ข้อมูล

2.8: บทนำ - ชีววิทยา

2.8: บทนำ - ชีววิทยา


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

DNA และ RNA เป็นทั้งคู่ กรดนิวคลีอิกซึ่งเป็นกรดโพลีเมอร์ที่แยกได้จากนิวเคลียสของเซลล์ DNA และ RNA สามารถแสดงเป็นสตริงของตัวอักษรอย่างง่าย โดยที่ตัวอักษรแต่ละตัวสอดคล้องกับ a เฉพาะ นิวคลีโอไทด์, ส่วนประกอบโมโนเมอร์ของพอลิเมอร์กรดนิวคลีอิก บทนี้จะทบทวนหลักฐานที่แสดงว่ากรดนิวคลีอิกเป็นสารพันธุกรรม จากนั้นจึงสำรวจโครงสร้างทางเคมีของกรดนิวคลีอิก

Southern blot-hybridizations

หลังจากการแยกโดยอิเล็กโตรโฟรีซิส ชิ้นส่วนดีเอ็นเอจะถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน (ไนลอนหรือไนโตรเซลลูโลส) และตรึงไว้ แบบจำลองของรูปแบบ DNA ในเจลนี้เรียกว่า "blot" โพรบที่ติดฉลากเฉพาะจะถูกผสมเข้ากับ blot เพื่อตรวจจับลำดับที่เกี่ยวข้อง หลังจากที่โพรบที่ถูกผูกไว้อย่างไม่จำเพาะถูกชะล้างออกไป ลูกผสมที่เจาะจงจะถูกตรวจพบโดยการถ่ายภาพรังสีอัตโนมัติของบล็อท

รูปที่ 2.28: แผนภาพของการซับใต้ จีโนมดีเอ็นเอที่ถูกย่อยด้วยเอ็นไซม์จำกัดจะถูกแยกออกมาบนเจลอากาโรส จากนั้น DNA จะถูกถ่ายโอนจากเจลไปยังเมมเบรนไนลอน (แผ่นสีเทา) โดยการซับ DNA ถูกตรึงบนเมมเบรน จากนั้นจึงตรวจสอบด้วยชิ้นส่วน DNA ที่มีฉลากกัมมันตภาพรังสีซึ่งประกอบกับลำดับเป้าหมาย หลังจากล้างอย่างเข้มงวด blot จะถูกฟิล์มเอ็กซ์เรย์เพื่อตรวจจับขนาดกรอบของโพรบที่ถูกผูกไว้ ในกรณีนี้ โพรบจับกับชิ้นส่วนขนาดต่างๆ ในเลน 1, 2 และ 3 ในภาพสุดท้าย สีส้มแสดงถึงตำแหน่งของ DNA ที่ถูกย่อย แต่จริงๆ แล้วไม่พบบนฟิล์มเอ็กซ์เรย์ (Original-J. Locke-CC:AN)

ไซต์ข้อจำกัดสามารถใช้เป็นเครื่องหมายทางพันธุกรรมได้ สามารถระบุข้อ จำกัด ความแตกต่างของความยาวส่วนย่อย (RFLPs) ที่เชื่อมโยงกับสถานที่เฉพาะ สามารถใช้เพื่อ

  1. พัฒนาการทดสอบวินิจฉัยโรค (เช่น โรคเคียว)
  2. ช่วยแยกยีน
  3. ลายพิมพ์ดีเอ็นเอสำหรับตำแหน่งที่แปรผันสูง

ขนาดของดีเอ็นเอและโครโมโซม และวิธีการแก้ไข

รูปต่อไปแสดงมุมมองของโครโมโซมและส่วนดีเอ็นเอบนมาตราส่วนที่แตกต่างกันสี่แบบ ระดับบนสุดเปรียบเทียบขนาดของโครโมโซมที่ไม่บุบสลายจากสิ่งมีชีวิตสี่ตัวที่เราจะพูดถึงในหลักสูตรนี้ ขนาดของโครโมโซมของยีสต์ III จะถูกขยายเพื่อให้สามารถเปรียบเทียบกับจีโนมของไวรัสและพลาสมิดบางตัวที่ใช้กันทั่วไป ถัดไป ให้มุมมองที่มีความละเอียดสูงกว่าของพลาสมิด pBR322 และสุดท้ายคือความละเอียดสูงสุดที่เรามักเกี่ยวข้อง กล่าวคือ ลำดับนิวคลีโอไทด์

รูปที่ 2.29.

การกำหนดลำดับของ DNA และ RNA

แนวทางพื้นฐานคือเพื่อ สร้างชุด DNA ที่ซ้อนกัน เศษชิ้นส่วนที่เริ่มต้นไซต์ทั่วไปและ ลงท้ายด้วย A, G ,C หรือ T. ชุดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ (ติดฉลาก) เหล่านี้ถูกแยกออกจากเจลโพลีอะคริลาไมด์ที่ทำให้เสียสภาพซึ่งมีความละเอียด 1 bp รูปแบบผลลัพธ์ทำให้สามารถอ่านลำดับได้ การดัดแปลงและการย่อยสลายทางเคมีจำเพาะพื้นฐาน พัฒนาโดย Maxam และ Gilbert เป็นแนวทางที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ความแตกแยกจำเพาะของนิวคลีโอไทด์ของ RNA โดยชุดของ Rnases สามารถใช้เพื่อจัดลำดับ RNA ได้ เราจะเน้นไปที่วิธีการหาลำดับดีเอ็นเอที่พบบ่อยที่สุด ซึ่งก็คือการยุติสายโซ่จำเพาะของนิวคลีโอไทด์

NS การสิ้นสุดสายโซ่ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ กระบวนการได้รับการพัฒนาในห้องปฏิบัติการของ Fred Sanger ที่ Cambridge ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ 2', 3' สามารถรวมเข้าไปใน DNA ตามที่กำหนดโดยสายแม่แบบ อย่างไรก็ตาม 3'-OH ที่หายไปจะขัดขวางการเกิดพอลิเมอไรเซชันเพิ่มเติม ดังนั้นสายนิวคลีโอไทด์ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่จะสิ้นสุดที่ เฉพาะฐาน, โซ่สิ้นสุด ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ ปฏิกิริยาจะดำเนินการเพื่อให้ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดลงท้ายด้วย G, C, A หรือ aT แต่ทั้งหมดเริ่มต้นที่เดียวกัน สิ่งนี้จะสร้างชุดผลิตภัณฑ์ที่ซ้อนกันซึ่งความยาวเป็นหน่วยวัดตำแหน่งของ G ทั้งหมดในลำดับเป้าหมาย หรือของ C ทั้งหมด เป็นต้น ดังนั้นเราสามารถอนุมานได้ว่าลำดับเป้าหมายเป็นส่วนเสริม เช่น G ที่ตำแหน่ง 1, T ที่ตำแหน่ง 2, C ที่ตำแหน่ง 3 และ 4 เป็นต้น สำหรับนิวคลีโอไทด์นับร้อยต่อการรัน

ในรายละเอียดเพิ่มเติม ไพรเมอร์เฉพาะจะถูกอบอ่อนไปยังเทมเพลต ต้นน้ำจากภูมิภาคที่จะจัดลำดับ DNA polymerase จะกระตุ้นการสังเคราะห์ DNA ใหม่จากปลาย 3' ของไพรเมอร์นั้น (การยืดตัว) ไพรเมอร์จึงสร้างจุดสิ้นสุดร่วมกันสำหรับชิ้นส่วนผลิตภัณฑ์ทั้งหมด (นี่เป็นพื้นฐานสำหรับชุดที่ซ้อนกันในแนวทางนี้)

DNA สังเคราะห์นั้นติดฉลากด้วยนิวคลีโอไทด์กัมมันตภาพรังสี เช่น [a35S]deoxy‑thio‑ATP หรือสีย้อมเรืองแสง ซึ่งมักติดอยู่กับไพรเมอร์

ตัวต่อปลายสายโซ่จำเพาะของเบสจะรวมอยู่ในปฏิกิริยาแต่ละอย่างจากสี่ปฏิกิริยา:

  • 2',3' dideoxyGTP ในปฏิกิริยา "G"
  • 2',3' dideoxyATP ในปฏิกิริยา "A"
  • 2',3' dideoxyTTP ในปฏิกิริยา "T"
  • 2',3' dideoxyCTP ในปฏิกิริยา "C"

ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสจะยืดออกจากไพรเมอร์ที่ผ่านการอบอ่อนแต่ละตัวจนกว่าจะรวมไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ 2', 3' ไม่สามารถเติมนิวคลีโอไทด์เพิ่มเติมลงในผลิตภัณฑ์นี้ได้ เนื่องจากไม่มี 3' OH จึงเป็นตัวเชื่อมต่อแบบลูกโซ่ การสิ้นสุดนี้เกิดขึ้นที่เรซิดิว G เท่านั้น (ประกอบกับของ C ในแม่แบบ) ในปฏิกิริยา "G" เฉพาะที่เรซิดิว A ในปฏิกิริยา "A" เท่านั้น เป็นต้น ดังนั้นผลิตภัณฑ์ของแต่ละปฏิกิริยาจึงประกอบรวมด้วยชุดของชิ้นส่วนที่ซ้อนกัน โดยมี สีรองพื้นเฉพาะที่ปลาย 5' และปลายสายโซ่เฉพาะฐานที่ปลาย 3' ผลิตภัณฑ์ได้รับการแก้ไขบนเจลซีเควนซ์ สัมผัสกับฟิล์มเอ็กซ์เรย์และอ่านลำดับ ดังในรูปที่ 2.30

รูปที่ 2.30. การจัดลำดับการสิ้นสุดสายโซ่ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์

วิธีการสิ้นสุดสายโซ่ไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์เป็นวิธีการที่ใช้ใน เครื่องซีเควนเตอร์อัตโนมัติ. สีย้อมเรืองแสงที่แตกต่างกัน (มักจะติดอยู่กับสีรองพื้น) จะรวมอยู่ในปฏิกิริยาจำเพาะของเบสแต่ละชนิด ดังนั้นผลิตภัณฑ์ของทั้งสี่สามารถทำงานได้ใน 1 เลนของเจลสำหรับการแยกสาร ทำให้สามารถวิเคราะห์ชุดลำดับ >20 ชุดในคราวเดียว เลเซอร์จะสแกนอย่างต่อเนื่องตามโซนหนึ่งของเจล และบันทึกเมื่อตรวจพบการเรืองแสงสีแดง เขียว น้ำเงิน หรือเหลืองในแต่ละเลน หมายความว่าไพรเมอร์ขยายไปถึง (เช่น) A, G, C หรือ T คือ ผ่านเขตการตรวจจับ ข้อมูลเหล่านี้จะได้รับการประมวลผลโดยอัตโนมัติ และค่าที่อ่านได้จะถูกสร้างขึ้นโดยมีค่าสูงสุดสำหรับสีย้อมเรืองแสงแต่ละสีตามหน้าที่ของเวลาที่เจลทำงานและลำดับที่อนุมาน ตัวอย่างของผลลัพธ์แสดงเป็นขาวดำด้านล่าง เอาต์พุตดั้งเดิมเป็นสี (สีต่างกันสำหรับนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว) การแก้ไขลำดับการอนุมานด้วยตนเองสามารถทำได้โดยอิงตามข้อมูลดิบ แต่ในโครงการจัดลำดับขนาดใหญ่ แต่ละภูมิภาคจะถูกกำหนดประมาณ 8 เวลาที่แตกต่างกัน และซอฟต์แวร์อื่นๆ จะใช้เพื่อกำหนดนิวคลีโอไทด์ที่เกิดขึ้นบ่อยที่สุดในแต่ละตำแหน่ง

ความสามารถของเครื่องจัดลำดับอัตโนมัตินั้นไม่ธรรมดา เครื่องจักรใหม่ที่ใช้ capillary gel electrophoresis เพื่อสร้างนิวคลีโอไทด์นับล้านต่อวันในศูนย์การจัดลำดับหลัก เทคโนโลยีนี้ช่วยให้สามารถจัดลำดับจีโนมที่มีขนาดใหญ่และซับซ้อนได้อย่างรวดเร็ว ตามที่กล่าวไว้ในบทที่ 4

รูปที่ 2.31. ตัวอย่างผลลัพธ์จากการจัดลำดับไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์แบบอัตโนมัติ ตัวอย่างผลลัพธ์ของการจัดลำดับ DNA ของการยุติลูกโซ่แบบอัตโนมัติ (CC BY-SA 3.0; อบิซาร์ ลักดาวัลละ )

Supercoiling ของ DNA ที่มีข้อ จำกัด ทางทอพอโลยี

DNA แบบปิดเชิงทอพอโลยีอาจเป็นแบบวงกลม (วงปิดแบบโควาเลนต์) หรือลูปที่ถูกจำกัดที่ฐาน การม้วน (หรือพัน) ของ DNA ดูเพล็กซ์รอบแกนของมันเองเรียกว่า supercoiling (รูปที่ 2.32 กลาง)

  • เชิงลบ supercoils บิด DNA รอบแกนของมันในทิศทางตรงกันข้ามจากการหมุนตามเข็มนาฬิกาของเกลียวคู่ที่ถนัดขวา (R-H)
  • DNA supercoiled เชิงลบคือ บาดแผล (และด้วยเหตุนี้จึงชอบการคลี่คลายเพล็กซ์)
  • DNA supercoiled เชิงลบมี R-H supercoil turns (รูปที่ 2.32)
  • เชิงบวก supercoils บิด DNA ไปในทิศทางเดียวกับการหมุนของเกลียวคู่ R-H
  • DNA supercoiled เชิงบวกคือ ท่วมท้น (เกลียวเป็นแผลแน่นขึ้น)
  • DNA supercoiled ในเชิงบวกมี L-H supercoil turns

การหมุนตามเข็มนาฬิกาของเกลียวคู่ R-H (รูปแบบ A หรือ B) ทำให้เกิดผลบวก บิด (NS); ดูรูปที่ 2.32 ทางซ้าย การหมุนตามเข็มนาฬิกา (ccw) ของ L-H helix (Z ) ทำให้เกิด T เป็นลบ

NS= บิดตัวเลข

  • สำหรับ DNA รูปแบบ B มันคือ + (# bp/10 bp ต่อการบิด)
  • สำหรับ DNA รูปแบบ A มันคือ + (# bp/11 bp ต่อการบิด)
  • สำหรับ Z DNA มันคือ - (# bp/12 bp ต่อการบิด)

W= บิดเบี้ยว ตัวเลขคือการหมุนแกนของดีเอ็นเอ เพล็กซ์ ในที่ว่าง

  • โมเลกุลที่ผ่อนคลาย W=0
  • supercoils เชิงลบ W เป็นลบ
  • supercoils บวก W เป็นบวก

หลี่= ลิงค์เบอร์= จำนวนครั้งที่เกลียวคู่หนึ่งเกลียว (ของโมเลกุลปิด) หนึ่งเส้นล้อมรอบ (หรือลิงก์) อีกเส้นหนึ่ง

[L = W + T]

  • L ไม่สามารถเปลี่ยนแปลงได้เว้นแต่เส้นใยหนึ่งเส้นหรือทั้งสองเส้นจะขาดและกลับเนื้อกลับตัว
  • การเปลี่ยนแปลงหมายเลขการเชื่อมโยง DL ถูกแบ่งพาร์ติชันระหว่าง T และ W (รูปที่ 2.32 ทางขวา) ดังนั้น:

[DL=DW+DT]

ถ้า (DL = 0), (DW=-DT)

รูปที่ 2.32. ความสัมพันธ์ระหว่าง supercoiling กับการบิด ภาพวาดแสดงความแตกต่างระหว่างโครโมโซม DNA แบบวงกลม (พลาสมิด) ที่มีการบิดเกลียวรองเท่านั้น และโครโมโซมที่มีการบิดเกลียวเหนือชั้นขั้นตติยภูมิเพิ่มเติมที่วางทับบนขดลวดทุติยภูมิ (CC BY-SA 3.0; JoKalliauer)

Ethidium Bromide แทรกแซงใน DNA และ untwists (หรือคลายออก) ดูเพล็กซ์โดย -27° ต่อโมเลกุลของเอธิเดียมโบรไมด์ที่มีการสอดแทรก ดังนั้นการสอดแทรกของ 14 โมเลกุลของเอทิเดียมโบรไมด์จะคลายการบิดตัวของเพล็กซ์โดย 378o นั่นคือ บิดเต็มที่มากกว่าหนึ่งรอบเล็กน้อย (ซึ่งจะเป็น 360°) สำหรับกระบวนการอินเทอร์คาเลชันนี้ DL=0 เนื่องจากไม่มีพันธะโควาเลนต์ใน DNA ถูกทำลายหรือถูกปฏิรูป การเปลี่ยนแปลงในการบิด DT เป็นค่าลบ ดังนั้น DW จึงเป็นค่าบวก ดังนั้นการแทรกสอดของเอทิเดียมโบรไมด์จึงสามารถคลายวงกลมที่มีขดลวดยวดยิ่งในเชิงลบ และการแทรกซ้อนเพิ่มเติมจะทำให้ดีเอ็นเอมีขดลวดยิ่งยวดในทางบวก (รูปที่ 2.33)

รูปที่ 2.33.

มีประโยชน์ที่จะมีนิพจน์สำหรับซุปเปอร์คอยล์ที่ไม่ขึ้นกับความยาว NS ความหนาแน่นยิ่งยวด เป็นเพียงจำนวนรอบ superhelical (S.H. ) ต่อเทิร์น (หรือบิด) ของเกลียวคู่

[ ext{ความหนาแน่นยิ่งยวด} = s= dfrac{W}{T}]

นี่คือ -0.05 สำหรับ DNA ของแบคทีเรียตามธรรมชาติ กล่าวคือ ใน DNA ของแบคทีเรีย มี S.H. เชิงลบ 1 ตัว เทิร์นต่อ 200 bp (คำนวณจาก 1 เทิร์นลบ S.H. ต่อ 20 บิด = 1 เทิร์น S.H. เชิงลบต่อ 200 bp)

DNA supercoiled เชิงลบมีพลังงานที่เก็บไว้ซึ่งช่วยในการคลี่คลายหรือเปลี่ยนจากรูปแบบ B เป็น Z DNA

สำหรับ NS = -0.05, (Delta G=-9 Kcal/mole) ซึ่งชอบการคลายตัว

ดังนั้น supercoiling เชิงลบจึงสามารถสนับสนุนการเริ่มต้นการถอดรหัสและการเริ่มต้นการจำลองแบบ

โทพอยโซเมอเรส

Topoisomerases กระตุ้นการเปลี่ยนแปลงในจำนวนที่เชื่อมโยงของ DNA

  • Topo I = เอ็นไซม์ปิดนิ๊ก, สามารถคลาย DNA supercoiled บวกหรือลบ, ทำให้แตกชั่วคราวใน 1 เส้น อี โคไล Topo I คลาย DNA supercoiled เชิงลบโดยเฉพาะ ลูกวัว ไธมัส Topo I ทำงานกับ DNA supercoiled ทั้งทางลบและทางบวก
  • Topo II = gyrase: ใช้พลังงานของ ATP hydrolysis เพื่อสร้าง supercoils เชิงลบ กลไกการออกฤทธิ์ของมันคือการทำให้สายสองเส้นขาดชั่วคราว ส่งผ่าน DNA ดูเพล็กซ์ผ่านการแตกหัก จากนั้นจึงปิดผนึกรอยแยกอีกครั้ง
การวัดการเปลี่ยนแปลงในการเชื่อมโยงจำนวน

สามารถวัดการเปลี่ยนแปลงในจำนวนการเชื่อมโยง (DL) โดยการตกตะกอน อิเล็กโตรโฟรีซิส หรือกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ดังแสดงในรูปที่ 2.34

รูปที่ 2.34.