ข้อมูล

ช่วยวิเคราะห์ SDS-Page gel

ช่วยวิเคราะห์ SDS-Page gel



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ในการทดลองนี้ เราเปลี่ยนการตัดปลายของลำดับโปรตีน NFAT เป็นพลาสมิดเวกเตอร์เพื่อแสดงใน E.Coli เป็นโปรตีนหลอมรวมที่มี GST นอกจากนี้เรายังพยายามเปลี่ยนพลาสมิดปกติโดยไม่มี NFAT เพื่อให้เราได้รับ GST เพียงอย่างเดียว หลังจากที่เติบโตในอาณานิคมเหล่านี้และเลือกอาณานิคมที่เป็นบวก เราก็แยกเชื้ออี.โคไล เรารวบรวมไลเซทนี้บางส่วนสำหรับ SDS-PAGE จากนั้นเราใส่สารละลาย GST และ GST-NFAT ที่แยกไว้แยกกันด้วยเม็ดบีดกลูตาไธโอน GST จับกลูตาไธโอน เราล้างคอลัมน์และรวบรวมการซักบางส่วนสำหรับ SDS-PAGE สุดท้าย เราแยก GST และ GST-NFAT ออกจากคอลัมน์และบันทึกบางส่วนสำหรับ SDS-PAGE

ฉันได้แนบรูปภาพของ SDS-PAGE เวอร์ชันที่ประสบความสำเร็จ

คุณต้องการมุ่งความสนใจไปที่เลนแรก นั่นคือ Molecular Weight Marker (MWM) เลนที่เหลือควรตีความในชุดที่ 3 เลนแรกจากสามเลนคือไลเซทหยาบ เลนที่สองในสามเลนคือการล้างครั้งแรก และสุดท้ายคือโปรตีนที่น่าสนใจ เลนสำคัญสำหรับการวิเคราะห์ของฉันคือ 8-10 และ 11-13

ฉันจะอธิบายสิ่งที่ฉันรู้จากเจล SDS-PAGE นี้จนถึงตอนนี้ ฉันทราบน้ำหนักของแถบต่างๆ ในเครื่องหมายแสดงน้ำหนักโมเลกุล เพราะฉันได้รับสำเนาของโปรตีนต่างๆ ในเครื่องหมาย จากข้อมูลนี้ ฉันสามารถยืนยันได้ว่าฉันแยกโปรตีนที่สนใจในเลน 13 และแยก GST อย่างเดียวในเลน 10 ฉันยังเข้าใจเหตุผลที่ว่าทำไมเลนไลเซทถึงมืดที่สุด ตามด้วยเลนล้าง แล้วก็สะอาดมาก โปรตีนที่น่าสนใจเลน นอกจากนี้ โปรดทราบว่าช่องทำเครื่องหมายและช่องชะล้างบรรจุด้วย 10 ไมโครลิตร ขณะที่ช่องอื่นๆ บรรจุ 2 ไมโครลิตร อย่างไรก็ตามมีบางอย่างที่ฉันไม่เข้าใจจากเจล
(1) ทำไมแถบความถี่จึงกระจาย/ความละเอียดต่ำ ฉันคิดว่ามันอาจจะบรรทุกบ่อน้ำมากเกินไป แต่ฉันไม่เชื่อเพราะฉันทำตามขั้นตอนที่ตั้งไว้
(2) เหตุใดจึงมีการสตรีคเป็นจำนวนมาก โดยเฉพาะในเลน 5, 8, 9, 10 และ 11
(3) ฉันแยกโปรตีนที่สนใจออกเพราะมันเป็นฟิวชันโปรตีนที่มี GST (หรือ GST เพียงอย่างเดียว) จากนั้นจึงขับโปรตีนออกจากเม็ดกลูตาไธโอนด้วยการล้างกลูตาไธโอนส่วนเกิน ในทางทฤษฎี เลนสำหรับตัวชะควรปราศจากทุกสิ่ง ยกเว้นโปรตีนที่น่าสนใจและกลูตาไธโอน ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็นจริงสำหรับเลน 4 และ 9 ซึ่งควรมีเฉพาะภาษี GST และกลูตาไธโอน อย่างไรก็ตาม ช่อง 7 และ 13 ควรมี GST-NFAT และกลูตาไธโอนเท่านั้น เลนไม่ชัดเจนเท่าที่ควรและดูเหมือนจะเปื้อนโปรตีนอื่นๆ มากมาย เกิดอะไรขึ้น?
(4) ศาสตราจารย์คนหนึ่งบอกฉันว่าวงที่สองในเลน 13 (เลน GST-NFAT) เป็นผลิตภัณฑ์ลดระดับ เป็นไปได้อย่างไร? วงดนตรีไม่สอดคล้องกับน้ำหนักของ NFAT เพียงอย่างเดียวหรือ GST เพียงอย่างเดียว นอกจากนี้ หาก NFAT-GST เสื่อมคุณภาพ จะมีผลิตภัณฑ์ลดการสลายตัวสองแถบไม่ใช่หรือ
(5) เหตุใดช่องทางเดียว GST จึงมีลักษณะเหมือนแถบคู่ (เลน 4, 10)
(6) หากเราชะโปรตีนที่น่าสนใจด้วยกลูตาไธโอนส่วนเกินซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลต่ำมาก ทำไมจึงไม่ปรากฏบนเจล เป็นไปได้ไหมที่มันวิ่งออกไปก่อนทุกอย่าง?
(7) ฉันมีรายการน้ำหนักของแถบของเครื่องหมายโมเลกุล ยังมีวงดนตรีพิเศษที่ด้านล่างที่ไม่ปรากฏในรายการของฉัน เป็นไปได้ไหมที่รายการของฉันไม่สมบูรณ์หรือมีอย่างอื่นเกิดขึ้น?

สุดท้าย ฉันได้แนบรูปภาพของเจล SDS-PAGE ที่ล้มเหลวมาด้วย

สิ่งเดียวที่ฉันรู้แน่ชัดคือสาเหตุของข้อผิดพลาดคือความจริงที่ว่าระดับบัฟเฟอร์ของฉันลดลงระหว่างการทำงาน (เนื่องจากการรั่วไหล) ผลลัพธ์ของเจลนี้แม่นยำ (เลน 2-7 ตรงกับเลน 8-13 บนเจลด้านบน และผลลัพธ์เกือบจะเหมือนกัน) แต่เจลกลับกลายเป็นอย่างน่ากลัว บัฟเฟอร์ล้มทำให้เกิดผลลัพธ์นี้ได้อย่างไร หรือมีอย่างอื่นที่อาจมีส่วนทำให้เกิดรูปแบบแปลก ๆ นี้หรือไม่? สุดท้าย เลนในเจลนี้ไม่ได้แตกต่างไปจากเจลตัวแรก แต่เป็นหวีเดียวกัน ดังนั้นจึงใช้ขนาดและช่องว่างที่เท่ากัน เหตุใดจึงมีเลือดออกมากระหว่างเลน / ขาดช่องว่างระหว่างเลน?

ขอบคุณล่วงหน้าสำหรับความช่วยเหลือใด ๆ


นี่คือความคิดบางส่วนจากประสบการณ์ของฉันเองในการทำให้โปรตีนจำนวนมากบริสุทธิ์และใช้เจล SDS-PAGE จำนวนมาก:

(1) ความละเอียด -- คุณเรียกใช้เจลนี้เร็วแค่ไหน? บ่อยครั้งถ้าคุณวิ่งที่สูงกว่า 150V หรือมากกว่านั้น คุณจะได้แบนด์ที่มีลักษณะเช่นนี้ ความละเอียดยังอาจเกี่ยวข้องกับ...

(2) ฉันพนันได้เลยว่าการสตรีคนั้นเกิดจากเกลือในตัวอย่าง ซึ่งส่วนใหญ่แล้วบัฟเฟอร์ lysis/wash/elution สามารถมีเกลือได้มากถึง 500 mM หรือ 1 M และสิ่งนี้ทำให้เกิด streak อย่างสม่ำเสมอ ใส่ตัวอย่างน้อยลงในเลนเหล่านี้ และรักษาปริมาตรรวมให้เท่ากันเพื่อเจือจางเกลือให้ต่ำกว่า 250 mM เป็นอย่างน้อย สิ่งอื่นในบัฟเฟอร์ของคุณอาจทำให้เกิด streaking ได้ แต่เกลือเป็นเรื่องธรรมดาที่สุด (แจ้งให้เราทราบถึงองค์ประกอบของ lysis/wash/elution buffers)

(3) การทำให้ GST บริสุทธิ์เพียงอย่างเดียวนั้นดูดีมาก - บ่อยครั้งที่การเตรียมการของคุณจะดูเหมือนเลนที่คุณระบุไว้ซึ่งไม่สะอาดทั้งหมด นี่เป็นเรื่องปกติธรรมดาสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ในขั้นตอนเดียว โดยบ่อยครั้งที่คุณต้องการ 2-3 สำหรับโปรตีนบางชนิดเพื่อขจัดสิ่งปนเปื้อนออกให้หมด มีหลายแหล่งที่มาที่เป็นไปได้ของวงดนตรีเหล่านี้:

  1. โปรตีนจากภายนอก: โปรตีนจากแบคทีเรียหลายชนิดจะเกาะติดกับเม็ดบีดโดยไม่เจาะจง (นี่คือเหตุผลที่เราล้าง) แต่การซักอย่างทั่วถึงก็ยังทิ้งสิ่งปนเปื้อนไว้ได้ โปรตีนเหล่านี้ยังสามารถจับกับโปรตีนที่คุณสนใจและถูกชะออกจากเรซินด้วย
  2. ผลิตภัณฑ์ตัดทอน: ขึ้นอยู่กับว่าแท็กของคุณอยู่ที่ไหน (ให้นั่งที่ปลาย N) บางครั้งคุณอาจได้รับผลิตภัณฑ์แปลที่ไม่สมบูรณ์ - พวกเขามีแท็ก แต่ไม่ใช่โปรตีนความยาวเต็ม สิ่งเหล่านี้จะยังคงผูกและหลุดออกจากลูกปัดเพราะยังคงแท็กไว้ ไม่ต้องสนใจจุดนี้หากแท็กของคุณอยู่ที่ปลาย C เนื่องจากในกรณีนั้นแท็กจะอยู่ที่โปรตีนเต็มความยาวเท่านั้น
  3. ผลิตภัณฑ์ที่ย่อยสลายได้: สิ่งนี้เกี่ยวข้องกับคำถามของคุณในภายหลัง บ่อยครั้งในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์ โปรตีนของคุณจะถูกย่อยสลายโดยโปรตีเอสจากแบคทีเรีย คุณได้รวมสารยับยั้งโปรตีเอสหลายชนิดไว้ในบัฟเฟอร์ lysis ของคุณหรือไม่? การเก็บตัวอย่างทั้งหมดของคุณบนน้ำแข็งก็มีความสำคัญด้วยเหตุนี้

(4) ทำความเข้าใจว่าผลิตภัณฑ์จากการย่อยสลายไม่ได้หมายความว่าคุณจะได้รับเฉพาะโปรตีนและ GST ที่หลอมรวมเท่านั้น แต่อาจเป็นการตัดทอนได้หลากหลายเนื่องจากการย่อยสลายโดยโปรตีเอส

(5) ฉันพนันได้เลยว่านี่เป็นเพราะสภาพการวิ่งของคุณหรือเกลือในตัวอย่างของคุณ ฉันคิดว่านี่น่าจะเป็นวง GST วงเดียวของคุณ

(6) กลูตาไธโอนจะไม่ปรากฏบนเจล เนื่องจากสูตรมีน้ำหนักประมาณ 300 กรัม/โมล ถ้าฉันจำได้ว่าหมายถึงประมาณ 300 ดาลตัน ซึ่งเล็กกว่าสิ่งที่คุณจะเก็บไว้ในเจลมาก ยิ่งไปกว่านั้น อย่าลืมว่าคราบของคุณเป็นโปรตีน - คูมัสซี่บลูจับสารตกค้างพื้นฐานบนโปรตีน

(7) ฉันไม่แน่ใจว่าคุณกำลังพูดถึงวงไหน แต่ฉันคิดว่าแถบด้านล่างสุดในเลนมาร์กเกอร์ของคุณเป็นเพียงด้านหน้าสีย้อม นอกจากนี้ยังอาจเป็นผลิตภัณฑ์ย่อยสลายโปรตีนในบันไดของคุณ

เท่าที่เจลที่สองไป ทั้งหมดเป็นเพราะระดับบัฟเฟอร์ลดลงระหว่างการวิ่ง หากไม่มีบัฟเฟอร์ครอบคลุมด้านบนของเจลจะไม่มีกระแสไหล อาจเป็นเพราะการรั่วไหลเกิดขึ้น คุณมีการกระจายบัฟเฟอร์ไม่สม่ำเสมอ สิ่งแปลก ๆ สามารถเกิดขึ้นได้เมื่อสิ่งนี้เกิดขึ้น (ฉันรู้ตามหลักวิทยาศาสตร์)


โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟตเคลือบโปรตีนตามสัดส่วนของน้ำหนักโมเลกุล จากนั้นให้ประจุไฟฟ้าเชิงลบที่เหมือนกันกับโปรตีนทั้งหมดในตัวอย่าง อัตราการย้ายของโพลีเปปไทด์ใน SDS-PAGE เป็นสัดส่วนผกผันกับลอการิทึมของน้ำหนักโมเลกุล ซึ่งหมายความว่ายิ่งโพลีเปปไทด์มีขนาดใหญ่เท่าใดก็จะยิ่งย้ายในเจลช้าลง น้ำหนักโมเลกุลถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบการย้ายถิ่นของจุดโปรตีนกับการย้ายถิ่นของมาตรฐาน พล็อตของน้ำหนักโมเลกุลของล็อกเทียบกับระยะการย้ายถิ่นมีความเป็นเส้นตรงพอสมควร

โปรตีนที่แยกจากกันโดย SDS-PAGE มักจะถูกกู้คืนในขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการแปลโปรตีนที่น่าสนใจบนเจลตาม SDS-PAGE โดยการชะโปรตีนออกจากเจล การกำจัดโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตออกจากตัวอย่างที่ชะ และสุดท้ายเปลี่ยนโปรตีน เพื่อการวิเคราะห์ในภายหลัง โปรตีนที่ถูกชะออกจากเจลถูกนำมาใช้ในการใช้งานปลายน้ำที่หลากหลาย เช่น เคมีโปรตีน การกำหนดองค์ประกอบของกรดอะมิโน การระบุโพลีเปปไทด์ที่สอดคล้องกับกิจกรรมของเอนไซม์จำเพาะ และวัตถุประสงค์อื่นๆ

การวิเคราะห์ความเข้มข้นของโปรตีนเป็นการทดสอบที่สำคัญในการวิจัยทางชีวเคมี การทดสอบ Bradford เป็นหนึ่งในวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดในการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน เทียบกับมาตรฐาน เทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับการก่อตัวของความซับซ้อนระหว่างโปรตีนในสารละลายและสีย้อม การทดสอบนี้แนะนำสำหรับการใช้งานโดยรวม โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการประเมินความเข้มข้นของโปรตีนสำหรับเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส โปรตีนที่แยกจากกันโดย SDS-PAGE มักจะถูกกู้คืนในขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการแปลโปรตีนที่น่าสนใจบนเจลตาม SDS-PAGE โดยการชะโปรตีน จากเจล โดยเอาโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟตออกจากตัวอย่างที่ชะ และสุดท้ายจะเปลี่ยนโปรตีนสำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง

โปรตีนที่ถูกชะออกจากเจลถูกนำมาใช้ในการใช้งานปลายน้ำที่หลากหลาย เช่น เคมีโปรตีน การกำหนดองค์ประกอบของกรดอะมิโน การระบุโพลีเปปไทด์ที่สอดคล้องกับกิจกรรมของเอนไซม์จำเพาะ และวัตถุประสงค์อื่นๆ การวิเคราะห์ความเข้มข้นของโปรตีนเป็นการทดสอบที่สำคัญในการวิจัยทางชีวเคมี การทดสอบ Bradford เป็นหนึ่งในวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดในการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีน เทียบกับมาตรฐาน เทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับการก่อตัวของความซับซ้อนระหว่างโปรตีนในสารละลายและสีย้อม Brilliant Blue G.

การทดสอบนี้แนะนำสำหรับการใช้งานโดยรวม โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการประเมินความเข้มข้นของโปรตีนสำหรับเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส อิงจากการสังเกตว่าค่าการดูดกลืนแสงสูงสุดสำหรับส่วนผสมที่เป็นกรดของ Coomassie Brilliant Blue G-250 ที่เปลี่ยนจาก 465 nm เป็น 595 nm ในเวลาที่เกิดการจับกับโปรตีน การทดสอบมีประสิทธิผลเนื่องจากค่าสัมประสิทธิ์การทำลายล้างของสารละลายอัลบูมิน-สีย้อมที่ซับซ้อนมักจะคงที่ตลอดช่วงความเข้มข้น 10 เท่า (Westermeier, Naven & Ho?pker, 2008)

สีย้อมทำปฏิกิริยากับอาร์จินีนตกค้างเป็นหลัก แต่น้อยกว่ากับฮิสติดีน ไลซีน ทริปโตเฟน ไทโรซีน และฟีนิลอะลานีนตกค้าง ดูเหมือนว่าการทดสอบนี้ไม่เหมาะสำหรับโปรตีนที่เป็นกรดหรือเป็นเบส อย่างไรก็ตาม มันค่อนข้างไวต่อโปรตีนอัลบูมินในซีรัมของวัว มากกว่าโปรตีนส่วนใหญ่ถึงสองเท่า แกมมาโกลบูลิน (IgG) เป็นโปรตีนมาตรฐานตามความชอบ วัตถุประสงค์ของสิ่งนี้


สารบัญ

SDS-PAGE เป็นวิธีการอิเล็กโตรโฟรีซิสที่ช่วยให้สามารถแยกโปรตีนตามมวลได้ สื่อ (เรียกอีกอย่างว่า 'เมทริกซ์') เป็นเจลที่ไม่ต่อเนื่องที่มีพอลิอะคริลาไมด์ นอกจากนี้ยังใช้ SDS (โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต) SDS ประมาณ 1.4 กรัมจับกับโปรตีน 1 กรัม Α] Β] Γ] ซึ่งสอดคล้องกับโมเลกุล SDS หนึ่งโมเลกุลต่อสองกรดอะมิโน SDS ทำหน้าที่เป็นสารลดแรงตึงผิว กำบังประจุที่แท้จริงของโปรตีน และให้อัตราส่วนประจุต่อมวลใกล้เคียงกันมาก ประจุที่แท้จริงของโปรตีนนั้นไม่สำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับการโหลด SDS และประจุบวกก็จะลดลงอย่างมากในช่วง pH พื้นฐานของเจลแยก เมื่อใช้สนามไฟฟ้าคงที่ โปรตีนจะเคลื่อนไปยังแอโนด แต่ละอันมีความเร็วต่างกัน ขึ้นอยู่กับมวลของโปรตีน ขั้นตอนง่ายๆ นี้ช่วยให้สามารถแยกโปรตีนตามมวลได้อย่างแม่นยำ

SDS มีแนวโน้มที่จะสร้างไมเซลล์ทรงกลมในสารละลายที่มีน้ำเหนือความเข้มข้นที่เรียกว่าความเข้มข้นของไมเซลลาร์ที่สำคัญ (CMC) เหนือความเข้มข้นของไมเซลลาร์ที่สำคัญที่ 7 ถึง 10 มิลลิโมลาร์ในสารละลาย SDS เกิดขึ้นพร้อมกันเป็นโมเลกุลเดี่ยว (โมโนเมอร์) และในฐานะไมเซลล์ ด้านล่าง CMC SDS เกิดขึ้นเฉพาะในโมโนเมอร์ในสารละลายที่เป็นน้ำเท่านั้น ที่ความเข้มข้นของไมเซลลาร์วิกฤต ไมเซลล์ประกอบด้วยโมเลกุล SDS ประมาณ 62 โมเลกุล Δ] อย่างไรก็ตาม มีเพียงโมโนเมอร์ SDS เท่านั้นที่จับกับโปรตีนผ่านปฏิกิริยาที่ไม่ชอบน้ำ ในขณะที่ไมเซลล์ SDS นั้นมีประจุลบจากภายนอกและไม่ดูดซับโปรตีนใดๆ Α] SDS เป็นแอมฟิพาติคในธรรมชาติ ซึ่งช่วยให้สามารถแฉโครงสร้างโปรตีนทั้งแบบมีขั้วและแบบไม่มีขั้ว Ε] ในความเข้มข้นของ SDS ที่สูงกว่า 0.1 มิลลิโมลาร์ การเปิดออกของโปรตีนเริ่มต้นที่ Α] และมากกว่า 1 มิลลิโมลาร์ โปรตีนส่วนใหญ่จะถูกทำให้เสียสภาพ Α] เนื่องจากผลกระทบของการเปลี่ยนสภาพที่รุนแรงของ SDS และการแตกตัวของสารเชิงซ้อนของโปรตีนในภายหลัง โดยทั่วไปแล้ว โครงสร้างควอเทอร์นารีไม่สามารถกำหนดได้ด้วย SDS ข้อยกเว้นคือโปรตีนที่ทำให้เสถียรโดยการเชื่อมโยงข้ามโควาเลนต์ เช่น -S-S- การเชื่อมโยงและสารเชิงซ้อนของโปรตีนที่ต้านทาน SDS ซึ่งมีความเสถียรแม้ในที่ที่มี SDS (อย่างไรก็ตาม อย่างหลังที่อุณหภูมิห้องเท่านั้น) ในการแปลงสภาพสารเชิงซ้อนที่ต้านทาน SDS จำเป็นต้องมีพลังงานกระตุ้นสูง ซึ่งทำได้โดยการให้ความร้อน ความต้านทาน SDS ขึ้นอยู่กับความสามารถในการแพร่กระจายของโปรตีนเท่า แม้ว่าโปรตีนที่ต้านทาน SDS ตามธรรมชาติที่พับเต็มที่จะไม่มีความคงตัวเพียงพอเมื่อมี SDS แต่สมดุลทางเคมีของการทำให้เสียสภาพที่อุณหภูมิห้องก็เกิดขึ้นอย่างช้าๆ สารเชิงซ้อนของโปรตีนที่เสถียรมีลักษณะเฉพาะไม่เพียงแค่ความต้านทาน SDS เท่านั้น แต่ยังมีความเสถียรต่อโปรตีเอสและครึ่งชีวิตที่เพิ่มขึ้นด้วย Ζ]

อีกทางเลือกหนึ่ง โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสยังสามารถดำเนินการกับสารลดแรงตึงผิวที่เป็นประจุบวก CTAB ใน CTAB-PAGE, Η] ⎖] ⎗] หรือ 16-BAC ใน BAC-PAGE ⎘]


16.6: Micro-report 5- SDS-PAGE และการวิเคราะห์ western blot

  • สนับสนุนโดย Clare M. O&rsquoConnor
  • รองศาสตราจารย์กิตติคุณ (ชีววิทยา) ที่วิทยาลัยบอสตัน

ในรายงานนี้ คุณจะอธิบายผลลัพธ์ของ SDS-PAGE และ Western blots ที่คุณใช้เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนในเซลล์ที่ถูกแปลงสภาพของคุณภายใต้สภาวะที่ถูกกดขี่และถูกกระตุ้น ให้ความสนใจเป็นพิเศษกับระดับที่ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันหรือขัดแย้งกับผลลัพธ์ของรายงานการเปลี่ยนแปลง/การเติมเต็มก่อนหน้านี้ ควรติดฉลากรูปในลักษณะที่นักวิทยาศาสตร์ที่มีประสบการณ์สามารถเข้าใจผลลัพธ์ของคุณจากรูปและตำนานเพียงอย่างเดียว รายละเอียดการทดลองจำนวนมากถูกผลักไสให้อยู่ในส่วน M&M เลนควรมีฉลากชัดเจนและควรรวมน้ำหนักโมเลกุลของมาตรฐานไว้ด้วย (ตัวอย่างด้านล่างมาจากชั้นเรียนอื่น ซึ่งนักเรียนใช้ SDS-PAGE และ western blots เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนยีสต์ที่แสดงออกจาก pBG1805 มากเกินไป โปรดทราบว่า แอนติบอดีปฐมภูมิของ HA epitope ถูกใช้เพื่อตรวจหาโปรตีนทางทิศตะวันตกต่างจากการทดลองของคุณ รอยเปื้อน)

วัสดุและวิธีการ: ให้ข้อมูลเกี่ยวกับสายพันธุ์ที่แปลงสภาพ สภาวะฟักตัว การเตรียมสารสกัดจากเซลล์ เจล SDS-PAGE และ Western blots อ้างอิงขั้นตอนที่เผยแพร่เมื่อเป็นไปได้ สังเกตการแก้ไขใดๆ หัวเรื่องย่อยอาจมีประโยชน์

สายพันธุ์ที่แปลงแล้ว: รวมชื่อสายพันธุ์และพลาสมิดที่คุณใช้ในการเตรียมสารสกัดจากเซลล์

สารสกัด: รวมข้อมูลเกี่ยวกับสื่อและเวลาฟักตัวที่ใช้ในการจัดการกับการแสดงออกของโปรตีนมากเกินไปจากสายพันธุ์ อ้างอิงคู่มือสำหรับขั้นตอนการสกัด สังเกตการดัดแปลงใดๆ

เจล SDS-PAGE: ให้รายละเอียดเกี่ยวกับ% อะคริลาไมด์ของเจล เวลาทำงาน และแรงดันไฟฟ้าที่ใช้สำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิส

การถ่ายโอนไฟฟ้า: รวมเวลาและแรงดันไฟฟ้าที่ใช้ในการถ่ายโอนโปรตีนจากเจล SDS-PAGE ไปยังเมมเบรน PVDF ดูคู่มือสำหรับรายละเอียดอื่นๆ

หยดตะวันตก: รวมแอนติบอดีที่คุณใช้สำหรับ blot และเงื่อนไข (เวลา, อุณหภูมิ) ที่คุณใช้สำหรับการฟักไข่แต่ละครั้ง รวมเวลาที่คุณใช้ในการตรวจจับโปรตีนที่แสดงออกมากเกินไปด้วย TMB (ซึ่งจะทำให้รู้สึกถึงความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนในสารสกัดของคุณ) คุณไม่จำเป็นต้องรวมขั้นตอนการล้างทั้งหมด - เพียงแค่อ้างอิงคู่มือ

ผลลัพธ์และการอภิปราย - เริ่มต้นด้วยการพูดคุยเรื่อง เจล SDS-PAGE. เจล SDS-PAGE ให้ภาพรวมของโปรตีนในเซลล์และการเปรียบเทียบความเข้มข้นของโปรตีนอย่างคร่าวๆ ในสารสกัดต่างๆ ความเข้มของการย้อมสีของแถบสะท้อนถึงความอุดมสมบูรณ์ในสารสกัด

  • ปริมาณโปรตีนทั้งหมดเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างที่เหนี่ยวนำและไม่เหนี่ยวนำอย่างไร (สิ่งนี้บ่งบอกถึงแหล่งคาร์บอนต่างๆ ได้อย่างไร)
  • คุณเห็นการเปลี่ยนแปลงใดๆ ในแต่ละวงบนเจลหรือไม่? เป็นไปได้ไหมที่จะตรวจจับฟิวชันโปรตีนกับพื้นหลังของโปรตีนอื่นๆ ในสารสกัด? จำได้ว่าเซลล์มีโปรตีนหลายพันชนิด และแถบหนึ่งอาจประกอบด้วยโปรตีนมากกว่าหนึ่งชนิด

NS blot ตะวันตก ช่วยให้คุณตรวจจับฟิวชันโปรตีนกับพื้นหลังของโปรตีนเซลล์อื่นๆ รวมตารางที่แสดงขนาดที่คาดการณ์และขนาดจริงของโปรตีน Met หรือ LacZ ที่ตรวจพบโดยใช้เทคนิค western blot ขนาดของโปรตีนมีความสำคัญเป็นพิเศษ (อาจเป็นไปไม่ได้ที่จะได้ค่าขนาดโปรตีนที่แน่นอน เนื่องจากความไม่ชัดเจนของมาตรฐานใน Western blots อย่างไรก็ตาม คุณควรจะสามารถวางโปรตีนไว้ภายในช่วงที่กำหนดได้) โปรตีนที่เข้ารหัสด้วยพลาสมิดจะ มีขนาดใหญ่กว่าโปรตีนที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติเนื่องจากแท็ก epitope ที่เข้ารหัสโดยพลาสมิด ขนาดที่สังเกตได้เป็นสิ่งที่คุณคาดหวังหรือไม่?


การวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) เป็นเทคโนโลยีที่ใช้กันทั่วไปในการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์และวิเคราะห์ SDS-PAGE สามารถแยกโปรตีนตามความแตกต่างของประจุและการเคลื่อนที่ที่แตกต่างกันเนื่องจากขนาดโมเลกุลต่างกัน ถ้าตัวอย่างโปรตีนได้รับการทำให้บริสุทธิ์อย่างสูงและมีโปรตีนเพียงตัวเดียว ผลลัพธ์จะแสดงแถบโปรตีนเดียวหลังจากการแยก SDS-PAGE อย่างไรก็ตาม เมื่อมีโปรตีนหลายชนิดในตัวอย่างโปรตีน โปรตีนที่ต่างกันสามารถแยกออกเป็นแถบโปรตีนหลายแถบผ่าน SDS-PAGE ดังนั้นเทคโนโลยี SDS-PAGE จึงเป็นวิธีวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างโปรตีนได้โดยตรง เพื่อตอบสนองความต้องการวิจัยในการวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์โปรตีน MtoZ Biolabs ได้พัฒนาและเพิ่มประสิทธิภาพเวิร์กโฟลว์ที่ใช้ SDS-PAGE และให้บริการวิเคราะห์ที่แม่นยำสำหรับการศึกษาการทำให้โปรตีน/เปปไทด์บริสุทธิ์

หลักการวิเคราะห์ของ SDS-PAGE

SDS เป็นสารลดแรงตึงผิวประจุลบชนิดหนึ่งที่สามารถทำลายพันธะไฮโดรเจนและพันธะที่ไม่ชอบน้ำในโปรตีน SDS สามารถจับกับโปรตีนในสัดส่วนที่แน่นอนเพื่อสร้างสารเชิงซ้อนโปรตีน SDS ซึ่งครอบคลุมประจุที่แท้จริงของโปรตีน ดังนั้นความเร็วในการย้ายของคอมเพล็กซ์โปรตีน SDS ทุกชนิดจึงถูกกำหนดโดยน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเท่านั้น โปรตีนที่ต่างกันจะถูกแยกออกโดย SDS-PAGE อิเล็กโตรโฟรีซิส ตามด้วยการย้อมโปรตีนและการวิเคราะห์แถบโปรตีน

เวิร์กโฟลว์การวิเคราะห์ SDS-PAGE

ขั้นตอนการวิเคราะห์ SDS-PAGE:

1. การหาความเข้มข้นของโปรตีน
2. การเตรียมตัวอย่าง: เพิ่มบัฟเฟอร์การโหลด 2x (5% β-ME) และต้มตัวอย่างเป็นเวลา 10 นาที
3. การเตรียมอิเล็กโตรโฟรีติก: การผลิตเจล การติดตั้งถังอิเล็กโตรโฟรีติก และการเตรียมบัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟรีติก
4. การโหลดตัวอย่างโปรตีน: ตามความเข้มข้นของโปรตีน นำตัวอย่างโปรตีนแปรรูปในปริมาณที่เหมาะสม และเพิ่มลงในกระเป๋าของเจล หลังจากใส่ตัวอย่างทั้งหมดแล้ว ให้เติมเครื่องหมายมาตรฐานโปรตีนลงในกระเป๋าเจลช่องแรกหรือช่องสุดท้ายของเจล
5. อิเล็กโตรโฟรีซิส: เปิดแหล่งจ่ายไฟปรับแรงดันไฟฟ้าเป็น 100V และเรียกใช้เจลแรงดันคงที่
6. การย้อมสีเจล: เมื่อสิ้นสุดการแยกอิเล็กโตรโฟเรติก ให้ย้อมด้วย R250 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามด้วยการแยกโปรตีนเจลออกจนพื้นหลังสะอาดใส
7. การวิเคราะห์ความบริสุทธิ์และน้ำหนักโมเลกุลของตัวอย่างโปรตีน

• ขั้นตอนการทดลอง
• พารามิเตอร์ของ SDS-PAGE
• ผลความบริสุทธิ์ของโปรตีน
• การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ


ผีเสื้อกับเทคโนโลยีชีวภาพ

สวัสดีผู้อ่านที่รักเพื่อน ๆ หายไปนานฉันเขียนที่นี่ ขอโทษด้วย ฉันค่อนข้างยุ่งในแล็บ! และคุณสามารถมีความสุขได้เพราะฉันยุ่ง เพราะฉันมีประสบการณ์มากมายที่จะแบ่งปันกับคุณ! มาเริ่มกันที่ SDS PAGE ก่อน!

SDS PAGE - โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต - โพลี อะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส! SDS PAGE นี้จัดทำขึ้นเพื่อแยกโปรตีนตามน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน เป็นเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายและมีประโยชน์มากสำหรับการมีแนวคิดเกี่ยวกับการแสดงออกของโปรตีนที่คุณสนใจ

หลักการ:
ชื่อ SDS PAGE มาจากข้อเท็จจริงที่ว่าวิธีนี้ใช้ SDS เพื่อทำให้โปรตีนของคุณมีประจุลบอย่างสม่ำเสมอ และแน่นอนว่าเจลนั้นเตรียมโดยใช้โพลีอะคริลาไมด์ ทำไมต้องทำให้โปรตีนมีประจุลบ? เพราะความสนใจของเราคือการแยกโปรตีนตามน้ำหนักโมเลกุลเท่านั้น แต่ไม่ได้ขึ้นอยู่กับประจุและโปรตีนทั้งหมดไม่มีประจุลบเหมือน DNA (ซึ่งแยกตามขนาดโดยใช้ Agarose Gel electrophoresis) SDS เป็นผงซักฟอกที่มีประจุลบและทำให้โปรตีนของคุณมีประจุลบ ดังนั้นโปรตีนของคุณจะเคลื่อนไปที่ขั้วบวก เช่น แอโนด

โอเค หลักการนั้นใช้ได้ แต่อะไรคือความผิดพลาดที่เป็นไปได้ทั้งหมดที่เราสามารถทำได้ในขณะที่ทำ SDS PAGE ฉันจะอธิบายข้อผิดพลาดที่อาจเป็นไปได้เพื่อช่วยผู้เริ่มต้น ฉันแนะนำให้คุณเรียนรู้ขั้นตอนสำหรับ SDS PAGE ก่อนอ่านข้อความนี้


ชีววิทยา - TPR/NS

A. การถ่ายโอน DNA ระหว่าง phage และแบคทีเรียไม่ได้เกิดขึ้นทันทีหลังจากการแทรกของไวรัส

B. ไม่มีการระบุ 32P ในสารพันธุกรรมของแบคทีเรียขั้นตอนที่ 3 ที่ติดเชื้อหลังจากการสลายของแบคทีเรียและการปล่อย phage virion

ค. เศษขนที่ประกอบด้วย 35S จากลูกหลานของฟาจดูดซับไปยังแบคทีเรีย แม้ว่าชิ้นส่วนนั้นจะไม่มีดีเอ็นเอก็ตาม

- ควรมีการถ่ายโอน DNA ในการทดลอง เพราะมันเป็นสารพันธุกรรม เราต้องพิสูจน์ผิดว่า S แทนที่จะเป็น P ถูกดูดเข้าไป

A. มีการกลายพันธุ์ในส่วนของ DNA ที่จับกับโปรโมเตอร์

B. พบการกลายพันธุ์ missense ในยีนที่กำหนดรหัสสำหรับตัวยับยั้ง

C. มีปัญหาเชิงโครงสร้างกับส่วนของ DNA ที่ผูกกับตัวยับยั้ง

A. มีจีโนมที่รหัสวัสดุเกือบทั้งหมดสำหรับโปรตีน

B. มักใช้ไมโทซิสในการแบ่งเซลล์

C. สามารถทำปฏิกิริยา catabolic เพื่อรับพลังงานจากโมเลกุลขนาดใหญ่

ก. เดินทางไกลขึ้นระหว่าง SDS-PAGE และชะล้างเร็วขึ้นระหว่างโครมาโตกราฟีแบบแยกขนาด

B. เดินทางไกลขึ้นระหว่าง SDS-PAGE และชะล้างช้าลงระหว่างโครมาโตกราฟีแบบแยกขนาด

C. เดินทางในระยะทางที่น้อยกว่าระหว่าง SDS-PAGE และชะล้างเร็วขึ้นระหว่างโครมาโตกราฟีแบบยกเว้นขนาด

SDS-PAGE + dithiothreitol: 3 วง

การคาดคะเนเกี่ยวกับโครงสร้างเอนไซม์ใดที่ได้รับการสนับสนุนมากที่สุดจากการสังเกตเหล่านี้

A. เอนไซม์ α มีอัตราส่วนของประจุต่อสารตกค้างที่ไม่มีประจุสูง

B. เอนไซม์ α มีหน่วยย่อยมากกว่าหนึ่งหน่วย

C. เอนไซม์ α มีอัตราส่วนของประจุต่อสารตกค้างที่ไม่มีประจุต่ำ

B. ออสโมลาลิตีในเลือดต่ำและความดันโลหิตสูง

C. ออสโมลาลิตีในเลือดสูงและความดันโลหิตต่ำ

คำถามถามว่าสภาวะทางสรีรวิทยาใดที่จะนำไปสู่การตอบสนองเช่นเดียวกับที่พบในระหว่างการบริโภคเครื่องดื่มแอลกอฮอล์

ระหว่าง FISH หัววัดที่ติดฉลากเรืองแสงจะถูกผสมเข้ากับกลุ่มโครโมโซม

ซึ่งคล้ายกับวิธีการใช้โพรบใน blots ทางใต้และทางเหนือ

โพรบต้องเป็น DNA/RNA สายเดี่ยว หากจะทำการผสมพันธุ์หรือจับกับโครโมโซม

A. ปกติ 25% ที่มีตาสีฟ้า, 25% ปกติในดวงตาสีน้ำตาล, 25% ตาสีฟ้าที่มีความเสี่ยงต่อโรค Crohn และตาสีน้ำตาล 25% ที่มีความเสี่ยงต่อการเป็นโรค Crohn

B. ปกติ 50% มีตาสีฟ้า และ 50% ตาสีน้ำตาล มีความเสี่ยงที่จะเป็นโรคโครห์น

ค. 50% ตาสีฟ้ามีความเสี่ยงที่จะเป็นโรคโครห์น และ 50% ปกติที่มีตาสีน้ำตาล

A. เหตุการณ์ครอสโอเวอร์เดี่ยวส่งผลให้เกิดการเคลื่อนตัวทางเดียวของเนื้อหาโครโมโซมจากโครโมโซมหนึ่งไปยังอีกโครโมโซม ในขณะที่เหตุการณ์ครอสโอเวอร์สองครั้งจะย้อนกลับการกระจัดทางเดียวนี้ ส่งผลให้โครโมโซมเหมือนกันกับโครโมโซมก่อนครอสโอเวอร์

B. เหตุการณ์ครอสโอเวอร์เดี่ยวเกิดขึ้นระหว่างการแบ่งเซลล์แบบไมโทซิสเมื่อเซลล์แบ่งออกเป็นสองเซลล์ ในขณะที่เหตุการณ์ครอสโอเวอร์แบบคู่จะเกิดขึ้นได้เฉพาะระหว่างไมโอซิสเมื่อเซลล์แยกออกเป็นสี่เซลล์

C. เหตุการณ์ครอสโอเวอร์เดี่ยวส่งผลกระทบต่อปลายแขนของโครโมโซมเท่านั้น ในขณะที่เหตุการณ์ครอสโอเวอร์สองครั้งอาจส่งผลต่อส่วนตรงกลางของแขนโครโมโซม

ก. มีความเป็นไปได้สูงที่จะแสดงไตรโซมี 21

ข. มีความน่าจะเป็นน้อยกว่าในการแสดงไตรโซมี 21

ค. มีความน่าจะเป็นคล้ายกันในการแสดงไตรโซมี 21

A. การถ่ายโอน DNA ระหว่าง phage และแบคทีเรียไม่ได้เกิดขึ้นทันทีหลังจากการแทรกของไวรัส

B. ไม่มีการระบุ 32P ในสารพันธุกรรมของแบคทีเรียขั้นตอนที่ 3 ที่ติดเชื้อหลังจากการสลายของแบคทีเรียและการปล่อย phage virion

ค. เศษขนที่ประกอบด้วย 35S จากลูกหลานของฟาจดูดซับไปยังแบคทีเรีย แม้ว่าชิ้นส่วนนั้นจะไม่มีดีเอ็นเอก็ตาม

A. ระดับ VEGF >400 pg/mL บ่งชี้ถึงภาวะแทรกซ้อนที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวาน

B. ระดับ VEGF ที่เพิ่มขึ้นทำให้ PDR มีความคืบหน้าแม้หลังการผ่าตัดรักษา

C. ระดับ VEGF >400 pg/mL บ่งบอกถึง PDR

ก. จำนวนอาณานิคมที่สังเกตพบเฉพาะสำหรับ CRC157 และ CRC184 ที่ทรานส์เฟกด้วย pC27-53 เท่านั้นจะลดลง

ข. จำนวนอาณานิคมในการทดลองทั้งหมดจะลดลง

C. จำนวนอาณานิคมที่สังเกตพบเฉพาะสำหรับ CRC169 ที่ทรานส์เฟกด้วย pC27-53 และ pC27-53X จะเพิ่มขึ้น

ก. เดินทางไกลขึ้นระหว่าง SDS-PAGE และชะล้างเร็วขึ้นระหว่างโครมาโตกราฟีแบบแยกขนาด

B. เดินทางไกลขึ้นระหว่าง SDS-PAGE และชะล้างช้าลงระหว่างโครมาโตกราฟีแบบแยกขนาด

C. เดินทางในระยะทางที่น้อยกว่าระหว่าง SDS-PAGE และชะล้างเร็วขึ้นระหว่างโครมาโตกราฟีแบบยกเว้นขนาด

A. กลุ่มตัวอย่างมีขนาดเล็กเกินไปที่จะรับประกันว่าผลการวิจัยมีนัยสำคัญทางสถิติ

B. Western blots ในรูปที่ 4 ดำเนินการในสัปดาห์ที่ 52 เมื่อน้ำหนักตัวของหนู Nbea+/+ และหนู Nbea+/- เท่ากัน

C. ฟีโนไทป์แคระของหนู Nbea+/- ล้มเหลวในการปรากฏอย่างสม่ำเสมอเมื่อเวลาผ่านไป

ก. การรักษาด้วย VPA จะเพิ่มระดับการถอดรหัส HERV-W ในตัวอย่างโรคจิตเภทอย่างมีนัยสำคัญ

B. การปรากฏตัวของโรคจิตเภทหรือโรคสองขั้วไม่ได้เพิ่มการถอดรหัสของ HERV-W เหนือระดับปกติอย่างมีนัยสำคัญ

C. การรักษาด้วย VPA มีผลอย่างมากต่อการถอดรหัส ERV-9

ที่นี่ เรากำลังมองหาคำสั่งที่ไม่สนับสนุนโดยผลลัพธ์ที่แสดง รูปที่ 2 แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มตัวอย่างโรคจิตเภททั้งสองกลุ่มกับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี ซึ่งหมายความว่าโรคจิตเภทจะเพิ่มการถอดรหัส ERV-9

A. การแสดงออก TEX11 จำเป็นสำหรับการพัฒนาโครงสร้างปกติของอัณฑะ

บี. โปรตีน TEX11 เกี่ยวข้องกับระยะหลังมีโอติกของการสร้างสเปิร์มของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม


PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) เป็นวิธีการวิเคราะห์ที่ใช้แยกส่วนประกอบของส่วนผสมโปรตีนตามขนาด เทคนิคนี้ใช้หลักการที่ว่าโมเลกุลที่มีประจุจะเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้าไปยังขั้วไฟฟ้าที่มีเครื่องหมายตรงข้ามกัน เทคนิคอิเล็กโตรโฟรีซิสทั่วไปไม่สามารถใช้กำหนดน้ำหนักโมเลกุลของโมเลกุลทางชีววิทยาได้ เนื่องจากการเคลื่อนที่ของสารในเจลขึ้นอยู่กับ ทั้งการชาร์จและขนาด เพื่อเอาชนะสิ่งนี้ ตัวอย่างทางชีวภาพจำเป็นต้องได้รับการปฏิบัติเพื่อให้ได้รับประจุที่สม่ำเสมอ จากนั้นการเคลื่อนที่ของอิเล็กโตรโฟรีติกจะขึ้นอยู่กับขนาดเป็นหลัก สำหรับโมเลกุลโปรตีนที่แตกต่างกันนี้ที่มีรูปร่างและขนาดต่างกัน จะต้องถูกทำให้เสียสภาพ (ทำโดยใช้ SDS) เพื่อให้โปรตีนสูญเสียโครงสร้างรอง ตติยอารี หรือควอเทอร์นารี โปรตีนที่ถูกปกคลุมด้วย SDS จะมีประจุลบและเมื่อบรรจุลงใน เจลและวางไว้ในสนามไฟฟ้าก็จะเคลื่อนเข้าหาขั้วบวก (ขั้วไฟฟ้าที่มีประจุบวก) คั่นด้วยผลการร่อนของโมเลกุลตามขนาด หลังจากการมองเห็นโดยเทคนิคการย้อมสี (เฉพาะโปรตีน) ขนาดของโปรตีนสามารถคำนวณได้โดยการเปรียบเทียบระยะการย้ายถิ่นกับบันไดน้ำหนักโมเลกุลที่รู้จัก (เครื่องหมาย)


นวัตกรรม

ย่อขนาด

เทคนิคการย่อขนาดเทคนิคอิเล็กโตรโฟรีติกได้รับการพัฒนาเพื่อประสิทธิภาพ: เพิ่มผลผลิตสูงสุดในขณะที่ลดพื้นที่ นวัตกรรมเหล่านี้ทำให้การทดลองทำงานพร้อมกันได้ เช่นเดียวกับการลดเวลาและค่าใช้จ่ายที่จำเป็นสำหรับการดำเนินการทดลองเหล่านี้ [7] คุณลักษณะของการย่อขนาดด้วยไฟฟ้าคือการรวมช่องสัญญาณแยกซึ่งทำงานเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพช่องสัญญาณ

โพลีเมอร์ เช่น พอลิไดเมทิลไซลอกเซน (PDMS) และโพลี (เมทิลเมทาคริเลต) (PMMA) ถูกนำมาใช้ในระบบอิเล็กโตรโฟเรติกสมัยใหม่ เนื่องจากสามารถผลิตได้ง่ายและมีความทนทานกว่าแก้ว โดยเฉพาะอย่างยิ่ง PMMA ถูกใช้ในเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสเพราะไม่ทำปฏิกิริยากับเจลโพลีอะคริลาไมด์ การพิจารณาวัสดุที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้ในอิเล็กโตรโฟรีซิสเมื่อทำเจล ตัวอย่างเช่น เจลอากาโรสใช้สำหรับการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลที่ใหญ่กว่า โดยเฉพาะชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดใหญ่ [8] โพลีอะคริลาไมด์มีความละเอียดที่สูงกว่าเจลอะกาโรสสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีขนาดเล็กกว่า เช่น การวิเคราะห์ดีเอ็นเอสายเดี่ยวหรือการวิเคราะห์โปรตีน รูพรุนใน PAGE มีขนาดเล็กลงและช่วยให้สามารถเลือกปฏิบัติและแยกตัวอย่างได้มากขึ้น โดยมีความสามารถรอบด้านที่ระดับจุลภาค

การวิเคราะห์หลายมิติ

การทดสอบหลายรายการสำหรับตัวอย่างเดียวสามารถวิเคราะห์ลักษณะที่แตกต่างกัน 2-4 แบบและปรับปรุงประสิทธิภาพการทดสอบ [9] การวิเคราะห์หลายมิติใช้ประโยชน์จากการวิเคราะห์คุณสมบัติของตัวอย่างที่แตกต่างกัน เช่น การรวมการโฟกัสแบบไอโซอิเล็กทริกและ SDS-PAGE [9],[10] การโฟกัสแบบไอโซอิเล็กทริกของตัวอย่างจะดำเนินการในแนวนอนและแยกโปรตีนตามจุดไอโซอิเล็กทริกของพวกมัน (ค่า pH โดยประมาณที่ตัวอย่างมีประจุที่เป็นกลางสุทธิ) สร้างบันไดของตัวอย่างตามระดับความลาดชันของค่า pH หลังจากนั้น SDS-PAGE จะใช้เจลชนิดเดียวกันและรันในแนวตั้ง แยกและแยกความแตกต่างของโปรตีนของจุดไอโซอิเล็กทริกที่คล้ายคลึงกันตามขนาด การวิเคราะห์หลายมิติใช้ประโยชน์จากคุณลักษณะต่างๆ ของตัวอย่าง (ประจุ ขนาด ฯลฯ) เพื่อแยกและแยกแยะตัวอย่างอย่างครอบคลุม (รูปที่ 7)


บทสรุป

การวิเคราะห์โปรตีโอมที่ใช้เจล 2 มิติได้ถูกนำมาใช้อย่างประสบความสำเร็จในการตรวจหาและกำหนดลักษณะโปรตีนของเครื่องหมายที่มีลักษณะเฉพาะสำหรับสถานะทางสรีรวิทยาหรือพยาธิวิทยาเฉพาะของเซลล์หรือเนื้อเยื่อ อย่างไรก็ตาม ตอนนี้เห็นได้ชัดว่าแนวทาง 2DE-MS/MS ไม่เหมาะที่จะตรวจจับ ระบุ และหาปริมาณโปรตีนทุกตัวในตัวอย่าง ซึ่งเป็นงานที่ดูเหมือนจำเป็นสำหรับการวิเคราะห์อย่างครอบคลุมและคำอธิบายทางคณิตศาสตร์ในท้ายที่สุดของกระบวนการและระบบทางชีววิทยา ด้วยเหตุผลนี้ จึงจำเป็นต้องพัฒนาเทคนิคใหม่ๆ ที่ยอมให้มีปริมาณเริ่มต้นเพิ่มขึ้นมากในขณะที่ยอมให้เปรียบเทียบการแสดงออกของโปรตีนในเชิงปริมาณในวงกว้าง


ดูวิดีโอ: How to make SDS-PAGE Gel? Western Blotting A to Z video library: Part 5 (สิงหาคม 2022).