจในตัวอย่างที่ซับซ้อนซึ่งอาจมีโปรตีนอื่นๆ มากมาย ในทางปฏิบัติมาเป็นเวลาสี่ทศวรรษ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา บรรณาธิการวารสารและผู้ตรวจสอบได้ร้องขอการนำวิธีการที่ปรับปรุงความถูกต้องและความสามารถในการทำซ้ำของข้อมูล Western blot เชิงปริมาณมาใช้ การทำให้โปรตีนเป็นมาตรฐานเป็นขั้นตอนสำคัญในการรับข้อมูล western blot เชิงปริมาณที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้ การทำให้เป็นมาตรฐานของโปรตีนทั้งหมดถือเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับ Western blotting เชิงปริมาณ การทำให้โปรตีนเป็นมาตรฐานของ western blots นั้นอาศัยโปรตีนสำหรับทำความสะอาด ซึ่งแสดงความอิ่มตัวของสัญญาณและระดับการแสดงออกของเซลล์ที่แตกต่างกัน ปัญหาเหล่านี้สามารถให้ผลลัพธ์ปลอม นำไปสู่ข้อสรุปที่ผิดพลาด ในการสัมมนาผ่านเว็บนี้ เราจะพูดถึงรีเอเจนต์การติดฉลากโปรตีนตัวใหม่ที่เสนอทางเลือกที่น่าสนใจในการทำให้โปรตีนกลับสู่สภาพปกติ Invitrogen No-Stain Protein Labeling Reagent เป็นวิธีที่ยืดหยุ่น แม่นยำ รวดเร็ว และเชื่อถือได้ในการแสดงภาพและทำให้โปรตีนเป็นปกติบนเจลหรือบนเมมเบรน (หลังการถ่ายโอน) รีเอเจนต์ No-Stain สามารถจับกับโปรตีนทั้งหมดบนเจลหรือเมมเบรนภายใน 10 นาที โดยไม่ต้องมีขั้นตอนการขจัดคราบใดๆ และสามารถมองเห็นได้ทันทีโดยใช้เครื่องสร้างภาพ UV แสงสีน้ำเงิน หรือสารเรืองแสง รีเอเจนต์แบบไม่มีคราบไม่ต้องการเจลหรือรีเอเจนต์พิเศษใดๆ และเข้ากันได้กับการย้อมสีเจลที่มีอยู่และเวิร์กโฟลว์การซับแบบตะวันตก เรานำเสนอข้อมูลและการวิเคราะห์ที่แสดงให้เห็นถึงความสะดวกในการใช้งาน และปรับปรุงความแม่นยำและความสามารถในการทำซ้ำของข้อมูล Western blot เชิงปริมาณด้วย No-Stain Protein Labeling Reagent เมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนทำความสะอาด


ยูเรียและเวสเทิร์นบลอต - (28 พ.ค. 2551 )

ฉันมีตัวอย่างเนื้อเยื่อขนาดเล็กมากที่ฉันต้องใช้สำหรับ qRT-PCR และสำหรับ Western Blots ฉันได้ใช้ชุดอุปกรณ์นี้ที่แยกจีโนม DNA และ RNA ออกจากกัน จากนั้นจึงทำการตกตะกอนของอะซิโตนเพื่อให้ได้โปรตีน ปัญหาหลักของฉันคือสิ่งที่จะละลายในเม็ดโปรตีน ชุดคิทแนะนำยูเรีย 8M หรือ SDS 5% ฉันโชคร้ายที่ใช้ SDS ในการละลายทั้งเม็ด และมีปัญหาเรื่องการตกตะกอนเมื่อสารละลายเย็นลง ฉันพยายามหาข้อมูลว่ายูเรียมีพฤติกรรมอย่างไรในภาษาตะวันตก และมีคำถามหลายข้อที่ฉันตอบยาก

1. ยูเรีย 8M ขัดขวางการทำงานของเจลหรือไม่? ฉันควรระงับโปรตีนของฉันในยูเรีย 8M ปริมาณเล็กน้อยแล้วเจือจางเมื่อฉันใส่เจลหรือไม่
2. บัฟเฟอร์ตัวอย่างที่ฉันใช้สำหรับฝรั่งแนะนำให้อุ่นตัวอย่างจนเดือดก่อนใส่เจล ฉันถือว่านั่นเป็นเพราะ SDS ในบัฟเฟอร์ตัวอย่าง ฉันได้อ่านมาว่าการให้ความร้อนกับยูเรียและโปรตีนทำให้เกิดคาร์บาไมเลชัน ซึ่งฉันไม่แน่ใจว่าจะเข้าไปยุ่งเกี่ยวกับอาหารตะวันตกของฉัน ฉันได้อ่านมาว่าบางคนให้ความร้อนกับตัวอย่างของพวกเขาถึง 30-37C ก่อนที่จะโหลดเจล แต่ฉัน"m ไม่แน่ใจว่าพวกเขาใช้เจลประเภทใดหรือบัฟเฟอร์ตัวอย่างประเภทใดที่พวกเขาใช้ ดังนั้น ฉันเดาว่าคำถามของฉันคือ อุณหภูมิใดที่ฉันให้ความร้อนกับตัวอย่างของฉัน หากเลย เมื่อใช้โปรตีนที่ถูกแขวนลอยใหม่ในยูเรีย 8M และใช้บัฟเฟอร์ตัวอย่าง Laemmli หรือบัฟเฟอร์ตัวอย่าง XT
3. มีตัวเลือกอื่นในการระงับเม็ดโปรตีนของฉันนอกเหนือจาก SDS และยูเรีย 8M ที่จะไม่รบกวนการทดสอบโปรตีน BCA หรือไม่?
4. สารละลายยูเรีย 8M สามารถละลายได้นานแค่ไหนและที่อุณหภูมิเท่าไร?

นั่นคือทั้งหมดที่สำหรับตอนนี้. ขอบคุณสำหรับความช่วยเหลือใด ๆ

ใช่นิดหน่อยแต่ไม่มาก ไม่มีอะไรเทียบได้กับ GnHCl ตัวอย่างเช่น ที่เปลี่ยนแปลงการโยกย้ายจริงๆ

โดยปกติไม่จำเป็นหากคุณใช้บัฟเฟอร์การโหลด SDS 2X ก็ใช้ได้

ฉันไม่กังวลเกี่ยวกับการรักษาความร้อนเพียง 2 นาทีที่ 95 ° C ควรทำงานได้อย่างสมบูรณ์ ฉันแสดง Western Blot หลายร้อยรายการด้วยตัวอย่างดังกล่าวและไม่เคยมีการรับรู้ปัญหาใด ๆ (ฉันใช้ anti His tag mAb เป็นหลัก)

3. มีตัวเลือกอื่นในการระงับเม็ดโปรตีนของฉันนอกเหนือจาก SDS และยูเรีย 8M ที่จะไม่รบกวนการทดสอบโปรตีน BCA หรือไม่?
4. สารละลายยูเรีย 8M สามารถละลายได้นานแค่ไหนและที่อุณหภูมิเท่าไร?

นั่นคือทั้งหมดที่สำหรับตอนนี้. ขอบคุณสำหรับความช่วยเหลือใด ๆ

คุณสามารถลองแขวนมันใหม่ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต เช่น pBS หรือทริสฟอสเฟต แต่แน่นอนว่าโปรตีนบางส่วนจะไม่ละลาย

สำหรับการทดสอบ Pierce BCA ขีดจำกัดของ UREA คือ 3M ดังนั้นหากคุณเจือจางตัวอย่างของคุณตามวิธี (20 ไมโครลิตรใน 200 ไมโครลิตร) พวกมันจะไม่เกิดปฏิกิริยาโต้ตอบมากเกินไป (อย่าลืมใช้บัฟเฟอร์เดียวกันสำหรับจุดศูนย์ของคุณ)

ขอบคุณมากสำหรับข้อมูลทั้งหมดนั้น เป็นเรื่องดีที่จะสะกดทุกอย่างไว้ในที่เดียว

สวัสดี ฉันมีคำถามว่าฉันใช้เนื้อเยื่อฮิปโปแคมปัลเพื่อตรวจหาโปรตีนเมมเบรนโดยเวสเทิร์บล็อตติง แต่ฉันไม่สามารถระบุโมเลกุลของตัวรับทั้งหมดที่มีความสำคัญได้ ดังนั้น หากใครมีความคิดเกี่ยวกับวิธีการแยกโปรตีนเมมเบรนทั้งหมด อาจจะโดยการเปลี่ยนความเข้มข้นของส่วนผสมที่ใช้ ได้โปรดฉันต้องการคำแนะนำ
ขอบคุณมาก
สุดาชาน

สวัสดี ฉันมีคำถามว่าฉันใช้เนื้อเยื่อฮิปโปแคมปัลเพื่อตรวจหาโปรตีนเมมเบรนโดยเวสเทิร์บล็อตติง แต่ฉันไม่สามารถระบุโมเลกุลของตัวรับทั้งหมดที่มีความสำคัญได้ ดังนั้น หากใครมีความคิดเกี่ยวกับวิธีการแยกโปรตีนเมมเบรนทั้งหมด อาจจะโดยการเปลี่ยนความเข้มข้นของส่วนผสมที่ใช้ ได้โปรดฉันต้องการคำแนะนำ
ขอบคุณมาก
สุดาชาน


ดูวิดีโอ: กระดาษซบดเมชนสำหรบผา Cotton 100% (มิถุนายน 2022).