ข้อมูล

14.3: ตัวรับ 7-TM (G-protein-coupled) - ชีววิทยา

14.3: ตัวรับ 7-TM (G-protein-coupled) - ชีววิทยา



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

7-transmembrane receptors หรือ G-protein-coupled receptors เป็นตระกูลโปรตีนที่ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ 7 ครั้งอย่างไม่น่าแปลกใจ ขั้วอะมิโนอยู่นอกเซลล์และปลายคาร์บอกซิลอยู่ในเซลล์ รูป (PageIndex{2}) แสดงขอบเขตของเมมเบรนที่กระจายออกไปเพื่อความชัดเจน แต่ที่จริงแล้วโดเมนของเมมเบรนจะรวมกันเป็นทรงกระบอกมากกว่า

โปรตีน 7-TM ถูกใช้เป็นตัวรับสารสื่อประสาท เช่น เอพิเนฟริน (ตัวรับ β-adrenergic), อะเซทิลโคลีน (ตัวรับมัสคารินิก) และเซโรโทนิน เช่นเดียวกับฮอร์โมน เช่น กลูคากอนหรือฮอร์โมนกระตุ้นต่อมไทรอยด์ และแม้แต่ลิแกนด์ที่ไม่ใช่โมเลกุล เช่น แสง ! Rhodopsins เป็นคลาสของตัวรับ 7-TM ที่ถูกกระตุ้นเมื่อพวกมันดูดซับโฟตอน (Figure (PageIndex{5})) การกระตุ้นตัวรับในตระกูลนี้ ไม่ว่าจะโดยโฟตอนหรือโดยการจับลิแกนด์แบบธรรมดา ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเชิงโครงสร้างในโดเมนไซโตพลาสซึมที่เปลี่ยนปฏิสัมพันธ์ระหว่างรีเซพเตอร์และโปรตีนเชิงซ้อนที่รู้จักกันในชื่อโปรตีน G แบบเฮเทอโรไตรเมอร์

โปรตีน G แบบ heterotrimeric ประกอบด้วยหน่วยย่อย a, b และ g ซึ่งหน่วยย่อยสามารถจับ GTP หรือ GDP อย่างใดอย่างหนึ่ง และสามารถไฮโดรไลซ์ GTP กับ GDP เมื่อรีเซพเตอร์ 7-TM ไม่ทำงาน คอมเพล็กซ์โปรตีน G มักจะเกี่ยวข้องกับเยื่อหุ้มเซลล์โดยไมริสโตอิเลชันหรือพาลมิโตอิเลชันของยูนิตย่อยและฟาร์เนซิเลชันหรือเจอรานิลเจอรานีเลชันของยูนิตย่อย g เมื่อเปิดใช้งานตัวรับ 7-TM มันจะเชื่อมโยงกับโปรตีน G-protein แบบ heterotrimeric ซึ่งทำให้ Ga ปล่อย GDP และผูกกับ GTP สิ่งนี้จะแยก Ga ออกจากหน่วยย่อยอีกสองหน่วย จากนั้นจะสามารถเชื่อมโยงและกระตุ้นเอนไซม์เพื่อขยายลำดับการส่งสัญญาณ หนึ่งในสองเส้นทางคลาสสิกเริ่มต้นด้วยการกระตุ้น Ga ของ adenylate (adenylyl) cyclase Adenylate cyclase (AC) แปลง ATP เป็น cAMP เนื่องจาก ATP มีมากมายและ AC เป็นเอนไซม์ที่ค่อนข้างเร็ว แอมพลิเคชั่นแรกของสัญญาณจึงมาพร้อมกับการสร้างค่ายโมเลกุล "ผู้ส่งสารที่สอง" โมเลกุลของแคมป์แต่ละตัวสามารถกระตุ้นเอ็นไซม์อื่นๆ ได้ โดยตัวหลักคือโปรตีนไคเนส A จากนั้น PKA สามารถฟอสโฟรีเลตสารตั้งต้นหลายชนิดเพื่อเปลี่ยนแปลงกิจกรรมของเซลล์โดยการแสดงออกของยีน มอเตอร์ระดับโมเลกุล หรือการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึม

เส้นทางคลาสสิกอื่น ๆ สำหรับตัวรับ 7-TM คือการกระตุ้นของ phosphlipase Cb โดย Ga. PLCb จะสร้างโมเลกุลผู้ส่งสารสองโมเลกุลจริง ๆ : มันไฮโดรไลซ์ phosphatidylinositol เป็น diacylgylcerol (DAG) และ inositol triphosphate (IP3). IP3 ส่วนใหญ่ก่อให้เกิดการปลดปล่อย Ca2+ จากเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม DAG สามารถกระตุ้นโปรตีนไคเนส C. PKC ยังถูกกระตุ้นโดยCa2+ และทั้ง Ca2+ และ DAG สามารถเปิดใช้งาน PKC เสริมฤทธิ์กัน โปรตีน kinase C เป็นไคเนสส่วนกลางที่สำคัญที่แสดงให้ทราบถึงฟอสโฟรีเลตและควบคุมการทำงานของเอ็นไซม์อื่นๆ มากมายตั้งแต่องค์ประกอบของโครงร่างโครงร่างไปจนถึงปัจจัยการถอดรหัส

รูปแบบที่น่าสนใจจากวิถี 7-TM แบบคลาสสิกเริ่มต้นด้วยตัวรับโรดอปซินในเซลล์แท่ง ตัวรับเหล่านี้จับโฟตอนเพื่อกระตุ้น และกระตุ้นโปรตีน G แบบเฮเทอโรไตรเมอร์ จากนั้น Ga-GTP จะจับกับหน่วยย่อย g ของฟอสโฟไดเอสเตอเรส (PDE) ซึ่งเปิดใช้งานและเร่งการเปลี่ยนแปลงของ cGMP เป็น GMP เมื่อ cGMP ลดลง ช่องไอออนจะปิด โพลาไรซ์เมมเบรนและเปลี่ยนสัญญาณจากเซลล์แท่งเป็นสมอง (ผ่านการเชื่อมต่อเซลล์ประสาท)

ผู้ส่งสารคนที่สองจะต้องมีคุณสมบัติสองประการ ต้องมีขนาดเล็กพอที่จะกระจายอย่างมีประสิทธิภาพ และเซลล์จะต้องสามารถสร้างได้อย่างรวดเร็ว Ca2+ และค่ายจัดอยู่ในหมวดหมู่นี้ นอกจากนี้ยังสามารถลบออกจากการหมุนเวียนได้อย่างรวดเร็ว: เดิมโดยCa2+ ปั๊มใน ER และ Golgi และหลังโดยกิจกรรม phosphodiesterase เมื่อค้นพบวิถีของ G-protein การใช้สารลิพิดที่สองนั้นน่าประหลาดใจ ฟอสโฟลิปิดของเมมเบรนส่วนใหญ่ถูกละเลยในขณะนั้นเนื่องจากส่วนประกอบแบบคงที่อย่างง่ายของเมมเบรน ตอนนี้เป็นที่ชัดเจนว่าฟอสโฟลิปิดบางชนิดมีฤทธิ์ทางชีวเคมี โดยมีเอ็นไซม์หลายชนิดที่ดัดแปลงพวกมัน รวมถึงฟอสโฟลิเปส ฟอสโฟลิปิด ไคเนส และฟอสโฟลิปิด ฟอสฟาเตส เอ็นไซม์เหล่านี้บางชนิดมีหน้าที่หลากหลายเนื่องจากสารตั้งต้นของผลิตภัณฑ์อาจเป็นโมเลกุลสารสำคัญ ตัวอย่างเช่น PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase) เป็นไคเนสส่งสัญญาณส่วนกลางเนื่องจากผลิตภัณฑ์ PIP3 (phosphatidylinositol (3,4,5) -triphosphate) เป็นตัวกระตุ้นสำหรับ Akt/PKB และเอนไซม์อื่นๆ ที่สามารถกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณได้หลายทาง

การเปิดใช้งานต้องสิ้นสุดลงในที่สุด และจะเกิดขึ้นเมื่อ Ga ไฮโดรไลซ์ GTP ที่ผูกไว้กับมัน ด้วยวิธีนี้ Ga ทำหน้าที่เป็นตัวจับเวลาสำหรับน้ำตกสัญญาณ นี่เป็นสิ่งสำคัญเพราะการส่งสัญญาณจะได้ผล จะต้องมีการควบคุมอย่างเข้มงวด ในช่วงต้นหลักสูตรนี้ ได้ชี้ให้เห็นว่า Ca2+ ถูกเก็บไว้ที่ความเข้มข้นต่ำมากในไซโตพลาสซึมของเซลล์เพราะเราต้องการCa2+- กลไกที่ละเอียดอ่อนเพื่อให้สามารถตอบสนองต่อการไหลเข้าของแคลเซียมได้อย่างรวดเร็ว แต่เราต้องการที่จะปิดสัญญาณได้อย่างรวดเร็วเท่าที่จำเป็น และนั่นทำได้ง่ายกว่ามากโดยการแยก Ca ในปริมาณเล็กน้อย2+ กว่ามันมาก ในทำนองเดียวกัน หากมีการเรียกกิจกรรมที่ยั่งยืนของเซลล์ผู้รับ มันจะสำเร็จได้โดยการกระตุ้นตัวรับอย่างต่อเนื่องและไม่ใช่โดยผลที่คงอยู่ยาวนานจากการกระตุ้นเพียงครั้งเดียว สิ่งนี้ทำให้แน่ใจได้ว่าหากผลของเซลล์ต้องถูกตัดออกอย่างกะทันหันและรวดเร็ว ก็สามารถทำได้โดยไม่มีช่วงเวลาหน่วงที่สำคัญระหว่างการหยุดการหลั่งฮอร์โมนและการหยุดส่งสัญญาณภายในเซลล์

ตัวรับเป็นส่วนหนึ่งของกลไกการปิดระบบอื่นเช่นกัน: เพื่อป้องกันการกระตุ้นมากเกินไป ตัวรับจะถูกลดความรู้สึกในช่วงเวลาสั้น ๆ หลังจากที่เปิดใช้งาน G-protein-coupled receptor kinase (GRK) ฟอสฟอรีเลตตัวรับ 7-TM ฟอสโฟรีเลชั่นสร้างไซต์การรับรู้สำหรับสารจับกุม สารจับกุมมีหลากหลายหน้าที่ ซึ่งง่ายที่สุดคือทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งการแข่งขันของ G-proteinbindingby the receptor นี่เป็นการลดความรู้สึกไว (desensitization) ที่มีอายุสั้น

สำหรับการ desensitization ที่นานขึ้น arrestin จะจับกับ AP2 และ clathrin ซึ่งเป็นการสร้างนิวเคลียสของ endocytic vesicle ที่เคลือบด้วย clathrin สิ่งนี้จะกำจัดตัวรับออกจากผิวเซลล์ ทำให้เซลล์ไวต่อความรู้สึกเป็นเวลานานกว่าการแข่งขันง่ายๆ ระหว่าง arrestin และ G-protein

สารจับกุมมีหน้าที่อื่นที่เป็นไปได้ พวกมันสามารถทำหน้าที่เป็นโปรตีนนั่งร้านที่นำคอมเพล็กซ์การส่งสัญญาณที่แตกต่างไปจากเดิมอย่างสิ้นเชิงมาที่ตัวรับ 7-TM รูป (PageIndex{8}) แสดงตัวอย่างที่ใช้ตัวรับ 7-TM เพื่อกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัส Jun

b-arrestin นำ AJK-1, MKKY และ JNK-1 ไปกระตุ้น JNK-1 ซึ่งสามารถทำให้เกิดฟอสโฟรีเลต Jun ได้ ซึ่งจะช่วยให้ย้ายฟอสโฟ-จุนไปในนิวเคลียสและไดเมอไรเซชันที่ตามมา โดยแปลงเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่ใช้งานอยู่

การทำงานของเซลล์บางอย่างที่สามารถกระตุ้นได้ด้วยการกระตุ้นตัวรับ 7-TM คืออะไร Ca2+ ไดนามิกจะกล่าวถึงในส่วนที่แยกต่างหาก IP3 แสดงให้เห็นว่าทำให้เกิดการหดตัวของกล้ามเนื้อเรียบและโครงร่าง แอกตินโพลิเมอไรเซชันและการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ การปลดปล่อยแคลเซียมจากการสะสมภายในเซลล์ การเปิดช่องโพแทสเซียม และการแยกขั้วของเมมเบรน แคมป์มีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมการสลายตัวของไกลโคเจนและการสร้างกลูโคเนซิส เมตาบอลิซึมของไตรเอซีกลีเซอรอล การหลั่งเอสโตรเจนโดยเซลล์รังไข่ การหลั่งกลูโคคอร์ติคอยด์ และการซึมผ่านของเซลล์ไตไปยังน้ำที่เพิ่มขึ้น


ข้อมูลเชิงลึกเชิงโครงสร้างเกี่ยวกับความแตกต่างระหว่างอนุพันธ์ของแลคติโซลในกลไกการยับยั้งกับตัวรับรสหวานของมนุษย์

Lactisole ซึ่งเป็นตัวยับยั้งตัวรับรสหวานของมนุษย์ มีโครงกระดูกกรด 2-phenoxypropionic และแสดงให้เห็นว่ามีปฏิสัมพันธ์กับโดเมนทรานส์เมมเบรนของหน่วยย่อย T1R3 (T1R3-TMD) ของตัวรับ ตัวยับยั้งอีกตัวหนึ่งคือ 2,4-DP ซึ่งใช้โครงกระดูกโมเลกุลเดียวกันกับแลคติโซล ได้รับการยืนยันว่ามีฤทธิ์ในการยับยั้งมากกว่าแลคติโซลประมาณ 10 เท่า อย่างไรก็ตาม โครงสร้างพื้นฐานของกลไกการยับยั้งต่อตัวรับยังคงต้องอธิบายให้ชัดเจน โครงสร้างผลึกของ TMD ของตัวรับเมตาบอทรอปิกกลูตาเมตซึ่งร่วมกับ T1R ถูกจัดอยู่ในประเภทตัวรับคู่ C G-protein ที่เพิ่งได้รับรายงานและทำให้สามารถสร้างแบบจำลองโครงสร้างที่แม่นยำสำหรับ T1R3-TMD ได้ ในการศึกษานี้ กลไกโครงสร้างโดยละเอียดที่อยู่เบื้องหลังการยับยั้งรสหวานนั้นมีลักษณะโดยการเปรียบเทียบการทำงานของแลคติโซลกับ T1R3-TMD กับการทำงานของ 2,4-DP ขั้นแรกเราทำการทดลองหลายชุดโดยใช้เซลล์ที่เพาะเลี้ยงซึ่งแสดงตัวรับรสหวานด้วยการกลายพันธุ์ และตรวจสอบปฏิสัมพันธ์กับสารยับยั้งเหล่านี้ จากผลลัพธ์ เราได้ทำการจำลองการเทียบท่า จากนั้นจึงใช้การลดพลังงานตามไดนามิกของโมเลกุล การวิเคราะห์ของเราเปิดเผยอย่างชัดเจนว่า (S) -ไอโซเมอร์ของทั้งแลคติโซลและ 2,4-DP ทำปฏิกิริยากับสารตกค้างเจ็ดตัวเดียวกันใน T1R3-TMD และศักยภาพในการยับยั้งของสารยับยั้งเหล่านี้ส่วนใหญ่เกิดจากการมีปฏิสัมพันธ์ที่เสถียรผ่านกลุ่มคาร์บอกซิลของพวกมัน ในแนวตั้งของช่องลิแกนด์ของ T1R3-TMD นอกจากนี้ 2,4-DP มีส่วนร่วมในอันตรกิริยาที่ไม่ชอบน้ำที่อาศัยโดยกลุ่ม o-Cl ของมัน และอันตรกิริยานี้อาจมีส่วนรับผิดชอบส่วนใหญ่สำหรับศักยภาพในการยับยั้งที่สูงขึ้นของ 2,4-DP

แถลงการณ์ความขัดแย้งทางผลประโยชน์

ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

ตัวเลข

รูปที่ 1 Lactisole และ 2,4-DP เป็นความหวาน…

รูปที่ 1 Lactisole และ 2,4-DP เป็นตัวยับยั้งรสหวาน

(A) สูตรโครงสร้างของ (±)-แลคติโซล และ…

รูปที่ 2 การจำลอง MD และการจำลองล่วงหน้า…

รูปที่ 2 การจำลอง MD และการจำลองล่วงหน้าสำหรับ lactisole และ 2,4-DP

รูปที่ 3 การเปรียบเทียบผลลัพธ์ของ...

รูปที่ 3 การเปรียบเทียบผลลัพธ์ของการลดขนาด MD สำหรับ ( NS )-แลคติโซล และ (…

รูปที่ 4. ฤทธิ์ยับยั้งรสหวานของ...

รูปที่ 4 ฤทธิ์ยับยั้งรสหวานของ ( NS )-, ( NS )-แลคติโซล และ (…


เชิงนามธรรม

G protein-coupled receptors (GPCRs) เป็นศูนย์กลางของวิถีการส่งสัญญาณของเซลล์พื้นฐานมากมาย พวกมันแปลงสัญญาณจากภายนอกสู่ภายในเซลล์ในกระบวนการทางสรีรวิทยาตั้งแต่การมองเห็นไปจนถึงการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน เป็นการท้าทายอย่างยิ่งที่จะดูทีละรายการโดยใช้เทคนิคการทดลองแบบเดิม เมื่อเร็ว ๆ นี้ แบบจำลองโมเลกุลอะตอมมิคเทียมได้กลายเป็นเครื่องมืออันทรงคุณค่าในการเข้าถึงข้อมูลเกี่ยวกับ GPCR โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการปฏิสัมพันธ์กับสภาพแวดล้อมในเยื่อหุ้มเซลล์ต้นกำเนิดและผลที่ตามมาต่อการจัดโครงสร้างเหนือโมเลกุลของพวกมัน วิธีนี้ใช้แบบจำลองเกรนหยาบของ Martini (CG) เพื่ออธิบายตัวรับ ลิปิด และตัวทำละลายในการจำลองแบบพลวัตของโมเลกุล (MD) และในรายละเอียดที่เพียงพอเพื่อรักษาความจำเพาะทางเคมีของโมเลกุลต่างๆ การกำจัดระดับความเป็นอิสระที่ไม่จำเป็นได้เปิดฉากการจำลองขนาดใหญ่ขององค์กรเหนือโมเลกุลที่มีไขมันเป็นสื่อกลางของ GPCR ที่นี่ หลังจากแนะนำวิธี Martini CGMD เราทบทวนการศึกษาเหล่านี้ดำเนินการกับสมาชิกหลายรายของตระกูล GPCR รวมถึง rhodopsin (ตัวรับภาพ) ตัวรับฝิ่น ตัวรับ adrenergic ตัวรับอะดีโนซีน ตัวรับโดปามีน และตัวรับสฟิงโกซีน 1-ฟอสเฟต การศึกษาเหล่านี้ได้นำเสนอหลักการทางชีวฟิสิกส์แบบใหม่ที่น่าสนใจ ข้อมูลเชิงลึกมีตั้งแต่การเปิดเผยการเสียรูปเฉพาะที่และรูปแบบต่างกันของเมมเบรน bilayer ที่พื้นผิวของโปรตีน อันตรกิริยาเฉพาะของโมเลกุลไขมันกับ GPCR แต่ละตัว ไปจนถึงผลกระทบของเมทริกซ์เมมเบรนต่อการประกอบตัวเองของ GPCR ทั่วโลก การทบทวนจบลงด้วยภาพรวมของบทเรียนที่ได้จากการใช้วิธี CGMD ซึ่งเป็นผลการวิจัยทางชีวฟิสิกส์และเคมีเกี่ยวกับการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างไขมันและโปรตีน


Lefkowitz, R. J. ซูเปอร์แฟมิลีของตัวรับตับ เนเจอร์ เซลล์ ไบโอล. 2, E133–E136 (2000).มุมมองทางประวัติศาสตร์ที่อธิบายต้นกำเนิดของช่องสัญญาณตัวรับ 7TM ในปี 1970 และ 1980

Dixon, R. A. และคณะ การโคลนยีนและ cDNA สำหรับตัวรับ β-adrenergic ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและความคล้ายคลึงกันกับ rhodopsin ธรรมชาติ 321, 75–79 (1986).เอกสารนี้รายงานการโคลนนิ่งของตัวรับ β2-adrenergic ความคล้ายคลึงและความคล้ายคลึงกันของ 7TM กับ rhodopsin และคาดการณ์เกี่ยวกับการมีอยู่ของตัวรับดังกล่าวในตระกูลใหญ่

Dohlman, H. G. , Thorner, J. , Caron, M. G. & Lefkowitz, R. J. Model ระบบสำหรับการศึกษาตัวรับเจ็ดเมมเบรน-เซกเมนต์ อันนุ. รายได้ Biochem. 60, 653–688 (1991).

Lee, D. K. , George, S. R. & amp O'Dowd, B. F. Novel G-protein-coupled ยีนรับยีนที่แสดงในสมอง: การค้นพบเป้าหมายการรักษาที่สำคัญอย่างต่อเนื่อง ความคิดเห็นของผู้เชี่ยวชาญ เธอ. เป้าหมาย 6, 1–18 (2002).

Palczewski, K. และคณะ โครงสร้างผลึกของโรดอปซิน: รีเซพเตอร์คู่โปรตีน G ศาสตร์ 289, 739–745 (2000).อธิบายโครงสร้างผลึกของตัวรับ 7TM เพียงตัวเดียวที่แก้ไขได้จนถึงตอนนี้

Rodbell, M. , Birnbaumer, L. , Pohl, S. L. & Krans, H. M. ระบบ adenyl cyclase ที่ไวต่อกลูคากอนในเยื่อหุ้มพลาสมาของตับหนู V. บทบาทบังคับของ guanylnucleotides ในการกระทำของกลูคากอน เจ. ไบโอล. เคมี. 246, 1877–1882 (1971).

Gilman, A. G. G โปรตีน: ทรานสดิวเซอร์ของสัญญาณที่สร้างตัวรับ อันนุ. รายได้ Biochem. 56, 615–649 (1987).

Ballesteros, J. A. และคณะ การเปิดใช้งานตัวรับ β2-adrenergic เกี่ยวข้องกับการหยุดชะงักของล็อคไอออนิกระหว่างปลายไซโตพลาสซึมของส่วนเมมเบรน 3 และ 6 เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 29171–29177 (2001).

Farahbakhsh, Z. T. , Ridge, K. D. , Khorana, H. G. & Hubbell, W. L. การทำแผนที่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ขึ้นกับแสงในวง cytoplasmic ที่เชื่อมต่อ helices C และ D ใน rhodopsin: การศึกษาการติดฉลากแบบหมุนตามไซต์ ชีวเคมี 34, 8812–8819 (1995).

De Vries, L. และคณะ ตัวควบคุมของตระกูลสัญญาณโปรตีน G อันนุ. รายได้ Pharmacol. ท็อกซิคอล 40, 235–271 (2000).

Ross, E. M. & amp Wilkie, T. M. โปรตีนกระตุ้น GTPase สำหรับโปรตีน heterotrimeric G: ตัวควบคุมการส่งสัญญาณโปรตีน G (RGS) และโปรตีนคล้าย RGS อันนุ. รายได้ Biochem. 69, 795–827 (2000).

Klein, S. , Reuveni, H. & Levitzki, A. การส่งสัญญาณโดยโปรตีน G ยีสต์ heterotrimeric ที่ไม่สามารถแยกออกได้ Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 97, 3219–3123 (2000).

Ferguson, S. S. แนวคิดวิวัฒนาการในการเอนโดไซโทซิสของรีเซพเตอร์ควบคู่โปรตีน G: บทบาทในการลดความไวของตัวรับและการส่งสัญญาณ ฟา. รายได้ 53, 1–24 (2001).

Pitcher, J. A. , Freedman, N. J. & Lefkowitz, R. J. G. ไคเนสรีเซพเตอร์ควบคู่โปรตีน อันนุ. รายได้ Biochem. 67, 653–692 (1998).การทบทวนอย่างกว้างขวางเกี่ยวกับชีวเคมีและระเบียบข้อบังคับของ G-protein-coupled-receptor kinases

Daaka, Y. , Luttrell, L. M. & Lefkowitz, R. J. การเปลี่ยนการมีเพศสัมพันธ์ของตัวรับβ2-adrenergic กับโปรตีน G ที่แตกต่างกันโดยโปรตีนไคเนส A. ธรรมชาติ 390, 88–91 (1997).อธิบายกลไกใหม่โดยที่ความจำเพาะของการจับคู่โปรตีน G ของตัวรับ 7TM อาจถูกควบคุมโดยฟอสโฟรีเลชันของตัวรับโปรตีน-ไคเนส-A

Zamah, A. M. , Delahunty, M. , Luttrell, L. M. & Lefkowitz, R. J. PKA-mediated phosphorylation ของ receptor β2-adrenergic ควบคุมการมีเพศสัมพันธ์กับ Gs และ Gi: การสาธิตในระบบที่สร้างใหม่ เจ. ไบโอล. เคมี. (ในสื่อ)

Lawler, O. A. , Miggin, S. M. & Kinsella, B. T. โปรตีนไคเนสฟอสโฟรีเลชั่น A-mediated ของซีรีน 357 ของตัวรับ prostacyclin ของเมาส์ควบคุมการมีเพศสัมพันธ์กับ Gs- ถึง Gi- และ Gq-coupled effector การส่งสัญญาณ เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 33596–33607 (2001).

Krupnick, J. G. & Benovic, J. L. บทบาทของไคเนสของตัวรับและการจับกุมในการควบคุมตัวรับโปรตีนควบคู่กับ G อันนุ. รายได้ Pharmacol. ท็อกซิคอล 38, 289–319 (1998).การทบทวนระบบการกำกับดูแลตัวรับสากลนี้อย่างละเอียด

Zhang, J. และคณะ กลไกระดับโมเลกุลของการส่งสัญญาณรีเซพเตอร์ควบคู่โปรตีนจี: บทบาทของไคเนสรีเซพเตอร์ที่ควบคู่โปรตีนจีและอาร์เรตินในการลดความไวของรีเซพเตอร์และรีเซพเตอร์ ช่องรับสัญญาณ 5, 193–199 (1997).

Winstel, R. และคณะ โปรตีน kinase cross-talk: การกำหนดเป้าหมายเมมเบรนของไคเนสตัวรับ β-adrenergic โดยโปรตีน kinase C Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 93, 2105–2109 (1996).

Cong, M. และคณะ ระเบียบของการกำหนดเป้าหมายเมมเบรนของ G โปรตีน-ควบคู่รับไคเนส 2 โดยโปรตีนไคเนส A และโปรตีนทอดสมอ AKAP79 เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 15192–15199 (2001).

Krueger, K. M. , Daaka, Y. , Pitcher, J. A. & Lefkowitz, R. J. บทบาทของการกักเก็บใน G protein-coupled receptor resensitization ระเบียบของ dephosphorylation ตัวรับ β2-adrenergic โดยการทำให้เป็นกรด vesicular เจ. ไบโอล. เคมี. 272, 5–8 (1997).

เหยือก, เจ.เอ. และคณะ G-protein-coupled receptor phosphatase: โปรตีน phosphatase type 2A ที่มีการกระจายตัวของ subcell ที่แตกต่างกันและความจำเพาะของซับสเตรต Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 92, 8343–8347 (1995).

Tsao, P. & von Zastrow, M. การลดระดับของตัวรับโปรตีนควบคู่ G สกุลเงิน ความคิดเห็น นิวโรไบโอล. 10, 365–369 (2000).

Collins, S. , Caron, M. G. & Lefkowitz, R. J. ระเบียบของการตอบสนองของ adrenergic receptor ผ่านการปรับการแสดงออกของยีนตัวรับ อันนุ. รายได้ Physiol. 53, 497–508 (1991).

Lyubarsky, A. L. และคณะ RGS9-1 จำเป็นสำหรับการปิดใช้งานการถ่ายโอนภาพถ่ายรูปกรวยของเมาส์ตามปกติ มล. วิส. 7, 71–78 (2001).

Oliveira-Dos-Santos, A.J. และคณะ กฎระเบียบของการกระตุ้นทีเซลล์ ความวิตกกังวล และความก้าวร้าวของผู้ชายโดย RGS2 Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 97, 12272–12277 (2000).

ฮาวเวิร์ด, เอ.ดี. และคณะ Orphan G-protein-coupled receptors และการค้นพบลิแกนด์ตามธรรมชาติ เทรนด์ Pharmacol วิทย์. 22, 132–140 (2001).

Kobilka, B. K. และคณะ ยีนที่ไม่มีการควบคุมภายในซึ่งเข้ารหัสสมาชิกที่มีศักยภาพของตระกูลตัวรับที่ควบคู่กับโปรตีนควบคุมนิวคลีโอไทด์ของกัวนีน ธรรมชาติ 329, 75–79 (1987).

Fargin, A. และคณะ จีโนมโคลน G-21 ซึ่งคล้ายกับลำดับตัวรับ β-adrenergic เข้ารหัสตัวรับ 5-HT1A ธรรมชาติ 335, 358–360 (1988).

Hsu, S. Y. และคณะ การกระตุ้นตัวรับเด็กกำพร้าโดยฮอร์โมนรีแล็กติน ศาสตร์ 295, 671–674 (2002).

Lembo, P. M. และคณะ ผลิตภัณฑ์ยีน Proenkephalin A กระตุ้นตระกูล GPCR เฉพาะเซลล์ประสาทประสาทสัมผัสใหม่ ประสาทวิทยาธรรมชาติ 5, 201–209 (2002).

Chuang, D. M. & Costa, E. หลักฐานสำหรับการทำให้ภายในของตำแหน่งการรับรู้ของตัวรับβ-adrenergic ในระหว่างการรับความรู้สึกอ่อนไหวที่เกิดจาก (−) -isoproterenol Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 76, 3024–3028 (1979).

Chuang, D. M. & Costa, E. β-Adrenergic receptors ของเม็ดเลือดแดงกบ ผลที่ตามมาทางชีวเคมีหลังจากการกระตุ้นด้วย isoproterenol นิวโรเคม. ความละเอียด 4, 777–793 (1979).

Daaka, Y. และคณะ บทบาทที่สำคัญสำหรับเอนโดไซโทซิสของรีเซพเตอร์ควบคู่โปรตีน G ในการกระตุ้นไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน เจ. ไบโอล. เคมี. 273, 685–688 (1998).

Claing, A. , Laporte, S. A. , Caron, M. G. & Lefkowitz, R. J. Endocytosis ของตัวรับโปรตีน G ควบคู่: บทบาทของ G โปรตีนควบคู่รับไคเนสและโปรตีนβ-arrestin โปรแกรม นิวโรไบโอล. 66, 61–79 (2002).ทบทวนกลไกที่ซับซ้อนที่เกี่ยวข้องกับการเอนโดไซโทซิสของตัวรับ 7TM

Claing, A. และคณะ วิถีทาง endocytic หลายทางของตัวรับโปรตีนควบคู่ G ที่อธิบายโดยความไวของ GIT1 Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 97, 1119–1124 (2000).

สมาร์ท E.J. et al. Caveolins โดเมนที่สั่งของเหลวและการส่งสัญญาณ มล. เซลล์. ไบโอล. 19, 7289–7304 (1999).

Lohse, M.J. และคณะ β-Arrestin: โปรตีนที่ควบคุมการทำงานของตัวรับβ-adrenergic ศาสตร์ 248, 1547–1550 (1990).

Goodman, O. B. , Jr และคณะ β-Arrestin ทำหน้าที่เป็นตัวปรับต่อ clathrin ใน endocytosis ของตัวรับβ2-adrenergic ธรรมชาติ 383, 447–450 (1996).

Laporte, S.A. และคณะ สารเชิงซ้อน β-adrenergic receptor/β-arrestin จะชักชวนอะแดปเตอร์ clathrin AP-2 ระหว่างการเกิด endocytosis Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 96, 3712–3717 (1999).

Gaidarov, I. et al. การทำงานของ Arrestin ในเอนโดไซโทซิสที่รับโปรตีนควบคู่กับ G นั้นต้องการการจับกับฟอสโฟโนซิไทด์ เอ็มบีโอ เจ 18, 871–881 (1999).

Scott, M. G. , Benmerah, A. , Muntaner, O. & Marullo, S. การคัดเลือกตัวรับโปรตีนที่ควบคู่ไปกับ G ที่ถูกกระตุ้นไปยังหลุมที่เคลือบด้วย clathrin ที่มีอยู่ก่อนแล้วในเซลล์ที่มีชีวิต เจ. ไบโอล. เคมี. 277, 3552–3559 (2002).

Santini, F. , Gaidarov, I. & Keen, J. H. G รีเซพเตอร์ควบคู่โปรตีน / การปรับ Arrestin3 ของเครื่องจักร endocytic เจ. เซลล์ ไบโอล. 156, 665–676 (2002).

Oakley, R. H. และคณะ ความสัมพันธ์ที่สัมพันธ์กันของ visual arrestin, β-arrestin1 และ β-arrestin2 สำหรับ GPCRs แยกประเภทตัวรับหลักสองคลาส เจ. ไบโอล. เคมี. 275, 17201–17210 (2000).

Luttrell, L. M. และคณะ การสร้างขึ้นอยู่กับβ-Arrestin ของβ2 adrenergic receptor–Src โปรตีนไคเนสเชิงซ้อน ศาสตร์ 283, 655–661 (1999).

อาห์น เอส. และคณะ Src-mediated tyrosine phosphorylation ของไดนามินเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการสร้างภายในตัวรับ β2-adrenergic และการส่งสัญญาณไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน เจ. ไบโอล. เคมี. 274, 1185–1188 (1999).

อาห์น เอส. และคณะ ไทโรซีนฟอสโฟรีเลชั่นที่ขึ้นกับ c-Src ควบคุมการประกอบตัวเองของไดนามินและเอนโดไซโทซิสที่รับสื่อกลาง เจ. ไบโอล. เคมี. 277, 26642–26651 (2002).

Shenoy, S. K. , McDonald, P. H. , Kohout, T. A. & Lefkowitz, R. J. ระเบียบของชะตากรรมของตัวรับโดยการแพร่หลายของตัวรับβ2-adrenergic ที่เปิดใช้งานและβ-arrestin ศาสตร์ 294, 1307–1313 (2001).

Pickart, C. M. กลไกการแพร่หลาย อันนุ. รายได้ Biochem. 70, 503–533 (2001).

McDonald, P. H. et al. การระบุ NSF เป็นโปรตีนที่จับกับ β-arrestin1 นัยสำหรับการควบคุมตัวรับ β2-adrenergic เจ. ไบโอล. เคมี. 274, 10677–10680 (1999).

Claing, A. และคณะ β-Arrestin-mediated ADP-ribosylation factor 6 การเปิดใช้งานและ endocytosis ตัวรับβ2-adrenergic เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 42509–42513 (2001).

Premont, R. T. et al. การควบคุมตัวรับ β2-Adrenergic โดย GIT1 ซึ่งเป็นโปรตีนที่กระตุ้นการทำงานของ ADP ไรโบซิเลชันของ ADP ที่เกี่ยวข้องกับตัวรับไคเนสที่ควบคู่กับโปรตีน G Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 95, 14082–14087 (1998).

Cong, M. และคณะ การจับของตัวรับ adrenergic β2 กับ NSปัจจัยที่ไวต่อยาเอทิลมาเลอิไมด์จะควบคุมการรีไซเคิลตัวรับ เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 45145–45152 (2001).

Seachrist, J. L. และคณะ การเชื่อมโยง Rab5 กับตัวรับ angiotensin II ประเภท 1A ส่งเสริมการจับ Rab5 GTP และการรวมตัวของตุ่ม เจ. ไบโอล. เคมี. 277, 679–685 (2002).

Kohout, T. A. และคณะ β-Arrestin 1 และ 2 ควบคุมการส่งสัญญาณและการค้ามนุษย์ของ heptahelical receptor ที่แตกต่างกัน Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 98, 1601–1606 (2001).

Marchese, A. & Benovic, J. L. Agonist-promoted ubiquitination ของ G protein-coupled receptor CXCR4 ไกล่เกลี่ยการเรียงลำดับ lysosomal เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 45509–45512 (2001).

Dodge, K. & Scott, J. D. AKAP79 และวิวัฒนาการของโมเดล AKAP FEBS เลตต์ 476, 58–61 (2000).

Fraser, I. D. และคณะ การประกอบ A kinase-anchoring protein–β(2)-adrenergic receptor complex ช่วยอำนวยความสะดวกในการรับฟอสโฟรีเลชันและการส่งสัญญาณ สกุลเงิน ไบโอล. 10, 409–412 (2000).

Shih, M. et al. คอมเพล็กซ์แบบไดนามิกของตัวรับ β-adrenergic ที่มีโปรตีนไคเนสและฟอสฟาเตสและบทบาทของกราวิน เจ. ไบโอล. เคมี. 274, 1588–1595 (1999).

Diviani, D. , Soderling, J. & Scott, J. D. AKAP-Lbc ยึดโปรตีนไคเนส A และนิวคลีเอตการสร้างเส้นใยความเครียด Rho-mediated Gα12-selective เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 44247–44257 (2001).

Tsunoda, S. และคณะ โปรตีนโดเมน PDZ แบบหลายวาเลนต์ประกอบสารเชิงซ้อนในการส่งสัญญาณในน้ำตกที่จับคู่กับ G-protein ธรรมชาติ 388, 243–249 (1997).

Brakeman, P. R. et al. โฮเมอร์: โปรตีนที่ผูกมัดตัวรับกลูตาเมตเมตาบอท ธรรมชาติ 386, 284–288 (1997).

Cao, W. และคณะ จำเป็นต้องมีการเชื่อมโยงโดยตรงของ c-Src ที่เปิดใช้งานกับตัวรับ β3-adrenergic สำหรับการกระตุ้น MAP kinase เจ. ไบโอล. เคมี. 275, 38131–38134 (2000).

Marrero, M. B. และคณะ การกระตุ้นโดยตรงของวิถี Jak/STAT โดยตัวรับ angiotensin II AT1 ธรรมชาติ 375, 247–250 (1995).

Hall, R. et al. ตัวรับ β2-adrenergic ทำปฏิกิริยากับปัจจัยควบคุม Na + /H + -exchanger เพื่อควบคุมการแลกเปลี่ยน Na + /H + ธรรมชาติ 392, 626–630 (1998).

Hall, R. A. และคณะ โมทีฟของเทอร์มินัล C ที่พบในรีเซพเตอร์ β2-adrenergic, รีเซพเตอร์ P2Y1 และตัวควบคุมการนำไฟฟ้าของเมมเบรนซิสติก ไฟโบรซิส กำหนดการจับกับแฟมิลีของปัจจัยควบคุมตัวแลกเปลี่ยน Na + /H + ของโปรตีน PDZ Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 95, 8496–8501 (1998).

Hu, L.A. และคณะ การเชื่อมโยงตัวรับβ1-adrenergic กับ PSD-95 การยับยั้งการ internalization ของตัวรับและการอำนวยความสะดวกในการมีปฏิสัมพันธ์ของตัวรับβ1-adrenergic กับ NS-เมทิล-ดี-แอสพาเทตรีเซพเตอร์ เจ. ไบโอล. เคมี. 275, 38659–38666 (2000).

โดเมน Sheng, M. & Sala, C. PDZ และการจัดระเบียบของคอมเพล็กซ์ซูเปอร์โมเลกุล อันนุ. รายได้ Neurosci 24, 1–29 (2001).การตรวจสอบอย่างเป็นทางการของกลไกการทำงานร่วมกันระหว่างโปรตีนกับโปรตีนที่ควบคุมการโต้ตอบของ GPCR หลายอย่าง

Luttrell, L. M. และคณะ การก่อตัวขึ้นขึ้นอยู่กับβ-Arrestin ของβ2 adrenergic receptor Src โปรตีนไคเนสคอมเพล็กซ์ ศาสตร์ 283, 655–661 (1999).

อิมามูระ, ต. และคณะ การจัดหาไคเนสในตระกูล Src ที่เป็นสื่อกลางโดยβ-Arrestin ใช่ สื่อกลางในการขนส่งกลูโคสที่กระตุ้นด้วย endothelin-1 เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 43663–43667 (2001).

Barlic, J. et al. กฎระเบียบของการกระตุ้นไทโรซีนไคเนสและการปล่อยแกรนูลผ่าน β-arrestin โดย CXCR1 ธรรมชาติอิมมูนอล 1, 227–233 (2000).

DeFea, K.A. และคณะ เอนโดไซโทซิสที่ขึ้นกับ β-อาร์เรสตินของรีเซพเตอร์ที่กระตุ้นโปรตีน 2 จำเป็นสำหรับการกำหนดเป้าหมายภายในเซลล์ของ ERK1/2 ที่ถูกกระตุ้น เจ. เซลล์ ไบโอล. 148, 1267–1281 (2000).อธิบายบทบาทของ β-arrestin ในการไกล่เกลี่ยการเปิดใช้งาน ERK โดยตัวรับ 7TM

Luttrell, L. M. และคณะ การเปิดใช้งานและการกำหนดเป้าหมายของไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์โดย β-arrestin scaffolds Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 98, 2449–2454 (2001).

McDonald, P. H. และคณะ β-Arrestin 2: โครงสร้าง MAPK ที่ควบคุมโดยตัวรับสำหรับการเปิดใช้งาน JNK3 ศาสตร์ 290, 1574–1577 (2000).

Tohgo, A. และคณะ β-Arrestin scaffolding ของ ERK cascade ช่วยเพิ่มการทำงานของ cytosolic ERK แต่ยับยั้งการถอดรหัส ERK-mediated หลังจากการกระตุ้นตัวรับ angiotensin AT1a เจ. ไบโอล. เคมี. 277, 9429–9436 (2002).

Cerione, R. A. และคณะ การสร้างระบบ adenylate cyclase ที่ไวต่อฮอร์โมนขึ้นใหม่ ตัวรับ β-adrenergic ที่บริสุทธิ์และโปรตีนควบคุมนิวคลีโอไทด์ควบคุม guanine ให้การตอบสนองของฮอร์โมนในหน่วยเร่งปฏิกิริยาที่ได้รับการแก้ไข เจ. ไบโอล. เคมี. 259, 9979–9982 (1984).

Cerione, R. A. และคณะ ตัวรับ β2-adrenergic ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม: การสร้างปฏิสัมพันธ์เชิงหน้าที่ระหว่างตัวรับบริสุทธิ์และโปรตีนที่จับกับนิวคลีโอไทด์ที่กระตุ้นโดยบริสุทธิ์ของระบบอะดีนิเลตไซคเลส ชีวเคมี 23, 4519–4525 (1984).

Heldin, C. H. Dimerization ของตัวรับผิวเซลล์ในการส่งสัญญาณ เซลล์ 80, 213–223 (1995).

Jordan, B. A. & Devi, L. A. G-protein-coupled receptor heterodimerization ปรับการทำงานของตัวรับ ธรรมชาติ 399, 697–700 (1999).

Devi, L. A. Heterodimerization ของตัวรับ G-protein-coupled: เภสัชวิทยาการส่งสัญญาณและการค้ามนุษย์ เทรนด์ Pharmacol วิทย์. 22, 532–537 (2001).

Salahpour, A. , Angers, S. & Bouvier, M. ความสำคัญเชิงหน้าที่ของ oligomerization ของตัวรับ G-protein-coupled เทรนด์เอนโดครินอล เมตาบ 11, 163–168 (2000).

Galvez, T. และคณะ การโต้ตอบแบบ allosteric ระหว่างหน่วยย่อย GB1 และ GB2 จำเป็นสำหรับฟังก์ชันตัวรับ GABAB ที่เหมาะสมที่สุด เอ็มบีโอ เจ 20, 2152–2159 (2001).

เนลสัน, จี. และคณะ ตัวรับรสกรดอะมิโน ธรรมชาติ 416, 199–202 (2002).

เนลสัน จี และคณะ ตัวรับรสหวานของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เซลล์ 106, 381–390 (2001).

McLatchie, LM และคณะ ทางลาดควบคุมการขนส่งและความจำเพาะของลิแกนด์ของตัวรับแคลซิโทนิน-เหมือนตัวรับ ธรรมชาติ 393, 333–339 (1998).

Kuwasako, K. และคณะ การแสดงภาพของตัวรับแคลซิโทนินที่คล้ายกับรีเซพเตอร์และโปรตีนที่ปรับเปลี่ยนกิจกรรมของตัวรับในระหว่างการสร้างภายในและการรีไซเคิล เจ. ไบโอล. เคมี. 275, 29602–29609 (2000).

Hilairet, S. และคณะ ตัวเร่งปฏิกิริยาส่งเสริมภายในของคอมเพล็กซ์ไตรภาคระหว่างรีเซพเตอร์เหมือนตัวรับแคลซิโทนิน, โปรตีนปรับเปลี่ยนกิจกรรมตัวรับ 1 (RAMP1) และ β-อาร์เรสติน เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 42182–42190 (2001).

ดีน, เอ็ม.เค. และคณะ Dimerization ของตัวรับ G-protein-coupled เจ เมด เคมี. 44, 4595–4614 (2001).

Gilman, A. โปรดตรวจสอบ EGO ที่ประตู มล. การแทรกแซง 1, 14–21 (2001).

Brzostowski, J. A. & amp Kimmel, A. R. การส่งสัญญาณที่ศูนย์ G: ฟังก์ชันที่ไม่ขึ้นกับ G-protein สำหรับตัวรับ 7-TM เทรนด์ไบโอเคม วิทย์. 26, 291–297 (2001).ตรวจสอบการส่งสัญญาณที่ไม่ขึ้นกับ G-โปรตีนโดยตัวรับ 7TM

เจิ้ง, บี. และคณะ RGS-PX1, GAP สำหรับ GαS และการคัดแยก nexin ในการค้ามนุษย์ตุ่ม ศาสตร์ 294, 1939–1942 (2001).

Ma, Y.C. และคณะ Src tyrosine kinase เป็นผลโดยตรงของโปรตีน G เซลล์ 102, 635–646 (2000).

McLaughlin, S. K. , McKinnon, P. J. & Margolskee, R. F. Gustducin เป็นโปรตีน G ที่จำเพาะต่อเซลล์รับรสซึ่งสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับทรานสดิวซิน ธรรมชาติ 357, 563–569 (1992).

Kwok-Keung Fung, B. & Stryer, L. Photolyzed rhodopsin กระตุ้นการแลกเปลี่ยน GTP สำหรับ GDP ที่ถูกผูกไว้ในส่วนนอกของเรตินอล Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 77, 2500–2504 (1980).

Meng, J. , Glick, J. L. , Polakis, P. & Casey, P. J. การทำงานร่วมกันระหว่างGαzและ Rap1GAP แสดงให้เห็นถึงรูปแบบใหม่ของการพูดคุยข้ามเซลล์ เจ. ไบโอล. เคมี. 274, 36663–36669 (1999).

Katada, T. et al. ส่วนประกอบควบคุม Guanine nucleotide-binding ที่มีฤทธิ์ยับยั้งของ adenylate cyclase คุณสมบัติและหน้าที่ของโปรตีนบริสุทธิ์ เจ. ไบโอล. เคมี. 259, 3568–3577 (1984).

Bokoch, G. M. และคณะ การทำให้บริสุทธิ์และสมบัติของส่วนประกอบควบคุมการจับกัวนีนนิวคลีโอไทด์ที่ยับยั้งของอะดีนิเลตไซคเลส เจ. ไบโอล. เคมี. 259, 3560–3567 (1984).

Chikumi, H. และคณะ การกระตุ้น RhoA ที่มีศักยภาพโดยตัวรับ Gαq และ Gq-coupled เจ. ไบโอล. เคมี. 277, 27130–27134 (2002).

Booden, M. A. , Siderovski, D. P. & amp Der, C. J. ปัจจัยการแลกเปลี่ยน Rho guanine นิวคลีโอไทด์ที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งเม็ดเลือดขาวช่วยกระตุ้นการกระตุ้น RhoA ควบคู่ไปกับGαq มล. เซลล์. ไบโอล. 22, 4053–4061 (2002).

Smrcka, A. V. , Hepler, J. R. , Brown, K. O. & Sternweis, P. C. ระเบียบของกิจกรรม phospholipase C เฉพาะของ polyphosphoinositide โดย Gq บริสุทธิ์ ศาสตร์ 251, 804–807 (1991).

Meigs, T. E. , Fields, T. A. , McKee, D. D. & Casey, P. J. ปฏิกิริยาของ Gα12 และ Gα13 กับโดเมน cytoplasmic ของ cadherin ทำให้เกิดกลไกสำหรับการปล่อยβ-catenin Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 98, 519–524 (2001).

Kozasa, T. และคณะ p115 RhoGEF โปรตีนกระตุ้น GTPase สำหรับ Gα12 และ Gα13 ศาสตร์ 280, 2109–2111 (1998).

Boyer, J. L. , Waldo, G. L. & amp Harden, T. K. βγ-Subunit การเปิดใช้งานของ G-protein-controlled phospholipase C. เจ. ไบโอล. เคมี. 267, 25451–25456 (1992).

แคมป์, M. et al. การกระตุ้นด้วยการคัดเลือกไอโซไซม์ของฟอสโฟไลเปส C-β2 โดยจีโปรตีน βγ-หน่วยย่อย ธรรมชาติ 360, 684–686 (1992).

เหยือก, เจ.เอ. และคณะ บทบาทของหน่วยย่อย βγ ของโปรตีน G ในการกำหนดเป้าหมายไคเนสของตัวรับ β-adrenergic ไปยังตัวรับที่ถูกผูกไว้กับเมมเบรน ศาสตร์ 257, 1264–1267 (1992).

Tang, W. J. & Gilman, A. G. ระเบียบเฉพาะประเภทของ adenylyl cyclase โดยหน่วยย่อย G โปรตีนβγ ศาสตร์ 254, 1500–1503 (1991).

Stephens, L. และคณะ การทำงานของไคเนสฟอสโฟโนซิไทด์ 3 แบบใหม่ในเซลล์ที่ได้มาจากมัยอีลอยด์ถูกกระตุ้นโดยหน่วยย่อยโปรตีน G βγ เซลล์ 77, 83–93 (1994).

Logothetis, D. E. และคณะ หน่วยย่อย βγ ของโปรตีนที่จับกับ GTP กระตุ้นช่อง K + มัสคารินิกในหัวใจ ธรรมชาติ 325, 321–326 (1987).การสาธิตครั้งแรกในระบบของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีแนวคิดแบบหัวรุนแรงในขณะนั้นว่า G-protein βγ dimers สามารถกระตุ้นเอฟเฟกต์ได้โดยตรง

Chen, C. K. และคณะ การตอบสนองของแสงที่ผิดปกติและการตายของเซลล์ที่เกิดจากแสงในแท่งที่ไม่มีโรดอปซินไคเนส Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 96, 3718–3722 (1999).

เจเบอร์, เอ็ม. และคณะ บทบาทสำคัญของไคเนส 1 ตัวรับ β-adrenergic ในการพัฒนาและการทำงานของหัวใจ Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 93, 12974–12979 (1996).

Rockman, H.A. และคณะ การแสดงออกของตัวรับไคเนส 1 ตัวรับ β-adrenergic ช่วยป้องกันการพัฒนาของภาวะกล้ามเนื้อหัวใจล้มเหลวในหนูที่มียีนเป้าหมาย Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 95, 7000–7005 (1998).

Peppel, K. และคณะ การหยุดชะงักของยีน G รีเซพเตอร์ที่ควบคู่กับโปรตีนไคเนส 3 (GRK3) นำไปสู่การสูญเสียการเสื่อมสภาพของตัวรับกลิ่น เจ. ไบโอล. เคมี. 272, 25425–25428 (1997).

วอล์คเกอร์ เจ.เค. และคณะ การเปลี่ยนแปลงของทางเดินหายใจและการตอบสนองของหัวใจในหนูทดลองที่ไม่มี G โปรตีน-coupled receptor kinase 3 เป็น. เจ. ฟิสิออล. 276, R1214–R1221 (1999).

Gainetdinov, R. R. et al. Muscarinic supersensitivity และ desensitization รีเซพเตอร์บกพร่องใน G protein-coupled receptor kinase 5-deficiency เซลล์ประสาท 24, 1029–1036 (1999).

Fong, A. M. และคณะ คีโมแทกซิสลิมโฟไซต์ที่บกพร่องในหนูที่ขาด β-arrestin2- และ GRK6 Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 99, 7478–7483 (2002).

คอนเนอร์, ดี.เอ. และคณะ หนูที่น่าพิศวง β-Arrestin1 ดูเหมือนปกติ แต่แสดงให้เห็นถึงการตอบสนองของหัวใจที่เปลี่ยนแปลงไปต่อการกระตุ้น β-adrenergic เซอร์ ความละเอียด 81, 1021–1026 (1997).

Bohn, L. M. และคณะ ยาแก้ปวดมอร์ฟีนที่ได้รับการปรับปรุงในหนูที่ไม่มี ar-arrestin 2 ศาสตร์ 286, 2495–2498 (1999).

Bohn, L. M. และคณะ μ-Opioid receptor desensitization โดย β-arrestin-2 กำหนดความทนทานต่อมอร์ฟีน แต่ไม่ขึ้นอยู่กับการพึ่งพา ธรรมชาติ 408, 720–723 (2000).

Dohlman, H. G. & Thorner, J. W. ระเบียบการส่งสัญญาณที่เริ่มด้วยโปรตีน G ในยีสต์: กระบวนทัศน์และหลักการ อันนุ. รายได้ Biochem. 70, 703–754 (2001).


ตัวรับเป้าหมาย 7 TM G-Protein-Coupled †

บทวิจารณ์นี้จะปรากฏในภายหลังเป็นบทในหนังสือ ชีววิทยาเคมี—ตั้งแต่โมเลกุลขนาดเล็กไปจนถึงชีววิทยาระบบและการออกแบบยา (บรรณาธิการ: S. Schreiber, T. Kapoor, G. Wess), Wiley-VCH, Weinheim ซึ่งมีกำหนดเผยแพร่ในเดือนพฤศจิกายน 2549

เชิงนามธรรม

วิธีการทางชีววิทยาเคมีมีประวัติศาสตร์อันยาวนานในการสำรวจกลุ่ม G-protein-coupled receptor (GPCR) ซึ่งเป็นกลุ่มเป้าหมายที่ใหญ่ที่สุดและสำคัญที่สุดสำหรับการรักษา การวิเคราะห์จีโนมมนุษย์เผยให้เห็นสมาชิกใหม่จำนวนมากที่ไม่ทราบหน้าที่ทางสรีรวิทยา ซึ่งปัจจุบันเป็นจุดสนใจของโครงการค้นหายาแบบย้อนกลับทางเภสัชวิทยาหลายโครงการ เนื่องจากเซ็กเมนต์ของเมมเบรนที่ไม่ชอบน้ำเจ็ดเซ็กเมนต์เป็นการกำหนดลักษณะโครงสร้างทั่วไปของรีเซพเตอร์เหล่านี้ และเนื่องจากการส่งสัญญาณผ่านโปรตีนเฮเทอโรไตรเมอร์ G ไม่ได้แสดงให้เห็นในทุกกรณี โปรตีนเหล่านี้ยังถูกเรียกว่าทรานส์เมมเบรนเจ็ดตัว (7 TM) หรือตัวรับเซอร์เพนไทน์ การทบทวนนี้สรุปเหตุการณ์สำคัญทางประวัติศาสตร์ที่สำคัญของการวิจัย GPCR ตั้งแต่เริ่มต้น เมื่อเภสัชวิทยาเป็นคำอธิบายเป็นส่วนใหญ่ จนถึงอายุของอณูชีววิทยาสมัยใหม่ ด้วยการโคลนของตัวรับแรกและตอนนี้มีรายการ GPCR ของมนุษย์ทั้งหมดตามลำดับและโปรตีน ระดับ. แสดงให้เห็นว่าการค้นพบยาที่ควบคุมโดย GPCR ในขั้นต้นนั้นมีพื้นฐานมาจากการทดสอบสารประกอบทางเคมีที่ผลิตขึ้นโดยเฉพาะอย่างพิถีพิถันเพียงไม่กี่ชนิดได้อย่างไร และปัจจุบันถูกดำเนินการด้วยวิธีการค้นพบยาสมัยใหม่ ซึ่งรวมถึงการออกแบบห้องสมุดแบบผสมผสาน ชีววิทยาเชิงโครงสร้าง สารสนเทศระดับโมเลกุล และเทคโนโลยีการคัดกรองขั้นสูงสำหรับ การระบุสารประกอบใหม่ที่กระตุ้นหรือยับยั้ง GPCR โดยเฉพาะ สารประกอบดังกล่าว ร่วมกับเทคโนโลยีใหม่อื่น ๆ ช่วยให้เราสามารถศึกษาบทบาทของตัวรับในด้านสรีรวิทยาและการแพทย์ และหวังว่าจะส่งผลให้เกิดการบำบัดแบบใหม่ นอกจากนี้เรายังสรุปว่าการวิจัยขั้นพื้นฐานเกี่ยวกับกลไกการส่งสัญญาณและการควบคุมของ GPCR มีความก้าวหน้าอย่างไร ซึ่งนำไปสู่การค้นพบโปรตีนที่โต้ตอบกับ GPCR ใหม่ และด้วยเหตุนี้จึงเป็นการเปิดมุมมองใหม่ๆ สำหรับการพัฒนายา ตัวอย่างที่ใช้งานได้จริงจากการศึกษานิพจน์ GPCR, HTS (การตรวจคัดกรองปริมาณงานสูง) และการออกแบบห้องสมุดรวมที่เน้น GPCR ที่เกี่ยวข้องกับโมโนเอมีนแสดงให้เห็นถึงการวิจัยทางชีววิทยาเคมีของ GPCR ที่กำลังดำเนินอยู่ สุดท้ายนี้ เราสรุปความก้าวหน้าในอนาคตที่อาจเกี่ยวข้องกับการค้นพบในปัจจุบันกับการพัฒนายาใหม่


ตัวรับโปรตีนควบคู่ของแมลง G และการถ่ายโอนสัญญาณ

รีเซพเตอร์คู่โปรตีน G (GPCR) เป็นโปรตีนเจ็ดเมมเบรน (7-TM) ที่แปลงสัญญาณภายนอกเซลล์ไปเป็นการตอบสนองทางสรีรวิทยาของเซลล์ผ่านการกระตุ้นของโปรตีนการจับกัวนีนนิวคลีโอไทด์ (หน่วยย่อย αβγ) คุณสมบัติทั่วไปของพวกมันได้รับการอนุรักษ์ไว้เป็นอย่างดีในช่วงวิวัฒนาการ Despite this general resemblance, a large variety of different signals are mediated via this category of receptors. Several GPCR-(sub)families have an ancient origin that is situated before the divergence of Protostomian and Deuterostomian animals. Nevertheless, an enormous diversification has occurred since then. The availability of novel sequence information is growing very rapidly as a result of molecular cloning experiments and of metazoan genome (Caenorhabditis elegans, แมลงหวี่ melanogaster, โฮโมเซเปียนส์) and EST (expressed sequence tags) sequencing projects. The Drosophila Genome Sequencing Project will certainly have an important impact on insect signal transduction and receptor research. In parallel, convenient expression systems and functional assay procedures will be needed to investigate insect receptor properties and to monitor the effects of natural and artificial ligands. The study of the evolutionary aspects of G protein–coupled receptors and of their signaling pathways will probably reveal insect-specific features. More insight into these features may result in novel methods and practical applications. โค้ง. แมลงชีวเคมี. Physiol. 48:1–12, 2001. © 2001 Wiley-Liss, Inc.


เชิงนามธรรม

Prostaglandins play a critical physiological role in both cardiovascular and immune systems, acting through their interactions with 9 prostanoid G protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are important therapeutic targets for a variety of diseases including arthritis, allergies, type 2 diabetes, and cancer. The DP prostaglandin receptor is of interest because it has unique structural and physiological properties. Most notably, DP does not have the 3–6 ionic lock common to Class A GPCRs. However, the lack of X-ray structures for any of the 9 prostaglandin GPCRs hampers the application of structure-based drug design methods to develop more selective and active medications to specific receptors. We predict here 3D structures for the DP prostaglandin GPCR, based on the GEnSeMBLE complete sampling with hierarchical scoring (CS-HS) methodology. This involves evaluating the energy of 13 trillion packings to finally select the best 20 that are stable enough to be relevant for binding to antagonists, agonists, and modulators. To validate the predicted structures, we predict the binding site for the Merck cyclopentanoindole (CPI) selective antagonist docked to DP. We find that the CPI binds vertically in the 1–2–7 binding pocket, interacting favorably with residues R310 7.40 and K76 2.54 with additional interactions with S313 7.43 , S316 7.46 , S19 1.35 , etc. This binding site differs significantly from that of antagonists to known Class A GPCRs where the ligand binds in the 3–4–5–6 region. We find that the predicted binding site leads to reasonable agreement with experimental Structure–Activity Relationship (SAR). We suggest additional mutation experiments including K76 2.54 , E129 3.49 , L123 3.43 , M270 6.40 , F274 6.44 to further validate the structure, function, and activation mechanism of receptors in the prostaglandin family. Our structures and binding sites are largely consistent and improve upon the predictions by Li et al. ( แยม. เคมี. ซ. 2007 , 129 (35), 10720) that used our earlier MembStruk prediction methodology.


Death Receptor Signaling Pathway

Death receptors are cell surface receptors that transmit apoptotic signals initiated by specific ligands and play a central role in instructive apoptosis. Death receptors belong to the tumor necrosis factor receptor (TNFR) gene superfamily. Eight members of the death receptor family have been characterized so far: TNFR1 (also known as DR1, CD120a, p55 and p60), CD95 (also known as DR2, APO-1 and Fas), DR3 (also known as APO-3, LARD, TRAMP and WSL1), TRAILR1 (also known as DR4 and APO-2), TRAILR2 (also known as DR5, KILLER and TRICK2), DR6, ectodysplasin A receptor (EDAR) and nerve growth factor receptor (NGFR). These death receptors are distinguished by a cytoplasmic region of

80 residues termed the death domain (DD). When these receptors are triggered by corresponding ligands, a number of molecules are recruited to the death domain and subsequently a signaling cascade is activated. Two types of death receptor signaling complex can be distinguished. The first group comprises the death-inducing signaling complexes (DISCs) that result in the activation of caspase-8, which plays the central role in transduction of the apoptotic signal. DISC is formed at the CD95 receptor, TRAILR1 or TRAILR2. The second group comprises the TNFR1, DR3, DR6 and EDAR. These recruit a different set of molecules, which transduce both apoptotic and survival signals.


The Molecular Basis of G Protein𠄼oupled Receptor Activation

G protein–coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to external stimuli. Upon activation by a ligand, the receptor binds to a partner heterotrimeric G protein and promotes exchange of GTP for GDP, leading to dissociation of the G protein into α and βγ subunits that mediate downstream signals. GPCRs can also activate distinct signaling pathways through arrestins. Active states of GPCRs form by small rearrangements of the ligand-binding, or orthosteric, site that are amplified into larger conformational changes. Molecular understanding of the allosteric coupling between ligand binding and G protein or arrestin interaction is emerging from structures of several GPCRs crystallized in inactive and active states, spectroscopic data, and computer simulations. The coupling is loose, rather than concerted, and agonist binding does not fully stabilize the receptor in an active conformation. Distinct intermediates whose populations are shifted by ligands of different efficacies underlie the complex pharmacology of GPCRs.


ผลลัพธ์

Β1AR Disrupts Kv11.1/14-3-3ε Association

Figure 1A shows that Kv11.1 coimmunoprecipitated with cotransfected 14-3-3ε, a result that is consistent with the report of Kagan และคณะ (2002). Interestingly, coexpression of β1ARwt disrupts the interaction, both in basal and Iso stimulated conditions. A detailed electrophysiological analysis of Kv11.1 currents upon Iso β1AR stimulation was performed in CHO cells stably expressing Kv11.1 channels cotransfected or not with the cDNA encoding β1ARwt. Figure 1, B and E, shows families of current traces for control conditions and after 10-min exposure to 1 nM Iso, obtained by applying 5-s pulses, imposed in 20-mV increments between −80 and +60 mV. The holding potential was fixed at −80 mV, and tail currents were recorded upon repolarization to −60 mV. In nontransfected cells (which express low levels of endogenous βAR, unpublished data), Iso accelerated the time course of activation but did not modify the maximum outward current and the time course of deactivation (n = 6 Figure 1B, Table 1). In cells expressing β1ARwt, Iso decreased both the outward and the tail current and accelerated the time course of the initial phase of deactivation, without modifying the time course of activation (n = 6 Figure 1E, Table 1). Panels C, F and D, G show the current-voltage plots of steady-state current at the end of the depolarizing step and the activation curves obtained in the presence and the absence of Iso in nontransfected (C and D) and in β1ARwt-transfected (F and G) cells. In nontransfected cells, Iso did not significantly modify either the steady state current or the slope of the activation curve (Figure 1, C and D), whereas it slightly shifted the midpoint of the activation curve to more negative potentials (Table 1). Such minor Iso-induced changes in channel activity in the absence of transfected β1AR appear to be not receptor-mediated, because it was also observed in the presence of 1 μM propranolol (unpublished data). In cells expressing β1ARwt Iso significantly decreased the current amplitude at −20 and −10 mV (Figure 1F) and the tail current amplitude after pulses between −20 and +60 mV (Figure 1G), without modifying the voltage dependence of activation (n = 6, p > 0.05 Table 1).

Figure 1. β1AR disrupts Kv11.1/14-3-3ε association and Iso inhibits Kv11.1 currents. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of β1ARwt. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed by using specific channel antibodies. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in วัสดุและวิธีการ Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces obtained by applying 5-s pulses that were imposed in 20-mV increments between −80 mV and +60 mV. Deactivating Kv11.1 tail currents were recorded at −60 mV. Currents were obtained in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected (E) or not (B) with β1ARwt. (C and F) Mean Kv11.1 current-voltage relationship 5-s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated experimental conditions. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated conditions. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Table 1. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τNS, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.

a p < 0.05 vs. data obtained in control conditions.

Β1AR Directly Interacts with 14-3-3ε

A possible explanation for the inhibition of Kv11.1/14-3-3ε interaction in the presence of β1AR may be a direct competition between Kv11.1 and β1AR for 14-3-3ε proteins. In this regard, in the third cytoplasmic loop and the C-terminal region of the β1AR there are PKA phosphorylation sites (Rapacciuolo และคณะ, 2003 RRPNSRLV and RPRANSGCL, respectively) that exhibit certain homology with the consensus binding site of 14-3-3 proteins (Muslin และคณะ, 1996 Yaffe และคณะ, 1997). Therefore, we explored whether 14-3-3ε proteins bind to β1AR. To this end, HEK-293 cells were transiently transfected with tagged β1AR and 14-3-3ε constructs. Figure 2A shows that upon immunoprecipitation of β1AR, HA-tagged 14-3-3ε could be detected in the receptor complexes and that the presence of Iso promoted a marked increase in β1AR/14-3-3ε coimmunoprecipitation at 5 min of stimulation. These results suggest that activation of β1AR promotes conformational changes and/or triggers signaling pathways that facilitate the recruitment of 14-3-3 proteins to the receptor complex. The basal association of β1AR and 14-3-3ε in cotransfected cells is decreased upon incubation with the β-antagonist betaxolol (unpublished data), consistent with the idea that the reported basal β1AR activity associated with receptor overexpression (Engelhardt และคณะ, 2001) also triggers to certain extent the mechanisms underlying the association. To more clearly visualize the modulation of β1AR/14-3-3 binding by different agents, cells were pretreated with betaxolol to lower such basal recruitment.

Figure 2. β1AR stimulation increases β1AR/14-3-3ε association in HEK-293 cells and guinea pig heart. (A) HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε and pretreated with betaxolol for 1 h were challenged with Iso, and the association between β1AR and 14-3-3 proteins was investigated by immunoprecipitation and Western blot analysis as detailed in วัสดุและวิธีการ Data indicate the amount of coprecipitated 14-3-3ε proteins, normalized by receptor immunoprecipitation and referred to association in basal (i.e., nonstimulated) conditions, and are mean ± SEM of four independent experiments. Representative gels are shown left. (B) Endogenous β1AR/14-3-3ε complexes are present in guinea pig heart extracts. After incubation of dissociated heart tissue with Iso 10 μM for the indicated periods of time, β1AR were partially purified from solubilized heart membrane extracts by affinity chromatography using alprenolol-Sepharose columns. After elution, fractions were assayed for the presence of receptor and 14-3-3ε proteins by Western blot using specific antibodies as detailed in วัสดุและวิธีการ In the case of the β1AR, two bands are apparent in some fractions likely due to different glycosylation patterns. Gels are representative of two independent experiments.

To validate this association in a more physiological setting, we searched for the occurrence of these molecular complexes in endogenous conditions. After exposure of guinea pig heart samples to Iso for different periods of time, β1AR were partially purified by affinity chromatography using the antagonist alprenolol. On elution of bound receptors and their associated proteins, fractions were analyzed for the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins by using specific antibodies. Figure 2B indicates that 14-3-3ε proteins coeluted with purified endogenous receptors and that such coelution is increased upon agonist stimulation. This result confirms that β1AR and 14-3-3ε proteins associate ”in situ“ in the heart in an agonist-dependent way.

Consistent with the idea that stimulation of the cAMP/PKA pathway is involved in triggering β1AR/14-3-3ε binding, their coimmunoprecipitation is rapidly promoted by incubating cells with forskolin, a well-known AC activator (Figure 3A). Conversely, both basal and agonist-induced association is blocked in the presence of the PKA inhibitor H-89 (Figure 3B), but not by protein kinase C or mitogen-activated protein kinase/ERK kinase (MEK) inhibitors (Ro-31-8220 and PD98059, respectively). Overall, these data clearly establish that PKA activity is directly or indirectly required for triggering the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins in the same molecular complex.

Figure 3. The association between β1AR and 14-3-3 proteins is direct and dependent on PKA activity. HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε were stimulated with forskolin (A) or Iso in the absence or presence of the indicated protein kinase inhibitors (B). The receptors were then immunoprecipitated and the presence of 14-3-3ε proteins analyzed and quantitated as in Figure 1. Gels representative of three independent experiments are shown. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, A and B. (C) Phosphorylation of β1AR cytoplasmic domain by PKA. The indicated GST fusion protein, encompassing the third intracellular loop of the β1AR, or GST as a control was incubated with PKA as detailed in Material and Methods, resolved by electrophoresis and analyzed by Coomassie blue staining or autoradiography ( 32 P). (D) The β1AR GST fusion protein (or GST as a control) was incubated in the absence or presence of PKA as in C. After washing, the GST proteins were incubated for 3 h in the presence of purified GST 14-3-3ε, and association to the latter protein was analyzed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies or a nonrelated IgG as a control. The immunoprecipitates were resolved by electrophoresis and blotted with 14-3-3ε or anti-GST antibodies to detect β1AR fusion protein, migration of which (including a GST-3il-β1AR proteolytic fragment) is shown with asterisks. Results are representative of two independent experiments.

To test if PKA phosphorylated β1AR would directly recruit 14-3-3 proteins, we next performed in vitro assays with purified 14-3-3ε and a β1AR cytoplasmic domain fusion protein. As shown in Figure 3C, a GST-fusion protein encompassing the third intracellular loop of the β1AR (GST-3il-β1AR) was readily phosphorylated in the presence of purified PKA. The GST-β1AR construct were subsequently incubated with purified GST-14-3-3ε, followed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies (or control nonrelated antibodies). Figure 3D shows a robust, specific interaction of 14-3-3ε with GST-3il-β1AR in a PKA phosphorylation–dependent way.

Mutation of PKA Phosphorylation Sites Renders β1AR Unable To Associate to 14-3-3ε and To Compete Its Interaction with Kv11.1

Overall, these results demonstrated a direct interaction between 14-3-3ε and PKA-phosphorylated β1AR. To further explore this point, we generated different β1AR mutants (β1ARS312A, β1ARS412A, and the double mutant β1ARS312,412A) in which serine residues 312 and 412 were substituted for alanines, a modification reported to prevent their phosphorylation by PKA upon receptor stimulation (Rapacciuolo และคณะ, 2546). All these receptor constructs showed a similar pattern of adenylyl cyclase stimulation upon expression of comparable levels in HEK-293 cells and challenge with Iso (see Supplementary Figure S1). Despite such efficient activation of the cAMP signaling pathway, the ability of these mutants to associate to cotransfected 14-3-3ε isoforms, both in basal and agonist-stimulated conditions is completely lost in the double mutant β1ARS312,412A (Figure 4A) or markedly decreased for the individual mutants (Figure 4B), in comparison with β1ARwt. These results clearly indicate that PKA phosphorylation of the β1AR at these residues is required for the association of 14-3-3 proteins. In contrast, mutation of S312 to aspartate, which would mimic receptor phosphorylation, leads to an increased β1AR/14-3-3ε interaction even in basal conditions (Figure 4C).

Figure 4. Mutation of residues critical for PKA-mediated phosphorylation render β1AR unable to associate to 14-3-3ε proteins. HEK-293 cells were transiently transfected with HA-tagged 14-3-3ε and different Flag-tagged β1AR constructs. Cells were stimulated with Iso (10 μM) for the time indicated, and the association between the different receptors and 14-3-3ε proteins assessed as in previous figures. Gels are representative of 3–4 independent experiments. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to the wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, C–E.

Β1ARwt and Mutants Unable To Interact with 14-3-3ε Display a Different Pattern of Modulation of Kv11.1

Our data suggested that β1AR stimulation would sequentially lead to PKA activation, receptor phosphorylation, and recruitment of 14-3-3ε proteins to the complex, which would displace these molecules from their binding sites in Kv11.1 channels. To explore this hypothesis, we tested whether the presence of β1AR mutants, differing in their ability to recruit 14-3-3ε, had different effects on the interaction between Kv11.1 and 14-3-3ε.

In contrast to the disruption of binding observed with β1ARwt, the Kv11.1/14-3-3ε association is preserved upon expression of similar levels of β1ARS312,412A (Figure 5A). In this case the presence of Iso leads to an enhanced association, in agreement with the expected increase in PKA-phosphorylated Kv11.1. Consistently, the β1ARS312A mutant, which barely displays association with 14-3-3, is also unable to disrupt the Kv11.1/14-3-3 binding, whereas β1AR S312D markedly inhibits Kv11.1/14-3-3 coimmunoprecipitation, as the β1ARwt does (Figure 5A, right panel).

Figure 5. Modulation of Kv11.1/14-3-3ε interaction and Kv11.1 currents by expression of different β1AR mutants. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of the indicated β1AR constructs. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed as in Figure 1A. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in วัสดุและวิธีการ. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces were obtained and analyzed as detailed in Figure 1 in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected with β1ARS312,412A or β1ARS312D as indicated. (C and F) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Interestingly, in cells expressing β1ARS312,412A (Figure 5B) Iso increased the maximum outward current and accelerated the time course of activation but did not modify the time course of deactivation (Table 1). In contrast to the results obtained with β1ARwt (see Figure 1, E–G), Iso significantly increased the maximum outward current amplitude at negative potentials (Figure 5C) and markedly shifted the voltage-dependence of activation (Figure 5D), which may explain the increase in the tail and maximum outward currents observed at negative potentials (n = 6–9 p < 0.05 vs. control Table 1). It should be stressed that in cells expressing β1ARS312A or β1AR S412A the effects produced by Iso on current amplitude, as well as on the time- and voltage-dependent properties of the channels, were almost identical to those produced in cell expressing β1ARS312,S412A (Table 1). On the contrary, in cells expressing the β1ARS312D mutant (Figure 5, E–G), Iso accelerated the time course of the initial phase of deactivation (Table 1) and decreased the maximum outward current at potentials between −20 and +20 mV and the tail current elicited by applying pulses positive to −30 mV, without modifying the voltage-dependence of the activation (Figure 5G and Table 1), a situation reminiscent of the effects observed in cells expressing β1ARwt (Figure 1, E–G).

To better compare the effects induced by Iso, in Figures 6, I–K the percentages of change in the maximum outward current that elicited at −20 mV and in the amplitude of tail currents elicited after pulses to +60 mV or to −20 mV are shown. In cells expressing β1ARWt or β1ARS312D, Iso decreased the current amplitude at −20 mV by 19.9 ± 5.4% (n = 6) and by 23.5 ± 1.8% (n = 7), respectively (panel I), whereas in cells not transfected with β1AR, Iso increased the current by 13.9 ± 3.2% (n = 6). In cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A, Iso markedly increased the current amplitude (n = 6–9, p < 0.05 vs. increase in nontransfected cells panel I). In cells expressing β1ARwt or β1ARS312D, Iso inhibited the tail current after pulses to + 60 mV (panel J) by 30.1 ± 5.3 and 32.1 ± 12.3%, respectively. In contrast, the reduction of the tail currents induced by Iso in nontransfected cells and in cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A was significantly lower (p < 0.01, n = 6–9 panel J). Moreover, in these mutants again in contrast to the ≈20% inhibition observed in cells expressing β1ARwt or S312D, Iso significantly increased the tail current amplitude after pulses to −20 mV (n = 6–9 Figure 6K).

Figure 6. The differential effect of Iso on Kv11.1 currents mediated by β1ARwt or β1AR S312,412A is abolished in the presence of 14-3-3 inhibitors. (A, C, E, and G) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1AR wt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (A and C) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (E and G). (B, D, F, and H) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1ARwt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (B and D) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (F and H). (I–K) Percentage of change induced by 1 nM Iso in the different conditions in the amplitude of Kv11.1 currents elicited after 5-s pulses to −20 mV (I) and tail currents elicited on repolarization to −60 mV after 5-s pulses to +60 mV (J) and −20 mV (K). In I *p < 0.05 versus Kv11.1. In J, *p <0.05 versus data obtained in β1ARwt transfected cells, # p < 0.05 versus data obtained in β1ARS312,S412A-transfected cells. Each point or bar represents the mean ± SEM of ≥6 experiments.

To confirm that 14-3-3 proteins are involved in these differential effects of the β1AR phosphorylation deficient mutants on Kv11.1 current modulation, we next performed similar experiments in conditions where endogenous 14-3-3 function was inhibited. We first studied the effects of Iso in the presence of R-18 (200 nM), an unphosphorylated peptide that binds to all 14-3-3 isoforms with equal affinities producing a competitive inhibition (Wang และคณะ, 2542). Because it can be presumed that the membrane diffusion of R-18 would be limited, this inhibitor was added to the internal solution that dialyzed the cells when the patch seals were broken. Kv11.1 currents recorded in R-18 dialyzed cells were of similar amplitude to those recorded in not dialyzed cells (p > 0.05) and exhibited the same time- and voltage-dependent properties. Interestingly, under these conditions, the differential effects produced by Iso on Kv11.1 currents in β1ARwt- and β1ARS312,412A-transfected cells were not observed. Iso similarly inhibited the maximum outward current elicited in cells expressing either β1ARwt or β1ARS312,S412A (Figure 6, A and C), as well as the tail currents elicited on return to −60 mV (Figure 6, B and D). Furthermore, Iso did not modify either the time course of channel activation and deactivation, or the voltage-dependence of activation (Table 2). Similar results were obtained when a different strategy of inhibition of 14-3-3 function based on cotransfection with a DN14-3-3 mutant was used (Figure 6, E–H, and Table 2). The effects of Iso on Kv11.1 channels in cells expressing β1AR wt or β1ARS312,S412A in the presence of 14-3-3 inhibitors, were qualitatively identical and not quantitatively different to those produced in cells expressing β1ARwt in the absence of inhibitors.

Table 2. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage-dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τNS, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.


ดูวิดีโอ: Receptores celulares (สิงหาคม 2022).