ข้อมูล

สามารถใช้ CRISPR ในการแก้ไขเซลล์หลักได้หรือไม่ ประสิทธิภาพการถ่ายเป็นอย่างไร?

สามารถใช้ CRISPR ในการแก้ไขเซลล์หลักได้หรือไม่ ประสิทธิภาพการถ่ายเป็นอย่างไร?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

บางครั้งผู้คนต้องการใช้เซลล์ปฐมภูมิในการแก้ไขยีน เนื่องจากโดยปกติแล้วเซลล์จะมีลักษณะที่น่าสนใจมากกว่า แต่เราทำได้จริงหรือ


การแก้ไขเซลล์หลักที่ใช้ CRISPR อย่างมีประสิทธิภาพที่สุดที่ฉันเคยอ่านเกี่ยวกับการใช้เทคโนโลยีที่เรียกว่าการแก้ไขเฉพาะที่พัฒนาขึ้นในปี 2019

ค้นหาและแทนที่การแก้ไขจีโนมโดยไม่ต้องแบ่งสายคู่หรือ DNA ของผู้บริจาค (ดาวน์โหลดไฟล์ PDF)

โปรโตคอล CRISPR-Cas9 ปกติเกี่ยวข้องกับการสร้างการแตกหักแบบสองสาย (DSBs) จากนั้นจึงแนะนำเทมเพลตสำหรับการซ่อมแซมที่คล้ายคลึงกันหรืออนุญาตให้เซลล์ซ่อมแซมส่วนที่ขาดโดยไม่มีเทมเพลตซึ่งนำไปสู่การแทรกหรือการลบที่บริเวณรอยโรค การตัดนอกเป้าหมายเป็นเรื่องปกติ ดังนั้น CRISPR-Cas9 ปกติจึงทำให้เกิดการกลายพันธุ์ที่ไม่พึงประสงค์หรือถึงตายในเซลล์ที่ทรานส์เฟกส่วนใหญ่

การแก้ไขเฉพาะจุดใช้ Cas9 ที่บกพร่องด้วยตัวเร่งปฏิกิริยา (สร้างชื่อเล่นแทน DSB) หลอมรวมกับการถอดรหัสแบบย้อนกลับ ฟิวชันโปรตีนถูกนำไปยังเป้าหมายโดยไพรม์เอดิเตอร์ gRNA ("pegRNA") ที่มีโดเมนการกำหนดเป้าหมายปกติที่ปลาย 5' และเทมเพลตสำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับที่ปลาย 3' นิคถูกสร้างขึ้นโดย Cas9 บนเกลียวที่เปิดเผย (เช่น. สแตรนด์ที่ไม่ได้ผูกมัดโดย gRNA) และส่วนที่ 3' ของ pegRNA ถูกไฮบริไดซ์บางส่วนกับด้าน 5' ของนิก โดยให้ปลายอิสระ 5' และ ssRNA ที่ยืดออกสำหรับการเกิดพอลิเมอไรเซชันของ DNA ความละเอียดของ "flap" ที่เป็นผลลัพธ์โดยกลไกการซ่อมแซมนิกภายในทำให้เกิดการแก้ไขที่ไซต์เป้าหมายโดยไม่มี DSB หรือเทมเพลต DNA จากภายนอก

วิธีนี้ได้รับการประเมินประสิทธิภาพในเซลล์หลายประเภท รวมทั้งเซลล์ประสาทเยื่อหุ้มสมองของหนูเมาส์ปฐมภูมิ ซึ่งเป็นเซลล์หลังไมโทติคและมีความแตกต่างในระยะสุดท้าย ผู้เขียนสังเกตการแก้ไขที่ต้องการของ DNMT1 ในเซลล์ 7.1% โดยมีค่าเฉลี่ย 0.58% การแก้ไข Cas9 nuclease ของเซลล์ประเภทเดียวกันโดยใช้ระบบการถ่าย lentivirus เดียวกัน ส่งผลให้โดยเฉลี่ย 31% มีอัตราความผิดพลาดมากกว่าการแก้ไขเฉพาะจุดมากกว่า 50 เท่า


ในทางทฤษฎี เทคโนโลยี CRISPR ไม่ได้ถูกจำกัดโดยเซลล์ของสปีชีส์ แต่เซลล์ปฐมภูมิมีข้อจำกัดในการเคลื่อนที่และการกระโดดของโมโนโคลนอล ดังนั้นโดยทั่วไปแล้วจะเป็นไลน์เซลล์ที่ใช้สำหรับการแก้ไขยีน


เชิงนามธรรม

การแก้ไขจีโนมในเซลล์ของมนุษย์ด้วยนิวคลีเอสที่เป็นเป้าหมายทำให้สามารถประยุกต์ใช้ด้านวิศวกรรมจีโนมสำหรับการทดลองและการรักษาได้หลากหลาย แต่การขยายไปยังเซลล์บีของมนุษย์ปฐมภูมิยังคงมีจำกัด ที่นี่ เรารายงานวิธีการสำหรับพันธุวิศวกรรมเป้าหมายในเซลล์ B ของมนุษย์ขั้นต้น โดยใช้อิเล็กโตรโพเรชันของ CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins (RNPs) เพื่อแนะนำการกลายพันธุ์ที่น่าพิศวงของยีนที่ตำแหน่งการเข้ารหัสโปรตีนที่มีประสิทธิภาพสูง ซึ่งในบางกรณีเกิน 80% นอกจากนี้ เราสาธิตการแก้ไขแบบน็อคอินของนิวคลีโอไทด์เป้าหมายที่มีประสิทธิภาพเกิน 10% ผ่านการส่งเทมเพลตโอลิโกนิวคลีโอไทด์ร่วมกันสำหรับการซ่อมแซมที่เน้นความคล้ายคลึงกัน เราส่งมอบ Cas9 RNPs ในระบบการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองที่แตกต่างกันสองระบบเพื่อให้เกิดการแก้ไขทั้งในเซลล์ B ที่ไม่แตกต่างและเซลล์ B ที่ถูกกระตุ้นซึ่งอยู่ระหว่างการสร้างความแตกต่าง ซึ่งสะท้อนถึงประโยชน์ใช้สอยในสภาวะการทดลองที่หลากหลาย โดยสรุป เราสาธิตเครื่องมือวิจัยที่ทรงพลังและปรับขนาดได้สำหรับการศึกษาทางพันธุกรรมเชิงหน้าที่ของชีววิทยาบีเซลล์ของมนุษย์ที่อาจนำไปใช้เพิ่มเติมในการบำบัดด้วยบีเซลล์ทางวิศวกรรม


การใช้การแก้ไขยีน CRISPR/ Cas9 ในปัจจุบัน

ประสบการณ์ในปัจจุบันของผู้ตอบแบบสำรวจในการแก้ไขยีนด้วยเทคโนโลยี CRISPR/Cas 9 และศักยภาพในการค้นคว้ายามีน้อย กล่าวคือได้ทำการตรวจสอบเบื้องต้นแล้ว ตามมาด้วย 32% ที่จำกัดมาก กล่าวคือ สามเณรสมบูรณ์ 22% ปานกลาง เช่น ประสบการณ์เชิงปฏิบัติ 5% สูง กล่าวคือ ใช้เป็นประจำ และมีเพียง 4% ที่ทันสมัย ​​เช่น ผู้เชี่ยวชาญระดับแนวหน้าของการวิจัยในปัจจุบัน (รูปที่ 1).

ระยะเวลามัธยฐานนับตั้งแต่ผู้ตอบแบบสำรวจได้ตรวจสอบหรือเริ่มใช้เทคโนโลยีการแก้ไขยีน CRISPR/Cas 9 เป็นครั้งแรกคือ 6-12 เดือนที่ผ่านมา (รูปที่ 2) ผู้ตอบแบบสำรวจส่วนใหญ่ (47%) สมัครหรือตั้งใจที่จะใช้การแก้ไขยีน CRISPR/Cas 9 กับพื้นที่การวิจัยพื้นฐานของกระบวนการค้นพบยา ตามด้วยการตรวจสอบเป้าหมาย (ใช้ 18%) การระบุเป้าหมาย (ใช้ 10%) จากนั้นจึงทำการศึกษาทางคลินิกและการสร้างโอกาสในการขาย (ใช้ 9% ทั้งคู่)

พื้นที่การค้นพบยาอื่น ๆ มีเพียง 6% ที่ใช้ (รูปที่ 3).

มะเร็ง/มะเร็งเป็นโรคสำคัญหรือพื้นที่การวิจัยที่มีเป้าหมายมากที่สุดโดยผู้ตอบแบบสำรวจ (กำหนดเป้าหมาย 52%) โดยการแก้ไขยีน CRISPR/Cas 9 ตามด้วยภูมิคุ้มกันวิทยา/โรคอักเสบ/ภูมิต้านตนเอง (กำหนดเป้าหมาย 30%) ประสาทวิทยา/ระบบประสาทส่วนกลาง/การเสื่อมสภาพของระบบประสาท/ความเจ็บปวด (กำหนดเป้าหมาย 27%) โรคเมตาบอลิซึม/เบาหวาน (กำหนดเป้าหมาย 18%) และโรคหัวใจและหลอดเลือด (เป้าหมาย 17%) (รูปที่ 4).

ผู้ตอบแบบสำรวจส่วนใหญ่ (49%) ตอบว่าไม่มี กล่าวคือ พวกเขาไม่ได้ตรวจสอบเทคโนโลยีการแก้ไขยีนอื่นๆ ก่อน CRISPR/Cas 9 จะพร้อมใช้งาน ก่อนหน้านี้ 29% ได้ตรวจสอบการถอดรหัสเอฟเฟกเตอร์เอฟเฟกเตอร์นิวคลีเอสที่คล้ายกับตัวกระตุ้นการถอดรหัส (TALENs) 21% ได้ตรวจสอบการรวมกลุ่มผ่านการรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกัน (เช่น กับ rAAV) 16% ซิงค์ฟิงเกอร์นิวคลีเอส (ZFN) และ 11% วิธีอื่นๆ (รูปที่ 5).


CRISPR | มันทำงานอย่างไร

DNA ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ที่ถูกผูกมัดเป็นคู่ นำคุณกลับไปสู่ชีววิทยาระดับมัธยมปลาย: อะดีนีนจับคู่กับไทมีน (A–T) และกวานีนจับคู่กับไซโตซีน (G–C) นิวคลีโอไทด์ที่ถูกล่ามโซ่อย่างง่ายเหล่านี้สร้างสายโซ่เกลียวคู่ที่ยาวซึ่งเป็นเอกลักษณ์ของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด โซ่เกลียวคู่เหล่านี้สร้างโครโมโซม นิวเคลียส และกำหนดทุกอย่างตั้งแต่สีตาของคุณไปจนถึงความสูงที่เป็นไปได้สูงสุดของคุณ

CRISPR (เรียกอีกอย่างว่า CRISPR-Cas9) ใช้เอนไซม์ Cas9 ซึ่งเป็นโปรตีนที่ผลิตขึ้นตามธรรมชาติในประเภทเซลล์ที่สร้างขึ้นสำหรับการประกบดีเอ็นเอ เพื่อ "เปิดเครื่องรูด" นิวคลีโอไทด์ที่ถูกล่ามโซ่ไว้ที่จุดใดจุดหนึ่ง จากนั้นจึงเปลี่ยนสายนิวคลีโอไทด์ด้วยตัวที่ติดอยู่ ตำแหน่งจะขึ้นอยู่กับข้อมูลที่ตั้งโปรแกรมไว้ล่วงหน้าในเอนไซม์ โดยพื้นฐานแล้วมันจะลอยอยู่ภายในนิวเคลียสจนกว่าจะพบจุดที่ถูกต้อง จากนั้นจึงเริ่มทำงาน

CRISPR ส่งผลต่อเส้นเซลล์อย่างไร

สายพันธุ์ของเซลล์คือการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่จะแพร่กระจายไปตลอดกาลตามเงื่อนไขที่เหมาะสมของพื้นที่และตัวกลาง ตัวอย่างเช่น เซลล์ CHO (เซลล์รังไข่ของหนูแฮมสเตอร์จีน) ถูกใช้อย่างกว้างขวางในการปฏิบัติตั้งแต่การทรานส์เฟกชันไปจนถึงการสร้างยาทางเภสัชกรรมไปจนถึงการผลิตโปรตีนลูกผสม แม้ว่าเซลล์ CHO เหล่านี้จะอยู่ในห้องปฏิบัติการหลักเกือบทุกแห่งทั่วโลก แต่เซลล์เหล่านี้ล้วนมาจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมชนิดเดียวกัน นั่นคือหนูแฮมสเตอร์จีนตัวเมียตัวเดียวกัน

CRISPR สามารถแก้ไขการเพาะเลี้ยงเซลล์ เปลี่ยนรหัสพันธุกรรมเพียงชิ้นเดียว แล้วปล่อยให้การเปลี่ยนแปลงลักษณะทางสัณฐานวิทยาและทางกายภาพปรากฏให้เห็น ดังนั้น สิ่งนี้ทำให้เทคโนโลยี CRISPR มีประโยชน์อย่างเหลือเชื่อสำหรับการแก้ไขจีโนม

ใครใช้ CRISPR

ไม่ใช่แค่นักพันธุศาสตร์และนักชีววิทยาด้านเซลล์เท่านั้นที่แย่งชิงตำแหน่งที่ตาราง CRISPR อันที่จริง อุตสาหกรรมจำนวนมากใช้เทคโนโลยีนี้เพื่อสร้างสายเซลล์ดัดแปลงพันธุกรรม

  • อุตสาหกรรมการเกษตร – นักวิทยาศาสตร์ที่ทำงานให้กับบริษัทด้านการเกษตรกำลังพยายามระบุวิธีการใช้ CRISPR เพื่อดัดแปลงพันธุกรรมพืชผลเพื่อทำทุกอย่างจาก:
    • สร้างผลไม้ที่ไม่ช้ำหรือเปลี่ยนสี
    • ปรับปรุงพืชผลให้รวมถึงคุณสมบัติของสารกำจัดศัตรูพืชตามธรรมชาติ สารกำจัดวัชพืช และสารฆ่าเชื้อรา
    • เสริมสร้างพืชผลเพื่อรองรับพายุต่างๆ (รวมถึงการเปลี่ยนแปลงอย่างช้าๆ ของภาวะโลกร้อน)
    • ปลูกอาหารขนาดใหญ่ขึ้นด้วยสารอาหารที่บรรจุอยู่ใน
    • การสร้างปศุสัตว์ขนาดใหญ่เพื่อผลิตเนื้อสัตว์ต่อสัตว์มากขึ้น
    • โรคอัลไซเมอร์สามารถถ่ายทอดทางพันธุกรรมจากพ่อแม่สู่ลูกได้ ตามความเข้าใจของ NIH :

    "บางกรณีของโรคอัลไซเมอร์ที่เริ่มมีอาการเกิดจากการกลายพันธุ์ของยีนที่สามารถถ่ายทอดจากพ่อแม่สู่ลูกได้ ส่งผลให้เกิดสิ่งที่เรียกว่าโรคอัลไซเมอร์ในครอบครัวในระยะเริ่มแรก (FAD) นักวิจัยพบว่ารูปแบบของโรคนี้อาจเกิดจากการกลายพันธุ์ในยีน APP, PSEN1 หรือ PSEN2 เมื่อยีนเหล่านี้เปลี่ยนแปลงไป ชิ้นส่วนโปรตีนที่เป็นพิษจำนวนมากที่เรียกว่าอะไมลอยด์เบตาเปปไทด์จะถูกสร้างขึ้นในสมอง”

    หากยีนสามารถแยกได้ภายในรหัสพันธุกรรมเอง เป็นไปได้ว่า CRISPR จะสามารถกำจัดหรือเปลี่ยนแปลงยีนเหล่านี้เพื่อหยุดการผลิตอะไมลอยด์เบตาเปปไทด์ได้

    นี่อาจดูเหมือนพลังมากเกินไปที่จะถูกใช้โดยแต่ละกลุ่ม—และบางทีอาจเป็น—อย่างไรก็ตาม การตัดต่อยีนโดยรวมไม่ใช่สิ่งใหม่เอี่ยม มีเครื่องมือแก้ไขยีนอยู่นานก่อนที่ CRISPR จะเข้ามา


    สามารถใช้ CRISPR ในการแก้ไขเซลล์หลักได้หรือไม่ ประสิทธิภาพการถ่ายเป็นอย่างไร? - ชีววิทยา

    การประยุกต์ใช้การรักษาในอนาคตหลายอย่างของ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 และ RNA-guided nucleases ที่เกี่ยวข้องกัน มีแนวโน้มว่าจะต้องใช้พวกมันเพื่อส่งเสริมการกำหนดเป้าหมายของยีน ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการพัฒนาวิธีการที่จัดให้มีส่วนประกอบสามส่วน —Cas9, guide RNAs และแม่แบบการรวมตัวกันใหม่—สู่เซลล์ปฐมภูมิที่แสดงผลอย่างเชี่ยวชาญสำหรับการซ่อมแซมที่เน้นความคล้ายคลึงกัน ที่นี่ เราสาธิตวิธีการส่งรหัสด้วยไฟฟ้า/การถ่ายทอดสัญญาณที่ใช้ mRNA เพื่อแสดงทั้ง Cas9 และ adenoviral E4orf6 และ E1b55k helper proteins ที่กลายพันธุ์ร่วมกับเวกเตอร์ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ adeno (AAV) ที่แสดง RNA ไกด์และเทมเพลตการรวมตัวใหม่ แนวทางใหม่นี้ส่งเสริมการหยุดชะงักของยีนอย่างมีประสิทธิภาพและ/หรือการกำหนดเป้​​าหมายยีนที่ตำแหน่งหลายตำแหน่งใน T-cell ของมนุษย์ปฐมภูมิ โดยแสดงให้เห็นศักยภาพในวงกว้างสำหรับการประยุกต์ใช้ในการแก้ไขยีนการแปล


    ผลลัพธ์และการอภิปราย

    การลบโดยอาศัย CRISPR/Cas9 ของการแสดงออกของ TCRα ที่พื้นผิวใน CD4 + T เซลล์ปฐมภูมิของมนุษย์

    เป็นตัวอย่างที่เป็นตัวแทนของการลบโปรตีนพื้นผิวบน T ลิมโฟไซต์ปฐมภูมิ เราได้เลือก TRAC ยีนเข้ารหัสสายโซ่TCRα ภาพรวมทั่วไปของการตั้งค่าการทดลองแสดงใน รูปที่ 1A และรวมถึงการแยกเซลล์เม็ดเลือดขาว CD4 + T ของมนุษย์ออกจากเลือดส่วนปลาย การถ่ายด้วย RNP ที่ประกอบด้วย Cas9 ลูกผสมและ TRAC gRNAs ที่กำหนดเป้าหมายยีน การกระตุ้น การเรียงลำดับและการวิเคราะห์เซลล์ที่ถูกลบ ชุดย่อยของทีเซลล์ที่ต้องการสามารถแยกออกจาก PBMC ตามการแสดงออกของตัวทำเครื่องหมายพื้นผิวตามที่บรรยายไว้ [4, 18] สำหรับการทดลองที่อธิบายไว้ที่นี่ มีการใช้หน่วยความจำ CD4 + T ลิมโฟไซต์ แต่ได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันสำหรับเซลล์ T ไร้เดียงสา

    (NS) ภาพรวมของเวิร์กโฟลว์การทดลอง ซึ่งรวมถึงการแยกทีเซลล์ออกจากเลือดส่วนปลาย การถ่าย RNP การกระตุ้นเซลล์ การคัดแยก และการวิเคราะห์ปลายน้ำ (NS) หน่วยความจำหลักของมนุษย์ T ลิมโฟไซต์ถูกทรานส์เฟกด้วยโอลิโกนิวคลีโอไทด์เรืองแสง 1-2 ไมโครโมลาร์โดยใช้การตั้งค่านีออนที่ระบุ 24 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชันเซลล์มีชีวิตและประสิทธิภาพของการรวม siGLO ถูกกำหนดหาโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (n = 1) (ค) หน่วยความจำหลักขณะพัก T lymphocytes ของมนุษย์ถูกถ่ายด้วย Cas9 RNP ซึ่งรวมถึง sgRNA ที่แตกต่างกันหนึ่ง สอง หรือสามตัวที่ต้านยีนเดียวกัน (TRAC) และการตั้งค่า Neon ที่ปรับให้เหมาะสม (2200V 20ms 1 ชีพจร) ตำแหน่งของ gRNA ที่สัมพันธ์กับ TRAC ยีนระบุไว้ในโครงร่างด้านบน สี่เหลี่ยมที่มีหมายเลขสีน้ำเงินแสดงถึงเอ็กซอน 24 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน เปอร์เซ็นต์ของการตายของเซลล์ถูกประเมินโดยการย้อมสีแบบมีชีวิต-dead เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีชีวิตตามที่ประเมินโดยเกตที่พารามิเตอร์การกระจายไปข้างหน้าและด้านข้าง (SSC, FSC) ยังถูกระบุอีกด้วย ประสิทธิภาพของการถ่ายทรานส์เฟกชันถูกวัดจากการรวมตัวกันของ tracrRNA เรืองแสง (ATTO + ) (n = 2–6) (NS) เช่นเดียวกับ (C) ยกเว้นว่า 24 ชั่วโมงหลังจากเซลล์การทรานส์เฟกชันถูกกระตุ้นด้วยแอนติบอดีต้าน CD3 และแอนติ-CD28 ที่จับกับจาน 3 วันหลังจากการกระตุ้น ความอยู่รอดของเซลล์ถูกประเมินโดยการย้อมสีแบบมีชีวิต-dead และประสิทธิภาพของการลบ TCR โดยการย้อมสีที่พื้นผิว ซ้าย: การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของการตายของเซลล์และประสิทธิภาพการลบ TCR ในตัวแทนผู้บริจาค ขวา: ผลลัพธ์ของ n = 2 การทดลองอิสระ

    อย่างแรก สภาวะอิเล็กโตรโพเรชันสำหรับทีเซลล์ปฐมภูมิที่แยกออกมาใหม่และพักอยู่ถูกปรับให้เหมาะสมเพื่อให้ได้ประสิทธิภาพการถ่ายสูงและจำกัดการตายของเซลล์ การใช้ฟลูออเรสเซนต์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ (siGLO) เพื่อวัดประสิทธิภาพการถ่ายและแผงการตั้งค่านีออน เราพบว่าเงื่อนไขหลายประการทำให้เซลล์มีชีวิตได้สูง แต่ประสิทธิภาพในการถ่ายต่ำ (เช่น 1350V 10ms 3 พัลส์) ในขณะที่เงื่อนไขอื่นๆ มีประสิทธิภาพดีขึ้นบ้างแต่สูงกว่า การตาย (เช่น 2400V 20ms 1 ชีพจร) สุดท้าย สภาวะระดับกลาง (เช่น 2200V 20ms 1 พัลส์) ให้ความสมดุลที่ดีระหว่างการตายของเซลล์ในระดับปานกลางและประสิทธิภาพสูง (รูปที่ 1B). จากการใช้เงื่อนไขอย่างหลัง เราพบว่าการถ่ายยีน gRNA หนึ่ง สอง หรือสามตัวกับยีนเดียวกัน (TRAC) ไม่เปลี่ยนแปลงการรอดชีวิตของเซลล์หรือประสิทธิภาพของการถ่ายทอดอย่างมีนัยสำคัญ โดยวัดจากเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ ATTO + (รูปที่ 1C) แสดงว่าการเปลี่ยนถ่าย gRNA หลายตัวไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อระบบ ต่อไป เราตรวจสอบผลกระทบต่อการแสดงออกของโปรตีนของการทรานส์เฟก sgRNA ที่ต่างกันหนึ่ง สอง หรือสามตัวกับยีนเดียวกัน เพียงอย่างเดียวหรือรวมกัน เราพบว่าประสิทธิภาพของการลบส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับลำดับของ gRNA แต่ละตัว (รูปที่ 1D). อันที่จริง การรวม gRNA ต่างๆ เข้าด้วยกันทำให้เกิดประสิทธิภาพที่คล้ายกับ gRNA ที่มีประสิทธิภาพที่สุดในการผสม โดยไม่เปลี่ยนแปลงระดับการตายของเซลล์ ในตัวอย่างเฉพาะที่แสดงใน รูปที่ 1DgRNA ทั้งสามมีประสิทธิภาพเพิ่มขึ้น (gRNA 1 ต่ำสุด gRNA 3) สูงสุด) และ gRNA 3 ให้ประสิทธิภาพที่คล้ายคลึงกันไม่ว่าจะใช้เพียงอย่างเดียวหรือใช้ร่วมกับ gRNA อื่น ๆ โดยรวมแล้ว เราได้ปรับสภาวะที่เหมาะสมซึ่งอนุญาตให้แก้ไขยีนอย่างมีประสิทธิภาพในทีลิมโฟไซต์โดยมีการตายของเซลล์จำกัด

    ต่อไป เราประเมินประสิทธิภาพของการลบในทีลิมโฟไซต์พักและกระตุ้น ประสิทธิภาพของการเปลี่ยนถ่ายถูกกำหนดในทุกกรณีโดยการวัดการเรืองแสงที่ได้จาก ATTO-550-tracrRNA (รูปที่ 2A). ในเซลล์ที่พักพิง สามวันหลังจากการทรานส์เฟกชัน มีการลดลงเพียงเล็กน้อยในการแสดงออกของพื้นผิว TCR ที่ประเมินโดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้แอนติ-CD3 แอนติบอดี (รูปที่ 2B). อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้ขึ้นอยู่กับความเสถียรของโปรตีนบนพื้นผิวเป็นหลัก อันที่จริง การลดลงของการแสดงออกที่พื้นผิวของโปรตีนที่มีความเสถียรน้อยกว่า กล่าวคือ β2-ไมโครโกลบูลิน [5] สามารถสังเกตได้ใน >64.9% ของเซลล์แม้จะไม่มีการกระตุ้น (รูปที่ 2B). การแก้ไขยีนเดียวกันในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นทำให้การแสดงออกของ TCR ลดลงเกือบ 60% เมื่อ TRAC การแก้ไขยีน และลดลงประมาณ 30% สำหรับ β2-microglobulin ความคงตัวสัมพัทธ์ของสารเชิงซ้อน TCR ที่พื้นผิวจัดให้มีหน้าต่างโอกาสสำหรับการกระตุ้นทีเซลล์โดยใช้แอนติบอดีต้าน CD3 และแอนติ-CD28 ที่จับกับจานแม้ในเซลล์ที่ประสบความสำเร็จในการลบยีนออกในขณะที่ทรานส์เฟกที่สถานะพัก สามวันหลังจากการทรานส์เฟกชันและสองวันหลังจากการกระตุ้น การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีพบว่า 22.6% ของ CD4 ที่ทรานส์เฟก + ทีเซลล์ปฐมภูมิของมนุษย์สูญเสียการแสดงออกของ TCR ที่พื้นผิว ซึ่งสอดคล้องกับการกำหนดเป้าหมายยีนที่ประสบความสำเร็จ (รูปที่ 2C). เซลล์ที่เหลือ 76.8% รักษาการแสดงออกของ TCR ที่ระดับที่เทียบได้กับเซลล์ควบคุม (ไม่มี RNP) ที่ทรานส์เฟก (รูปที่ 2C). โดยรวมแล้ว เราพบว่าการลบอย่างมีประสิทธิผลโดย CRISPR-Cas9 เป็นไปได้ทั้งใน T lymphocytes ขณะพักและกระตุ้น แม้ว่าประสิทธิภาพโดยรวมจะขึ้นอยู่กับหลายปัจจัย รวมถึงคุณภาพของ sgRNA เป้าหมายและความเสถียรของโปรตีนที่สนใจ

    (NS) ตัวอย่างประสิทธิภาพของการเปลี่ยนถ่าย RNP ในหน่วยความจำ T ลิมโฟไซต์ขณะพัก ซึ่งกำหนดโดยการวัดการเรืองแสงของ tracRNA ที่ติดฉลาก ATTO-550 (สีแดง) สีน้ำเงิน: ไม่มีการควบคุม RNP (อย่างน้อย n = 2) (NS) การแยกโปรตีนบนพื้นผิวตามการถ่าย RNP ในการพักผ่อนและกระตุ้นทีลิมโฟไซต์ของมนุษย์ปฐมภูมิ (n = 1) (ค) การระเหยที่พื้นผิวอย่างมีประสิทธิภาพของคอมเพล็กซ์ TCR ในทีเซลล์พักซึ่งถ่ายด้วย TRAC RNPs ที่กำหนดเป้าหมายยีนและเปิดใช้งาน (อย่างน้อย n = 2) (NS) ภาพรวมของการทดสอบความแตกแยกของ T7 endonuclease I รวมถึงตำแหน่งของ TRAC-กำหนดเป้าหมาย gRNA, การขยาย PCR, นำไปสู่ประชากร DNA แบบผสม, การเปลี่ยนสภาพและการหลอมใหม่, การย่อยด้วย T7 endonuclease I และการหาปริมาณ (จ) ผลลัพธ์ของการทดสอบความแตกแยกของ T7 endonuclease I ที่ดำเนินการบนเซลล์ดังเช่นใน (ค)ไม่เรียงลำดับหรือเรียงลำดับตามนิพจน์ CD3 (n = 2)

    การถ่ายยีน RNP นำไปสู่ประชากรผสมซึ่งการกลายพันธุ์และอินเดลสามารถปรากฏบนอัลลีลหนึ่ง (เฮเทอโรไซโกต) สองอัลลีล (โฮโมไซโกต) หรือไม่มีเลย (ชนิดพันธุ์ป่า) (รูปที่ 2D). ดังนั้นเราจึงประเมินประสิทธิภาพของการกำหนดเป้าหมาย TCRα ที่ระดับของ gDNA โดยการทดสอบความแตกแยกของ T7 endonuclease I วิธีนี้ให้การอ่านค่ากึ่งเชิงปริมาณของเปอร์เซ็นต์ของอัลลีลที่กลายพันธุ์ภายในประชากรเซลล์ผสม [17] และภาพรวมของวิธีการแสดงไว้ใน รูปที่ 2D. โดยย่อ PCR โอลิโกนิวคลีโอไทด์ได้รับการออกแบบเพื่อขยายขอบเขตจีโนม 1153 bp ขนาบข้างตำแหน่งของ gRNA การเปลี่ยนสภาพและการหลอมใหม่ของผลิตภัณฑ์ PCR ทำให้เกิดการก่อรูปของเฮเทอโรดูเพล็กซ์ระหว่างแอมพลิคอนชนิดพันธุ์ป่าและแอมพลิคอนที่กลายพันธุ์ หากการกลายพันธุ์หรืออินเดลมีอยู่อย่างน้อยส่วนหนึ่งของประชากรเซลล์ การย่อยของเฮเทอโรดูเพล็กซ์เหล่านี้ด้วยเอ็นไซม์ T7 endonuclease I นำไปสู่การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ที่มีความแตกแยกซึ่งสามารถแก้ไขได้ด้วยเจลและวัดปริมาณ ความถี่ของการกลายพันธุ์สามารถประมาณได้โดยการเปรียบเทียบกลุ่มควบคุม (ไม่มี T7 เอนโดนิวคลีเอส I) และตัวอย่างจากการทดลอง เพื่อประเมินความถี่ของการดัดแปลงจีโนม (การกลายพันธุ์, อินเดล) ในประชากรทีเซลล์ที่ทรานส์เฟกที่แสดงใน รูปที่ 2C, CD3 + และ CD3 – เซลล์ถูกแยกโดยการเรียงลำดับ และ gDNA ถูกสกัดและใช้สำหรับการทดสอบความแตกแยกของ T7 endonuclease I พบผลิตภัณฑ์ PCR ที่มีขนาดที่คาดไว้ในทุกตัวอย่าง ซึ่งรวมถึงกลุ่มควบคุมที่ไม่มี RNP, ประชากรแบบผสม, ที่ไม่เรียงลำดับ ตลอดจนประชากร CD3 + และ CD3 ที่คัดแยก (รูปที่ 2E). การย่อยด้วยเอ็นไซม์ T7 endonuclease I ทำให้เกิดแถบที่เล็กกว่าสองแถบคือ 724 bp และ 429 bp ซึ่งเด่นชัดที่สุดในประชากร CD3 แต่ยังอยู่ในประชากรผสมและในเซลล์ CD3 + ที่เรียงลำดับ ไม่มีการควบคุม RNP แสดงว่าไม่มีการย่อยที่มีความหมาย การมีอยู่ของผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากการตัดแยกในเซลล์ CD3 + แม้จะมีระดับของการแสดงออกของ TCR ที่เทียบได้กับเซลล์ควบคุมก็ตามมีแนวโน้มเนื่องจากการกลายพันธุ์แบบเฮเทอโรไซกัส (ดังนั้นจึงเหลืออัลลีลที่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์หนึ่งอัลลีล) และ/หรือการกลายพันธุ์และอินเดลเล็กๆ ที่ไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของโปรตีน TCRα ในท้ายที่สุด . ในทางกลับกัน ผลิตภัณฑ์ที่ยังไม่ได้ล้างที่เหลืออยู่ซึ่งถูกสังเกตพบในเซลล์ CD3 น่าจะเกิดจากการหลอมซ้ำของลำดับที่มีการกลายพันธุ์ที่เหมือนกันทุกประการ (รูปที่ 2E). ควรพิจารณาระดับความบริสุทธิ์ของประชากรหลังจากการคัดแยกด้วย อย่างไรก็ตาม เปอร์เซ็นต์ที่คำนวณได้ของการดัดแปลงยีนนั้นสูงกว่าในเซลล์ CD3 ที่เรียงลำดับ ต่ำกว่าในเซลล์ CD3 + และตัวกลางในประชากรผสม ซึ่งสะท้อนถึงฟีโนไทป์ที่สังเกตพบ เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนถ่ายด้วย RNP ช่วยให้สามารถลบโปรตีนที่แสดงออกบนพื้นผิวของ T lymphocytes ปฐมภูมิของมนุษย์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ทั้งการพักและกระตุ้น และการทดสอบความแตกแยกของ T7 endonuclease I เป็นวิธีที่ค่อนข้างรวดเร็วและคุ้มค่า ประมาณการไม่ตรงกันที่เกิดจาก RNP ในทีเซลล์

    ข้อควรพิจารณาสำหรับการลบปัจจัยภายในเซลล์โดยอาศัย RNP และการโคลนทีเซลล์

    การดำเนินการกำหนดเป้าหมายยีนในทีเซลล์ปฐมภูมิของมนุษย์โดยใช้ RNP electroporation นำไปสู่ประชากรเซลล์ที่หลากหลายและต่างกันซึ่งมีสัดส่วนที่แปรผันได้ของชนิดพันธุ์ป่าและอัลลีลที่กลายพันธุ์ของยีนที่สนใจ ตลอดจนการกลายพันธุ์ประเภทต่างๆ ตัวแปรที่มีอิทธิพลต่อเศษส่วนของเซลล์ที่ถูกลบออก ได้แก่ สภาวะอิเล็กโตรโพเรชัน เซตย่อยของทีเซลล์ที่ต้องทำการทรานส์เฟก ไม่ว่าเซลล์จะถูกกระตุ้นหรือพักผ่อนแล้ว และคุณภาพของ gRNA ที่พร้อมใช้งานสำหรับยีนที่สนใจ ซึ่งสามารถออกแบบโดยใช้เครื่องมือต่างๆ ได้มากมาย . gRNA ที่ใช้ในการศึกษานี้ได้รับการออกแบบโดยใช้เครื่องมือออนไลน์ของ Integrated DNA Technologies (www.idtdna.com/CRISPR-Cas9) การออกแบบ gRNA จะต้องได้รับการปรับแต่งให้เข้ากับยีนเป้าหมายแต่ละยีน ขึ้นอยู่กับโครงสร้างของยีน โดยทั่วไป ดีกว่าที่จะกำหนดเป้าหมาย 40% แรกของลำดับการเข้ารหัส เพื่อเพิ่มความน่าจะเป็นที่จะได้รับการกลายพันธุ์ที่สูญเสียฟังก์ชันหลังจากการเข้าร่วมแบบไม่โฮโมโลกัส-end-joining (NHEJ) [19] อย่างไรก็ตาม ในการกำหนดเป้าหมายตำแหน่งเฉพาะของโปรตีน (เช่น โดเมนเร่งปฏิกิริยาหรือโดเมนทรานส์เมมเบรน) หรือไอโซฟอร์มเฉพาะ อาจจำเป็นต้องเลือก gRNA ที่เหมาะสมซึ่งกำหนดเป้าหมายบริเวณเฉพาะเหล่านั้น การใช้ gRNA เดียวสามารถทำให้เกิดอินเดลแบบสุ่มและการกลายพันธุ์ที่เพียงพอต่อการสูญเสียการแสดงออกของโปรตีน (รูปที่ 1).

    การเลือกทีลิมโฟไซต์ซึ่งผ่านการตัดต่อยีนที่ประสบความสำเร็จอาจเป็นเรื่องที่ท้าทาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อเป็นเรื่องของการศึกษาโปรตีนภายในเซลล์ เนื่องจากการคัดแยกเซลล์ การเลือกเซลล์ที่มีชีวิตซึ่งลบยีนที่สนใจได้อย่างมีประสิทธิภาพจึงค่อนข้างตรงไปตรงมาสำหรับโปรตีนบนพื้นผิว ในกรณีของโปรตีนภายในเซลล์หรือ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัส การเลือกเซลล์ที่ถูกดัดแปลงอาจกลายเป็นสิ่งที่ท้าทายอย่างยิ่ง ตัวอย่างเช่น ความพร้อมใช้งานของแอนติบอดีสำหรับการย้อมสีภายในเซลล์อาจยอมให้มีการแยกเซลล์ที่ตายตัวและเซลล์ที่ซึมผ่านได้ ซึ่งอาจมีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์ที่ปลายน้ำที่จำเพาะบางอย่าง แต่ไม่อนุญาตให้มีการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่มีชีวิตและด้วยเหตุนี้การศึกษาการตอบสนองของทีเซลล์ ความเป็นไปได้อีกประการหนึ่งในการเลือกเซลล์ที่มีชีวิตซึ่งลบยีนที่สนใจได้อย่างมีประสิทธิภาพคือการใช้ประโยชน์จากกลไกการซ่อมแซม DNA ที่เหมือนกันโดยตรง (HDR) HDR ช่วยให้สามารถแก้ไขจีโนมได้อย่างแม่นยำผ่านการส่งเทมเพลต HDR (DNA แบบสายเดี่ยวหรือแบบคู่) ร่วมกับ RNP ที่กำหนดเป้าหมายไปยังยีนที่สนใจ แม้ว่าในทางเทคนิคจะมีความท้าทาย แต่ HDR ยอมให้วิศวกรรมของการเปลี่ยนแปลงจีโนม เช่น การแทนที่ฐาน การแทรกหรือการลบลำดับที่บริเวณจีโนมที่กำหนดไว้ รวมถึงการแนะนำไซต์การจำกัดหรือยีนของผู้รายงานทั้งหมด [2, 20, 21] อย่างไรก็ตาม ขั้นตอนนี้ใช้เวลานานกว่าและมีประสิทธิภาพน้อยกว่ามากเมื่อเทียบกับการเปลี่ยนถ่าย RNP ปกติของ T lymphocytes และต้องมีการจัดการเซลล์อย่างกว้างขวาง การคัดเลือกเซลล์ที่มีชีวิตซึ่งไม่มียีนที่เข้ารหัสโปรตีนภายในเซลล์หรือ RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสจึงยังคงเป็นความท้าทายทางเทคนิค ความเป็นไปได้อย่างหนึ่งในทิศทางนี้คือการได้มาซึ่งสำเนาพันธุ์เซลล์เดียวจากทีเซลล์ที่ถูกทรานส์เฟก และเพื่อศึกษาฟีโนไทป์ของพวกมันหลังจากเลือกโคลนที่ถูกลบออกอย่างมีประสิทธิผลโดยการสอบวิเคราะห์ความแตกแยกของ T7 เอนโดนิวคลีเอส I เวิร์กโฟลว์ของการตั้งค่าการทดลองดังกล่าวแสดงใน รูปที่ 3A. โดยสังเขป หลังจากการแยกเซลล์และการทรานส์เฟกชัน ทีเซลล์แต่ละเซลล์ถูกเพาะในเพลต 384 หลุมโดยการจำกัดการเจือจาง และกระตุ้นด้วย PBMC ที่เป็นอัลโลเจเนอิกและไฟโตเฮมักกลูตินินที่ถูกฉายรังสี โดยมี IL-2 เพื่อรักษาการงอกขยาย [4, 15, 22] โคลนแต่ละตัวจะถูกเลือกหลังจาก

    14 วัน ถ่ายโอนในเพลต 96 หลุมที่มีก้น U และขยายเพิ่มเติมก่อนการสกัด gDNA และการวิเคราะห์การทำงาน จากนั้นโคลนแต่ละตัวสามารถเลือกได้ตามเปอร์เซ็นต์ของการดัดแปลงยีนที่กำหนดโดยการสอบวิเคราะห์การตัดแยก T7 เอนโดนิวคลีเอส I (รูปที่ 3B). ข้อเสียเปรียบของขั้นตอนการโคลนมีความเชื่อมโยงอย่างชัดเจนกับหน้าที่ของยีนที่จะต้องถูกลบทิ้ง ตัวอย่างเช่น ถ้ายีนที่สนใจเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเพิ่มจำนวนหรือการอยู่รอดของทีเซลล์ จะไม่มีการโคลนที่ถูกลบออกไป นอกจากนี้ การเพาะเลี้ยงทีเซลล์ในระยะยาวมีลักษณะเฉพาะด้วยการเพิ่มจำนวนอย่างมากมายที่อาจส่งผลต่อฟีโนไทป์ภายใต้การวิเคราะห์ ตัวอย่างเช่น ปริมาณของไซโตไคน์จำเพาะบางตัวที่เซลล์อาจสามารถผลิตได้ [4] โดยไม่คำนึงถึงข้อพิจารณาเหล่านี้ การควบรวมการโคลนทีเซลล์กับการย่อย T7 endonuclease I เป็นวิธีที่มีประสิทธิผลในการเลือกเซลล์ที่เหตุการณ์ที่ประสบความสำเร็จในการแก้ไขยีนเกิดขึ้นและเพื่อให้ได้ประชากรเซลล์ที่เป็นเนื้อเดียวกันหลังจากการลบออก

    (NS) ภาพรวมของเวิร์กโฟลว์การทดลอง ซึ่งรวมถึงการแยกทีเซลล์ออกจากเลือดส่วนปลาย การถ่าย RNP การโคลนและการขยายเซลล์เดียว การคัดกรอง gDNA และการวิเคราะห์การทำงาน (NS) การแสดงแผนผังของขั้นตอนการโคลนนิ่งเซลล์เดียวที่ตามด้วยการสอบวิเคราะห์ความแตกแยกของ T7 เอนโดนิวคลีเอส I

    การลบปัจจัยภายในเซลล์ใน T ลิมโฟไซต์ปฐมภูมิของมนุษย์และการเลือกสำเนาพันธุ์ที่ถูกลบ

    เพื่อเป็นตัวอย่างของปัจจัยภายในเซลล์ที่จะลบ เราเลือก ZC3H12D ยีนการเข้ารหัสสำหรับ Regnase-4 และเอนไซม์ RNase สามารถยับยั้งการแสดงออกของไซโตไคน์อักเสบใน T lymphocytes ของมนุษย์ [4, 23] เราเลือก gRNA สองรายการ โดยทั้งคู่กำหนดเป้าหมายไปที่ exon 1 ของ ZC3H12D, คั่นด้วย 147 bp (รูปที่ 4A). กลยุทธ์การเลือกโคลนเกี่ยวข้องกับ PCR ทั่วทั้งภูมิภาคที่กำหนดเป้าหมายโดย gRNA ทั้งสอง (PCR แบบยาว) ตามด้วย T7 endonuclease I การย่อยอาหาร นอกจากนี้เรายังออกแบบ “PCR แบบสั้น” (ดูด้านล่าง) โดยไพรเมอร์ทับซ้อนกับลำดับของ gRNA (รูปที่ 4B). เนื่องจากเซลล์มีอัลลีลสองอัลลีลสำหรับยีนนี้ การรวมกันทั้งหมดของการกลายพันธุ์/อินเดลจึงเป็นไปได้ในหลักการและสามารถเกิดขึ้นได้ในโฮโม- หรือเฮเทอโรไซโกซิส (รูปที่ 4B). ดังนั้นรูปแบบการย่อยของ T7 endonuclease I ที่คาดหวังจึงซับซ้อนโดยการใช้ gRNA สองตัวพร้อมกันซึ่งสามารถให้ผลลัพธ์ที่แตกต่างกันในอัลลีลทั้งสองสำหรับยีนเดียวกันและสรุปเป็นแผนผังใน รูปที่ 4C. ประการแรก ขนาดที่คาดหวังของผลิตภัณฑ์ PCR สำหรับอัลลีลชนิดไวด์ ZC3H12D คือ 1098 bp และการย่อย T7 endonuclease I จะส่งผลให้ไม่มีผลิตภัณฑ์แตกแยก (รูปที่ 4C, เลน 1 และ 2). ในทางกลับกัน ถ้า gRNA 1 หรือ 2 ทำให้เกิดการกลายพันธุ์หรืออินเดลเล็กมากในไซต์เป้าหมายที่เหมือนกันอย่างสมบูรณ์ในทั้งสอง ZC3H12D อัลลีลและในทุกเซลล์ (สถานการณ์ที่ไม่น่าจะเกิดขึ้น) การทดสอบก็จะส่งผลให้เกิดแถบเดียวที่คล้ายกับไวด์ไทป์ (รูปที่ 4C, เลน 3, 4 และ 5) บ่อยกว่านั้น ส่วนผสมของอัลลีลและอัลลีลชนิดไวด์ที่ดัดแปลงโดย gRNA 1 หรือ 2 อย่างใดอย่างหนึ่งจะมีอยู่ในประชากร และสิ่งนี้จะทำให้เกิดการรวมกันของผลิตภัณฑ์ที่ไม่สะอาดและแยกส่วนตั้งแต่ 455 bp ถึง 643 bp (รูปที่ 4C, เลน 7 และ 8) สุดท้าย หากทั้ง gRNA 1 และ 2 นำไปสู่การลบขอบเขต DNA ที่แทรกแซงระหว่าง gRNA ควรคาดหวังแอมพลิคอน 951 bp (รูปที่ 4C, เลน 9) หากการลบดังกล่าวเกิดขึ้นในอัลลีลทั้งสอง การย่อยด้วยเอนไซม์ T7 endonuclease I จะไม่ทำให้เกิดความแตกแยกเพิ่มเติม (รูปที่ 4C, เลน 10). ในที่สุด การรวมการลบและการกลายพันธุ์ในอัลลีลที่แตกต่างกันจะทำให้เกิดรูปแบบการย่อยที่ซับซ้อนมากขึ้น (รูปที่ 4C, เลน 12 และ 13).

    (NS) การแสดงแผนผังของ ZC3H12D ยีนที่ระบุตำแหน่งของ gRNAs และผลิตภัณฑ์ PCR (NS) ด้านบน: ตำแหน่งของไพรเมอร์ "PCR แบบสั้น" เมื่อเปรียบเทียบกับตำแหน่งของ gRNA และ ZC3H12D ลำดับจีโนม ด้านล่าง: การถ่าย RNP อาจนำไปสู่อัลลีลที่ไม่ได้รับการแก้ไข (WT) แก้ไขเฉพาะที่ตำแหน่งของหนึ่ง gRNA (gRNA 1 หรือ 2) หรือแก้ไขที่ทั้งสองตำแหน่ง (gRNA 1+2) ซึ่งนำไปสู่อัลลีลที่เป็นไปได้ที่แสดง ในแต่ละเซลล์ สามารถผสมกันของอัลลีลสองอัลลีลใดก็ได้ (สีแดง: การดัดแปลงยีน) (ค) การแสดงแผนผังของผลลัพธ์ที่เป็นไปได้ทั้งหมดของการทดสอบความแตกแยก T7 endonuclease I ดำเนินการกับอัลลีลที่แตกต่างกันดังเช่นใน (NS) UD = ไม่ได้แยกแยะ (NS) หลังจากการถ่ายด้วย RBPs ที่กำหนดเป้าหมาย ZC3H12D การโคลนยีนและเซลล์ การโคลนทีเซลล์แต่ละตัวถูกขยาย และวิเคราะห์ gDNA สำหรับการมีอยู่ของอินเดล/การกลายพันธุ์โดยการทดสอบความแตกแยกของ T7 endonuclease I แผงแสดงผลิตภัณฑ์ PCR ก่อน (ซ้าย) หรือหลัง (ขวา) การย่อยด้วยเอนไซม์ T7 endonuclease I แผนภาพความหนาแน่นแสดงการหาปริมาณที่เป็นตัวแทน (สำเนาพันธุ์ตัวแทนจากผู้บริจาคอิสระ 2 ราย) ไม่มี RNP = การจำลองโคลนควบคุมทรานส์เซก (จ) การแสดงแผนผังของผลการจัดลำดับ Sanger ของแถบ PCR สำหรับโคลน 54 และ 55 ที่แสดงในแผง (NS). (NS) เปอร์เซ็นต์การดัดแปลงยีนของโคลนที่วิเคราะห์เป็นin (NS) (n = 35 โคลน) (NS) PCR แบบสั้นเพื่อประเมินการมีอยู่ของการลบ DNA ระหว่าง gRNA ทั้งสอง (n = 12 โคลนจากผู้บริจาคอิสระสองคน)

    หลังจากการประกอบ RNP และการถ่ายเทเซลล์ CD4 + หน่วยความจำ T ที่แยกออกมาใหม่ จะมีการวัดความมีชีวิตและประสิทธิภาพอิเล็กโตรโพเรชัน ในการทดลองเฉพาะนี้ ประสิทธิภาพอิเล็กโตรโพเรชันคือ >97% ในขณะที่ความมีชีวิตคือ >70% จากนั้นทีเซลล์ถูกโคลนโดยการจำกัดการเจือจางที่ 0.5 เซลล์ต่อหลุม จากนั้นเราได้ขยาย 116 โคลนสำหรับ ZC3H12D ตัวอย่างที่ทรานส์เฟก RNP และ 60 โคลนสำหรับตัวอย่างกลุ่มควบคุม ประสิทธิภาพการโคลนคำนวณจากจำนวนโคลนที่มีชีวิตที่แยกได้หลังการเพาะเลี้ยง 14 วัน เทียบกับจำนวนเซลล์ที่เพาะในตอนแรกและเป็น

    11–15%. ประสิทธิภาพการโคลนสามารถได้รับผลกระทบโดยประชากรย่อยที่เลือก เนื่องจากตัวอย่างเช่น ทีลิมโฟไซต์ของหน่วยความจำรวมถึงเซลล์หน่วยความจำเอฟเฟกเตอร์ที่แยกความแตกต่างมากกว่าด้วย ซึ่งอาจมีความยืดหยุ่นมากกว่าที่จะได้รับการเพิ่มจำนวนที่กว้างขวางซึ่งจำเป็นในระหว่างขั้นตอนการทำสำเนาพันธุ์ ประสิทธิภาพการโคลนนิ่งยังเป็นพารามิเตอร์สำคัญที่อาจบ่งชี้การทำงานเบื้องต้นเกี่ยวกับยีนที่กำลังถูกกำหนดเป้าหมาย ตัวอย่างเช่น การกำหนดเป้าหมายของยีนจำเพาะอาจทำให้ขั้นตอนการโคลนนิ่งลดลง ตัวอย่างเช่น ในกรณีของยีนที่สำคัญต่อการเพิ่มจำนวนทีเซลล์หรือการอยู่รอด เมื่อสร้างและขยายแล้ว สามารถใช้สำเนาพันธุ์ทีเซลล์แต่ละตัวเพื่อแยก gDNA และสำหรับการวิเคราะห์เชิงฟังก์ชันและ/หรือการแยก RNA แม้ว่าจำนวนเซลล์ต่อโคลนสามารถเปลี่ยนแปลงได้อย่างมาก แต่สามารถรับเซลล์ได้มากถึง 1x10 6 เซลล์ สำหรับการวิเคราะห์ปลายน้ำ เราเลือกโคลน 34 ตัวที่ได้จากเซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย RNP เทียบกับ ZC3H12D ยีน และ 15 โคลนควบคุม เมื่อใช้ PCR แบบยาวที่อธิบายข้างต้น เราสังเกตว่าโคลนส่วนใหญ่แสดงการดัดแปลงที่ ZC3H12D โลคัส แม้ว่าจะมีขอบเขตต่างกันและมีรูปแบบต่างกัน (แสดงสำเนาโคลนห้าตัวใน รูปที่ 4D). ตัวอย่างเช่น โคลน 53, 54 และ 72 นำเสนอแถบ PCR สองแถบก่อนการย่อย T7 endonuclease I เมื่อเอนไซม์แตกตัว a

    วง 500 bp ชัดเจนขึ้น รูปแบบดังกล่าวสอดคล้องกับอัลลีลหนึ่งที่มีการกลายพันธุ์หรืออินเดลเล็กๆ ที่ไซต์เป้าหมายของ gRNA 1 และอัลลีลอื่นๆ ที่มีการลบขนาดใหญ่ระหว่างไซต์เป้าหมายทั้งสอง (คล้ายกับเลน 11 และ 13 ใน รูปที่ 4C). การจัดลำดับ Sanger ของแถบ PCR สองแถบที่แสดงใน รูปที่ 4D สำหรับโคลน 54 ให้ข้อมูลที่มีค่าเกี่ยวกับการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นในโคลนนี้ สอดคล้องกับผลลัพธ์ของการย่อย T7 endonuclease I เราพบว่าแถบด้านล่างและเล็กกว่าสำหรับโคลน 54 มีการลบ 147 bp อย่างแท้จริง ซึ่งนำไปสู่การกำจัดขอบเขตจีโนมทั้งหมดระหว่าง gRNA ทั้งสอง (การแสดงแผนผังของการจัดลำดับ ผลลัพธ์ใน รูปที่ 4E). การจัดลำดับของโคลน 54 ขนาดใหญ่บนสุดเผยให้เห็นแทนว่าในกรณีนี้ บริเวณที่แทรกแซงระหว่าง gRNA ทั้งสองนั้นตื่นเต้นแล้วใส่กลับเข้าไปใหม่ในทิศทางตรงกันข้าม นำไปสู่การผกผันที่ขัดขวางยีนอย่างมีประสิทธิภาพ แต่ไม่ได้เปลี่ยนขนาด ของวงดนตรีเมื่อเทียบกับไวด์ไทป์ (รูปที่ 4E).

    การวิเคราะห์โคลน 55 เผยให้เห็นรูปแบบที่แตกต่างออกไปโดยมีการสร้าง a

    แถบความถี่ 650 bp ในผลิตภัณฑ์ที่ตัดแยกซึ่งสอดคล้องกับการกลายพันธุ์ที่ gRNA 2 นำเสนอในอัลลีลหนึ่ง ในขณะที่อัลลีลที่สองยังคงไม่ได้รับการแก้ไขหรือมีเพียงการกลายพันธุ์แบบจุดเท่านั้น การจัดลำดับของแถบ PCR จากโคลน 55 เผยให้เห็นการมีอยู่ของการกลายพันธุ์หลายครั้งที่เริ่มต้นในบริเวณใกล้เคียงของ gRNA ทั้งสอง แสดงให้เห็นว่าแม้ว่าโดยรวมแล้วแถบนี้สอดคล้องกับขนาดของชนิดพันธุ์ป่า แท้จริงแล้วมีการกลายพันธุ์ (รูปที่ 4E). ในที่สุด โคลน 67 แสดงให้เห็นการลบขอบเขต DNA ระหว่างตำแหน่งเป้าหมายทั้งสองแทน บนอัลลีลทั้งสอง Because the two alleles contained most likely identical deletions, no cleavage product was observed after T7 endonuclease I digestion (similar to lane 10 in Fig 4C).

    Next, we calculated a quantitative estimate of the percentage of gene modification in 34 modified clones and 10 control clones, as previously described [17]. Briefly, we generated profile plots for each PCR gel lane, with or without digestion with T7 endonuclease I (examples of the profile plots are shown in Fig 4D). The area below each peak was quantified and used to estimate the “fraction cleaved” for each T cell clone analyzed (fraction cleaved = PCR digested/ (PCR undigested + PCR digested)) and subsequently used to calculate the percentage of gene modification [17]. The mean percentage of gene modification obtained from control (no RNP) samples was used to set a threshold (21.7%) below which we considered that no RNP-mediated modification occurred. We found that the majority of modified, experimental clones displayed a percentage of gene modification ranging from

    30 to 53% (Fig 4F). This variability might be related to the sensitivity of this assay that can be affected at all stages, from the efficiency of PCR amplification, to the heteroduplex formation and T7 endonuclease I digestion. Moreover, as for other agarose gel quantification assays, the estimated percentage could be greatly affected by the quality of the gel run and imagining, which have to be standardized as much as possible. Overall, the quantification revealed that most selected clones contained a modified ZC3H12D locus. Clone 114 did not show any cleavage pattern upon T7 endonuclease I digestion, resulted in a percentage of gene modification comparable to the control clones (Fig 4F, red dot) and was therefore considered as unmodified. It is important to notice however, that in T cell clones like clone 67, presenting an identical deletion on both alleles that cannot be digested by the T7 endonuclease I enzyme, the percentages of gene modification were close to the one observed for the wild-type clones (Fig 4F, white dots), suggesting that careful visual inspection of the PCR and digestion patterns for each clone remains crucial.

    As an independent confirmation of the potential deletion between the two gRNAs, we also designed a “short PCR” (schematic in Fig 4A) that can give rise to a product only if the genomic region between the two gRNAs is still intact. The absence of a PCR product from clone 67 and similar clones (e.g. 29, 33) confirmed the absence of the DNA region in between the two gRNAs (Fig 4G). Concordant with the sequencing results, the “short PCR” of clone 54 and 55 showed no or very inefficient amplification due to presence of mutations already within the sites of annealing of the PCR primers, which overlap with the gRNAs (Fig 4B).

    Altogether, we identified T cell clones in which a successful editing of the ZC3H12D gene occurred. The deletion of this gene in primary human T lymphocytes also affected their phenotype and their ability to produce inflammatory cytokines, as we recently reported [4].

    Finally, to assess the general applicability of our method, we applied our workflow to the deletion of the transcription factor T-BET (encoded by the TBX21 gene) in primary human T lymphocytes and we assessed the functional outcome on IFN-γ expression. First, we designed three different gRNAs within the TBX21 locus (Fig 5A), and we transfected primary memory T lymphocytes with a combination of two or three RNPs containing different gRNAs. After single-cell cloning and expansion, the ability of the cells to produce IFN-γ was measured by intracellular staining and revealed a significant reduction in the fraction of IFN-γ-producing clones in all samples transfected with gRNAs against TBX21, as compared to control clones transfected with a scrambled, non-targeting gRNA (Fig 5B). Analysis of the gDNA of some of these clones revealed that gene modifications in the TBX21 locus could be identified as expected (Fig 5C).


    CRISPR-Cas–Based Genome Editing: Technology Overview

    Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and CRISPR-associated (Cas) systems are revolutionizing the field of genome editing. Able to achieve highly flexible and specific targeting, CRISPR-Cas systems can be modified and redirected to become powerful tools for genome editing in many species, including mammalian cells. It is a simple system comprising a catalytic unit, Cas9, and a short noncoding guide RNA (gRNA) that confers target specificity. It is an attractive tool for large-scale genome engineering in a wide variety of hosts. We have developed various CRISPR-Cas9 formats that can be used to edit genomes in a wide variety of cell types, including stem cells. Using these formats we have achieved greater than 50% target-specific DNA cleavage in mouse embryonic stem cells (ESCs) and human iPSCs and ESCs. With so many genomic tools and technologies available, trying to decide which ones to use for your research can be overwhelming. That’s why we’ve simplified the process with this easy to use selection guide.


    Selecting a Transfection Reagent & Transfection Protocols

    With the evolution of transfection protocols and the growing ease of transfections assays, it is essential to select the appropriate transfection reagent to achieve optimum transfection efficiency.

    While considering a suitable transfection reagent, it is important to identify the cell type and culture conditions for the assay. Rare cell cultures, neurons and primary cells are usually harder to transfect and hence will require reagents that can facilitate transfection even in hard-to-transfect cells.

    Furthermore, the reagent levels and the cytotoxicity parameters should also be considered before selecting an appropriate transfection agent. An ideal reagent should have low cytotoxicity and high transfection efficiency for the required cell types.


    Efficient Transfection Method for Primary Cells

    Transfection of primary cells and stem cells is a problem in the laboratory routine and further in tissue engineering and gene therapy. Most methods working effectively for cell lines in culture fail to transfect primary cells. Here we describe the use of the Nucleofector™ technology developed by amaxa biosystems. We were able to transfect primary human melanocytes, human coronary smooth muscle cells, human chondrocytes, and human mesenchymal stem cells with high efficiencies (28.9–45.3%). All primary cell types failed to be transfected satisfactorily by methods based on liposome-mediated transfection in our hands. The viability of the transfected cells varied between 11.2% and 75% in comparison to untreated cells. Only 200,000 cells per transfection sample were needed. In summary, this method presents an effective and fast mean for transfection of primary and stem cells demonstrated by four cell types which are only transfected with low efficiency by other methods.


    การอภิปราย

    In this study, we demonstrate the successful application of RNA-guided CRISPR Cas9 for generating gene disruptions in CHO-K1 cells. The tested sgRNAs for COSMC created indels with a frequency between 13.6% and 47.3% according to MiSeq analysis in a pool of transfected cells with a transfection efficiency of approximately 60%. In comparison, genetic disruption frequency of 3.8% and 6.3% in CHO cells for BAK and BAX, respectively, has been observed using pre-screened ZFNs (Cost et al., 2010 ). With an indel frequency between 11.1% and 42.5% created at the target sites, the tested sgRNAs for FUT8 revealed an activity similar to the high efficiencies observed for COSMC. Selection pressure with LCA furthermore facilitated enrichment of cells exhibiting functional disruptions in the FUT8 gene for each of the four sgRNAs. Together, RNA-guided Cas9 activity was able to generate indels with a relatively high frequency for all eight sgRNAs examined, demonstrating that the Cas9 genome-editing methodology is robust and efficient. With these high efficiencies obtained with CRISPR Cas9 system in CHO cells, it will be worthwhile to investigate the capacity of Cas9-based multiplexing to generate multiple gene disruptions in a single round of modifications. Since Cas9-based multiplexing has successfully been performed in other mammalian cells (Cong et al., 2013 Wang et al., 2013 ), multiplexing using the Cas9 system may as well be a powerful technique in CHO cells.

    The mutations created by the eight sgRNAs were predominantly very short indels (56.5% single or double base pair indels) with a preference for single base pair insertions. Analysis of indel sizes obtained with Cas9 in human cells revealed mainly single base pair deletions (Mali et al., 2013 ). The preference for small single base pair deletions was also observed in another study involving Cas9 in human cells (Wang et al., 2014 ). Interestingly, the preference for single base pair insertions or deletions observed in our study resulted in a high frequency of indels creating frameshifts (85%) within the open reading frame further supporting Cas9 as a highly attractive endonuclease for generating gene disruptions.

    To enable high throughput automated gene disruptions in CHO, the bioinformatics tool “CRISPy” was developed to assist in identification of sgRNA target sites. The sgRNA design tool incorporates additional elements/properties not currently available elsewhere including visualization of sgRNA target sites, detailed off-target information and links to primer design tools. Since off-target indel events have been observed in previous reports on Cas9 in human cells (Fu et al., 2013 Hsu et al., 2013 Wang et al., 2014 ), prescreening sgRNAs for possible off-target effects represents a useful addition to the target design tool box. The CRISPy tool presented here provides upfront off-target analysis of the designed sgRNAs, enabling selection of sgRNAs with the minimal number of possible off-target sites. Furthermore, CRISPy aids researchers in primer design for targeted analysis of off-target effects. We envision incorporating new knowledge on target sequence-dependent activity of sgRNAs as it becomes available in the future.

    In this study, we have been able to enrich the FUT8 knockout population by LCA selection. However, this type of selection is often unavailable and so single cell cloning will be required to obtain cells with the desired gene disruptions. This is commonly achieved through either FACS sorting or limited dilution. These clones must then be analyzed for homozygous populations through screening by fragment analysis and sequencing. However, this process can be time consuming and includes a number of challenges. With the high genome editing efficiency of the Cas9 system, the number of analyzed single cell clones sufficient for obtaining homozygous mutations is expected to be lowered considerably. Thus, the CRISPR Cas9 system holds the potential to significantly decrease the heavy workload involved in generating knockout CHO cell lines.

    Our study demonstrates that design and implementation of Cas9-sgRNA-based genome engineering is straightforward and fast. Additionally, the CRISPR Cas9 system is relatively inexpensive as the Cas9 expression vector is reused and only new sgRNA constructs need to be cloned for every target sequence at the cost of a few oligonucleotides. The high efficiency, robustness, ease of use, and low costs make the CRISPR Cas9 system a highly attractive genome-editing tool for both the academic and industrial community. The introduction of the CRISPR Cas9 system in CHO cells combined with the CRISPy design tool will significantly accelerate the pace of genome editing in CHO cells and enhance the rate of CHO cell line improvement for increasing yields and quality of biopharmaceuticals.

    The authors thank Jae Seong Lee and Bjørn Voldborg for valuable guidance, support, and fruitful discussions. The authors thank Patrice Menard and Sara Petersen Bjørn for technical assistance. In addition, the authors thank Anna Koza for her assistance with the MiSeq experiments. This work was supported by The Novo Nordisk Foundation.

    Additional supporting information may be found in the online version of this article at the publisher's web-site.

    Filename Description
    bit25233-sm-0001-SuppData-S1.docx3.5 MB Supporting Information.

    Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article.