ข้อมูล

12.8: การประกบทางเลือก - ชีววิทยา

12.8: การประกบทางเลือก - ชีววิทยา


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

สำหรับยีนจำนวนมาก อินตรอนทั้งหมดใน mRNA จะถูกแยกออกในลักษณะเฉพาะ ส่งผลให้มี mRNA หนึ่งตัวต่อยีน แต่มีตัวอย่างจำนวนมากขึ้นเรื่อยๆ ของยีนอื่นๆ ซึ่งเอ็กซอนบางตัวถูกรวมหรือแยกออกจาก mRNA ที่โตเต็มที่สุดท้าย ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่า ประกบทางเลือก. เอ็กซอนบางตัวอาจรวมอยู่ในเนื้อเยื่อบางส่วนและไม่รวมในเนื้อเยื่ออื่นๆ หรืออาจมีเฉพาะเพศ ซึ่งบ่งชี้ถึงข้อบังคับบางประการเกี่ยวกับการเลือกไซต์ประกบ

การประกบแบบทางเลือกของ pre‑mRNA หมายความว่ายีนตัวเดียวอาจเข้ารหัสผลิตภัณฑ์โปรตีนมากกว่าหนึ่งตัว (เช่น การกำหนดเพศใน แมลงหวี่เมลาโนกัสเตอร์).

แมลงหวี่ melanogaster

อัตราส่วน X ต่อออโตโซม (อัตราส่วน X:A) ในไซโกตจะเป็นตัวกำหนดเส้นทางการพัฒนาที่แตกต่างกันสองทางซึ่งแมลงวันจะพัฒนา หากอัตราส่วน X:A สูง (เช่น ตัวเมียคือ XX และอัตราส่วน X:A คือ 1.0) แมลงวันจะใช้ทางเดินของตัวเมีย ถ้าอัตราส่วนต่ำ (เช่น 0.5 เนื่องจากเพศชายเป็น XY) ก็จะพัฒนาเป็นเพศชาย

อัตราส่วน X:A ถูกกำหนดโดยการ "นับ" ยีนบางตัว (หรือการแสดงออกของพวกมัน) บนโครโมโซม X (เช่น น้องสาว, น้องสาวข, และ runt) สำหรับตัวเศษและการนับยีนอื่นๆ (เช่น เหลอ) สำหรับตัวส่วน ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดของยีนเหล่านี้มีความคล้ายคลึงกันกับปัจจัยการถอดรหัสต่าง ๆ ที่สอดคล้องกับกฎเกณฑ์กำหนดเพศอย่างน้อยก็เป็นส่วนหนึ่งของการถอดความ อย่างไรก็ตาม ตามที่กล่าวไว้ด้านล่าง การประกบทางเลือกก็มีบทบาทสำคัญเช่นกัน อย่างน้อยก็ใน แมลงหวี่.

เส้นทางมีอย่างน้อยสี่ขั้นตอนที่กำหนดโดยพันธุกรรมโดยการกลายพันธุ์ที่ก่อให้เกิด แมลงวันตัวเมียโดยพันธุกรรม (X:A สูง) เพื่อพัฒนาเป็นตัวผู้ ในแต่ละกรณี ยีนเดียวกันเข้ารหัส mRNA เฉพาะเพศชายและหญิง (และโปรตีน) ทั้งตัวผู้และตัวเมีย แต่ mRNA เฉพาะเพศ (และโปรตีน) ต่างกันอันเป็นผลมาจากการประกบแบบอื่น

ในทุกกรณี สถานะเริ่มต้นคือการพัฒนาของผู้ชาย และกิจกรรมใหม่บางอย่างจะต้องมีอยู่เพื่อสร้างและรักษาเส้นทางของผู้หญิง

  1. เป้าหมายของสัญญาณ X:A คือ เซ็กส์-ตายยีน (Sxl) ซึ่งทำหน้าที่เป็นยีนสวิตช์หลัก ในการพัฒนาในระยะเริ่มต้น อัตราส่วน X:A ที่ 1 ในเพศหญิงจะนำไปสู่การกระตุ้นการทำงานของโปรโมเตอร์จำเพาะของตัวอ่อนของ Sxlยีนในขณะที่ Sxlไม่ได้ถ่ายทอดในตัวอ่อนเพศชาย ต่อมาในการพัฒนา Sxlถูกถอดความในทั้งสองเพศ ตอนนี้อัตราส่วน X:A ที่สูงนำไปสู่การข้าม exon ในการประกบ pre‑mRNA จาก เซ็กส์-ร้ายแรงยีน. สิ่งนี้สร้างโปรตีน Sxl ที่ใช้งานได้ในตัวเมีย ในเพศชาย (ทางเดินเริ่มต้น) mRNA มี codon ที่สิ้นสุดก่อนกำหนด และไม่มีการสร้างโปรตีน Sxl ที่ใช้งานได้
  1. โปรตีน Sxl ที่ใช้งานได้จะยับยั้งการประกบ pre‑mRNA จาก หม้อแปลงไฟฟ้ายีนเพื่อสร้างโปรตีน Tra ทำงานในตัวอ่อนเพศหญิง ในการประกบเฉพาะตัวเมียของ ตราpre‑RNA ไซต์ประกบ 5' (ทั่วไปสำหรับการประกบทั้งชายและหญิง) เชื่อมต่อกับไซต์ประกบ 3' ทางเลือก ดังนั้นจึงเอา codon สิ้นสุดและอนุญาตให้สร้างโปรตีน Tra ฟังก์ชัน (รูปที่ 3.3.15)
  2. โปรตีน Tra ส่งเสริมการต่อ pre-mRNA เฉพาะตัวเมียจาก tra2ยีนสร้างโปรตีน Tra2 ที่ใช้งานได้อีกครั้งในเพศหญิงเท่านั้น
  3. โปรตีน Tra และ Tra2 ส่งเสริมการประกบ pre‑mRNA เฉพาะเพศหญิงจาก doublesexยีน (dsx). ในกรณีนี้ mRNA เฉพาะผู้ชายข้ามเอ็กซอน (รูปที่ 3.3.15) การข้าม exon ต้องมีการเปลี่ยนแปลงรูปแบบการต่อที่ทั้งไซต์ประกบ 3' และไซต์ประกบ 5' รอบ exon
  4. โปรตีน Dsx จำเพาะสำหรับเพศชายจะบล็อกความแตกต่างของเพศหญิงและนำไปสู่การพัฒนาเพศชาย โปรตีน Dsx จำเพาะสำหรับผู้หญิงยับยั้งการแสดงออกของยีนเพศชายและนำไปสู่การพัฒนาของเพศหญิง

เบาะแสบางอย่างเกี่ยวกับกลไก

  1. Tra และ Tra2 เป็นโปรตีนที่จับกับ RNA ที่เกี่ยวข้องกับ Splicing Factor 2 (SF2) โปรตีนหลังนี้มีโดเมนที่อุดมไปด้วยไดเปปไทด์ Arg‑Ser ซึ่งกำหนดโดเมนการจับ RNA ประเภทหนึ่ง จำเป็นต้องใช้ SF2 สำหรับขั้นตอนแรกในการประกอบ spliceosome โปรตีน Tra และ Tra2 ที่เกี่ยวข้องไม่จำเป็นสำหรับการมีชีวิต แต่จะควบคุมเหตุการณ์การประกบเฉพาะสำหรับ pre‑mRNA จาก dsx
  2. Tra2 จับกับ exon เฉพาะตัวเมียของการถอดเสียง dsx และน่าจะควบคุมการเลือกไซต์ splice ตำแหน่งการยึดสำหรับ Tra2 ภายใน exon เป็นตัวอย่างของตัวเพิ่มประสิทธิภาพการประกบ กลไกที่การจับกันของโปรตีนควบคุมการประกบ (เช่น Tra, Tra2) กับสารเพิ่มประสิทธิภาพการประกบเป็นงานวิจัยที่มีความกระตือรือร้นอย่างมากในปัจจุบัน
  3. Sxl เป็นโปรตีนที่จับกับ RNA อีกตัวหนึ่งที่ยับยั้งรูปแบบการประกบดีฟอลต์สำหรับ tra pre‑mRNA

รูปที่ 3.3.20


ในยูคาริโอตที่ซับซ้อนเช่นมนุษย์ การประกบทางเลือกเป็นกฎ แทนที่จะเป็นข้อยกเว้น

การประกบยูคาริโอตได้รับการจัดการโดยระบบการกำกับดูแลที่ซับซ้อน รวมถึงองค์ประกอบต่างๆ มากกว่า 100 รายการ ซึ่งบางส่วนเป็นตัวเสริมและสารควบคุม ดังนั้น ในขณะที่รูปแบบหนึ่งมักจะมีความโดดเด่น โดยทั่วไปแล้วเราควรคาดหวังอย่างน้อยว่าจะมีทางเลือกบางอย่างอยู่ในเซลล์

ในขณะที่ปริมาณงานเกี่ยวกับความแตกต่างระดับประชากรยังคงมีขนาดใหญ่กว่าการเปลี่ยนแปลงภายในเซลล์เดี่ยวมาก การศึกษาเกี่ยวกับความแตกต่างของการประกบได้ระบุว่ารูปแบบต่างๆ มักจะปรากฏพร้อมกันภายในเซลล์เดียว ตัวอย่างเช่น ในการศึกษาล่าสุดนี้ รูปที่ 2 แสดงให้เห็นว่าแม้ว่าการกระจายระหว่างทางเลือกการประกบสองทางเลือกจะเป็นแบบไบโมดอล แต่เซลล์เดี่ยวยังคงมีการผสมแบบเศษส่วนระหว่างสองรูปแบบทั้งหมด


การพัฒนาโลคัลไลเซชันของทางเลือกประกบของตัวรับปัจจัยการเจริญไฟโบรบลาสต์ -2 (FGFR2)

ยีนสำหรับตัวรับปัจจัยการเจริญของไฟโบรบลาสต์-2 (FGFR2) เข้ารหัสแวเรียนต์การต่อสองแบบที่กำหนดที่นี่เป็นปัจจัยการเจริญเติบโตของเคราติโนไซต์ (KGFR) และเบค ความจำเพาะในการจับลิแกนด์แตกต่างกันอย่างเห็นได้ชัดเนื่องจากการประกบทางเลือกที่แยกจากกัน เราถามว่าการใช้ exon ทางเลือก นอกเหนือไปจากการมีอิทธิพลต่อความจำเพาะของตัวรับ อาจสัมพันธ์กับการแปลการถอดรหัส ปัญหานี้ได้รับการศึกษาโดย in situ hybridization และ PCR โดยใช้โพรบและไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ exons ทางเลือกของ FGFR2 ตรวจพบการถอดเสียงของทั้งสองสายพันธุ์ในชั้นเชื้อโรคทั้งสามชั้นภายในตัวอ่อนและบริเวณนอกของตัวอ่อนระยะดึกดำบรรพ์ ระดับโดยรวมของนิพจน์ KGFR สูงกว่าระดับ bek อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นของตัวรับตัวแปรทั้งสองมีการแพร่กระจายในกระเพาะอาหารมากกว่าในช่วงหลังของการสร้างอวัยวะ เมื่อการถอดเสียงของ KGFR ปรากฏชัดในส่วนใหญ่ในเยื่อบุผิว ในขณะที่ bek มีอยู่ใน mesenchymes ที่สอดคล้องกัน การค้นพบของเราแสดงดังต่อไปนี้: (1) การแสดงออกของทั้งสองสายพันธุ์ FGFR2 สอดคล้องกับการมีส่วนร่วมในกระเพาะอาหารของหนู พวกเขาอาจให้ความสามารถในหลายพื้นที่ ซึ่งอาจจำกัดโดยลิแกนด์ที่คับแคบกว่าของพวกมัน (2) KGFR และ bek ดูเหมือนจะมีบทบาทเฉพาะในการพัฒนาผิวหนังและอนุพันธ์ของมัน ในขณะที่ bek จะแสดงออกมาเป็นพิเศษในระหว่างการสร้างกระดูก ตัวแปรทั้งสองมีขอบเขตที่เป็นไปได้ของการควบคุมทรานส์ในจีโนม ดังนั้น เราขอแนะนำว่าการประกบทางเลือกมีหน้าที่ร่วมกันในการจับลิแกนด์และความจำเพาะเชิงพื้นที่ (3) สุดท้าย เราได้กำหนดความจำเพาะในการผูกมัดของ KGFR และกำหนดเป็น FGF ต่างๆ ความเป็นไปได้ของการระบุพื้นที่ทำงานจำเพาะสำหรับคู่ลิแกนด์-รีเซพเตอร์บางคู่ถูกกล่าวถึง


ผลลัพธ์และการอภิปราย

ก่อนอื่นเราขอนำเสนอภาพรวมของแบบจำลองการกู้คืนการถอดรหัสพร้อมคำอธิบายโดยละเอียดในส่วน "วิธีการ" ตามด้วยการเปรียบเทียบ TransComb กับแอสเซมเบลอร์ที่ล้ำสมัยประเภทเดียวกันทั้งบนชุดข้อมูลจำลองและชุดข้อมูลจริง

โมเดลทรานส์คอมบ์

ขั้นแรก TransComb จะสร้างกราฟประกบโดยเริ่มจากการจัดตำแหน่งของ RNA-seq ที่อ่านไปยังจีโนมอ้างอิง ตามหลักวิชา โลคัสของยีนแต่ละตัวจะแสดงด้วยกราฟประกบ และแต่ละเอ็กซอนจะถูกแทนด้วยโหนดในกราฟ และโหนดสองโหนดจะเชื่อมต่อกันด้วยขอบที่กำกับไว้หากมีจุดเชื่อมต่อประกบกันระหว่างพวกมัน ความครอบคลุมของแต่ละขอบถูกกำหนดเป็นจำนวนการอ่านที่ครอบคลุมทางแยกที่เกี่ยวข้อง

เพื่อสร้างกราฟ splicing ที่แม่นยำยิ่งขึ้น ซึ่งจะช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพของแอสเซมเบลอร์ได้เป็นส่วนใหญ่ TransComb ใช้การอ่านแบบคู่เพื่อซ่อมแซม exons ที่กระจัดกระจายเนื่องจากระดับการแสดงออกของยีนในระดับต่ำ และเลื่อนหน้าต่างเพิ่มเติมเพื่อแก้ไข exons ที่ผสานผิดพลาด เนื่องจากข้อผิดพลาดในการจัดลำดับหรือการทำแผนที่ จากกราฟประกบกัน เราได้พัฒนาแบบจำลองทางคณิตศาสตร์ที่เข้มงวดเพื่อกำหนดทรานสคริปต์ที่มีแนวโน้มมากที่สุดที่จะแสดง

การแก้ไขความคลุมเครือในการเชื่อมโยงจุดต่อเข้าและออกจากการประกบที่ exon แต่ละตัวด้วยจุดต่อประกบหลายจุดเป็นงานที่ยากที่สุดในการพัฒนาแอสเซมเบลอร์ แอสเซมเบลอร์ที่มีอยู่ส่วนใหญ่ประสบปัญหานี้ ส่งผลให้มีความแม่นยำในการประกอบต่ำ (ดูตัวอย่างในไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S4) เพื่อบรรเทาปัญหานี้ เราได้ออกแบบกลยุทธ์การประกอบใหม่โดยแนะนำกราฟ acyclic แบบกำกับอื่นที่เรียกว่า a กราฟทางแยกโดยมีโหนดแสดงขอบในกราฟประกบ และขอบแสดงขอบตกกระทบสองจุดในกราฟการประกบ แต่ละโหนดในกราฟทางแยกจะถ่วงน้ำหนักโดยความครอบคลุมของขอบที่สอดคล้องกันในกราฟการประกบ ในขณะที่แต่ละขอบจะถ่วงน้ำหนักด้วย 0, 1 หรือ 2 ที่กำหนดโดยใช้เทคนิคสองวิธี ได้แก่ กลยุทธ์การบรรจุถังและข้อมูลคู่ น้ำหนัก 0 บนขอบจะถือว่าไม่มีข้อมูลสนับสนุนขอบนี้ที่รวมอยู่ในการถอดเสียงใด ๆ ที่แสดงออก กล่าวคือจะไม่มีอยู่ในบันทึกที่คาดการณ์ไว้ของ TransComb น้ำหนัก 1 บนขอบหมายความว่าข้อมูลจากกลยุทธ์การบรรจุถังสนับสนุนขอบนี้ที่รวมอยู่ในการถอดเสียงที่แสดงด้วยความน่าเชื่อถือสูง ในบางกรณีพิเศษ ความกำกวมข้างต้นนั้นแก้ไขได้ยากด้วยกลยุทธ์ bin-packing เช่น กลยุทธ์จะมีปัญหาเมื่อการถอดเสียงสองตัวที่แชร์ exon มีระดับการแสดงออกที่คล้ายกันมาก ข้อมูลปลายคู่ที่เกี่ยวข้องอย่างละเอียดในกราฟจุดเชื่อมต่อสามารถใช้อย่างมีประสิทธิภาพเพื่อปรับแต่งโซลูชันจากกลยุทธ์การบรรจุถังขยะ ดังนั้น น้ำหนักที่ขอบเท่ากับ 2 แสดงว่าข้อมูลจากการอ่านแบบคู่รองรับขอบนี้ด้วยความน่าเชื่อถือสูง เมื่อได้รับประโยชน์จากข้อมูลแบบ bin-packing และ paired-end TransComb สามารถเชื่อมโยงทางแยกเข้าและออกจากการประกบที่ exon แต่ละตัวได้แม่นยำยิ่งขึ้น (เช่น โหนดที่อยู่ติดกันในกราฟจุดเชื่อมต่อ) ดังนั้นจึงสามารถเอาชนะความคลุมเครือได้ในระดับที่ดี ความแตกต่างที่สำคัญระหว่าง TransComb และแอสเซมเบลอร์อื่น ๆ อยู่ในลักษณะระเบียบวิธีของพวกเขา TransComb รวมการครอบคลุมและข้อมูลปลายคู่พร้อมกันโดยใช้เทคนิค bin-packing และ paired-end ร่วมกันกับกราฟทางแยกที่เรียกว่า แทนที่จะทำงานจากกราฟประกบเหมือนที่แอสเซมเบลอร์อื่นๆ ทำ นอกจากนี้ เรายังได้พัฒนากลยุทธ์การขยายใหม่สำหรับเส้นทางที่แสดงการถอดเสียงบนกราฟทางแยก ซึ่งแต่ละเส้นทางที่คาดการณ์มีโอกาสสูงมากที่จะเป็นตัวแทนของการถอดเสียงที่แสดงออก ไม่ว่าระดับการแสดงออกจะต่ำหรือสูง (ดู “ วิธีการ” และรูปที่ 1 สำหรับรายละเอียดเพิ่มเติม)

ลักษณะระเบียบวิธีของ TransComb สำหรับตัวเลขสองตัวของขอบในกราฟประกบ ตัวเลขที่อยู่เหนือขอบแสดงถึงความครอบคลุมของขอบ และตัวเลขที่วงกลมด้านล่างแสดงถึงดัชนีของขอบ ตัวเลขบนแต่ละโหนดของกราฟทางแยกแสดงถึงน้ำหนักของโหนดนี้ ซึ่งเป็นความครอบคลุมของขอบที่สอดคล้องกันบนกราฟการต่อเชื่อม

การประเมินผลการปฏิบัติงาน

เราเปรียบเทียบ TransComb กับแอสเซมเบลอร์ที่แนะนำจีโนมชั้นนำอีกสี่ตัว—StringTie, Cufflinks, Bayesembler และ Traph—บนทั้งชุดข้อมูลจำลองและของจริงโดยใช้ค่าเริ่มต้นและพารามิเตอร์อื่นๆ บนเซิร์ฟเวอร์เดียวกัน (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับรายละเอียดการตั้งค่าพารามิเตอร์สำหรับ แอสเซมเบลอร์ที่เปรียบเทียบ) ในการทดลองของเรา การจัดตำแหน่งการอ่าน RNA-seq ที่สร้างโดย TopHat2 (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับข้อมูลการดาวน์โหลดสำหรับไฟล์ดัชนี TopHat2) และการถอดเสียงอ้างอิงที่ดาวน์โหลดจาก Ensembl Genome Browser (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับข้อมูลการดาวน์โหลด) ถูกนำมาใช้เพื่อ ประเมินแอสเซมเบลอร์ในชุดข้อมูลจริง การถอดเสียงอ้างอิงจะถือว่าได้รับการกู้คืนอย่างถูกต้องหากมีจำนวน exon เท่ากันกับสำเนาบันทึกที่ประกอบแล้ว เช่นเดียวกับขอบเขตอินตรอนที่ตรงกันทุกประการ ในการศึกษานี้ มีการใช้ Cuffcompare [10] เพื่อตรวจหาการถอดเสียงประกอบอย่างถูกต้อง การถอดเสียงอ้างอิงเรียกว่าผลบวกที่แท้จริงสำหรับแอสเซมเบลอร์หากแอสเซมเบลอร์กู้คืนได้อย่างแน่นอน ความแม่นยำถูกวัดโดยการเรียกคืนและความแม่นยำ โดยที่การเรียกคืนถูกกำหนดให้เป็นเศษส่วนของผลบวกที่แท้จริงจากการถอดเสียงอ้างอิงที่แสดงทั้งหมดในการทดลอง และความแม่นยำถูกกำหนดเป็นเปอร์เซ็นต์ของการถอดเสียงที่ประกอบเข้าด้วยกันซึ่งตรงกับการถอดเสียงอ้างอิงอย่างถูกต้อง เราใช้การเรียกคืนและความแม่นยำในการประเมินความแม่นยำในการประกอบของแต่ละแอสเซมเบลอร์ที่เปรียบเทียบ

การเปรียบเทียบประสิทธิภาพกับข้อมูลจำลอง

ก่อนอื่นเราทดสอบ TransComb กับแอสเซมเบลอร์อีกสี่ตัวบนชุดข้อมูลจำลองที่ใช้ใน CIDANE [17] สำหรับการประเมินประสิทธิภาพ (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับข้อมูลการดาวน์โหลดสำหรับข้อมูลจำลอง) ชุดข้อมูลนี้สร้างโดย Flux Simulator [29] โดยใช้การถอดเสียงที่ทราบทั้งหมดจากคำอธิบายประกอบของยีน UCSC hg19 ซึ่งประกอบด้วยการอ่านค่า RNA-seq ที่จับคู่โดย RNA-seq เฉพาะสายประมาณ 80 ล้านครั้ง ที่ความยาว 100 bp

การทดสอบแอสเซมเบลอร์ทั้งห้า TransComb, StringTie, Cufflinks, Bayesembler และ Traph ด้วยการตั้งค่าเริ่มต้น TransComb ดำเนินการกู้คืนการถอดเสียงได้ดีที่สุด โดยมีผลบวกจริง 10,528 เทียบกับ 9988 สำหรับ StringTie, 8281 สำหรับกระดุมข้อมือ 9835 สำหรับ Bayesembler และ 8299 สำหรับ Traph (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S1). ในวงกว้าง TransComb กู้คืนผลบวกที่แท้จริง 5% มากกว่าแอสเซมเบลอร์ที่ดีที่สุดถัดไปอย่าง StringTie และความแตกต่างอย่างมากระหว่าง TransComb และส่วนอื่น ๆ สามารถคาดหวังได้จากชุดข้อมูลจริงขนาดใหญ่ ดังนั้นจึงแสดงให้เห็นจากผลการเปรียบเทียบว่า TransComb ได้รับการเรียกคืนที่สูงกว่าแอสเซมเบลอร์อื่นๆ

ผลการเปรียบเทียบความแม่นยำแสดงให้เห็นว่า TransComb สูงถึง 62.83% เมื่อเทียบกับ StringTie ที่ 55.09 % กระดุมข้อมือที่มี 52.36 % Bayesembler ที่มี 68.08 % และ Traph ที่มี 42.32 % ซึ่ง Bayesembler ดูเหมือนจะทำงานได้ดีที่สุด อย่างไรก็ตาม ความแม่นยำที่ดีกว่าของ Bayesembler มาจากข้อเท็จจริงที่ว่ามันกรองตัวเลือกที่มากเกินไปด้วยการตั้งค่าเริ่มต้น ในขณะที่ TransComb ไม่ได้กรอง ทำให้จำนวนผู้สมัครที่สร้างโดย TransComb มีจำนวนมากกว่าที่สร้างโดย Bayesembler มาก เพื่อให้การเปรียบเทียบที่ยุติธรรมระหว่าง Bayesembler และ TransComb เราได้กรองตัวเลือกของ TransComb โดยใช้พารามิเตอร์การกรอง (ดูรายละเอียดในไฟล์เพิ่มเติม 1) ที่ใกล้เคียงกับ Bayesembler ผลการเปรียบเทียบในรูปที่ 2a แสดงให้เห็นว่าการเรียกคืนและความแม่นยำที่ทำได้โดย TransComb นั้นสูงกว่าที่ Bayesembler ทำได้เมื่อกรองผู้สมัครให้อยู่ในระดับเดียวกัน (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1: ตารางที่ S1 สำหรับรายละเอียดของผู้สมัครที่กรองแล้ว)

ผลการเปรียบเทียบชุดข้อมูลจำลอง NS ค่าความแม่นยำและการเรียกคืนสำหรับแอสเซมเบลอร์แต่ละตัว วงกลมทึบ/สี่เหลี่ยม แสดงถึงความแม่นยำและค่าการเรียกคืนที่ได้รับโดยใช้การตั้งค่าเริ่มต้นของแอสเซมเบลอร์ วงกลมว่างเปล่า/สี่เหลี่ยม แสดงค่าความแม่นยำและการเรียกคืนโดยใช้การตั้งค่าที่ไม่ใช่ค่าเริ่มต้นของแอสเซมเบลอร์ NS ข้ามวงกลม แสดงถึงความแม่นยำและการเรียกคืนค่าของ TransComb เมื่อกรองตัวเลือกไปยังระดับเดียวกับ Bayesembler NS จำการแจกแจงเทียบกับระดับนิพจน์การถอดเสียง

ในการประเมินประสิทธิภาพโดยรวมของแอสเซมเบลอร์ต่างๆ เราคำนวณความแม่นยำและการเรียกคืนโดยการปรับพารามิเตอร์การกรอง (รูปที่ 2a ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับรายละเอียด) แสดงให้เห็นว่า TransComb มีประสิทธิภาพเหนือกว่าตัวอื่นๆ เสมอ ดังนั้นจึงสรุปได้ว่า TransComb มีความแม่นยำสูงสุดในบรรดาแอสเซมเบลอร์ที่ทดสอบบนชุดข้อมูลจำลอง

แอสเซมเบลอร์ในอุดมคติควรจะสามารถกู้คืนข้อความถอดเสียงที่แสดงออกมาได้มากขึ้นไม่ว่าจะมีระดับการแสดงออกต่ำหรือสูง ในการประเมินแอสเซมเบลอร์ในแง่ของระดับการแสดงออก เราคำนวณการกระจายการเรียกคืนกับระดับนิพจน์การถอดเสียงในรูปที่ 2b ซึ่งแสดงให้เห็นว่า TransComb นั้นเหนือกว่าแอสเซมเบลอร์ตัวอื่นที่เปรียบเทียบในทุกระดับนิพจน์

การเปรียบเทียบประสิทธิภาพกับข้อมูลจริง

การทดสอบข้อมูลจริงควรประเมินสาระสำคัญของแอสเซมเบลอร์ได้ดีกว่า เนื่องจากข้อมูลมีคุณสมบัติที่ไม่สามารถจับภาพได้อย่างถูกต้องโดยการจำลอง ในการศึกษานี้ ชุดข้อมูลเฉพาะสายสองชุดจากเซลล์ K562 ของมนุษย์และเซลล์ H1 และชุดข้อมูลเฉพาะสายจากเซลล์เดนไดรต์ของหนูเมาส์ถูกใช้เพื่อประเมินประสิทธิภาพของแอสเซมเบลอร์ที่เปรียบเทียบ ชุดข้อมูลทั้งสามนี้มี 125 ล้าน, 41 ล้าน และ 53 ล้านคู่อ่านตามลำดับ ชุดข้อมูล RNA-seq ของเซลล์ K562 ของมนุษย์และเซลล์ H1 ถูกรวบรวมจากฐานข้อมูล NCBI Sequence Read Archive (SRA) ที่มีรหัสการเข้าใช้ SRX110318 และ SRX082572 ตามลำดับ ชุดข้อมูลเซลล์เดนไดรต์ของหนูเมาส์ยังถูกรวบรวมจากฐานข้อมูล NCBI SRA ด้วยรหัสภาคยานุวัติ SRX062280 น่าเสียดายที่ Traph ใช้งานไม่ได้กับชุดข้อมูลจริงเนื่องจากความไม่เสถียร ดังนั้นเราจึงประเมิน TransComb กับ StringTie, Cufflinks และ Bayesembler เท่านั้น ดังที่นำเสนอใน [8] เป็นไปไม่ได้ที่เราจะทราบการถอดเสียงของแท้ทั้งหมดที่เข้ารหัสในตัวอย่าง อย่างไรก็ตาม เราอาจพิจารณาว่าสิ่งเหล่านั้นที่รวมกันเป็นผลบวกที่แท้จริง หากพวกมันตรงกับสิ่งอ้างอิงอย่างถูกต้อง หรือผลบวกลวงอย่างอื่น โดยไม่ส่งผลกระทบอย่างมากต่อประสิทธิภาพการเปรียบเทียบของพวกเขา ดังนั้นเราจึงเปรียบเทียบ TransComb กับแอสเซมเบลอร์อีกสามชุดบนชุดข้อมูลจริงสามชุดบนพื้นฐานนี้ และใช้ความแม่นยำและการเรียกคืนจากชุดข้อมูลจำลองเพื่อประเมินความแม่นยำของแอสเซมเบลอร์ในชุดข้อมูลจริง

การรันแอสเซมเบลอร์สี่ตัวด้วยการตั้งค่าเริ่มต้นบนชุดข้อมูล RNA-seq จริงสามชุด TransComb กู้คืนผลบวกที่แท้จริงมากกว่าแอสเซมเบลอร์อีกสามตัวสำหรับแต่ละรายการ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S2, S3 และ S4) TransComb กู้คืนผลบวกที่แท้จริง 12,948, 12,135 และ 11,117 รายการสำหรับเซลล์ K562 และ H1 ของมนุษย์และชุดข้อมูลเซลล์เดนไดรต์ของเมาส์ตามลำดับ เทียบกับ 10,507, 10,832 และ 9874 ที่กู้คืนโดย Bayesembler ซึ่งเป็นแอสเซมเบลอร์ที่ดีที่สุดอันดับสอง เมื่อเปรียบเทียบกับ Bayesembler TransComb กู้คืนผลบวกที่แท้จริงเพิ่มขึ้น 23% ในข้อมูลเซลล์ K562 ของมนุษย์ มากกว่า 12% ในข้อมูลเซลล์ H1 ของมนุษย์ และข้อมูลเซลล์เดนไดรต์ของเมาส์เพิ่มขึ้น 13% ผลการเปรียบเทียบแสดงให้เห็นว่า TransComb ได้รับการเรียกคืนสูงสุดในบรรดาแอสเซมเบลอร์ที่เปรียบเทียบทั้งหมด

สำหรับความแม่นยำ TransComb บรรลุ 24.5, 24.23 และ 32.04% ในเซลล์ K562 และ H1 ของมนุษย์และข้อมูลเซลล์เดนไดรต์ของเมาส์ตามลำดับ เทียบกับ 17.69, 20.64 และ 38.26 % สำหรับ StringTie, 13.43, 15.33 และ 32.95 % สำหรับ Cufflinks และ 21.3, 23.72 และ 28.18 % สำหรับ Bayesembler ผลการเปรียบเทียบแสดงให้เห็นว่า TransComb ทำงานได้ดีกว่าแอสเซมเบลอร์อื่นๆ ทั้งหมดในเซลล์ K562 ของมนุษย์และชุดข้อมูลเซลล์ H1 สำหรับชุดข้อมูลเซลล์เดนไดรต์ของเมาส์ ตามที่ระบุไว้ในส่วนสุดท้าย TransComb จะไม่กรองตัวเลือกของตัวเลือกด้วยการตั้งค่าเริ่มต้น ในขณะที่แอสเซมเบลอร์อื่นๆ กรองตัวเลือกด้วยการตั้งค่าเริ่มต้น ส่งผลให้มีความแม่นยำสูงกว่า TransComb ด้วยการกรอง ใช้โดยตัวกรอง StringTie และ Cufflinks ส่งผลให้ชุดข้อมูลเซลล์เดนไดรต์ของเมาส์มีความแม่นยำสูงสุด เช่นเดียวกับข้อมูลการจำลอง เราได้กรองตัวเลือกของ TransComb หลังจากตั้งค่าพารามิเตอร์การกรอง (ดูรายละเอียดในไฟล์เพิ่มเติม 1) ให้มีขนาดใกล้เคียงกับ StringTie และ Cufflinks ผลการเปรียบเทียบในรูปที่ 3c แสดงให้เห็นว่า TransComb ยังได้รับระดับการเรียกคืนและความแม่นยำที่สูงกว่าแอสเซมเบลอร์ที่เปรียบเทียบอื่น ๆ ทั้งหมดบนชุดข้อมูลเซลล์เดนไดรต์ของเมาส์เมื่อกรองตัวเลือกของพวกเขาให้อยู่ในระดับเดียวกัน (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S4 สำหรับรายละเอียดของการกรอง ผู้สมัคร)

ผลการเปรียบเทียบชุดข้อมูลจริงสามชุด: NS เซลล์ k562 ของมนุษย์ NS เซลล์ H1 ของมนุษย์และ เซลล์เดนไดรต์ของเมาส์ วงกลมทึบ/สี่เหลี่ยม แสดงถึงความแม่นยำและค่าการเรียกคืนที่ทำได้โดยใช้การตั้งค่าเริ่มต้น วงกลมว่างเปล่า/สี่เหลี่ยม แสดงถึงความแม่นยำและค่าการเรียกคืนที่ทำได้โดยใช้พารามิเตอร์การกรองที่แตกต่างกัน NS ข้ามวงกลม ใน แสดงถึงความแม่นยำและการเรียกคืนค่าของ TransComb เมื่อกรองผู้สมัครให้อยู่ในระดับเดียวกับ StringTie และ Cufflinks

เช่นเดียวกับการจำลอง เรายังเปรียบเทียบความแม่นยำและการเรียกคืนค่าเมื่อใช้พารามิเตอร์การกรองที่แตกต่างกัน (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับรายละเอียด) ในชุดข้อมูลจริงสามชุด (รูปที่ 3) ซึ่งแสดงให้เห็นว่า TransComb เหนือกว่าแอสเซมเบลอร์อื่น ๆ อย่างสม่ำเสมอจากการทดสอบทั้งหมด ชุดข้อมูลจริง ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่า TransComb มีความแม่นยำที่ดีที่สุดในบรรดาแอสเซมเบลอร์ที่ทดสอบทั้งบนชุดข้อมูลจำลองและชุดข้อมูลจริง

การเปรียบเทียบอื่นๆ ทั้งชุดข้อมูลจำลองและชุดข้อมูลจริง

นอกเหนือจากการเปรียบเทียบข้างต้น เรายังเปรียบเทียบยีนที่ระบุอย่างถูกต้องและผลบวกที่แท้จริงที่ไม่ซ้ำกัน (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับคำจำกัดความของเกณฑ์เหล่านี้) ในชุดข้อมูลทั้งจำลองและจริง ผลลัพธ์ (ไฟล์เพิ่มเติม 1) แสดงให้เห็นว่า TransComb ทำงานได้ดีกว่าแอสเซมเบลอร์ที่เปรียบเทียบทั้งหมดตามเกณฑ์เหล่านี้ ในขณะที่มันด้อยกว่า StringTie เพียงเล็กน้อยในแง่ของยีนที่ระบุอย่างถูกต้องในชุดข้อมูลเซลล์ H1 ของมนุษย์ (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม รายละเอียด).

สำหรับการประมาณระดับนิพจน์ เราได้พัฒนาวิธีการที่เรียบง่ายแต่ไม่ธรรมดา ซึ่งรักษาระดับความแม่นยำให้เทียบเท่ากับเครื่องมืออื่นๆ แต่ดีกว่า Traph มาก (ดูไฟล์เพิ่มเติม 1 สำหรับผลการเปรียบเทียบโดยละเอียด) อาจให้แนวคิดสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่สนใจในการพัฒนาตัวประมาณที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น

เปรียบเทียบเวลาทำงานและการใช้หน่วยความจำ

เราแสดงเวลาทำงานและการใช้หน่วยความจำของแอสเซมเบลอร์ทั้งสี่สำหรับชุดข้อมูลเซลล์ K562 ของมนุษย์เท่านั้น ซึ่งมีจำนวนการอ่านมากที่สุด (ประมาณ 125 ล้านอ่าน) ในบรรดาชุดข้อมูลที่ทดสอบทั้งหมด (รูปที่ 4 รายละเอียดในไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S10 ). StringTie ใช้เวลา CPU น้อยที่สุด (23 นาที) และ TransComb ใช้เวลา CPU น้อยที่สุดเป็นอันดับสอง (56 นาที) เร็วกว่า Cufflinks เจ็ดเท่า (429 นาที) และเร็วกว่า Bayesembler (537 นาที) ถึงเก้าเท่า StringTie ใช้เวลาน้อยกว่าแอสเซมเบลอร์อื่น ๆ เพราะมันใช้อัลกอริธึมที่โลภเพื่อขยายพา ธ ในกราฟประกบ นอกจากนี้ TransComb เวอร์ชันปัจจุบันได้รับการพัฒนาให้ทำงานบน CPU ตัวเดียวในขณะที่ StringTie ทำงานบน CPU หลายตัว เราจะทำการ Parallize TransComb ในอนาคตอันใกล้นี้ เพื่อเพิ่มปริมาณงานเมื่อมี CPU หลายตัว

เวลา CPU และการใช้งานหน่วยความจำของแอสเซมเบลอร์สี่ตัวบนชุดข้อมูลเซลล์ K562 ของมนุษย์ NS เวลา CPU ของแอสเซมเบลอร์สี่ตัว NS ช่วงการใช้หน่วยความจำของแอสเซมเบลอร์ทั้งสี่ เส้นสีดำแนวนอน แสดงถึงการใช้หน่วยความจำเฉลี่ยสำหรับแอสเซมเบลอร์แต่ละตัว

สำหรับการใช้งานหน่วยความจำ แอสเซมเบลอร์ทั้งสี่มีหน่วยความจำขนาดใหญ่ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S10) เนื่องจากชุดข้อมูล RNA-seq ขนาดใหญ่ที่จะถูกประมวลผล โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการถอดเสียงที่แสดงออกสูง เราเห็นจากรูปที่ 4b ว่า TransComb ใช้หน่วยความจำน้อยกว่าหน่วยความจำอื่นๆ โดยเฉลี่ย ในขณะที่ Bayesembler มีการใช้งานหน่วยความจำที่แย่ที่สุด และ StringTie และ Cufflinks ใช้ทรัพยากรหน่วยความจำที่ใกล้เคียงกันโดยเฉลี่ย


การแนะนำ

การต่อยีนทางเลือกเป็นกระบวนการที่ข้อมูลทางพันธุกรรมที่เข้ารหัสในลำดับดีเอ็นเอถูกประมวลผลเป็นการถอดรหัส mRNA ที่หลากหลาย และเป็นปรากฏการณ์ที่แพร่หลายในจีโนม metazoan เชื้อรา และพืช (Artamonova และ Gelfand 2007 Cheah et al. 2007) การต่อประกบทางเลือก (AS) ได้รับการศึกษาได้ดีที่สุดในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ซึ่งยีนส่วนใหญ่สร้างความหลากหลายทางเลือกของ mRNA splice (SVs) นอกเหนือจากการถอดเสียงตามบัญญัติ (CT) ซึ่งมีส่วนทำให้เกิดการถอดรหัสที่กว้างใหญ่และซับซ้อน (Yeo et al. 2005 Carninci 2007 Kim et al. 2007a) ในมนุษย์ ยีน multi-exon มากถึง 95% ถูกต่อเข้าด้วยกัน (Nusbaum et al. 2005 Wang et al. 2008) แต่ละโลคัสสร้างการถอดเสียงหลักโดยเฉลี่ย 5.4 สำเนา นอกจากนี้ ยังมีการคัดลอก DNA จีโนมขนาดใหญ่ที่ไม่มีการเข้ารหัสอีกด้วย และอีกทางหนึ่งประกบ (Birney et al. 2007 Tress et al. 2007) แม้ว่ารายงานในช่วงต้นระบุว่าอัตราการประกบทางเลือกจะใกล้เคียงกันในหมู่สิ่งมีชีวิต metazoan (Brett et al. 2002) เมื่อเร็ว ๆ นี้ได้มีการแสดงให้เห็นว่าสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและนกมีอัตราการต่อแบบทางเลือกที่คล้ายคลึงกัน แต่มีอัตราที่สูงกว่าในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังหรือพืชอย่างมีนัยสำคัญ ( Kim et al. 2004, 2007a) ในความเป็นจริง แม้แต่ในหมู่สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม มีอัตราการต่อประกบทางเลือกที่หลากหลาย ทั้งในแง่ของเศษส่วนของยีนที่ได้รับการต่อประกบแบบสลับกัน และจำนวนของการถอดเสียงทางเลือกต่อสถานที่ (Kim et al. 2004, 2007a)

ความสำคัญในการปรับตัวของความหลากหลายในการถอดรหัส RNA ทางเลือกนั้นส่วนใหญ่ไม่ทราบ แม้ว่าตัวแปรบางตัวจะชัดเจน 𠇏unctional”—นั่นคือ พวกมันจำเป็นในช่วงวงจรชีวิตของสิ่งมีชีวิตและถูกกระตุ้นในลักษณะที่มีการควบคุม (Sorek et al. 2004)—ส่วนใหญ่ไม่มีหน้าที่ที่ชัดเจน (Skandalis และ Uribe 2004 Sorek et al. 2004) จากสำเนา 2608 สำเนาของตำแหน่งการเข้ารหัสโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะในโครงการเข้ารหัส มีเพียง 1097 การถอดเสียงจาก 434 loci เท่านั้นที่คาดการณ์ว่าจะเป็น “productive” และเข้ารหัสโปรตีนที่ใช้งานได้จริง (Tress et al. 2007) แล้วอะไรคือความหมายเชิงหน้าที่ของสิ่งที่เรียกว่าทรานสคริปต์ที่ไม่ก่อผลซึ่งสามารถเขียนโค้ดสำหรับโปรตีนที่มีข้อบกพร่องหรือไม่สามารถเขียนโค้ดสำหรับโปรตีนได้เลย? ยังไม่มีคำตอบที่ชัดเจนสำหรับคำถามนี้ แต่หน้าที่ที่เป็นไปได้ของตัวแปรต่อที่ไม่ก่อผล (สำหรับการตรวจสอบ โปรดดูที่ Blencowe 2006 Artamonova และ Gelfand 2007) รวมถึงการควบคุมการแสดงออกของยีน (Lewis et al. 2003) และวิวัฒนาการของยีน (Zhang and Chasin 2006) Sorek 2007 Zhang et al. 2007) อย่างไรก็ตาม ส่วนสำคัญของรูปแบบการต่อเชื่อมอาจแสดงถึงข้อผิดพลาด (Sorek et al. 2004) ในการวิเคราะห์การต่อประกบทางเลือกในมนุษย์ ข้อผิดพลาดแบบสุ่มดูเหมือนจะอธิบายตัวแปรการต่อรอยที่สร้างโดยบางตำแหน่ง (Skandalis et al. 2002 Skandalis และ Uribe 2004)

ปัญหาสองประการทำให้การตรวจสอบฟังก์ชันการทำงานของตัวแปรต่อ (SV) ซับซ้อนขึ้น ประการแรก แวเรียนต์ส่วนต่อประสานที่มีนัยสำคัญไม่สามารถเข้ารหัสสำหรับการสังเคราะห์โปรตีนได้ ด้วยเหตุนี้ การค้นหาฟังก์ชันจึงอาจต้องขยายไปสู่บทบาทที่เป็นไปได้ของ SV ในวิถีการควบคุม โดยไม่ขึ้นกับการสังเคราะห์โปรตีน ประการที่สอง การวิเคราะห์เชิงหน้าที่ของตัวแปร splice แต่ละชนิดเป็นกระบวนการที่ใช้เวลานานมาก เนื่องจากเป็นการยากที่จะพิสูจน์ว่าการถอดเสียงไม่มีหน้าที่ใดๆ ในระหว่างเซลล์หรือสิ่งมีชีวิต เพื่อเอาชนะความยุ่งยากดังกล่าว แนวทางที่ใช้บ่อยคือการวิเคราะห์การอนุรักษ์วิวัฒนาการของการประกบทางเลือก (หรือความคล้ายคลึงกันของ SV) ทั่วทั้งจีโนมโดยอิงจากลำดับในฐานข้อมูลสาธารณะ การศึกษาหลายชิ้นได้ตรวจสอบการอนุรักษ์การถอดเสียงแบบทางเลือก ตามที่เปิดเผยโดยแท็กลำดับการแสดง (EST) และการสำรวจ microarray ส่วนใหญ่ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม แต่ยังรวมถึงในนก (ไก่) สัตว์ที่ไม่มีกระดูกสันหลัง และพืช (Kim et al. 2007b) การศึกษาเหล่านี้มีประโยชน์ในการประเมินการอนุรักษ์ SV แต่มีข้อจำกัดหลายประการ: สามารถใช้สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการวิเคราะห์จีโนมอย่างครอบคลุม (โดยปกติคือสิ่งมีชีวิตจำลอง) พวกเขาสามารถลำเอียงโดยความแตกต่างในสิ่งมีชีวิตที่มี EST หรือ microarray ครอบคลุม จะต่ำกว่ามากสำหรับสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่แบบจำลอง ความไวของพวกมันถูกจำกัดให้ตรวจจับการถอดเสียงทางเลือกที่สำคัญ (บ่อยที่สุด) และตำแหน่งที่แสดง SV ที่ระดับต่ำกว่านั้นไม่มีลักษณะเฉพาะที่ดี (Skandalis et al. 2002) ข้อจำกัดเหล่านี้อาจทำให้ความเข้าใจของเรามีอคติเกี่ยวกับกลไกที่สร้างรูปแบบการประกบกันและการทำงานที่เป็นไปได้ของพวกมัน เทคนิคที่ใช้หลายตำแหน่งยังทำให้สมมติฐานโดยปริยายว่าความสำคัญเชิงหน้าที่ (หรือขาดมัน) ของ SV ที่ไม่ก่อผลจะเหมือนกันสำหรับ loci ทั้งหมด ในขณะที่นัยสำคัญเฉพาะยีนเป็นไปได้

เราเสนอวิธีการอื่นที่เสริมกันในการประเมินขอบเขตว่ารูปแบบการต่อแบบใดได้รับการอนุรักษ์อย่างมีวิวัฒนาการในกลุ่มแท็กซ่าต่างๆ ในขณะที่แนวทาง EST และ microarray ที่สรุปไว้ข้างต้นมุ่งเน้นไปที่การวิเคราะห์ข้อมูลการประกบทางเลือกที่จำกัดจากยีนจำนวนมากในแท็กซ่าหนึ่งหรือน้อยมาก กลยุทธ์ของเราเกี่ยวข้องกับการกำหนดลักษณะของการประกบทางเลือกในจำนวนที่จำกัดของตำแหน่งตัวบ่งชี้ในหลายสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดสำหรับ ซึ่งเราเข้าใจความสัมพันธ์สายวิวัฒนาการ

DNA polymerase β (Pol β) เป็นยีนการดูแลทำความสะอาดที่แสดงออกอย่างแพร่หลาย โพล β คือ กรดอะมิโน 335, 39-kDa พอลิเมอร์ที่เข้ารหัสโดย POLB โลคัสหลังจากการประกบกันของส่วนประกอบภายนอก 14 ชิ้น (Uchiyama et al. 2009 Yamtich และ Sweasy 2009) Pol β เป็นสมาชิกของ X-family ของ DNA repair polymerase มีบทบาทสำคัญในการซ่อมแซม DNA การตัดตอนเบส และการไม่มีมันทำให้เกิดความไวต่อสารเมทิลเลต (Yamtich and Sweasy 2009) POLB เชื่อกันว่ามีวิวัฒนาการหลังจากการแตกแขนงของโปรโตสโตม ดิวเทอโรสตอม ซึ่งมีความจำเป็นในสัตว์มีกระดูกสันหลังและแสดงออกในเซลล์ทุกประเภท (Uchiyama et al. 2009 Yamtich and Sweasy 2009)

POLB รูปแบบการต่อประกบแตกต่างกันอย่างเห็นได้ชัดระหว่างมนุษย์และหนู โดยที่มนุษย์ผลิต SV ได้บ่อยและหลากหลายมากขึ้น (Disher and Skandalis 2007) ความแตกต่างเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า POLB การประกบอาจมีหน้าที่ต่างกันในสองสายพันธุ์นี้ แม้ว่าจะเป็นการดึงดูดที่จะอนุมานฟังก์ชันบางอย่างโดยเชื่อมโยงรูปแบบการประกบกับความแตกต่างทางสรีรวิทยาหรือลักษณะประวัติชีวิต เช่น ขนาดของร่างกาย (ใหญ่กับเล็ก) หรืออายุขัย (ยาวกับสั้น) การเปรียบเทียบโดยพิจารณาจากสองสายพันธุ์นี้เท่านั้นไม่อนุญาต เราต้องแยกแยะว่าความแตกต่างนั้นสะท้อนถึงความแตกต่างที่อนุรักษ์ไว้ระหว่างไพรเมตกับสัตว์ฟันแทะหรือลักษณะเฉพาะของสายพันธุ์ของมนุษย์และหนูที่อาจไม่เป็นแบบอย่างของกลุ่มของมัน การแยกความแตกต่างระหว่างทางเลือกเหล่านี้จำเป็นต้องมีการตรวจสอบรูปแบบการประกบของญาติสนิท

ดังนั้น เพื่อตรวจสอบความสำคัญทางชีวภาพของการประกบทางเลือกในไพรเมต เราจึงจำแนกลักษณะการอนุรักษ์ SV ของยีนการดูแลทำความสะอาด DNA polymerase β (Pol β) ในไพรเมตห้าสายพันธุ์—มนุษย์ (โฮโมเซเปียนส์), ชิมแปนซี (แพน troglodytes), กอริลลา (กอริลลากอริลลา), อุรังอุตัง (Pongo pygmaeus) และลิงแสม (Macaca fascicularis). โดยการเปรียบเทียบรูปแบบสายวิวัฒนาการของการประกบทางเลือกระหว่างแท็กซ่า เราควรจะสามารถแยกแยะได้ว่ารูปแบบการประกบนั้นได้รับการอนุรักษ์ไว้ในหมู่ไพรเมต หรือรูปแบบมีแนวโน้มที่จะเฉพาะสายพันธุ์หรือไม่ เนื่องจากการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการหมายถึงการทำงาน หลักฐานของการอนุรักษ์วิวัฒนาการในความถี่หรือความหลากหลายของ POLB การต่อประกบจะสนับสนุนสมมติฐานที่ว่าการผลิตตัวแปรการประกบ “unproductive” มีนัยสำคัญเชิงฟังก์ชัน แม้ว่าฟังก์ชันจะยังไม่ชัดเจนก็ตาม ข้อดีอีกประการของวิธีวิวัฒนาการสายวิวัฒนาการหรือเปรียบเทียบในการวิเคราะห์การอนุรักษ์วิวัฒนาการของความหลากหลายและความอุดมสมบูรณ์ของ splice คือการให้กรอบการทำงานสำหรับการประเมินสมมติฐานเกี่ยวกับความสำคัญเชิงหน้าที่ของการประกบทางเลือกซึ่งไม่สามารถระบุได้อย่างง่ายดายด้วยวิธีการที่ไม่เปรียบเทียบ ตัวอย่างเช่น หากรูปแบบการประกบเกี่ยวข้องกับลักษณะทางสรีรวิทยาหรือประวัติชีวิต เช่น ช่วงชีวิต ความสัมพันธ์ดังกล่าวจะได้รับการประเมินอย่างดีที่สุดในบริบทของชุดความสัมพันธ์สายวิวัฒนาการที่เป็นที่รู้จัก (Pagel and Harvey 1989 Freckleton et al. 2002) ในการสื่อสารนี้ เรารายงานว่ามีการอนุรักษ์ . เพียงเล็กน้อย POLB SV ก่อตัวขึ้นในหมู่ไพรเมต และความถี่ของการเชื่อมต่อทางเลือกของยีนนี้ก็แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างห้าสายพันธุ์ ในทางกลับกัน ความถี่ในการประกบและความหลากหลายมีความสัมพันธ์ที่ดีกับพารามิเตอร์ประวัติชีวิตบางอย่าง เช่น อายุขัย ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าแนวทางสายวิวัฒนาการสามารถเป็นประโยชน์ในการให้ความกระจ่างถึงความสำคัญเชิงหน้าที่ของการประกบทางเลือก


ส่วนที่ 2: โครงสร้าง Spliceosome และพลศาสตร์

00:00:00.02 สวัสดี ฉันเมลิสสา มัวร์ จากโรงเรียนแพทย์มหาวิทยาลัยแมสซาชูเซตส์
00:00:03.24 และ Howard Hughes Medical Institute และในการบรรยายครั้งนี้
00:00:06.28 ฉันจะบอกคุณเกี่ยวกับงานบางอย่างจากแล็บของเราเอง
00:00:09.27 เกี่ยวกับโครงสร้าง spliceosome และไดนามิก ดังที่เราเห็นใน
00:00:14.15 การบรรยายครั้งแรก ยีนยูคาริโอตถูกแยกออกโดยที่พวกมัน
00:00:20.00 น. ได้แสดงขอบเขตหรือ exons บนนี้ และ introns
00:00:26.13 และต้องลบอินตรอนออกและในครั้งก่อนของฉัน
00:00:30.21 การ์ตูน ฉันเพิ่งใช้กรรไกรกับเทป ดังนั้นในการบรรยายครั้งนี้
00:00:34.15 เรากำลังจะบอกว่า "อะไรคือธรรมชาติของพวกนั้น
00:00:36.27 กรรไกรกับเทป แล้วพวกมันทำปฏิกิริยายังไงล่ะ"
00:00:39.25 อันดับแรก เรามาพูดถึงการประกบกันที่เกิดขึ้นจริงกันก่อนว่าเป็นอย่างไร
00:00:45.17 และมันเกิดขึ้นในสองขั้นตอนทางเคมี ในขั้นตอนแรก
00:00:50.18 ของการประกบ ไซต์สาขา -- เราก็เลยพูดถึงเรื่องนั้น นั่นคือ
00:00:54.11 อนุรักษ์อะดีโนซีนในอินตรอนใกล้กับจุดต่อไพร์ม 3 แห่ง
00:00:58.19 ไฮดรอกซิลไพรม์ 2 ตัวของบริเวณกิ่งโจมตีฟอสเฟต
00:01:05.07 ที่จุดต่อไพร์ม 5 จุด และสร้างบาศตัวกลาง
00:01:10.11 ซึ่งมีไพรม์ 2 ไพรม์ 5 ไพรม์ และฟอสเฟตไพรม์ 3 ตัว
00:01:13.23 สารอะดีโนซีนออกมาทั้งหมด และปล่อย 5 ไพรม์
00:01:17.23 เอ็กซอน ตอนนี้ 5 ไพร์มเอ็กซอนไม่ลอยออกไปจะเป็น
00:01:24.10 จับโดยเครื่องจักรประกบ ซึ่งเราจะพูดถึง
00:01:27.09 ในอีกสักครู่ ขั้นตอนที่สองของการประกบ - ดังนั้นนี่คือตัวกลาง
00:01:33.22 ในปฏิกิริยา ไฮดรอกซิล 3 ไพรม์นี้ที่ถูกสร้างขึ้น
00:01:38.15 ในขั้นตอนแรกของเอ็กซอนไพรม์ 5 ตัว ตอนนี้มันโจมตี
00:01:42.16 ฟอสเฟตที่จุดต่อไพร์ม 3 จุด และตอนนี้ก็เริ่มหมดฤทธิ์
00:01:47.28 อินตรอนและเชื่อมเอ็กซอนทั้งสองเข้าด้วยกัน ตอนนี้เรา
00:01:53.09 รู้ว่านี่คือเคมี และสิ่งเหล่านี้เกิดขึ้นเป็นโสด
00:01:57.27 ปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชัน สองขั้นตอนของการประกบ
00:02:01.28 ถูกกระตุ้นโดยสารเชิงซ้อนขนาดใหญ่ในเซลล์ที่เรียกว่า spliceosome
00:02:09.06 spliceosome น่าจะเป็นเครื่องจักรระดับโมเลกุลที่ซับซ้อนที่สุด
00:02:13.26 ในห้องขัง อย่างที่เราเห็นในอีกสักครู่ และ spliceosome ประกอบด้วย
00:02:17.24 จากสี่ส่วนหลัก ชิ้นใหญ่ หน่วยย่อยที่จำเป็นต้อง
00:02:23.23 มาต่อกันในแต่ละรอบที่ซับซ้อนนี้
00:02:27.04 การเต้นรำที่เรียกว่าวงจรประกบกันที่เราจะพูดถึง
00:02:30.07 ในอีกไม่กี่สไลด์ แต่ที่อยากนำเสนอคือ
00:02:34.12 ชิ้นส่วนของ spliceosome ชิ้นส่วนหลักคือเหล่านี้
00:02:38.13 ส่วนประกอบที่เรียกว่า U1, U2, ทริปเปิ้ล snRNP U4/5/6 และ NineTeen คอมเพล็กซ์
00:02:46.00 หรือ กทช. ตอนนี้สิ่งเหล่านี้คืออะไร?
00:02:49.17 ทีนี้อะไรคือ U1, U2 ที่ฉันให้คุณดูในสไลด์ที่แล้ว
00:02:57.06 พวกมันเรียกว่า snRNP สำหรับคอมเพล็กซ์โปรตีน RNA นิวเคลียร์ขนาดเล็ก
00:03:03.21 ดังนั้น snRNP แต่ละตัวจึงประกอบด้วย RNA นิวเคลียร์ขนาดเล็ก
00:03:07.27 อยู่ที่ไหนสักแห่งระหว่างหนึ่งร้อยถึงสองร้อยนิวคลีโอไทด์
00:03:12.19 มันคืออาร์เอ็นเอที่เสถียรซึ่งซับซ้อนด้วยชุดของโปรตีน ดังนั้นสำหรับ
00:03:17.00 ตัวอย่าง U1 snRNP มี U1 snRNA อยู่ในนั้นและชุดของโปรตีนหลัก
00:03:23.05 เรียกว่าโปรตีนเอสเอ็ม มีโปรตีนเจ็ดชนิด พวกเขาทำ
00:03:26.08 โครงสร้างคล้ายวงแหวน คุณจะเห็นว่าเป็นเรื่องปกติของ
00:03:29.18 snRNPS จำนวนมาก แล้วก็โปรตีนบางชนิด
00:03:32.26 ซึ่งเป็นเรื่องปกติสำหรับ U1 snRNP และในกรณีของ U1 --70K, A และ C
00:03:38.03 U2 ซับซ้อนกว่า และนี่คือโปรตีนทั้งหมดที่เป็น
00:03:42.10 ที่เกี่ยวข้องกับ U2 snRNP แล้วด้วย Triple snRNP
00:03:46.09 ที่เรียกว่า Triple snRNP เพราะมีนิวเคลียร์ขนาดเล็กสามตัว
00:03:50.14 มีอาร์เอ็นเอในนั้น และมีโปรตีนชุดใหญ่ขึ้นด้วย
00:03:55.17 นอกจาก snRNP แล้ว ยังมี NineTeen complex ดังนั้น
00:04:00.12 ตั้งชื่อเพราะมีโปรตีนที่เรียกว่า Prp19 และ
00:04:05.15 ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง ดังนั้นมันจึงเหมือนกับ snRNP ยกเว้นมัน
00:04:10.02 ไม่มีองค์ประกอบ RNA แล้วนอกจากนี้
00:04:13.25 สำหรับส่วนประกอบหลักที่เสถียรเหล่านี้ ยังมีสิ่งที่เรียกว่า
00:04:18.11 ปัจจัยการประกบ และนี่คือโปรตีนที่ผ่านเข้ามา
00:04:22.10 แต่ไม่สัมพันธ์กับ snRNP เดี่ยวใดๆ
00:04:26.05 และรวมอยู่ในคลาสนี้คือ RNA helicases ที่เปลี่ยน
00:04:32.29 โครงสร้างของ RNA หรือสามารถเปลี่ยนโครงสร้างของ RNA โปรตีนเชิงซ้อนได้
00:04:39.02 แน่นอนว่ามีโปรตีนที่จับกับ RNA ที่เราพูดถึง
00:04:42.12 สองชั้นเรียนของผู้บรรยายครั้งสุดท้าย -- โปรตีน SR
00:04:46.06 และโปรตีน hnRNP และมีโปรตีนที่คาดไม่ถึง
00:04:51.05 เช่น cis/trans prolyl isomerases และ ubiquitin ligases
00:04:54.25 รวมรายการชิ้นส่วน spliceosome ทั้งหมดที่เราเข้าใจแล้ว
00:05:01.23 ประกอบด้วย 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 และ U6) และร้อย
00:05:09.26 โปรตีนในยีสต์ โปรตีนหลายร้อยชนิด และประมาณ
00:05:12.25 โปรตีนสามร้อยชนิดในมนุษย์ และสาเหตุที่
00:05:17.13 เครื่องจักรประกบมนุษย์นั้นซับซ้อนกว่ามาก
00:05:19.17 กว่าเครื่องจักรประกบยีสต์ คุณนึกออก
00:05:22.11 เหตุใดเพราะเรามีอินตรอนที่แตกต่างกันมากมาย และเราทำทุกอย่าง
00:05:25.07 การประกบแบบอื่นที่ยีสต์ไม่ทำ และส่วนใหญ่
00:05:28.08 ของโปรตีนเหล่านี้ โปรตีนพิเศษ เกี่ยวข้องกับการประกบทางเลือก
00:05:32.00 ให้ฉันบอกคุณเล็กน้อยเกี่ยวกับ snRNA เรียกว่า
00:05:36.03 "U" snRNAs เพราะพวกมันเป็น RNA ที่อุดมด้วยยูริดีน และพวกมัน
00:05:40.23 การนับนั้นมาจาก -- ถ้าใครแค่ทำให้บริสุทธิ์ RNA ที่เสถียรทั้งหมด
00:05:47.27 ออกจากนิวเคลียสแล้ววิ่งบนเจล อุดมสมบูรณ์ที่สุด
00:05:53.01 อันหนึ่งคือ U1 อันที่มีจำนวนมากที่สุดเป็นอันดับสองคือ U2 และอื่นๆ
00:05:57.06 และปรากฎว่า U3 มีอยู่จริง แต่มันเกี่ยวข้องกับการสร้างไรโบโซมชีวภาพ
00:06:03.28 เช่นเดียวกับ U7 แต่อีกห้าในหกที่อุดมสมบูรณ์ที่สุด
00:06:09.29 ทั้งหมดเกี่ยวข้องกับการต่อ pre-mRNA หรือ spliceosome
00:06:14.13 เราอยู่ที่ spliceosome กลับมาที่วงจร spliceosome
00:06:17.15 และเราจะมองให้ละเอียดกว่านี้หน่อยเพราะ
00:06:20.18 ฉันจะบอกคุณเกี่ยวกับการทดลองที่เราเพิ่งทำไป
00:06:22.29 เสร็จสิ้นเพื่อทดสอบรอบนี้ ดังนั้นในช่วงแรกของวัฏจักร
00:06:27.24 ที่จุดเริ่มต้นของการประกอบ spliceosome U1 snRNP โต้ตอบกับ
00:06:33.23 ไซต์ประกบสำคัญ 5 ไซต์และ U1 snRNA เป็นคู่เบสจริงๆ
00:06:38.22 และรู้จักจุดต่อไพร์ม 5 จุด ในทำนองเดียวกัน U2 snRNA
00:06:44.29 เบสจับคู่และรับรู้ลำดับฉันทามติของไซต์สาขา
00:06:49.22 และ U2 snRNA เมื่อมันรวม U1 snRNA จะเกิดเป็นเชิงซ้อน
00:06:56.03 E complex ย่อมาจาก "early" complex แล้ว A, B และ C คือ--
00:07:02.21 อีกสักครู่เดี๋ยวก็รู้ -- ถูกตั้งชื่อตามตำแหน่งที่พวกเขาวิ่งไป
00:07:06.07 บนเจล ดังนั้น คอมเพล็กซ์ต้องมาก่อน ตามด้วยก้อนใหญ่ถัดไป
00:07:11.12 ของ spliceosome ที่เข้ามาคือ triple snRNP--
00:07:15.17 U4/5/6. เมื่อ snRNP สามตัวอยู่ที่นั่น, เรามี B เชิงซ้อน
00:07:21.10 จากนั้นก็มีการจัดเรียงโครงสร้างใหม่ ซึ่งจริงๆ แล้ว U1 snRNP นั้น
00:07:26.24 ถูกนำออก มันถูกไล่ออกและมีการจัดเรียงใหม่ที่สำคัญเช่น
00:07:31.20 ว่า U6 snRNA มีปฏิสัมพันธ์กับไซต์ต่อไพร์ม 5 แห่ง ในการจัดเรียงใหม่
00:07:38.27 U4 snRNP ถูกไล่ออก จากนั้น NineTeen complex ก็เข้ามา
00:07:47.17 และตอนนี้ เรามี spliceosome ที่เร่งปฏิกิริยา ซึ่งขั้นตอนแรก
00:07:53.18 และขั้นตอนที่สองของการประกบก็เกิดขึ้น เมื่อขั้นตอนที่สองของการประกบ
00:07:58.01 เสร็จสมบูรณ์ ผลิตภัณฑ์ต่อถูกปล่อย และ intron ที่แยกออก
00:08:05.21 ออกไปพร้อมกับ spliceosome ที่เหลือ เครื่องประกบนั้นต้องถอดประกอบ
00:08:10.27 แล้วประกอบใหม่ในแต่ละรอบของการประกบ ดังนั้น ergo
00:08:15.29 วงจรประกบกัน แล้วเราจะทราบรายละเอียดของกลไกเหล่านี้ได้อย่างไร
00:08:22.04 ที่ฉันบอกคุณเกี่ยวกับ? วิธีหนึ่งที่เรารู้ก็คือโดย
00:08:25.19 ดำเนินการปฏิกิริยาการประกบในหลอดทดลอง ดังนั้นในปฏิกิริยาการประกบในหลอดทดลอง
00:08:31.15 เราเอาอาร์เอ็นเอชิ้นหนึ่ง ปกติแล้วชิ้นส่วนของอาร์เอ็นเอที่จะเป็นคู่
00:08:37.19 นิวคลีโอไทด์นับร้อยที่จะประกอบด้วยเอ็กซอนที่มีหนึ่งอินตรอน
00:08:42.16 ตามด้วย exon ดาวน์สตรีม และเครื่องหมายดอกจันเล็ก ๆ ที่นี่ เครื่องหมายดอกจันสีแดง
00:08:49.01 แสดงว่าอาร์เอ็นเอนี้จะถูกติดฉลากกัมมันตภาพรังสี ดังนั้นเราจะ
00:08:53.04 ถอดความมันในหลอดทดลองและใส่นิวคลีโอไทด์กัมมันตภาพรังสีให้ทั่ว
00:08:59.23 จากนั้นเราก็ผสม RNA นี้กับสารสกัดทั้งเซลล์อย่างใดอย่างหนึ่ง ถ้าเรากำลังทำงานกับยีสต์ spliceosome
00:09:05.08 หรือสารสกัดนิวเคลียร์ หากเรากำลังดำเนินการเกี่ยวกับ spliceosome ของมนุษย์ ตัวอย่างเช่น เรา
00:09:09.20 อาจได้รับสิ่งนั้นจากเซลล์ HeLa ซึ่งเป็นเซลล์เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อทั่วไปสำหรับมนุษย์
00:09:15.01 แล้วก็ ATP ด้วย เพราะ ATP จำเป็นสำหรับการประกบกัน เพราะ
00:09:21.21 การเปลี่ยนช่วง spliceosome ที่ฉันแสดงให้คุณเห็นทั้งหมดที่นี่
00:09:26.12 หลังจากการก่อตัว E ที่ซับซ้อน แต่ละขั้นตอนนั้นต้องการ ATP และ
00:09:32.07 ก็วนกลับมาที่นี่เช่นกัน ทำไมเราถึงใช้สารสกัดทั้งเซลล์
00:09:38.01 หรือสารสกัดนิวเคลียร์? ฉันเพิ่งบอกคุณไปว่าเครื่องประกบคือ
00:09:43.08 ซับซ้อนอย่างไม่น่าเชื่อ มีโพลีเปปไทด์หลายร้อยชนิดในยีสต์
00:09:48.15 ในมนุษย์ โพลีเปปไทด์ที่แตกต่างกันสามร้อยชนิด ไม่มีอะไรจริงๆ
00:09:51.26 วิธีในปัจจุบันที่เราสามารถทำให้โปรตีนแต่ละชนิดบริสุทธิ์ได้นั้น
00:09:56.23 ในหลอดทดลอง และสร้างเครื่องจักรใหม่ทั้งหมด ดังนั้นตอนนี้
00:10:01.10 วิธีที่ดีที่สุดในการศึกษา spliceosome นั้นเกือบจะเป็นวิธีการดั้งเดิม
00:10:04.12 สภาพแวดล้อม และอยู่ในการแยกเซลล์แบบไม่แยกส่วน ดังนั้นถ้าเราเอา
00:10:11.16 ปฏิกิริยาประกบเหล่านั้น และนำจุดเวลาออกแล้วทำให้บริสุทธิ์
00:10:17.23 อาร์เอ็นเอกัมมันตภาพรังสีและเรียกใช้บนเจลที่ทำให้เสียสภาพ -- และในกรณีนี้
00:10:22.07 เปอร์เซ็นต์เจลทำให้เสียสภาพค่อนข้างสูง สิ่งที่เราเห็นคือมันจบแล้ว
00:10:26.16 เวลา (และหลักสูตรเวลานี้เริ่มจากศูนย์ถึงหกสิบนาที
00:10:31.23 ในหลอดทดลอง) เราจะเห็นพื้นผิวค่อยๆ หายไป และแล้วเมื่อเช้า
00:10:40.11 จุดเวลา ตัวกลางของการประกบสองตัวปรากฏขึ้น บาศตัวกลาง
00:10:44.11 และ 5 ไพรม์เอ็กซอน จากนั้นคุณจะเห็นจุด .ในเวลาต่อมา
00:10:49.18 ผลิตภัณฑ์บาศ ผลิตภัณฑ์อินตรอน และผลิตภัณฑ์เอ็กซอนแบบประกบ
00:10:56.22 ปรากฏขึ้น และเหตุผลที่บาศนั้นวิ่งสูงในเจลแม้ว่า
00:11:01.26 พวกมันเล็กกว่า RNA พรีเมสเซนเจอร์ พวกมันมีสิ่งนี้
00:11:06.21 โครงสร้างแบบวงกลม และเนื่องจากโครงสร้างที่ไม่ปกตินั้น พวกมันจึงปัญญาอ่อน
00:11:11.17 ในเจลมากกว่า RNA เชิงเส้น ดังนั้นพวกมันจึงวิ่งสูงกว่า
00:11:16.16 อย่างที่คุณคาดหวัง แต่ตอนนี้ถ้าเราใช้ปฏิกิริยาประกบแบบเดียวกันนี้แทน
00:11:23.27 แต่อย่าทำให้ RNA บริสุทธิ์และเพียงแค่เรียกใช้บนเจลพื้นเมือง ดังนั้นตอนนี้เรา
00:11:30.05 มองไปที่สารเชิงซ้อนที่มีอาร์เอ็นเอ ที่นี้เราจะได้เห็นกัน
00:11:35.12 คอมเพล็กซ์ที่ฉันบอกคุณก่อนหน้านี้ นี่คือ E เชิงซ้อน เชิงซ้อนต้น
00:11:39.18 A, B และ C ก่อตัวและหายไปตามกาลเวลา อย่างที่คุณคาดไว้
00:11:45.29 และนั่นคือที่มาของชื่อคอมเพล็กซ์ต่างๆ เหล่านี้
00:11:49.10 ง่ายๆ โดยการโยกย้ายบนเจล เอาล่ะตอนนี้แตกต่างกัน
00:11:57.05 คอมเพล็กซ์สามารถทำให้บริสุทธิ์ได้ พวกมันเสถียร มั่นคงพอที่จะ
00:12:01.11 มีชีวิตรอดจากเจลพื้นเมือง และตอนนี้มีวิธีการต่างๆ มากมายที่คิดค้นขึ้น
00:12:07.13 เพื่อชำระล้างสารเชิงซ้อนต่างๆ นี่เป็นตัวอย่างหนึ่งจากห้องปฏิบัติการของฉัน
00:12:11.17 สิ่งที่เราทำคือเราเอาซับสเตรตประกบ ที่เรากลายพันธุ์
00:12:15.20 ไซต์ประกบหลัก 3 แห่ง ดังนั้นเครื่องจักรประกบสามารถสร้างขึ้นบน
00:12:19.28 อาร์เอ็นเอ ก้าวแรกทำได้ แต่ก้าวที่สองไม่ได้
00:12:24.11 เพราะจุดต่อไพร์ม 3 จุดถูกกลายพันธุ์ และในอินตรอนนั้น เราได้สร้าง
00:12:30.04 Stem loops ที่รู้จักโดยโปรตีน MS2 ซึ่งเป็นไวรัสโค้ต
00:12:35.06 โปรตีนที่จับแน่นมากกับลำดับการจดจำของมัน ไวรัสโค้ตนั้น
00:12:40.09 โปรตีนที่เรียกว่า MS2 เราเชื่อมโยงกับโปรตีนที่จับกับมอลโตส ผูกมอลโตส
00:12:45.13 โปรตีนชอบจับอะมิโลสเรซิน ดังนั้นเราจึงสามารถใช้สิ่งนั้นเป็นตัวสัมพันธ์
00:12:50.12 เพื่อดึง spliceosomes เหล่านี้ลงมาและทำให้บริสุทธิ์ และสามารถดูได้ที่นี่
00:12:56.07 ภาพ EM ของ spliceosome และ spliceosomes ทั้งหมด
00:13:02.24 ขนาดประมาณ 20-30 อังสตรอม จากอิมเมจ EM เหล่านั้น คุณทำได้
00:13:11.07 การสร้างอนุภาคเดี่ยวขึ้นใหม่เพื่อเริ่มรับโครงสร้างของเครื่องจักรประกบ
00:13:17.27 และ ณ จุดนี้ เมื่อเปรียบเทียบกับไรโบโซม ตัวอย่างเช่น
00:13:25.08 ข้อมูลโครงสร้างที่เรามีสำหรับ spliceosome ค่อนข้างจำกัด
00:13:30.13 เรามีโครงสร้างผลึกอยู่แล้ว -- โครงสร้างผลึกสองแบบที่แตกต่างกันของ U1 snRNP
00:13:36.20 ซึ่งเป็น snRNP ที่พบได้บ่อยที่สุด และอยู่ที่ 5.5 และ 4.4
00:13:43.08 ความละเอียดอังสตรอม พอเห็นอาร์เอ็นเอและโปรตีน
00:13:49.13 แต่สำหรับคอมเพล็กซ์ที่ใหญ่กว่า เรายังคงอยู่ที่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
00:13:54.09 บนเวที เป็นต้น นี่คือรูปภาพบางส่วนจากห้องทดลองของ Reinhardt Luhrmann
00:13:57.28 ของสารเชิงซ้อนต่อยีสต์ -- บี คอมเพล็กซ์ บี คอมเพล็กซ์ที่ถูกกระตุ้น
00:14:04.04 และจากนั้นก็ซี คอมเพล็กซ์ ซึ่งเป็นสปลิโอโซมที่มีตัวกลาง
00:14:08.12 อยู่ในนั้น และในปีต่อๆ ไป เราคือกลุ่มประกบกันจริงๆ
00:14:14.08 ดิ้นรนอย่างหนัก แต่รอคอยที่จะมีโครงสร้างที่มีความละเอียดสูง
00:14:19.09 เพราะเราอยากเห็นจริงๆ ว่าส่วนต่างๆ เหล่านี้ผูกไว้ที่ไหน
00:14:22.19 และวิธีที่พวกเขาทั้งหมดเข้ากันได้เพื่อสร้างเครื่องจักรที่น่าทึ่งจริงๆ
00:14:27.09 ในระหว่างนี้ นั่นคือที่ที่เราอยู่ด้านหน้าโครงสร้าง ใน
00:14:34.11 นอกเหนือจากโครงสร้างสำหรับคอมเพล็กซ์หรือเครื่องจักรทางชีวเคมีใดๆ แล้วคุณ
00:14:38.29 จำเป็นต้องสังเกตบางอย่างเกี่ยวกับไดนามิกของพวกมัน ดังนั้นฉันจึงข้ามเรื่องนี้ไป
00:14:42.29 รอบการต่อทั้งหมดกับคุณ แต่อย่างที่ฉันอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ รอบการประกบคือ
00:14:47.17 ตามคอมเพล็กซ์ที่มีความเสถียรเพียงพอที่จะแก้ไขได้
00:14:54.14 บนเจล หรือคุณสามารถชำระล้างพวกมันได้ แต่มันไม่ได้บอกคุณเกี่ยวกับ
00:15:00.19 จลนศาสตร์ของสิ่งต่างๆ ตัวอย่างเช่นมันจะเป็นจริงหรือไม่
00:15:07.00 น. ว่าทุกอินตรอน U1 จะต้องมาก่อน U2 และสองสิ่งนี้ต้องมาก่อน
00:15:14.01 สาม snRNP? และลูกศรทั้งหมดที่เรากำลังแสดงอยู่นี้เป็นทางเดียว
00:15:19.12 ลูกศร แต่ปฏิกิริยาทางชีวเคมีและปฏิกิริยาเคมีส่วนใหญ่เป็น
00:15:23.11 สองทาง ลูกศรเหล่านี้เป็นทางเดียวจริง ๆ หรือไม่ มันเป็นถนนเดินรถทางเดียวหรือไม่?
00:15:28.07 หรือกระบวนการนี้สามารถย้อนกลับได้หรือไม่? เพื่อที่จะได้ข้อมูลนั้น
00:15:34.07 ห้องทดลองของฉันเพิ่งร่วมมือกับห้องทดลองของ Jeff Gelles
00:15:39.02 ที่มหาวิทยาลัย Brandeis และมหาวิทยาลัย Virginia Cornish ที่มหาวิทยาลัยโคลัมเบีย
00:15:43.29 และเพื่อนร่วมงานที่ New England Biolabs เพื่อพัฒนาสิ่งใหม่ๆ
00:15:48.12 เครื่องมือเพื่อดูพลวัตของ spliceosome หลัก
00:15:53.27 วิธีที่เราใช้งานอยู่เรียกว่าการสะท้อนกลับภายในทั้งหมด
00:15:59.08 นี่คือการทดลองที่คุณสามารถลองทำเองที่บ้านได้ นี่จึงเป็นเพียงแค่เลเซอร์
00:16:03.21 ตัวชี้ที่ลงไปในตู้ปลา และถ้าคุณวางตำแหน่งอย่างถูกต้อง
00:16:11.12 ตัวชี้เลเซอร์ที่มุมวิกฤต เมื่อมีการเปลี่ยนแปลงใน
00:16:15.23 ดัชนีการหักเหของแสง ในกรณีนี้ ระหว่างน้ำกับอากาศ ตามด้วยเลเซอร์ทั้งหมด
00:16:20.23 แสงจะถูกสะท้อนอย่างสมบูรณ์ ซึ่งเรียกว่าการสะท้อนแสงภายในทั้งหมด
00:16:25.05 ยกเว้นตรงจุดที่เลเซอร์สัมผัสกัน
00:16:34.15 พลังงานที่ไหลผ่านอีกด้านหนึ่ง เรียกว่าคลื่นที่หลบหลีก
00:16:38.13 ดังนั้นคลื่นที่ลางออกไป ในกรณีนี้ เราจะมีเลเซอร์
00:16:44.26 ผ่านอากาศไปยังสไลด์ไมโครสโคป นี่แหละคือความเปลี่ยนแปลง
00:16:49.02 ในดัชนีการหักเหของแสงกำลังเคลื่อนจากสไลด์กล้องจุลทรรศน์ไปเป็นน้ำ
00:16:56.14 เลเยอร์เหนือสไลด์กล้องจุลทรรศน์ คลื่นจะลาลับไป
00:17:00.05 สารละลาย 100 นาโนเมตรเหนือสไลด์กล้องจุลทรรศน์
00:17:05.25 ลองนึกภาพว่าไม่ใช่แค่เลเซอร์ตัวเดียว แต่มีสามสีที่ต่างกัน
00:17:11.17 ของเลเซอร์ ปรากฎว่าเราสามารถทำเลเซอร์ได้ห้าครั้ง ฉันจะแสดงให้คุณเห็นแค่สามคน
00:17:16.05 สามวันนี้ แต่ลองนึกภาพว่ามีเลเซอร์สามสีที่ต่างกันออกไป
00:17:23.23 อยู่ในมุมวิกฤต และมีบางสิ่งผูกติดอยู่กับผิวน้ำ
00:17:27.25 ภายใน 100 นาโนเมตรนี้ และมีโมเลกุลที่เป็นฟลูออเรสเซนต์
00:17:34.07 ด้วยสีที่ตื่นเต้นด้วยเลเซอร์สามแบบของคุณ ดังนั้นโมเลกุล
00:17:41.14 ที่อยู่ในสารละลายเหนือคลื่นที่หลบเลี่ยงไม่ใช่หลอดฟลูออเรสเซนต์
00:17:45.25 เพราะมันอยู่นอกพื้นที่ที่มีพลังงานแสงอยู่ แล้วก็
00:17:51.10 เฉพาะโมเลกุลที่ผูกติดกับพื้นผิวเท่านั้นที่จะเรืองแสงได้
00:17:55.07 ดังนั้นเราจึงสามารถใช้สิ่งนี้เพื่อขออะไรก็ได้ที่ผูกติดอยู่กับพื้นผิว
00:18:01.02 โมเลกุลสีต่างๆ ที่สัมพันธ์กับ
00:18:05.13 โมเลกุลที่ผูกติดกับพื้นผิว มาดูกันว่าหน้าตาเป็นอย่างไร
00:18:09.04 ลองนึกภาพว่าคุณกำลังมองลงไปที่พื้นผิวนี้แล้วเราจะเป็น
00:18:13.27 มองไปที่โมเลกุลบนพื้นผิว เราจึงเรียกเทคนิคนี้ว่า colocalization
00:18:20.21 ของสเปกโทรสโกปีโมเลกุลเดี่ยวหรือ CoSMos และเทคนิคนี้คือ
00:18:25.13 เป็นผู้บุกเบิกโดย Jeff Gelles และเพื่อนร่วมงานของเขา Larry Friedman ที่ Brandeis
00:18:29.00 มหาวิทยาลัย. ในที่นี้เรากำลังดูการเรืองแสงและแต่ละอันของ
00:18:35.29 จุดเหล่านี้เป็นโมเลกุลเดี่ยวบนฝาครอบกระจกที่มีสีต่างกัน
00:18:42.21 เกี่ยวกับมัน ในกรณีนี้ โมเลกุลเป็นสาย DNA และ
00:18:49.16 สิ่งต่าง ๆ ที่เป็นสีต่าง ๆ กัน oligos ที่ประกอบกับสาย DNA นั้น
00:18:53.22 แต่พวกมันมีฟลูออโรฟอร์ต่างกัน และเพื่อให้คุณสามารถเห็นสำหรับ
00:18:57.12 ตัวอย่างที่โมเลกุลของ DNA นี้มีโอลิโกสทั้งสามที่ถูกผูกไว้กับมัน
00:19:04.18 แต่โมเลกุลของ DNA นี้มีเพียงตัวเดียว -- มีเพียงสีเขียวและ
00:19:10.04 ผูกสีน้ำเงินไว้กับมัน และคุณจะเห็นว่านี่คืออันที่มีเพียงสีน้ำเงิน
00:19:13.19 โมเลกุลถูกผูกไว้กับมัน มันง่ายมากเพราะสิ่งที่เราทำคือ
00:19:18.25 เรากำลังดูสิ่งนี้อยู่ เช่น กลุ่มดาว กลุ่มดาวต่างๆ ของจุด
00:19:23.17 และเรากำลังจะเรียนรู้บางอย่างเกี่ยวกับระบบทางชีววิทยาของเรา
00:19:27.09 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ถ้าเราสามารถดูว่าจุดเหล่านี้เปลี่ยนแปลงไปอย่างไรเมื่อเวลาผ่านไป
00:19:33.13 เราสามารถเรียนรู้เกี่ยวกับพลวัตของระบบ ตอนนี้เพื่อที่จะ
00:19:37.19 ใช้สิ่งนี้เพื่อศึกษา spliceosome เราต้องพัฒนาจำนวน
00:19:42.01 เทคโนโลยีที่แตกต่างหรือใหม่เพื่อให้เราสามารถติดฉลากชิ้นส่วนของ spliceosome
00:19:46.22 เพื่อให้เราได้เห็นพวกเขา และสิ่งหนึ่งที่เราต้องทำ
00:19:51.18 คือการสร้าง pre-mRNA ที่ติดแท็กเรืองแสงเพราะเราจำเป็นต้องรู้
00:19:57.21 โดยที่ pre-mRNA อยู่บนพื้นผิว นอกจากนี้ pre-mRNA ของเรายังต้อง
00:20:02.26 มีวิธีผูกไว้กับพื้นผิว วิธีที่เราทำก็คือ
00:20:06.13 ใส่โมเลกุลไบโอตินที่ปลายข้างหนึ่ง แล้วเราก็มีไบโอตินบน
00:20:12.05 พื้นผิวกระจก เรามี PEG ที่เติมไบโอติน--โพลีเอทิลีนไกลคอล
00:20:17.19 แล้วเราก็ทำแซนวิช โดยมีสเตรปทาวิดิน สเตรปทาวิดิน
00:20:21.24 สามารถจับไบโอตินได้ 4 โมเลกุล คุณจึงใช้ไบโอตินทำ
00:20:25.11 แซนวิชและผูก RNA ของคุณไว้ที่นั่น ตอนนี้สิ่งอื่นที่เราต้อง
00:20:30.07 การพัฒนาเป็นวิธีอื่นในการติดแท็ก snRNP เพราะสิ่งที่เราจริงๆ
00:20:33.27 สิ่งที่ต้องทำคือดู snRNP ที่กำลังมาและไปตามเวลาจริง
00:20:37.22 ดังนั้น วิธีที่เราแท็ก snRNP คือการใช้แท็กโปรตีนสองแท็ก
00:20:44.22 หนึ่งคือแท็ก SNAP ที่พัฒนาโดย Kai Johnsson และตอนนี้
00:20:49.17 ใช้ได้ผ่าน New England Biolabs SNAP ขึ้นอยู่กับโปรตีนที่
00:20:55.12 เป็นเอนไซม์ฆ่าตัวตายที่เอาหมู่อัลคิลออกจากนิวคลีโอไทด์ของกัวนีน
00:21:01.23 ของดีเอ็นเอ ดังนั้นมันจึงถ่ายโอนหมู่อัลคิลเหล่านั้นไปยังตัวมันเอง ดังนั้นในกรณีนี้
00:21:08.03 ถ้าคุณมีเบนซิล กวานีน -- นี่คือ กวานีน แล้วก็มีหมู่เบนซิล
00:21:13.19 กับมัน และถ้าคุณติดสีย้อมเรืองแสงนั้น โปรตีนแท็ก SNAP
00:21:20.05 จะถ่ายโอนสีย้อมนั้นไปยังตัวมันเอง และถ้าคุณสร้างฟิวชันโปรตีน
00:21:25.21 ระหว่างแท็ก SNAP และโปรตีนที่คุณสนใจ ในกรณีนี้ a
00:21:30.08 โปรตีน snRNP -- จากนั้น คุณสามารถระบุโปรตีน snRNP ของคุณโดยเฉพาะได้
00:21:34.29 นี่คือแท็กอื่นที่เราใช้คือ E. coli DHFR
00:21:42.03 แท็กไดไฮโดรโฟเลตรีดักเตสและแบคทีเรียไดไฮโดรโฟเลตรีดักเตสผูก
00:21:50.08 แน่นมากกับไตรเมโทพริม -- โมเลกุลนี้ข้างล่างนี้ มันไม่ใช่โควาเลนต์
00:21:54.15 ปฏิสัมพันธ์ Trimethoprim เป็นตัวยับยั้ง E. coli DHFR แต่โมเลกุลนี้
00:21:59.29 ไม่ผูกมัดกับ DHFR ของยูคาริโอต แต่นี่เป็นปฏิสัมพันธ์ที่แน่นแฟ้นมากและ
00:22:07.29 อีกครั้ง ถ้าเราผูกมัดย้อมด้วยสิ่งนั้น สีย้อมนี้จะมีผลกับ DHFR . ของเรา
00:22:13.14 แท็กและให้เราติดฉลากโปรตีนนั้น และเทคโนโลยีนี้ก็คือ
00:22:19.18 พัฒนาโดยเวอร์จิเนีย คอร์นิชและเพื่อนร่วมงานของเธอที่มหาวิทยาลัยโคลัมเบีย
00:22:23.22 แล้วเราจะรับแท็กเหล่านี้ใน snRNP ของเราได้อย่างไร วิธีที่เราทำคือ
00:22:29.17 เราใช้ระบบยีสต์ และเราใช้การรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกัน
00:22:33.16 ดังนั้นเราจึงสร้างยีนโปรตีนแบบต่างๆ ที่เราต้องการ
00:22:38.09 แท็ก -- ในกรณีนี้คือโปรตีน U1 สองตัวและโปรตีน U2 หนึ่งตัว จากนั้นเราก็วางแท็ก
00:22:45.22 น่าสนใจที่ปลาย C ของโปรตีนนั้น หรือยีนของโปรตีนนั้น
00:22:50.00 น. แล้วเราก็มีผู้ผลิตที่สามารถเลือกได้ และเราใช้ความคล้ายคลึงกัน
00:22:54.25 การรวมตัวกันอีกครั้งเพื่อนำยีนที่ดัดแปลงเหล่านี้ไปเป็นยีสต์เดี่ยว และ
00:23:01.11 นั่นหมายถึงยีนเดียวที่เข้ารหัสโปรตีนในยีสต์คือ
00:23:07.17 โปรตีนที่เราสนใจ -- โปรตีนที่ติดแท็กของเรา ดังนั้นจากยีสต์เหล่านั้น
00:23:13.15 สายพันธุ์ เราสามารถสร้างสารสกัดทั้งเซลล์ได้ และในกรณีนี้ เรามี U1
00:23:18.15 มีแท็ก DHFR สองแท็กบนโปรตีนสองชนิดที่แตกต่างกัน หรือ U1 มีแท็กสองแท็ก
00:23:26.03 และ U2 มีแท็ก SNAP อยู่ ดังนั้นจึงมีแท็กสามแท็ก เราก็
00:23:33.06 นำสารสกัดเหล่านั้นและเราสามารถเพิ่ม TMP ไปที่ label
00:23:40.17 DHFR หรือเพื่อติดแท็ก SNAP เรานำเบนซิลกัวนีนของเราที่มี
00:23:46.15 ป้ายเรืองแสงบนนั้น เราทำปฏิกิริยากับสารสกัดทั้งเซลล์ เราลบ
00:23:52.07 สีย้อมส่วนเกินโดยการกรองเจล จากนั้นเราก็เพิ่ม TMP ของเราได้แล้ว แล้วก็
00:23:58.04 สิ่งที่ยอดเยี่ยมจริงๆ เกี่ยวกับระบบนี้ อย่างแรกเลย เรารู้ว่า
00:24:04.00 น. โปรตีนที่เรากำลังแท็กทำงานอยู่เพราะ 1) พวกมันเป็นเพียงสำเนาเดียวของ
00:24:08.09 โปรตีนในเซลล์ และเราติดแท็กเฉพาะโปรตีนที่จำเป็นเท่านั้น
00:24:14.29 โปรตีนหลายชนิดใน spliceosome มีความจำเป็น ดังนั้นเราจึงรู้
00:24:20.07 ว่าถ้าเซลล์เติบโต เพราะการประกบกันเป็นสิ่งจำเป็น โปรตีนนั้น
00:24:24.06 ต้องเปิดใช้งาน ประการที่สอง ไม่มีการสร้างโปรตีนขึ้นมาใหม่โดยเด็ดขาด
ต้อง 00:24:29.04 ดังนั้นเราจึงไม่ได้สร้างโปรตีนลูกผสมใดๆ เพื่อทำให้พวกมันบริสุทธิ์
00:24:32.25 แล้วใส่กลับเข้าไป เรากำลังใช้โปรตีนจากภายใน พวกเราแค่
00:24:36.08 เพิ่มแท็กโปรตีนขนาดเล็กให้กับสิ่งนั้น ตอนนี้เรามาดูกันว่าสิ่งเหล่านี้เป็นอย่างไร
00:24:43.03 การทดลองกำลังจะดำเนินต่อไป เราจะมีพรี mRNA . ของเรา
00:24:50.18 ที่ติดอยู่กับพื้นผิวผ่านแซนด์วิชไบโอติน-สเตรปทาวิดินนี้
00:24:54.12 มันมีฟลูออโรฟอร์อยู่ด้วย เพื่อให้เราสามารถติดตามว่าพรี-mRNA . อยู่ที่ไหน
00:24:58.24 โมเลกุลคือ และนี่คือมุมมองผ่านกล้องจุลทรรศน์ของ
00:25:04.09 เขตข้อมูลของ pre-mRNA เหล่านี้มีลักษณะอย่างไร โดยที่แต่ละจุดเหล่านี้
00:25:08.21 เป็นโมเลกุลเดี่ยวของพรี mRNA และในภาพยนตร์ที่ฉันจะแสดง
00:25:15.11 คุณกำลังจะดู U1 snRNP ที่ผูกมัดกับ pre-mRNA เหล่านั้น
00:25:21.20 เมื่อเวลาผ่านไปในปฏิกิริยาประกบ สิ่งหนึ่งที่เกี่ยวกับโมเลกุลเดี่ยว
00:25:27.09 ปฏิกิริยาคือคุณเห็นทุกสิ่งที่เกิดขึ้นจริงๆ--
00:25:36.11 อะไรก็ได้ที่เรืองแสง ฝุ่นหรืออะไรก็ตามที่คุณเห็น
00:25:41.01 ดังนั้น คุณต้องควบคุมหลายอย่างจริงๆ เพื่อให้แน่ใจว่าคุณรู้ว่าอะไร
00:25:44.21 คุณกำลังดูอยู่ อย่างแรกที่ฉันจะให้คุณดูคือหนัง
00:25:48.19 ที่เรากำลังทำการควบคุม โดยที่เราได้ละทิ้ง
00:25:54.13 RNA เรืองแสง หรือเราไม่มีแท็กบน U1 snRNP (และเรา
00:26:00.28 จะไม่คาดหวังสัญญาณ) หรือเรามีปฏิกิริยาที่สมบูรณ์ซึ่งเรา
00:26:04.19 มี RNA ที่ติดแท็กเรืองแสงและ snRNP ที่ติดแท็กเรืองแสง
00:26:09.07 ดูหนังเรื่องนั้นกัน ภาพยนตร์เรื่องนี้แสดงมุมมองการควบคุมสองช่อง
00:26:19.21 และมุมมองทดลองหนึ่งช่องทางด้านขวา ขอบเขตการมองเห็น
00:26:24.28 ไปทางซ้าย เรามี pre-mRNA ชนิดไวด์อยู่
00:26:31.21 เราไม่สามารถเห็นสิ่งนั้นในมุมมองนี้เพราะเราไม่ได้มองในด้านนั้น
00:26:35.13 ช่อง. เรากำลังดูช่อง Cy3 ซึ่งเป็นช่อง TMP
00:26:39.18 และเรายังมี Cy3-TMP ในสารสกัด แต่ไม่มีแท็ก
00:26:44.05 โปรตีน คุณจะเห็นว่าเรามีพื้นฐานเล็กน้อยกับ
00:26:48.07 วัสดุผูกกับสไลด์โดยไม่เจาะจง นั่นคือเหตุผลว่าทำไมจึงสำคัญ
00:26:55.07 เพื่อทำการควบคุมเหล่านั้น เพื่อให้แน่ใจว่าพื้นหลังของคุณไม่สูงเกินไป
00:26:59.06 ที่แผงตรงกลาง ตอนนี้เรามีแท็ก U1 และ Cy3-TMP
00:27:07.24 แต่เราไม่มี pre-mRNA บนสไลด์ เราจึงเห็นเพียงอีกครั้ง
00:27:11.26 ผูกพื้นหลัง แล้วในแผงขวาสุดซึ่งเป็นอันหนึ่ง
00:27:16.14 ด้วยไฟกะพริบทั้งหมด เรามีส่วนประกอบทั้งสาม เราก็เลยมี
00:27:21.05 แท็ก U1 เรามีพรี-mRNA บนพื้นผิว และเรามี Cy3-TMP
00:27:28.11 สิ่งหนึ่งที่คุณสามารถเห็นได้ทันทีจากสิ่งนี้คือการโต้ตอบของ U1
00:27:35.03 ที่มี RNA เป็นไดนามิกสูง ดังนั้นแม้ในกรณีที่ไม่มี ATP, U1
00:27:40.27 ผูกมัดและปล่อยหลายครั้งจากแต่ละ pre-mRNA ตอนนี้ที่เรา
00:27:48.28 รู้ว่าระบบของเราทำงาน มาทำการทดลองกันจริงๆ และ
00:27:53.09 เจ๋งจริง ๆ เกี่ยวกับการทดลองเหล่านี้ คือ คุณสามารถเห็นได้
00:27:58.09 คำตอบด้วยสายตาของคุณ เลยจะพามาดูหนัง
00:28:04.15 ต่อไป โดยเราได้ใส่แท็กเรืองแสงสองแท็กบนแต่ละ subcomplexes หลัก
00:28:10.00 ดังนั้น ในหนึ่งสารสกัด ในหนึ่งจตุภาค คุณจะเห็นสารสกัดนั้น
00:28:16.08 มีฉลากบน U1 snRNP อย่างที่คุณเห็นแล้วในโปรตีนสองชนิดที่แตกต่างกัน
00:28:20.25 จากนั้น เรามีสารสกัดอื่นที่มีป้ายกำกับบน U2 snRNP บนส่วนประกอบ U5
00:28:26.21 ของ Triple snRNP และบน NineTeen complex และในชุดแรกของ .นี้
00:28:34.12 ภาพยนตร์ เราจะไม่มี ATP อยู่ ดังนั้นในกรณีที่ไม่มี ATP
00:28:40.27 เราทราบจากการศึกษาเกี่ยวกับเจลว่าเป็นเพียงคอมเพล็กซ์เดียวที่ควรมี
00:28:49.15 แบบฟอร์มคือ E คอมเพล็กซ์ ดังนั้น U1 เท่านั้นจึงจะสามารถโต้ตอบกับ ได้อย่างเสถียร
00:28:55.02 อาร์เอ็นเอ ทีนี้ลองดูและดูว่าเป็นเช่นนั้นหรือไม่
00:29:02.22 นี่คือภาพยนตร์ที่แสดงสารสกัดที่แตกต่างกันสี่แบบด้วย snRNP . ที่แตกต่างกัน
00:29:11.02 กำกับในแต่ละสารสกัด ไม่ว่าจะเป็น U1 ที่มุมบนซ้ายมือ snRNP สามตัว
00:29:17.27 ที่มุมล่างซ้ายมือ U2 ที่มุมขวาบนหรือ
00:29:22.06 กทช. ที่มุมล่างขวามือ และในกรณีที่ไม่มี ATP อะไร
00:29:28.05 คุณจะเห็นดังที่เราเห็นในภาพยนตร์ก่อนหน้านี้ว่า U1 กำลังจะมาและผูกพัน
00:29:34.18 ย้อนกลับได้ แต่สำหรับ snRNP อื่นๆ ทั้งหมด เราไม่เห็นการผูกมัดที่มีนัยสำคัญ
00:29:41.04 บนพื้นหลัง ถ้าเรานำข้อมูลที่ได้จากมุมมองแต่ละด้านนั้นมา
00:29:46.26 และนับจำนวนจุดในช่วงเวลาหนึ่ง -- จำนวนจุดทั้งหมด
00:29:53.20 เมื่อเวลาผ่านไป สิ่งที่คุณเห็นก็คือในกรณีที่ไม่มี ATP อยู่เพียง U1
00:29:58.27 เพิ่มขึ้น และไม่มี snRNPs อื่น ๆ หรือ NTC ที่มีมากจริงๆ
00:30:05.07 เข้าพัก ณ เวลาใดเวลาหนึ่งในกรณีที่ไม่มี ATP ตอนนี้เรามาเรียกใช้ .กัน
00:30:12.16 วงจร spliceosome ทั้งหมด ดังนั้นตอนนี้เราจะเพิ่ม ATP และดูว่าเกิดอะไรขึ้น
00:30:19.17 ตอนนี้ภาพยนตร์เรื่องนี้อยู่ในลำดับเดิม แต่ตอนนี้เราได้เพิ่ม ATP . แล้ว
00:30:25.19 ต่อปฏิกิริยา และถ้าสังเกตดีๆ จะเห็นว่า
00:30:32.06 ลำดับที่ชัดเจนของการเพิ่ม snRNP ในช่วงต้นของภาพยนตร์
00:30:37.03 และหนังวนซ้ำไปเรื่อยๆ จะเห็นว่า U1 ผูกพัน
00:30:42.10 และมาและไป snRNP ถัดไปที่จะสร้างคือ U2 แล้ว
00:30:52.02 หลัง U2 เริ่มเห็น U4, 5 และ 6 ขึ้นมา แล้ว กทช. เรา
00:30:59.10 มองเห็นน้อยลง แต่สะสมมากขึ้นในภายหลังในปฏิกิริยา
00:31:03.24 สิ่งที่คุณเห็นจากหนังเรื่องนี้คือเราสามารถเห็นได้แบบเรียลไทม์
00:31:12.04 snRNP ทั้งสี่เหล่านี้ผูกกับพื้นผิวที่ปกคลุมด้วย
00:31:16.22 โมเลกุลก่อน mRNA และอย่างที่ผมจะแสดงให้คุณเห็นในสไลด์หน้า เราจะเห็น
00:31:23.10 ว่า snRNP ทั้งหมดมีผลผูกพันแบบไดนามิก นั่นคือกำลังมา
00:31:27.08 และไปเพื่อไม่มีใครมาและอยู่อย่างถาวร
00:31:32.07 สิ่งหนึ่งที่คุณสามารถเห็นได้จากภาพยนตร์เหล่านั้น ไม่ใช่แค่เราทำได้
00:31:37.18 เห็นว่า snRNP ทั้งหมดมีผลผูกพันต่อหน้า ATP แต่ไม่เหมือน
00:31:42.11 วงจร spliceosome ที่ฉันแสดงให้คุณเห็นก่อนหน้านี้ด้วยลูกศรทางเดียวทั้งหมด
00:31:47.12 snRNP ทั้งหมดมีผลผูกพันแบบย้อนกลับได้ และเราสามารถเห็นสิ่งนี้โดย -- นี่คือการดู
00:31:52.24 โมเลกุลอาร์เอ็นเอแต่ละโมเลกุล และเรากำลังมองหาความเข้มข้นเมื่อเวลาผ่านไปสำหรับสิ่งนั้น
00:32:00.07 หนึ่งโมเลกุลอาร์เอ็นเอ และคุณคงเห็นว่า U1 ถูกผูกไว้สองครั้ง นี่คือ RNA
00:32:05.16 โมเลกุลโดยที่ U2 สองตัวจับกัน U5 และ NTC เหตุผล
00:32:11.08 เราไม่เพียงแค่เห็นเหตุการณ์ที่ผูกมัดสองครั้งบ่อยครั้งโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ U1 เราจะ
00:32:16.00 ดูสามเหตุการณ์ บางครั้งก็มากถึงสิบเหตุการณ์ เหตุผลที่เรากำลังแสดง
00:32:21.19 ร่องรอยเฉพาะเหล่านี้แสดงให้คุณเห็นว่าการเชื่อมโยงนี้เกิดจากการย้อนกลับได้
00:32:27.09 มีผลผูกพันและไม่ได้เกิดจากการฟอกสี ดังนั้นการฟอกสีด้วยแสงจึงเป็นปัญหาเสมอ
00:32:31.08 ในปฏิกิริยาโมเลกุลเดี่ยวนี้ เพราะภายใต้แสงเลเซอร์ที่เข้มข้น
00:32:36.09 สีย้อมมักจะถูกโฟโต้bleach และจากนั้นก็จะว่างเปล่าและเมื่อไหร่
00:32:41.04 สัญญาณหายไป คุณไม่รู้ว่าเป็นเพราะคอมเพล็กซ์ของคุณมี
00:32:44.13 หายไปจากคลื่นที่ลางออกหรือสีย้อมของคุณถูกโฟโต้ฟอกขาว นี่คือ
00:32:49.02 เหตุใดเราจึงแนบฟลูออโรฟอร์ที่แตกต่างกันสองชนิดเข้ากับ snRNP แต่ละตัวเพราะ
00:32:53.13 เมื่อเราเห็นพฤติกรรมการเหยียบ นี่อาจเป็นเพราะการปล่อยสีย้อม
00:32:58.27 เพราะเราใช้แท็ก DHFR หรือเกิดจากการฟอกสี แต่นั่น
00:33:03.26 หมายความว่าโมเลกุลนี้ซึ่งหายไปในขั้นตอนเดียวจะต้องเป็น
00:33:08.26 โมเลกุลที่หายไป คอมเพล็กซ์ทั้งหมดหายไป เพราะมันมาก
00:33:14.28 ไม่น่าเป็นไปได้ที่คุณจะมีสองขั้นตอนในการฟอกขาวพร้อมกันหรือสองขั้นตอน
00:33:20.02 ขั้นตอนการย้อมสีพร้อมกัน และคุณเห็นว่ามันหายไปแล้ว
00:33:27.28 อีกคนกลับมา นี่เป็นอีกตัวควบคุมหนึ่งที่
00:33:32.13 คุณต้องทำเมื่อคุณทำการทดลองโมเลกุลเดี่ยว ไม่เป็นอะไร
00:33:36.14 ลองนึกย้อนไปถึงหนังพวกนั้น ถ้าเรานับรวม
00:33:41.16 จุดในแต่ละเฟรม แล้วพลอตตัวเลขตรงนี้ และนี่ก็คือ
00:33:46.19 จำนวนสีย้อมต่อโมเลกุลก่อน mRNA ดูได้แล้วใน
00:33:51.02 การปรากฏตัวของ ATP U1 เกิดขึ้นก่อน จากนั้น U2 จากนั้น U5 และ NTC
00:33:58.11 หลังจากนั้น ดังนั้นสิ่งนี้จึงทำให้เรามีขั้นตอนการสั่งซื้อที่ชัดเจนสำหรับ spliceosome
00:34:04.05 ประกอบ และมันก็สอดคล้องกัน แต่ก็ไม่ได้บอกอะไรเราเลย
00:34:09.13 หนึ่งโมเลกุลที่สั่งการประกอบ spliceosome แต่เราทำได้
00:34:15.14 ทดสอบโดยตรงด้วยวิธีโมเลกุลเดี่ยวของเราโดยทำตาม
00:34:20.07 สอง snRNP พร้อมกัน ตอนนี้เรากำลังจะทำการทดลองสามสี
00:34:24.04 ดังนั้นหนึ่งสีบนพรี mRNA หนึ่งสีในกรณีนี้--U2 snRNP
00:34:30.25 และสีอื่นใน U1 และในการทดลองเดียวกันโดยการดู snRNPs เหล่านี้
00:34:36.13 พร้อมกัน เราจะเห็นว่า U1 มาก่อนหรือ U2 มาก่อน?
00:34:43.25 และนี่คือลักษณะที่ข้อมูลเหล่านี้ นี่คือหนึ่งในสิ่งเหล่านี้อีกครั้ง
00:34:48.22 มีร่องรอยของโมเลกุลเดี่ยว แต่นี่คือโมเลกุลก่อน mRNA หนึ่งตัวที่
00:34:53.06 U1 และ U2 มาถึง pre-mRNA เดียวกันในสารสกัดเดียวกัน และคุณจะเห็น
00:34:59.22 ชัดเจนมากว่า U1 มาก่อนแล้ว U2 มา แต่เราสามารถหาปริมาณได้โดย
00:35:07.26 วัดเวลาตรงสำหรับทั้ง U2 และ U1 และรับความแตกต่างนี้
00:35:14.00 น. เวลามาถึงของ U2 ลบเวลาที่มาถึงของ U1 และนั่นคือ
00:35:20.10 เวลาล่าช้าระหว่างทั้งสอง ถ้าจำนวนนั้นเป็นบวก แสดงว่า
00:35:24.24 U2 ตามมาหลัง U1 หากตัวเลขนั้นเป็นลบ แสดงว่า U2 มาก่อน U1
00:35:32.08 แล้วเราก็ดูตัวเลขนี้จากโมเลกุลก่อน mRNA ต่างๆ ได้มากมาย
00:35:38.08 นี่คือสิ่งที่เรียกว่า พล็อตความหนาแน่นของความน่าจะเป็น เป็นกราฟแท่งที่มีความน่าจะเป็น
00:35:45.22 ความหนาแน่นคือความสูงของถังขยะหารด้วยความกว้างของถัง สิ่งสำคัญที่ต้องดู
00:35:51.16 คือว่าที่นี่เรากำลังดูโมเลกุลที่แตกต่างกัน 82 โมเลกุลและเกือบทั้งหมด
00:35:55.20 มีจำนวนบวกสำหรับ tU2 นี้ ลบ tU1 นั่นหมายความว่าเมื่อเกือบ
00:36:02.20 ทั้งหมด U2 ตามมาหลัง U1 ตอนนี้มีไม่กี่แห่งที่ U2
00:36:08.18 เห็นได้ชัดว่ามาก่อน แต่จะสอดคล้องกับจำนวน
00:36:15.16 การติดฉลากสารสกัดของเราเพราะเราไม่สามารถติดฉลากได้อย่างสมบูรณ์ 100%
00:36:20.11 เป็นไปไม่ได้ถ้าสารสกัดของเราไม่ตาย ดังนั้นเราจึงมีประมาณ 90%
00:36:27.05 ประสิทธิภาพการติดฉลากในสารสกัดของเรา และระดับนี้จะสอดคล้องกับ
00:36:31.15 U1 ที่มืดมิดมาก่อน U2 จึงไม่สอดคล้องกับรุ่นที่สั่ง
00:36:39.22 ดังนั้นเราจึงได้ทำสิ่งนี้สำหรับคู่ของเชิงซ้อนทั้งหมด นี่คือ U2 กับ
00:36:46.28 U1. นี่เป็นอีกชุดข้อมูลที่มี 111 โมเลกุล นี่ U5
00:36:52.05 เทียบกับ U2 และนี่คือ NTC เทียบกับ U5 และคุณสามารถเห็นสิ่งเหล่านี้ทั้งหมด
00:36:57.27 เหตุการณ์ส่วนใหญ่ ให้จำนวนบวกกับคุณ ดังนั้น
00:37:04.21 คอมเพล็กซ์ที่สองมาหลังจากคอมเพล็กซ์แรก และนั่นนำเราไปสู่
00:37:11.24 สรุปว่าสำหรับพรี mRNA ที่เราได้ร่วมงานด้วย
00:37:17.07 (และนี่คือ RP51A -- เป็นซับสเตรตการประกบแบบจำลองในยีสต์) ซึ่งเป็นสารตั้งต้นที่สูงมาก
00:37:22.29 สั่งเส้นทางการประกอบกับ U1 ก่อน U2 และ . เกือบทุกครั้ง
00:37:31.19 จากนั้น snRNP สามตัว แล้ว NTC ก็ตามมาหลังจากนั้น แต่สิ่งที่เรารู้ตอนนี้
00:37:37.07 ที่ใหม่ที่เราไม่เคยรู้มาก่อนคือทุกๆ ย่างก้าวของเส้นทางนี้
00:37:42.11 ย้อนกลับได้ นั่นหมายความว่า pre-mRNA ไม่จำเป็น
00:37:52.21 มุ่งมั่นที่จะประกบในขั้นตอนแรกด้วยการเพิ่ม U1 แต่นั่น
00:37:58.17 มีความมุ่งมั่นมากขึ้นเมื่อคุณผ่าน spliceosome
00:38:03.00 น. เส้นทางการชุมนุม นอกจากนี้ในแง่ของการประกบทางเลือกในระบบมนุษย์
00:38:08.20 หากสามารถแยกชิ้นส่วนประกบกันได้ ตัวอย่างเช่น ที่นี่ในภายหลัง
00:38:15.06 แล้วคุณจะจินตนาการได้ว่าคุณสามารถยับยั้งการต่อที่จุดต่อรอยแยกได้
00:38:19.02 ที่ใดก็ได้ตามทางเดินนี้ เพราะมันสามารถถอยหลังได้ตลอดทาง
00:38:23.14 ทางเดินถ้ามันถูกยับยั้ง ดังนั้นสิ่งนี้จึงมีนัยสำคัญต่อความเข้าใจของเรา
00:38:27.24 ของการประกบทางเลือก สุดท้ายนี้ต้องขอบคุณคนที่ทำจริงๆ
00:38:32.13 งาน และเห็นได้ชัดว่าสิ่งที่ซับซ้อนนี้ได้รับข้อมูลจากหลาย ๆ คน
00:38:39.07 ต่างคนต่างไป จากห้องทดลองของฉัน วันนี้ฉันให้คุณดูข้อมูลจากเมลิสสา
00:38:46.28 แอรอน แดนนี่ เอริค จิง และนิค มีส่วนสนับสนุน อีกทั้งงานทั้งหมดนี้ได้ทำใน
00:38:53.28 ร่วมมือกับห้องทดลองของ Jeff Gelles ซึ่งพัฒนา CoSMos
00:38:57.10 เทคโนโลยี โดยเฉพาะแลร์รี่และอเล็กซ์ แล้วก็คอร์นิช
00:39:03.24 ห้องปฏิบัติการ ผู้พัฒนาเทคนิคการติดฉลาก DHFR และสุดท้ายคือ
00:39:08.23 New England Biolabs สำหรับความช่วยเหลือเกี่ยวกับแท็ก SNAP และงานนี้ก็คือ
00:39:14.09 ได้รับทุนจาก HHMI และสถาบันสุขภาพแห่งชาติ ขอบคุณมาก.
00:39:22.07

  • ส่วนที่ 1: การแยกยีนและ RNA Splicing

การประกบทางเลือกและการรักษามะเร็ง

ข้อดีของการสร้างเนื้องอกโดยการประกบทางเลือกไม่จำกัดเฉพาะการเพิ่มจำนวนหรือการปิดกั้นการตายของเซลล์ การประกบแบบผิดวิธียังสามารถให้วิธีการสำหรับการหลีกเลี่ยงการรักษาโดยการเพิ่มฟังก์ชัน ขณะที่เราปรับปรุงความเข้าใจเกี่ยวกับพื้นฐานระดับโมเลกุลของมะเร็งชนิดต่างๆ ขึ้น การพัฒนาสารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กที่มีความจำเพาะสูงได้ให้ผลสำเร็จอย่างมาก 147 เมื่อตรวจพบมะเร็งในคลินิกและเริ่มการรักษา แรงกดดันที่เลือกสรรภายในเนื้องอกมักจะส่งเสริมการดื้อต่อการรักษา ผู้ป่วยเกือบ 80% ที่ลงทะเบียนในการทดลองทางคลินิกระยะที่ 1 สำหรับมะเร็งผิวหนังระยะลุกลามสังเกตเห็นการตอบสนองบางส่วนหรือทั้งหมดต่อ vemurafenib ซึ่งเป็นตัวยับยั้ง BRAF(V600E) 148 ผู้ป่วยจะกำเริบอย่างต่อเนื่อง ทำให้เกิดการดื้อยาผ่านกลไกต่างๆ 149, 150, 151 สิ่งที่น่าสนใจ ในหลอดทดลอง รูปแบบของความต้านทานตัวยับยั้ง ตัวแปร splice แบบใหม่ที่ไม่มี exons 4-8 ได้ส่งเสริม BRAF dimerization และการส่งสัญญาณไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ที่ต้านทาน vemurafenib ผู้ป่วยหกใน 19 รายที่ได้รับความต้านทานต่อ vemurafenib ยังแสดงรูปแบบการต่อสาย BRAF (V600E) ซึ่งบ่งชี้ว่าการต้านทานการรักษาสามารถทำได้ผ่านการประกบที่ผิดปกติ 152

ด้วยข้อมูลที่เกิดขึ้นใหม่ซึ่งเชื่อมโยงกับรูปแบบการประกบกับการอยู่รอด สามารถใช้ข้อมูลนี้เพื่อปรับปรุงการรักษาได้หรือไม่? หากการประกบแบบผิดวิธีนำไปสู่ผลที่ตามมา การแก้ไขการประกบอาจร่วมกับการรักษาแบบเดิม จะทำให้การรอดชีวิตในมะเร็งดีขึ้นหรือไม่ แบบจำลองเมาส์ของกล้ามเนื้อลีบกระดูกสันหลังให้เบาะแสในเรื่องนี้ กล้ามเนื้อลีบกระดูกสันหลังเป็นโรคทางพันธุกรรมที่การสูญเสียโปรตีน SMN ทำให้เซลล์ประสาทสั่งการตายในฮอร์นหน้าของไขสันหลัง ส่งผลให้เกิดความอ่อนแอที่ก้าวหน้าและทำให้ร่างกายทรุดโทรม แม้ว่าจะเกิดจากการกลายพันธุ์ของฟังก์ชันที่สูญเสียไปใน SMN1, 153 ความรุนแรงของโรคถูกปรับโดย paralog SMN2ซึ่งสามารถผลิตโปรตีนทำงานในระดับต่างๆ ได้ ความแปรปรวนในการแสดงออกของฟังก์ชัน SMN2 เกิดจากข้อเท็จจริงที่ว่า exon 7 ถูกข้ามไปเป็นส่วนใหญ่ ส่งผลให้ SMN ไม่ทำงาน 154 โอลิโกนิวคลีโอไทด์ต้านความรู้สึกที่กำหนดเป้าหมายไปยังตัวเก็บเสียงแบบประกบ intronic ถูกนำมาใช้เพื่อแก้ไข SMN2 ประกบและฟื้นฟูการแสดงออกของ SMN ให้การช่วยเหลือระยะยาวที่มีประสิทธิภาพของกล้ามเนื้อลีบกระดูกสันหลังในหนู 155 ถ้าสามารถพัฒนาโอลิโกนิวคลีโอไทด์ต้านความรู้สึกทางเภสัชวิทยาเพื่อให้เกิดการล้มลงที่จำเพาะได้ ในร่างกายแนวทางนี้สามารถมุ่งไปที่ตัวแปรการต่อแบบเฉพาะของเนื้องอกสำหรับการรักษามะเร็ง

ขณะที่การพัฒนาทางเภสัชวิทยาของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ต้านความรู้สึกยังคงดำเนินต่อไป การรักษาแบบเดิมยังคงขับเคลื่อนโดยสารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กและอนุพันธ์ของสารประกอบที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติที่มีฤทธิ์ต้านเนื้องอก Herboxidiene, 156 FR901464 157 และ pladienolides 158 เป็นผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่ปรับส่วนประกอบ spliceosomal สิ่งเหล่านี้เป็นที่สนใจเป็นพิเศษเนื่องจาก IC . นาโนโมลาร์ต่ำของพวกมัน50 และผลต่อเซลล์มะเร็งในเซลล์มะเร็งและแบบจำลองของสัตว์ พวกเขานำไปสู่การพัฒนาอนุพันธ์สังเคราะห์โดยตรง: E7107 จาก pladienolide B, spliceostatin A และ meayamycin จาก FR901464 และ sudemycins ซึ่งเป็นชุดของโมเลกุลที่ออกแบบโดยใช้เภสัชตำรับที่เป็นเอกฉันท์ซึ่งรวบรวมจากความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับกิจกรรมที่รู้จัก (ทบทวนใน Bonnal และคณะ 159 และ เวบบ์ และคณะ 160 ). SF3B ซึ่งเป็นหน่วยย่อยของไรโบนิวคลีโอโปรตีนนิวเคลียร์ขนาดเล็ก U2 ที่อำนวยความสะดวกในการจดจำตำแหน่งรอยต่อ (รูปที่ 6) เป็นเป้าหมายหลักของสารประกอบเหล่านี้ 161, 162 และปรับไม่เพียงแต่การประกบทางเลือกเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการแสดงออกของยีนที่สำคัญต่อการลุกลามของมะเร็งด้วย 163, 164, 165

โดยมีผลต่อการคงอยู่ของอินตรอนหรือการข้าม exon ยาเหล่านี้ในท้ายที่สุดจะนำไปสู่การกระตุ้นของวิถีการสลายตัวที่ไร้สาระเป็นสื่อกลางหรือการผลิตยีนในวัฏจักรเซลล์ที่ไม่ได้ใช้งาน ส่งผลให้เซลล์หยุดทำงาน 161, 162, 166 สิ่งที่น่าสนใจคือ ยาเหล่านี้แสดงผลเฉพาะของเนื้องอกโดยมีความเป็นพิษเพียงเล็กน้อย แม้ว่าจะมีผลในทางทฤษฎีต่อเซลล์ปกติก็ตาม คำอธิบายที่เป็นไปได้ประการหนึ่งคือปริมาณยามีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการหลีกเลี่ยงการยับยั้งการประกบอย่างสมบูรณ์ ซึ่งจะเป็นพิษในระดับสากล ในปริมาณที่เหมาะสม ยาเหล่านี้อาจยังคงมีประสิทธิภาพในการกำจัดการประกบผิดปรกติหรือลดไอโซฟอร์มการประกบที่มีความสำคัญต่อการลุกลามของมะเร็ง ในการตั้งค่านี้ มะเร็งที่ได้รับการควบคุมรูปแบบการต่อแบบทั่วโลกอาจเหมาะสมที่สุดสำหรับการบำบัดด้วยการยับยั้ง spliceosome นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่เนื้องอกที่ขับเคลื่อนบางส่วนผ่านการประกบที่ทำงานผิดปกติอาจมีความไวอย่างมากต่อโมดูเลเตอร์ spliceosomal เหล่านี้ เนื่องจากยาจะย้อนกลับการพึ่งพาการประกบ การศึกษาในอนาคตที่วิเคราะห์รากฐานของโมเลกุลของยาเหล่านี้อาจเปิดเผยเพิ่มเติมเกี่ยวกับบทบาทหน้าที่ของการประกบทางเลือกในมะเร็ง


เอกสารการวางแผน

รายการด้านล่างแสดงเฉพาะต้นฉบับที่วางแผนไว้เท่านั้น กองบรรณาธิการยังไม่ได้รับต้นฉบับเหล่านี้บางส่วน เอกสารที่ส่งไปยังวารสาร MDPI จะต้องได้รับการทบทวน

เชิงนามธรรม: ขั้นตอนแรกในการมองเห็นคือการดูดกลืนแสงโดยโมเลกุลของ photopigment ที่แสดงออกในเซลล์รับแสงของเรตินา เซลล์รับแสงในเรตินาของมนุษย์มี 2 ประเภท ซึ่งมีหน้าที่ในการสร้างภาพ คือ แท่งและโคน ยกเว้นที่ระดับแสงน้อยมากเมื่อแท่งทำงาน การมองเห็นทั้งหมดจะขึ้นอยู่กับรูปกรวย โคนมีหน้าที่ในการมองเห็นที่มีความคมชัดสูงและการมองเห็นสี นอกจากนี้ ยังมีความสำคัญอย่างยิ่งในกลไกการตอบสนองด้วยภาพที่ควบคุมการเจริญเติบโตของดวงตาในช่วงวัยเด็ก เพื่อให้แน่ใจว่าความยาวในแนวแกนของดวงตาตรงกับพลังของส่วนประกอบออปติคัล เพื่อให้ผู้ใหญ่ ผู้คนมีความเอนเอียงและมีการมองเห็นที่โฟกัสได้อย่างสมบูรณ์แบบในมนุษย์ ประมาณ 94% ของโฟโตรีเซพเตอร์รูปกรวยมีความไวต่อความยาวคลื่นยาวและความยาวคลื่นกลาง และสารสีที่ไวต่อแสงของพวกมันจะถูกเข้ารหัสโดย OPN1LW และ OPN1MW ยีนตามลำดับ ยีนเหล่านี้อยู่ควบคู่กันบนโครโมโซม X และมีความเหมือนกันของลำดับนิวคลีโอไทด์มากกว่า 96% และด้วยเหตุนี้ กลไกการรวมตัวใหม่ได้ผสมผสานระหว่าง OPN1LW และ OPN1MW ลำดับของยีน ทำให้เกิดความหลากหลายของฮาโพลไทป์สูง โดยเฉพาะอย่างยิ่งใน exon 3 ซึ่งมีแปดนิวคลีโอไทด์พหุสัณฐาน (SNPs) การผสมผสานเฉพาะของ SNP เหล่านี้ทำให้ exon 3 ข้ามไปในการประกบ pre-mRNA และมีความเกี่ยวข้องกับความผิดปกติของการมองเห็นที่หลากหลาย ซึ่งรวมถึงตาบอดสีแดง-เขียว โมโนโครมสีน้ำเงินรูปกรวย สายตาสั้นระดับสูง และโคนเสื่อม

2. Title :Alternative splicing and hypoxia puzzle in อัลไซเมอร์และโรคพาร์กินสัน

เชิงนามธรรม: การประกบ pre-mRNA ทางเลือกมีบทบาทสำคัญในการขยายความหลากหลายของโปรตีน เนื่องจากสร้างการถอดรหัสจำนวนมากจากยีนที่กำหนดรหัสโปรตีนเพียงตัวเดียว ดังนั้น การเปลี่ยนแปลงกระบวนการนี้จึงนำไปสู่ความผิดปกติทางระบบประสาทของมนุษย์ รวมถึงโรคอัลไซเมอร์และพาร์กินสัน นอกจากนี้ หลักฐานที่รวบรวมได้บ่งชี้ว่าเครื่องจักรประกบมีส่วนอย่างมากต่อความสามารถของเซลล์ในการปรับตัวให้เข้ากับสภาพแวดล้อมภายในเซลล์ที่เปลี่ยนแปลงไปต่างๆ เช่น ภาวะขาดออกซิเจน เป็นที่ทราบกันดีว่าภาวะขาดออกซิเจนมีผลต่อการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีววิทยาหลายอย่าง เช่น การสร้างเม็ดเลือดแดง การสร้างเส้นเลือดใหม่ การสร้างระบบประสาท และเป็นหนึ่งในปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญในการเกิดโรคทางระบบประสาท

ในการทบทวนนี้ เราจะหารือเกี่ยวกับความรู้ในปัจจุบันเกี่ยวกับยีนที่ต่อกันอีกทางหนึ่ง ซึ่งตามที่มีรายงานแล้ว มีความเกี่ยวข้องกับโรคอัลไซเมอร์และโรคพาร์กินสัน นอกจากนี้เรายังนำเสนออิทธิพลที่เป็นไปได้ของสภาพแวดล้อมระดับเซลล์ขนาดเล็กสำหรับการก่อตัวของไอโซฟอร์ม mRNA ที่เอื้อต่อการพัฒนาของโรคทางระบบประสาทเหล่านี้

3. ชื่อเรื่อง: โปรตีนจับ RNA QKI-7 เป็นตัวควบคุมหลักใน vasculopathy เบาหวาน

สังกัด: Wellcome-Wolfson Institute of Experimental Medicine, Queen's University Belfast, BT9 7BL, สหราชอาณาจักร

4. ชื่อเรื่อง: Splicing ข้อบกพร่องในยีนของเซรั่มอัลบูมินของมนุษย์

1 Laboratorio di Nefrologia Molecolare และ 2 UOC Nefrologia e Trapianto Rene, Istituto Giannina Gaslini IRCCS, Via Gaslini 5,16148 GENOVA

3 Department of Molecular Medicine, University of Pavia, Via Taramelli 3b , 27100 PAVIA

เชิงนามธรรม: เซรั่มอัลบูมินของมนุษย์ (ALB) เป็นตัวแทนของโปรตีนในซีรัมที่แพร่หลาย (ประมาณ 35-50 กรัม/ลิตร) ซึ่งทำหน้าที่เป็นพาหะของปัจจัยหลายประการ เช่น สเตียรอยด์ กรดไขมัน ฮอร์โมนไทรอยด์ และสารอื่นๆ อีกหลายชนิด และควบคุมของเหลวนอกเซลล์ ปริมาณ. การเปลี่ยนแปลงของยีน (ALB) อาจส่งผลให้ไม่มีโปรตีนอย่างสมบูรณ์ (ทวารหนักที่มีมา แต่กำเนิด, CAA) หรือในซีรัมไหลเวียนของตัวแปรทางพันธุกรรม (alloalbuminaemia) Alloalbuminaemia ไม่เกี่ยวข้องกับฟีโนไทป์ของโรค ยกเว้นตัวแปรที่ทำให้เกิดภาวะ hyperthyroxinaemia ในครอบครัว dysalbuminemic และ hypertriiodothyroninaemia ซึ่งมีความเกี่ยวข้องทางคลินิก ในทางตรงกันข้าม ผลกระทบทางคลินิกของ CAA เป็นที่รู้จักกันดี จนถึงปัจจุบัน โปรตีน 73 สายพันธุ์และข้อบกพร่องระดับโมเลกุล 28 ตัวที่นำไปสู่ ​​CAA ได้รับการระบุลักษณะในระดับโมเลกุล โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ข้อบกพร่องในการต่อประกบเป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของ CAA และยังรับผิดชอบต่อการมีอยู่ของตัวแปรทางพันธุกรรมสามตัว ในการทบทวนปัจจุบัน เราจะอธิบายอย่างละเอียดถี่ถ้วนถึงข้อบกพร่องในการประกบ 14 ข้อที่ทราบจนถึงขณะนี้ และเมื่อทราบ / เป็นไปได้ ผลกระทบของข้อบกพร่องเหล่านั้นที่ mRNA และที่ระดับโปรตีน การกระจายของข้อบกพร่องเหล่านี้ในลำดับฉันทามติคงที่ไดนิวคลีโอไทด์ GT และ AG ที่จุดประกบ 5&ไพรม์ (ผู้บริจาค) และ 3&ไพรม์ (ตัวรับ) ของอินตรอนถูกกล่าวถึง

คีย์เวิร์ด: ข้อบกพร่องระดับโมเลกุลของอัลบูมินในซีรัมของมนุษย์ alloalbuminaemia แต่กำเนิด analbuminaemia ทางเลือก splicing splice ตัวแปร

5. ชื่อ: การกินความเครียด: บทบาทของ autophagy, ESCRT และการประกบทางเลือกในการตอบสนองต่อความเครียดของเซลล์

เชิงนามธรรม: Autophagy เป็นกระบวนการที่มีการศึกษาอย่างกว้างขวางซึ่งจำเป็นสำหรับการย่อยสลายออร์แกเนลล์ของเซลล์ที่เสียหายหรือการรีไซเคิลชีวโมเลกุลเพื่อรักษาสภาวะสมดุลของเซลล์ กระบวนการของ autophagy เริ่มต้นด้วยการก่อตัวของ autophagosome ซึ่งเป็นโครงสร้างที่ล้อมรอบส่วนประกอบ cytosolic และหลอมรวมกับ lysosome เพื่ออำนวยความสะดวกในการย่อยสลายเนื้อหา autophagosome แม้ว่า autophagy จะมีบทบาทสำคัญในการรักษาสุขภาพของเซลล์ แต่ความผิดปกติของกระบวนการนี้พบได้บ่อยในหลายโรคตั้งแต่มะเร็งไปจนถึงโรคเกี่ยวกับระบบประสาท คอมเพล็กซ์การคัดแยกเอนโดโซมที่จำเป็นสำหรับเครื่องจักรการขนส่ง (ESCRT) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมเหตุการณ์ฟิวชั่นออโตฟาโกโซม และการหยุดชะงักของเครื่องจักรนี้นำไปสู่การสะสมออโตฟาโกโซม การเพิ่มความซับซ้อนอีกชั้นหนึ่งคือการประกบ pre-mRNA ทางเลือกของยีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy โดยที่ไอโซฟอร์มของ mRNA แต่ละตัวอาจมีผลยับยั้งหรือกระตุ้นต่อ autophagy ในการทบทวนนี้ เราสรุปบทบาทที่หลากหลายของเครื่องจักร ESCRT และการประกบทางเลือกในการควบคุม autophagy และการทำงานของพวกมันอาจมีผลกระทบต่อการลุกลามของมะเร็งอย่างไร

6. ชื่อ: การระบุ RNA antisense ใหม่ใน osteosarcoma โอกาสใหม่

เชิงนามธรรม: จีโนมมนุษย์เข้ารหัส RNAs (lncRNAs) ที่ไม่มีการเข้ารหัสตามธรรมชาติหลายพันตัว ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการแสดงออกของยีนควบคุมในหลายระดับ รวมถึงการทำซ้ำ การถอดรหัส และการแปล การไม่ควบคุมของ antisense lncRNAs มีบทบาทสำคัญในความก้าวหน้าทางชีวภาพหลายอย่าง เช่น ความก้าวหน้าของเนื้องอก การแพร่กระจายและการดื้อต่อยารักษาโรค จนถึงปัจจุบัน มีการศึกษาหลายชิ้นที่วิเคราะห์โปรไฟล์การแสดงออกของ lncRNAs ใน osteosarcoma &ndash ไม่เพียงพอที่จะเน้นถึงความซับซ้อนของโรค ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบรูปแบบการแสดงออกของ antisense lncRNAs จากเนื้อเยื่อ osteosarcoma และตัวอย่างกระดูกปกติ (24 ตัวอย่างเนื้องอก -16 กระดูก) โดยการจัดลำดับอาร์เอ็นเอ เราระบุ antisense lncRNAs 15 รายการ (RUSC1-AS1, TBX2-AS1, PTOV1-AS1, UBE2D3-AS1, ERCC8-AS1, ZMIZ1-AS1, RNF144A-AS1, RDH10-AS1, TRG-AS1, GSN-AS1, HMGA2-AS1, ZNF528-AS1, OTUD6B-AS1, COX10-AS1 และ SLC16A1-AS1) ได้รับการควบคุมในตัวอย่างเนื้องอกเมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างกระดูกปกติ นอกจากนี้เรายังระบุการเพิ่มขึ้นของ DANCR และ TUG1 ในตัวอย่างเนื้องอก นอกจากนี้ เราทำปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ (RT-PCR) เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของยีนของ lncRNAs ใน 8 สายพันธุ์ของเซลล์ osteosarcoma ที่แตกต่างกัน (SaOS, G-292, HOS, U2-OS, 143B, SJSA-1, MG- 63, MNNG-HOS) เมื่อเปรียบเทียบกับ hFOB (สายเซลล์เซลล์สร้างกระดูกของมนุษย์) การศึกษานี้อาจช่วยในการค้นพบเครื่องหมายพยากรณ์โรคใหม่และเป้าหมายการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับ osteosarcoma

7. หัวข้อ: บทบาทประกบทางเลือกของจุดตรวจภูมิคุ้มกันในโรคช่องท้อง

เชิงนามธรรม:โรค celiac เป็นความผิดปกติของภูมิต้านทานผิดปกติเป็นโรคที่ปรากฏในการรับสัมผัสและปฏิกิริยาตอบสนองของภูมิคุ้มกันต่อกลูเตน ได้รับการยืนยันแล้วว่าเกี่ยวข้องกับปัจจัยทางพันธุกรรมและสิ่งแวดล้อม ซีดีมีความเกี่ยวข้องอย่างยิ่งกับอัลลีล HLA DQB1*02 หรือ DQB1*0302 ซึ่งจำเป็นแต่ไม่เพียงพอสำหรับการพัฒนาของซีดี และยีนเสี่ยงอื่นๆ ที่ไม่ใช่ HLA ก็มีส่วนทำให้เกิดความอ่อนไหวต่อโรค งานวิจัยหลายชิ้นระบุถึงความเชื่อมโยงหรือความสัมพันธ์ของ CD กับยีนของผู้สมัคร CD28, HLA-G, CTLA4, ICOS และ PD1 ว่าเป็นตัวควบคุมจุดตรวจภูมิคุ้มกันที่สำคัญของกิจกรรมของ T-cell จุดตรวจภูมิคุ้มกันมีความสำคัญต่อการรักษาความอดทนในตนเองและป้องกันเนื้อเยื่อตนเองจากความเสียหายระหว่างการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันอย่างต่อเนื่อง

ในการทบทวนนี้ เราจะหารือเกี่ยวกับชีววิทยาของจุดตรวจภูมิคุ้มกัน การตรวจหาจุดตรวจภูมิคุ้มกันแบบประกบ/ละลายได้เหล่านี้จากผู้ป่วยซีดี ซึ่งแนะนำว่ารูปแบบที่ละลายได้ของโมเลกุล HLA-G, CTLA-4 และ PD1 ที่พบไม่ได้เกิดจากการแตกแยก ของแบบฟอร์มเต็มความยาว เครื่องจักรประกบจะทำหน้าที่เป็นไบโอเซนเซอร์เพื่อปรับการแสดงออกของยีนให้เข้ากับสภาวะทางพยาธิสรีรวิทยา ดังนั้น การควบคุมยีนผิดปกติของยีนเหล่านี้อาจนำไปสู่ความไม่สมดุลของรูปแบบการประกบกันที่มีอยู่ในเซลล์ ณ เวลาใดก็ตาม เปปไทด์ที่ได้จากไกลอะดินจะสามารถปรับการแสดงออกของส่วนประกอบที่เกี่ยวข้องของรอยต่อและหน้าที่ของเครื่องจักรประกบได้

8. ชื่อเรื่อง:การวิเคราะห์อย่างเป็นระบบของรูปแบบการประกบทางเลือกในตัวอย่างเลือดครบส่วนของผู้ป่วยโรคลูปัส Erythematosus

เชิงนามธรรม: การประกบ pre-mRNA เป็นขั้นตอนสำคัญในการแสดงออกของยีน การประกบทางเลือกเพิ่มความซับซ้อนของเอาต์พุตการถอดรหัส แต่ในหลายกรณี อาจนำไปสู่การลดการแปล mRNA หรือการผลิตโปรตีนที่ไม่ทำงานหรือทำงานผิดปกติ จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือเพื่อตรวจหาและกำหนดลักษณะของเหตุการณ์ประกบทางเลือกที่เกิดขึ้นในผู้ป่วยที่เป็นโรค Systemic Lupus Erythematosus (SLE) ซึ่งเป็นโรคภูมิต้านตนเองที่มีลักษณะการผลิต auto-antibodies ในเลือด เพื่อระบุถึงความเชื่อมโยงระหว่าง SLE และการประกบทางเลือก เราได้ดำเนินการระบุจีโนมทั่วๆ ไปและการหาปริมาณของเหตุการณ์การประกบทางเลือกตามข้อมูล RNA-Seq จากตัวอย่างเลือดครบส่วนของผู้ป่วย 142 คนที่มี SLE และผู้ที่มีสุขภาพดี 58 คน เราติดตามสิ่งนี้โดยการวิเคราะห์การทำงานโดยละเอียดของเหตุการณ์การประกบที่กำหนดไว้ที่ระดับของยีนออนโทโลยี การควบคุม และการกำหนดลักษณะเชิงพื้นที่ การศึกษานี้สนับสนุนการเชื่อมโยงที่สมเหตุสมผลระหว่างกระบวนการประกบกับการเกิดโรคของ SLE ซึ่งชี้ให้เห็นว่าองค์ประกอบของเครื่องจักรประกบอาจทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่มีศักยภาพ

9. ชื่อเรื่อง:ทางเลือก RNA Splicing & ndash ม้าโทรจันของเซลล์มะเร็งในเคมีบำบัด

เชิงนามธรรม:ยีนของมนุษย์เกือบทั้งหมดที่คัดลอกมาได้รับการประกบ RNA ทางเลือก ซึ่งเพิ่มความหลากหลายของภูมิทัศน์ของเซลล์ที่เข้ารหัสและไม่เข้ารหัส ผลิตภัณฑ์ยีนที่เป็นผลลัพธ์อาจมีความแตกต่างอย่างชัดเจน และในบางกรณี อาจมีการทำงานที่ตรงกันข้าม ดังนั้น กฎระเบียบที่ผิดปกติของการประกบทางเลือกจึงมีบทบาทสำคัญในการเปลี่ยนแปลง การพัฒนา และการลุกลามของมะเร็ง ซึ่งเป็นข้อเท็จจริงที่สนับสนุนโดยโปรไฟล์การประกบที่แตกต่างกันซึ่งระบุทั้งในเซลล์ที่มีสุขภาพดีและเซลล์เนื้องอก การดื้อยาส่งผลให้การรักษาล้มเหลว ยังคงเป็นความท้าทายที่สำคัญสำหรับการรักษามะเร็งในปัจจุบัน นอกจากนี้ เซลล์เนื้องอกมักจะใช้ประโยชน์จากการประกบ RNA ที่ผิดปกติเพื่อเอาชนะความเป็นพิษของยาเคมีบำบัดที่บริหารให้ ดังนั้น การถอดรหัสตัวแปรการประกบ RNA ทางเลือกในเซลล์เนื้องอกจะให้โอกาสสำหรับการออกแบบการรักษาแบบใหม่และมีประสิทธิภาพในการต่อสู้กับมะเร็งได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น ในการทบทวนปัจจุบัน เราให้โครงร่างที่ครอบคลุมของการค้นพบล่าสุดในการประกบทางเลือกในเนื้องอกที่พบบ่อยที่สุด ได้แก่ ปอด ลำไส้ใหญ่ เต้านม ต่อมลูกหมาก เนื้องอกไกลโอมา HNSCC และมะเร็งในเลือด กลไกระดับโมเลกุลที่พัฒนาขึ้นโดยเซลล์มะเร็งเพื่อส่งเสริมการสร้างเซลล์มะเร็ง เช่นเดียวกับการหลีกเลี่ยงการรักษาด้วยยาต้านมะเร็งและความล้มเหลวของเคมีบำบัดที่ตามมานั้นยังได้กล่าวถึงอีกด้วย เมื่อนำมารวมกัน การค้นพบนี้มอบโอกาสใหม่ๆ สำหรับการศึกษาในอนาคตและการพัฒนาการรักษาแบบเจาะจงเป้าหมายสำหรับตัวแปรการต่อมะเร็งที่จำเพาะ

10. ชื่อทบทวน: การประกบทางเลือกในโรคหัวใจและหลอดเลือด &ndash ความรู้ในปัจจุบันและมุมมองในอนาคต

เชิงนามธรรม:การประกบทางเลือก ตัวขับเคลื่อนของความแปรปรวนหลังการถอดเสียง แตกต่างจากการประกบแบบบัญญัติโดยการจัดเรียงอินตรอนและเอ็กซอนของการถอดเสียงก่อน mRNA ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะในหลากหลายวิธี แม้ว่าการประกบแบบทางเลือกจะถูกค้นพบเมื่อเกือบครึ่งศตวรรษก่อน แต่การประเมินสัดส่วนของยีนที่ได้รับการต่อประกบแบบทางเลือกได้เพิ่มขึ้นอย่างมากในช่วงสองทศวรรษที่ผ่านมา วิธีการจัดลำดับเชิงลึกและอัลกอริธึมชีวสารสนเทศแบบใหม่ได้นำไปสู่ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับความชุกของตัวแปรต่อ รูปแบบการต่อเฉพาะเนื้อเยื่อ และความสำคัญของการประกบทางเลือกในการพัฒนาและโรค จนถึงปัจจุบัน บทบาทของการประกบทางเลือกได้รับการเปิดเผยในพื้นที่ต่างๆ ตั้งแต่การพัฒนาของหัวใจ การตอบสนองต่อภาวะกล้ามเนื้อหัวใจตายจากโรคโครงสร้างหัวใจ RNA แบบวงกลมซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ของ back-splicing ทางเลือกถูกค้นพบครั้งแรกในปี 1976 แต่สิ่งตีพิมพ์ที่สำคัญเพิ่งระบุบทบาทการกำกับดูแล การแสดงออกที่เฉพาะเจาะจงของเนื้อเยื่อ และความอุดมสมบูรณ์ของการถอดรหัส ซึ่งกระตุ้นความสนใจในหัวข้อนี้ขึ้นใหม่ จุดมุ่งหมายของการทบทวนนี้คือเพื่อให้ภาพรวมที่ครอบคลุมของการค้นพบที่มีอยู่เกี่ยวกับบทบาทของการประกบทางเลือกในการพัฒนาหัวใจและโรคหัวใจและหลอดเลือด โดยเน้นที่หลอดเลือด กล้ามเนื้อหัวใจตาย หัวใจล้มเหลว โรคหัวใจและหลอดเลือดและ RNA แบบวงกลมในโรคหัวใจและหลอดเลือด

11. ชื่อเรื่อง: Cancer Spliceome: ผลกระทบจากการทำงานและผลกระทบทางคลินิกในมะเร็งต่อมน้ำเหลือง

เชิงนามธรรม: การประกบ RNA ทางเลือก (AS) เป็นหน้าที่ทางสรีรวิทยาที่จำเป็นซึ่งกระจายโปรตีโอมของมนุษย์ ยีนของมนุษย์ประมาณ 70% ถูกผลิตขึ้นโดย AS และ 95% ของยีน multi-exonic มีรูปแบบการประกบแบบอื่น AS เป็นสิ่งสำคัญในระหว่างการพัฒนาเซลล์ อันที่จริงแล้ว การก่อกวนในการประกบมีส่วนเกี่ยวข้องกับการพัฒนาของมะเร็งหลายชนิดรวมถึงมะเร็งชนิดไมอีลอยด์ Missplicing และ AS ของยีนดาวน์สตรีมที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดโลหิตขาวเป็นกลไกสำคัญที่นำไปสู่การลดระดับโมเลกุลที่ทำให้เกิดโรคของมะเร็งต่อมน้ำเหลือง

ความผิดปกติของการประกบอาจเป็นอิสระจากรอยโรคทางพันธุกรรม หรือปรากฏเป็นผลโดยตรงของการกลายพันธุ์ในส่วนประกอบของเครื่องจักรประกบ RNA เช่น ในกรณีที่มีการกลายพันธุ์บ่อยครั้งเกิดขึ้นในยีนปัจจัยการประกบ (PRPF8, SF3B1, SRSF2 U2AF1, ZRSR2), ตัวควบคุมยีน RNA-splicing (RBM10) และยีนไรโบนิวคลีโอโปรตีนนิวเคลียร์ (HNRNPCL1). นอกจากนี้ เซลล์มะเร็งยังแสดงการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสที่ทำเครื่องหมายไว้ รวมถึงการใช้ไอโซฟอร์ม AS ที่อาจก่อให้เกิดผลกระทบเฉพาะเนื้อเยื่อและการเปลี่ยนแปลงของวิถีทางปลายน้ำ

ความเข้าใจเกี่ยวกับการลดการควบคุมการประกบกันในมะเร็งนั้นได้รับการคาดหมายว่าจะนำไปสู่แนวทางสำหรับการบำบัดด้วย RNA ที่เป็นนวัตกรรมใหม่ในอนาคต

บทความทบทวนของเราจะให้ภาพรวมของวรรณกรรมน้ำเชื้อที่บรรยาย a) AS ในสรีรวิทยาปกติ b) การยกเลิกการควบคุม RNA-splicing ใน oncogenes และ tumor suppressors c) วิธีการกำหนดเป้าหมายความผิดปกติของ splicing d) การผลิตการเปลี่ยนแปลง AS ที่หลากหลายเป็นกลไกใหม่ ของการสร้างนีโอแอนติเจน ส่วนหลังจะรวมบทสรุปของความสำคัญทางคลินิกและผลกระทบของการสร้างนีโอแอนติเจนในยุคของการบำบัดด้วยการปิดกั้นด่านภูมิคุ้มกัน

12. ชื่อเรื่อง: Alternative Splicing Role in New Therapies of Spinal Muscular Atrophy

เชิงนามธรรม: มีการประเมินว่า 80% ของ pre-mRNA ผ่านการประกบทางเลือก ซึ่งเพิ่มการไหลของข้อมูลทางชีววิทยาในกระบวนการของเซลล์อย่างทวีคูณ และสามารถเป็นเป้าหมายการรักษาที่น่าดึงดูดใจ เป็นกลไกสำคัญในการเพิ่มความหลากหลายทางพันธุกรรม การประกบทางเลือกที่ถูกรบกวนนั้นพบได้ในความผิดปกติหลายอย่าง รวมถึงโรคประสาทและกล้ามเนื้อและมะเร็ง

Spinal Muscular Atrophy (SMA) เป็นโรคเกี่ยวกับระบบประสาทเสื่อมแบบ autosomal recessive การลบ Homozygous ใน 5q13 (ขอบเขตที่เข้ารหัสสำหรับยีนการอยู่รอดของเซลล์ประสาทสั่งการ (SMN1)) รับผิดชอบ 95% ของกรณี SMA เกือบเหมือนกัน SMN2 ยีนเนื่องจากการประกบ exon 7 ที่แตกต่างกันไม่ชดเชยการสูญเสีย SMN ที่เกิดจาก SMN1 การกลายพันธุ์ของยีน โปรตีนเซลล์ประสาทสั่งการการรอดชีวิตในระดับต่ำ (SMN) ทำให้เกิดความเสื่อมของเซลล์ฮอร์นหน้าในไขสันหลัง ร่วมกับการทำลายเซลล์อัลฟามอเตอร์และแสดงออกโดยกล้ามเนื้ออ่อนแรงและของเสีย

ทำความเข้าใจกฎระเบียบของ SMN2 กระบวนการประกบ pre-mRNA ทำให้สามารถคิดค้นการรักษาและแนะนำยาใหม่สำหรับ SMA หลังจากอธิบายแนวคิดของการปรับการประกบ การทบทวนนี้จะครอบคลุมความคืบหน้าที่ทำได้ในด้านนี้ โดยเน้นถึงความก้าวหน้าที่ทำได้เมื่อเร็วๆ นี้สำหรับการรักษา SMA โดยใช้กลไกการประกบทางเลือก .


ชีววิทยา

ห้องปฏิบัติการ Barbazuk ใช้จีโนมเชิงคำนวณ เปรียบเทียบและเชิงฟังก์ชันเพื่อศึกษาสถาปัตยกรรม ฟังก์ชัน และวิวัฒนาการของจีโนม เพื่อที่จะตอบคำถามเหล่านี้ จำเป็นต้องมีลำดับจีโนมและแคตตาล็อกของยีนที่เป็นที่ยอมรับและตำแหน่งภายในจีโนม เมื่อมีข้อมูลจีโนมมากขึ้นเรื่อย ๆ วิธีการที่ใช้ในการจัดทำรายการยีนจะมีประสิทธิภาพมากขึ้น และท้ายที่สุด คำถามเกี่ยวกับการจัดระเบียบจีโนม ปฏิสัมพันธ์ของยีน และระเบียบข้อบังคับสามารถแก้ไขได้ ห้องปฏิบัติการของเราทำงานกับพืชผล (โดยเฉพาะข้าวโพดและมะเขือเทศ) แบบจำลอง (Arabidopsis) และจีโนมที่ไม่ใช่แบบจำลอง ซึ่งเราใช้การวิเคราะห์เปรียบเทียบและวิธีการคำนวณเพื่อตรวจสอบโครงสร้างยีน ปริมาณยีน การจัดยีน/จีโนมและระเบียบข้อบังคับ

เรากำลังตรวจสอบ:

ลำดับถัดไปของข้อมูลการถอดรหัสและลำดับจีโนม: เรากำลังใช้ข้อมูลลำดับรุ่นต่อไปจากหลายแพลตฟอร์มเพื่อตรวจสอบและกำหนดลักษณะจีโนมและทรานสคริปต์ ขณะนี้เรามีโครงการที่ใช้เทคโนโลยีลำดับรุ่นต่อไปเพื่อตรวจสอบเนื้อหาของยีน โครงสร้างยีน การแสดงออก การเพิ่ม/การสูญเสียของยีน สถาปัตยกรรมของจีโนม และความหลากหลายของลำดับ

คำอธิบายประกอบของยีนและโครงสร้างยีน: ลำดับจีโนมของพืชเป็นโครงสร้างพื้นฐานด้านความรู้สำหรับพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุลของพืชและการปรับปรุงพืชผลรุ่นต่อไป และจะเป็นรากฐานสำหรับการปรับปรุงพืชผล ผลิตภัณฑ์ของโครงการจัดลำดับโรงงานที่กำลังดำเนินการอยู่และในอนาคตคือคอลเล็กชันของส่วนนิวคลีโอไทด์ที่ต่อเนื่องกันขนาดใหญ่ซึ่งไม่มีความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับเนื้อหาหรือการทำงาน ดังนั้น เครื่องมือคำนวณปริมาณงานสูงที่สามารถระบุยีนได้อย่างแม่นยำภายในลำดับจีโนมจึงจำเป็นอย่างยิ่งสำหรับการทำหมายเหตุประกอบและทำความเข้าใจจีโนมของข้าวโพด ในความร่วมมือกับ Dr. Michael Brent ที่มหาวิทยาลัย Washington กำลังปรับปรุงการทำนายยีนในข้าวโพดและมะเขือเทศโดยระบุ “training set” ของแบบจำลองยีนที่สมบูรณ์และใส่คำอธิบายประกอบ และใช้สิ่งเหล่านี้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพ TWINSCAN TWINSCAN เป็นเครื่องมือค้นพบยีนรุ่นต่อไปที่พัฒนาโดย Michael Brent เดิมทีได้รับการออกแบบมาสำหรับการทำนายยีนของมนุษย์ โดยปรับปรุงการตรวจหายีนโดยบูรณาการแบบจำลองความน่าจะเป็นแบบดั้งเดิม เช่น GENSCAN และ FGENESH พื้นฐานด้วยข้อมูลจากการจัดตำแหน่งระหว่างสองจีโนม

การประกบทางเลือก: การประกบทางเลือก (AS) สร้างการถอดรหัส mRNA หลายรายการจากยีนเดียว แม้ว่า AS จะเป็นที่ทราบกันดีว่ามีส่วนช่วยในการควบคุมยีนและความหลากหลายของโปรตีนในสัตว์ แต่การศึกษาถึงความสำคัญในพืชยังอยู่ในช่วงเริ่มต้น อย่างไรก็ตาม ชุดข้อมูลจีโนมพืชและลำดับการถอดรหัสที่มีอยู่เมื่อเร็วๆ นี้ช่วยให้สามารถวิเคราะห์ AS ทั่วโลกในพืชหลายชนิดได้ ผลการวิเคราะห์จีโนมเผยให้เห็นความแตกต่างระหว่างสัตว์และพืชในความถี่ของการประกบทางเลือก สัดส่วนของยีนพืชที่มีไอโซฟอร์มการถอดรหัสทางเลือกอย่างน้อยหนึ่งตัวอยู่ที่ประมาณ 20% ซึ่งบ่งชี้ว่า AS ในพืชนั้นหาได้ยาก แม้ว่าอัตรานี้จะอยู่ที่

1/3 ของจำนวนนั้นที่สังเกตได้ในมนุษย์ เหตุการณ์ AS ของพืชส่วนใหญ่ไม่ได้ระบุลักษณะการทำงาน แต่หลักฐานแสดงให้เห็นว่า AS มีส่วนร่วมในหน้าที่สำคัญของพืชรวมถึงการตอบสนองต่อความเครียด และอาจส่งผลกระทบต่อการเลือกเลี้ยงและการเลือกลักษณะความพร้อมใช้งานที่เพิ่มขึ้นของข้อมูลลำดับจีโนมของพืชช่วยให้สามารถวิเคราะห์เปรียบเทียบได้มากขึ้นซึ่งจะระบุเหตุการณ์ AS ของพืชที่มีความสำคัญตามหน้าที่โดยพิจารณาจากการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการกำหนดอิทธิพลของการจำลองซ้ำของจีโนมต่อวิวัฒนาการของ AS และค้นพบเฉพาะพืช cis องค์ประกอบที่ควบคุม AS


ดูวิดีโอ: RNA: mRNA u0026 tRNA - Biology (อาจ 2022).