ข้อมูล

ความเข้มข้นของไอโซพรีนอยด์ไดฟอสเฟตในยีสต์ saccharomyces cerevisiae

ความเข้มข้นของไอโซพรีนอยด์ไดฟอสเฟตในยีสต์ saccharomyces cerevisiae


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ไอโซพรีนอยด์ไดฟอสเฟต (IPP) เป็นสารเมแทบอไลต์ที่สำคัญซึ่งเป็นสารตั้งต้นในเมตาโบไลต์ทุติยภูมิจำนวนมาก เช่น โดลิโคลไดฟอสเฟต ยูบิควิโนน โปรตีนพรีไนเลต และแคโรทีนอยด์ (ไม่ได้สังเคราะห์ใน s cerevisiae)

ความเข้มข้นเฉลี่ยของ IPP ที่มีอยู่ในยีสต์ต่อกรัมคือเท่าใด ?


แม้ว่าข้อมูลนี้จะไม่ได้ให้คำตอบโดยตรงสำหรับคำถามของคุณ แต่ฉันหวังว่าข้อมูลนี้จะเป็นตัวกำหนดสิ่งที่จะทำได้ในวิศวกรรมเมตาบอลิซึมจาก IPP นอกจากนี้ยังควรเป็นจุดเริ่มต้นสำหรับการวิจัยวรรณกรรมเพิ่มเติม

นี่เป็นการทบทวนเมื่อเร็ว ๆ นี้เกี่ยวกับวิศวกรรมเมตาบอลิซึมของเส้นทางที่เกี่ยวข้องในระบบจุลินทรีย์ต่างๆ รวมถึง แซคคาฮาร์มอยส์:

Ajikumar PK et al. (2008) Terpenoids: โอกาสในการสังเคราะห์ทางชีวภาพของยาที่ผลิตจากธรรมชาติโดยใช้จุลินทรีย์ที่ออกแบบ เภสัชโมเลกุล 5: 167-190

การทบทวนหมายถึง:

โร, ดี. และคณะ (2549) การผลิตกรดอาร์เทมิซินิกสารตั้งต้นของยาต้านมาเลเรียในยีสต์วิศวกรรม ธรรมชาติ 440, 940-943.

ในงานนี้ การแนะนำยีนเฉพาะของทางเดินนำไปสู่การผลิต 4.4 มก. L-1 ของผลิตภัณฑ์ เพิ่มขึ้นเป็น 153 มก. L-1 โดยการปรุงแต่งหลายอย่าง ได้แก่ :

การเพิ่มฟลักซ์ผ่านทางเดินโดยการแสดง HMG CoA reductase ที่ดัดแปลงแล้ว

ลดฟลักซ์ในการสังเคราะห์สเตอรอลโดยการปรับลด ERG9 ยีนรวมกับการแสดงออกของอัลลีลเชิงลบที่โดดเด่นของปัจจัยการถอดรหัส Upc2

อัปเดต

หลังจากโพสต์คำตอบของฉัน ฉันพบเอกสารนี้:

หวาง, บี. et al. (2011) การวิเคราะห์เมตาโบไลต์เป้าหมายของวิถีไอโซพรีนอยด์ใน Saccharomyces cerevisiae เพื่อตอบสนองต่อการดัดแปลงทางพันธุกรรมโดย GC-SIM-MS ควบคู่ไปกับเคมีบำบัด เมตาบอลิซึม 7:134-146

บทความนี้มีการอภิปรายโดยละเอียดเกี่ยวกับระเบียบวิธีต่างๆ ซึ่งฉันจะไม่กล่าวถึงในที่นี้

แม้ว่าจะไม่มีการวัดค่า IPP แต่ในตารางที่ 7 ได้แสดงผลลัพธ์นี้: geranyl pyrophosphate 32 ng ml-1 ในวัฒนธรรม 48 ชั่วโมง A600 ~ 2.3. ERG9 การหยุดชะงักเพิ่มขึ้นเป็น 56 ng ml-1

เท่าที่ฉันสามารถบอกได้ว่าค่าเหล่านี้แสดงเป็น ng ml-1 วัฒนธรรมดั้งเดิม การใช้ 1 U ของ OD600 เท่ากับ 0.41 g ของเซลล์แห้งลิตร-1 ที่นำมาจากที่นี่ ฉันจะคำนวณค่า GPP ที่ 34 µg g-1 น้ำหนักแห้งในสายพันธุ์ป่า


การผลิตรีคอมบิแนนท์ระดับสูงของสควาลีนโดยใช้ที่เลือกไว้ Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์

สำหรับการผลิตรีคอมบิแนนท์ของสควาลีน ซึ่งเป็นสารประกอบไตรเทอร์พีนอยด์ที่มีการใช้งานในอุตสาหกรรมเพิ่มขึ้น ในจุลินทรีย์ที่ได้รับการยอมรับโดยทั่วไปว่าปลอดภัย เราได้คัดเลือก Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์เพื่อตรวจสอบความเหมาะสม พบการพึ่งพาความเครียดที่แข็งแกร่งในการผลิตสควาลีนในหมู่ Saccharomyces cerevisiae ความเครียดจากการแสดงออกของยีนที่มากเกินไปซึ่งมีความสำคัญต่อการสังเคราะห์ไอโซพรีนอยด์ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การผลิตสควาลีนในระดับสูง (400 ± 45 มก./ลิตร) ได้รับในขวดเขย่าที่มียีน Y2805 แสดงออกมากเกินไปซึ่งเข้ารหัสการสังเคราะห์ฟาร์นีซิล ไดฟอสเฟตจากแบคทีเรีย (ispA) และรูปแบบตัดปลายของไฮดรอกซิล-3-เมทิลกลูทาริล-CoA รีดักเตส (tHMG1). การยับยั้ง squalene epoxidase บางส่วนโดย terbinafine เพิ่มการผลิต squalene ได้ถึง 1.9 เท่า (756 ± 36 มก./ลิตร) นอกจากนี้ การผลิตสควาลีนของปี 2011 ± 75 หรือ 1026 ± 37 มก./ลิตร ได้มาจากการหมักแบบเลี้ยงด้วยอาหารสัตว์ 5-L เมื่อมีหรือไม่มีการเสริมเทอร์บินาไฟน์ตามลำดับ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าสายพันธุ์ Y2805 มีศักยภาพในการเป็นแหล่งผลิตสควาลีนทางเลือกใหม่

นี่คือตัวอย่างเนื้อหาการสมัครสมาชิก เข้าถึงผ่านสถาบันของคุณ


กระบวนการสังเคราะห์ไอโซพรีนอยด์

รูปที่ 2 เส้นทางการเผาผลาญสำหรับการผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพที่ใช้ไอโซพรีนอยด์ในระบบที่มีชีวิต เส้นทาง mevalonate (MVA) มาจาก acetyl-CoA และเส้นทาง deoxyxylulose 5-phosphate (DXP) มาจาก glyceraldehyde-3-phosphate และ pyruvate IPP, isoprenyl diphosphate DMAPP, dimethylallyl diphosphate IDI, isoprenyl diphosphate isomerase nudiX, nucleoside diphosphate hydrolases GPP, geranyl pyrophosphate FPP, farnesyl pyrophosphate GPPS, geranyl pyrophosphate synthase FPPS, farnesyl pyrophosphate ซินธิเนส pyrophosphatase ภายนอก

ผลิตภัณฑ์เชื้อเพลิงชีวภาพที่ใช้ไอโซพรีนอยด์ขั้นปลาย

รูปที่ 3 การปรับเส้นทางให้เหมาะสมสำหรับการผลิตที่เพิ่มขึ้นของเชื้อเพลิงชีวภาพที่มีไอโซพรีนอยด์จากโฮสต์โปรคาริโอต ลูกศรเปิดและเติมแสดงถึงการแสดงออกร่วมกันและการแสดงออกของโปรตีนหลอมรวม ตามลำดับ ยีนในอักษรตัวพิมพ์ใหญ่มีความแตกต่างกัน ในขณะที่ยีนในอักษรตัวพิมพ์เล็กมีลักษณะภายนอก/คล้ายคลึงกัน กล่องเส้นทึบแสดงเส้นทางต้นน้ำแบบเดิม (เส้นทาง MVA และ DXP) ในขณะที่กล่องเส้นประแสดงเส้นทางใหม่ผ่านการแยกตัวของเส้นทาง MVA แบบเดิม atoB, ยีน acetyl-CoA acetyltransferase HMGS, ไฮดรอกซีเมทิลกลูตาริล-CoA synthase HMGR, ไฮดรอกซีเมทิลกลูตาริล-CoA reductase MK, mevalonate kinase PMK, phosphomevalonate kinase PMD, mevalonate diphosphate decarboxylase dexoses-5 ฟอสเฟตซินซิลลูเลส ispD, 2--เมทิลเลอรีทริทอล-4-ฟอสเฟต ไซทิดิลทรานสเฟอเรส ยีน ispF, 2--เมทิลเลอรีทริทอล-2,4-ไซโคลไดฟอสเฟต ซินเทสยีน ispG, 1-ไฮดรอกซี-2-เมทิล-2-(อี) -butenyl-4-diphosphate synthase ยีน IPP, isoprenyl diphosphate DMAPP, dimethylallyl diphosphate idi/IDI, isoprenyl diphosphate isomerase nudF, B. subtilis ADP ไรโบส pyrophosphatase ยีน nudiX, นิวคลีโอไซด์ ไดฟอสเฟต hydrolases ฟอสเฟต ispA, farnes ไพโรฟอสเฟต ซินเทส PS, ไพนีน ซินเทส AFS, ฟาร์เนซีน ซินเทส BIS, บิสซาโบลีน ซินเทส OLETเจ, จอตกาลิคอคคัส sp. กรดไขมันดีคาร์บอกซิเลส

ผลลัพธ์

การแสดงออกของ .มากเกินไป SRT1 ยับยั้งการเจริญเติบโตและข้อบกพร่องของไกลโคซิเลชันของ rer2

Srt1p แสดงความเป็นเอกลักษณ์ 30% กับ Rer2p ในลำดับกรดอะมิโน โครงสร้าง Srt1p (กรดอะมิโน 343 ตัว) มีขนาดใหญ่กว่า Rer2p (กรดอะมิโน 286 ตัว) และมีกรดอะมิโนที่ปลาย N เพิ่มขึ้นอีกประมาณ 30 ตัว ซึ่งค่อนข้างไม่ชอบน้ำ การหยุดชะงักของ RER2 ส่งผลให้เกิดข้อบกพร่องในการเติบโตอย่างรุนแรงในขณะที่การหยุดชะงักของ SRT1 ทำให้ไม่มีฟีโนไทป์การเติบโตที่ชัดเจน ( Sato et al. 2542 ). ในทางกลับกัน การแสดงออกที่มากเกินไปของ SRT1 สามารถกู้คืนข้อบกพร่องการเจริญเติบโตของ Δrer2 เกือบถึงระดับไวด์ (รูปที่ 1A) การกลายพันธุ์สองครั้งของ Δrer2 Δsrt1 เป็นสิ่งที่คงอยู่ไม่ได้ ( Sato et al. 2542 ). การสังเกตทางพันธุกรรมเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Rer2p และ Srt1p มีหน้าที่ซ้ำซ้อน แต่ Rer2p นั้นให้กิจกรรมหลักที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ นอกจากนี้เรายังทดสอบว่าข้อบกพร่องของไกลโคซิเลชันของ Δrer2 ได้รับการแก้ไขโดย SRT1. lysates ของเซลล์ทั้งหมดถูกเตรียมและสถานะไกลโคซิเลชันของ carboxypeptidase Y (CPY), vacuolar glycoprotein ( Stevens et al. 1982 ) ถูกวิเคราะห์โดยอิมมูโนบล็อตติงด้วยแอนติบอดีต้าน CPY ดังแสดงในรูปที่ 1B ฟีโนไทป์อันเดอร์ไกลโคซิเลชันของ Δrer2 ได้รับการบูรณะเกือบทั้งหมดโดย SRT1 บนพลาสมิดหลายสำเนา SRT1 บนพลาสมิดสำเนาเดียวไม่เพียงพอที่จะระงับข้อบกพร่องของ Δrer2 ถึงระดับไวด์ ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำอย่างยิ่งว่า Srt1p มี ซิส-กิจกรรมของพรีนิลทรานสเฟอเรสด้วยตัวเอง

การแสดงออกของ .มากเกินไป SRT1 ยับยั้ง Δrer2 กลายพันธุ์. (A) ฟีโนไทป์การเจริญเติบโตของ Δrer2 ปราบปรามโดย SRT1. ประเภทไวด์ (YPH500, เพชรปิด), Δsrt1 (SMY30, สี่เหลี่ยมสีเทา), Δrer2 แบก RER2 บนพลาสมิดสำเนาเดียว (SMY20-2, สามเหลี่ยมเปิด) Δrer2 แบก SRT1 บนพลาสมิดหลายสำเนา (SMY20-3, เพชรเปิด) และ rer2-2 (SNH23-7D, วงกลมเปิด) ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ MCD และเพาะเลี้ยงที่ 30 °C OD600 ถูกวัดและวางแผนในแต่ละจุดเวลา (NS) SRT1 ยับยั้งข้อบกพร่องไกลโคซิเลชันของ Δrer2. สถานะไกลโคซิเลชันของคาร์บอกซีเปปติเดส Y ถูกวิเคราะห์โดยอิมมูโนบลอตติงของไลเซทของเซลล์ทั้งหมดในเฟสลอการิทึมช่วงต้น เลน 1, Δrer2 แสดงออก RER2 บนพลาสมิดสำเนาเดียว (SMY20-2) เลน2 Δrer2 แสดงออก SRT1 บนพลาสมิดสำเนาเดียว (SMY20-4) เลน ​​3 Δrer2 แสดงออก SRT1 บนพลาสมิดมัลติสำเนา (SMY20-3) เลน ​​4 Δrer2 (SMY20) จอดเฉพาะเลนที่ 5 เท่านั้น Δsrt1 (SMY30). m, CPY ที่โตเต็มที่ ug, CPY ใต้ไกลโคซิเลต

Srt1p มี ซิส-กิจกรรมพรีนิลทรานสเฟอเรส

เพื่อพิสูจน์ทางชีวเคมี ซิส-กิจกรรม prenyltransferase ของ Srt1p เราพยายามทำให้ Srt1p บริสุทธิ์โดยใช้ อี. โคไล ระบบการแสดงออกหรือโดยตรงจากยีสต์ lysates แต่ไม่มีวิธีการใดที่ประสบความสำเร็จ ดังนั้นเราจึงใช้เศษส่วนของเมมเบรนของ Δrer2 เซลล์แสดงออก SRT1 ภายใต้โปรโมเตอร์ที่แท้จริงบนพลาสมิดหลายสำเนา (เรียกว่า SRT1-ขึ้นอยู่กับเซลล์) เป็นแหล่งเอนไซม์ของ Srt1p สำหรับการเปรียบเทียบ เศษส่วนของเมมเบรนยังถูกเตรียมจากชนิดพันธุ์ป่า rer2 และ Δsrt1. เริ่มแรก เศษส่วนของเมมเบรนถูกเตรียมจากเซลล์ในระยะลอการิทึมช่วงต้น (1.2∼1.7 × 10 7 เซลล์/มล.) และทดสอบหา ซิส-prenyltanrsferase activity ที่มี FPP และ [1– 14 C] -IPP เป็นสารตั้งต้น อย่างไรก็ตาม กิจกรรมเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยใน SRT1- เซลล์ขึ้นอยู่กับเมื่อเปรียบเทียบกับ rer2 กลายพันธุ์ (รูปที่ 2). เมื่อพิจารณาถึงความเป็นไปได้ที่ปัจจัยบางอย่างในส่วนที่ละลายได้นั้นจำเป็นสำหรับกิจกรรมทั้งหมดของ Srt1p การสังเคราะห์สารประกอบโดลิชิลก็ได้รับการทดสอบโดยใช้ไลเซทของเซลล์ทั้งหมดด้วย แม้แต่ในการทดลองนี้ กิจกรรมของการสังเคราะห์โดลิคอลยังต่ำมากใน SRT1- เซลล์ขึ้นอยู่กับ (ไม่แสดงข้อมูล) ดังที่อธิบายไว้ในภายหลัง เราพบว่าระดับนิพจน์ของ Srt1p เปลี่ยนแปลงตามความคืบหน้าของระยะการเติบโตและเพิ่มขึ้นในขั้นสุดท้ายของลอการิทึมและเฟสคงที่ ดังนั้น เศษส่วนของเมมเบรนจึงถูกเตรียมขึ้นใหม่จากเซลล์ในเฟสที่อยู่นิ่ง (1.2 × 10 8 เซลล์/มล.) และสอบวิเคราะห์ ภายใต้เงื่อนไขนี้กิจกรรมสูงของ ซิส-prenyltransferase ตรวจพบใน SRT1-ขึ้นอยู่กับเซลล์ (รูปที่ 2) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า Srt1p เองมี ซิส-prenyltransferase activity และถูกควบคุมในระยะนิ่ง การลบของ SRT1 เพียงอย่างเดียวไม่ส่งผลต่อการทำงานของเซลล์ แสดงว่าสำเนาจีโนมของ SRT1 มีส่วนได้ส่วนน้อยเท่านั้น ซิส-การทำงานของ prenyltransferase ภายใต้สภาวะปกติ

Srt1p มี ซิส- การทำงานของพรีนิลทรานสเฟอเรส เศษส่วนของเมมเบรนถูกเตรียมจากเซลล์ของชนิดพันธุ์ป่า (YPH500) Δsrt1 (SMY30), Δrer2 อยู่อาศัย RER2 บนพลาสมิดสำเนาเดียว (SMY20-2) Δrer2 อยู่อาศัย SRT1 บนพลาสมิดหลายสำเนา (SMY20-3) และ rer2-2 (SNH23-7D) สายพันธุ์ในระยะลอการิทึมหรืออยู่กับที่ในระยะแรกและทดสอบหา ซิส-กิจกรรมพรีนิลทรานสเฟอเรส ในหลอดทดลอง.

ยังได้ประเมินความยาวสายโซ่ของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเหล่านี้ด้วย ผลิตภัณฑ์โพลีพรีนิลของ ในหลอดทดลอง cisการสอบวิเคราะห์ -prenyltransferase ถูกบำบัดเพิ่มเติมด้วยฟอสฟาเตสและอยู่ภายใต้โครมาโตกราฟีแบบชั้นบางแบบย้อนกลับเฟสที่ตามด้วยฟลูออโรกราฟี (รูปที่ 3) ที่น่าสนใจคือผลิตภัณฑ์หลักที่สังเคราะห์โดย SRT1เซลล์ที่ขึ้นต่อกันนั้นยาวโดยสองหน่วยไอโซพรีนมากกว่าเซลล์ของ Δsrt1 (NS RER2ขึ้นอยู่กับ) หรือเซลล์ชนิดพันธุ์ป่า ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่า ซิส-prenyltransferase กำหนดความยาวสายโซ่ของ dolicol และ Rer2p และ Srt1p มีคุณสมบัติที่แตกต่างกันในการยุติปฏิกิริยาการควบแน่นของไอโซเพนเทนิล

การวิเคราะห์โพลิพรีนอลที่สังเคราะห์โดย Rer2p และ Srt1p ในหลอดทดลอง. ผลิตภัณฑ์ของ ซิสการทดสอบเพรนิลทรานส์เฟอเรสถูกบำบัดด้วยฟอสฟาเตสและวิเคราะห์โดยการทำปฏิกิริยาเคมีแบบชั้นบางแบบรีเวิร์สเฟสด้วยเพลต LKC-18 และระบบตัวทำละลายอะซิโตน: น้ำ (39 : 1) WT แบบไวด์ (YPH500) RER2, Δsrt1 (SMY30) SRT1, Δrer2 อยู่อาศัย SRT1 บนพลาสมิดหลายสำเนา (SMY20-3)

ปริมาณของ dolicol และ Dol-P

นอกจากกิจกรรมของเอนไซม์ ในหลอดทดลอง, ปริมาณเนื้อหาในเซลล์ของ dolicols และ Dol-Ps สำหรับเซลล์กลายพันธุ์ Dolicol และ Dol-P ถูกสกัดตามลำดับจากเซลล์ในระยะลอการิทึมกลาง (4∼5 × 10 7 เซลล์/มล.) ตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนการทดลอง เศษส่วนของ Dolicol และ Dol-P ถูกวิเคราะห์โดย HPLC เฟสผันกลับ ซึ่งให้การแยกสารประกอบแต่ละชนิดตามความยาวของสายโซ่ รูปที่ 4 แสดงผลจากการวิเคราะห์เศษส่วนโดลิกอล เนื้อหาทั้งหมดของ dolichols และ Dol-Ps สรุปได้ในรูปที่ 5 Wild-type มี dolichols และ Dol-Ps เกือบเท่ากัน และ C75 และ C80 เป็นองค์ประกอบหลักในเศษส่วนทั้งสอง ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้สำหรับยีสต์ประเภท wild-type (Adair & Cafmeyer 1987) เนื้อหา dolicol ของ rer2 การกลายพันธุ์ลดลงเหลือประมาณ 25% ของประเภทพันธุ์ป่า ใน rer2 พีคขนาดเล็กที่กลายพันธุ์อันเนื่องมาจากโดลิโคลที่มีความยาวสายโซ่ยาวขึ้นนั้นชัดเจนขึ้น ซึ่งไม่ได้สังเกตพบในเซลล์ชนิดพันธุ์ป่า Srt1p อาจมีการควบคุมขึ้นบ้างใน rer2. ระดับของ Dol-Ps ใน rer2 ต่ำเกินไปที่จะประมาณด้วยวิธีนี้ ใน SRT1เซลล์ที่ขึ้นกับรูปแบบ HPLC ของเศษส่วนโดลิคอลเปลี่ยนแปลงอย่างเด่นชัดว่าแต่ละพีคเป็นสองเท่า มีรายงานว่าสภาวะ HPLC นี้ให้การแยกบางส่วนของส่วนประกอบ α-unsaturated (polyprenol) และ α-saturated (dolicol) ที่มีความยาวเท่ากัน และ polyprenol จะถูกชะเร็วกว่า dolicol เล็กน้อย ( Ekstrom et al. 2527 ). เรายืนยันสิ่งนี้โดยใช้สารประกอบมาตรฐาน C95-polyprenol และ C95-dolicol เวลาเก็บรักษามาตรฐานเหล่านี้ใกล้เคียงกับช่วงเวลาสูงสุดชุดเดียวใน SRT1เซลล์ขึ้นอยู่กับตามที่แสดงในรูปที่ 4D ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าพีคแยกนั้นสอดคล้องกับโพลิพรีนอลและโดลิคอลที่มีความยาวเท่ากันและ SRT1เซลล์ที่พึ่งพาอาศัยกันมีพอลิพรีนอลจำนวนมาก ซึ่งแทบไม่ตรวจพบในเซลล์ชนิดพันธุ์ป่า ปริมาณโดลิคอลและโพลิพรีนอลทั้งหมดใน SRT1เซลล์ที่พึ่งพาอาศัยกันนั้นประมาณสองเท่าของชนิดพันธุ์ป่า แม้ว่า 30% ของเซลล์จะอยู่ในรูปแบบที่ไม่อิ่มตัว α ที่ผิดปกติ สอดคล้องกับ ในหลอดทดลอง การวิเคราะห์ พีคหลักของโดลิคอล (และโพลิพรีนอล) ใน SRT1เซลล์ที่ขึ้นต่อกันคือ C95–C105 ซึ่งเห็นได้ชัดว่ายาวกว่าเซลล์ที่สังเกตพบในเซลล์ชนิดพันธุ์ป่า (C75-C80) สังเกตรูปแบบที่ไม่อิ่มตัวสำหรับทุกความยาวของสายโซ่ ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีความพึงพอใจที่ชัดเจนสำหรับความยาวในปฏิกิริยารีดักชัน ทั้งๆ ที่ SRT1เซลล์ที่พึ่งพากันมีโดลิคอลในปริมาณที่เพียงพอ ระดับของ Dol-P ต่ำมาก (13% ของชนิดพันธุ์ป่า) เราตรวจไม่พบพอลิพรีนอลที่มีฟอสโฟรีเลต แต่อาจเป็นเพราะรูปแบบฟอสโฟรีเลตโดยรวมในระดับต่ำ การกระจายตัวของ Dol-Ps ในแง่ของความยาวโซ่นั้นคล้ายคลึงกับของ dolicols และ polyprenol อิสระ

การวิเคราะห์ HPLC แบบกลับเฟสของเศษส่วนโดลิคอล เศษส่วนโดลิคอลที่สกัดจากเซลล์ชนิดไวด์ (YPH500, A), Δsrt1 (SMY30, B), rer2-2 (SNH23-7D, C) และ Δrer2 อยู่อาศัย SRT1 บนพลาสมิดหลายสำเนา (SMY20-3, D) ถูกวิเคราะห์ด้วยคอลัมน์ ODS และ 2-โพรพานอล : เมทานอล (3 : 2) เป็นสารชะ ตำแหน่งการชะของ C95-polyprenol และ C95-dolicol ถูกระบุไว้ใน (C) และ (D)

เนื้อหาของ dolicols และ Dol-Ps ในสายพันธุ์กลายพันธุ์ เศษส่วน Dolicol และ Dol-P ถูกสกัดจากเซลล์ของชนิดพันธุ์ป่า (YPH500) Δsrt1 (SMY30), rer2-2 (SNH23-7D) และ Δrer2 อยู่อาศัย SRT1 บนพลาสมิดหลายสำเนา (SMY20-3) และหาปริมาณตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนการทดลอง แสดงค่าเฉลี่ย (ไมโครกรัม/กรัม [น้ำหนักเปียก] ของเซลล์) ของการทดลองอิสระสองการทดลอง น.d. ตรวจไม่พบ

ระดับของ Rer2p และ Srt1p เปลี่ยนไปตามระยะการเติบโต

เพื่อตรวจหาโปรตีน Srt1 แท็ก 3HA ถูกนำมาใช้ที่ปลาย C ของ Srt1p Srt1-3HAp นี้ใช้งานได้อย่างสมบูรณ์เพราะ SRT1-3HA ยีนยับยั้งความไวต่ออุณหภูมิของ rer2 กลายพันธุ์เช่นเดียวกับของแท้ รฟท.1 (ไม่แสดงข้อมูล) SRT1-3HA ถูกแสดงออกใน Δsrt1 เซลล์บนพลาสมิดสำเนาเดียวหรือหลายสำเนา และผลิตภัณฑ์ของพวกมันถูกวิเคราะห์โดยอิมมูโนบล็อตติงด้วยโมโนโคลนัลแอนติบอดีต้าน HA (16B12) ตรวจพบ Srt1-3HAp เป็นแถบเดียวประมาณ 45 kDa ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (ไม่แสดงข้อมูล) ในระหว่างการทดลอง เราสังเกตเห็นว่าปริมาณ Srt1-3HAp เพิ่มขึ้นในช่วงสุดท้ายของลอการิทึม ดังนั้น ระดับของ Srt1p และ Rer2p จึงได้รับการวิเคราะห์อย่างรอบคอบตลอดช่วงการเติบโตโดยใช้ Δrer2 Δsrt1 เซลล์ที่แสดงออก 3HA-ติดแท็ก SRT1 และ RER2 ยีนภายใต้โปรโมเตอร์ของพวกมันเอง (SMY241) NS 3HA-RER2 ยีนยังทำงานได้ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ ( Sato et al. 2542 ). ไลเซตทั้งหมดถูกเตรียมที่แต่ละจุดและ 60 ไมโครกรัมของโปรตีนอยู่ภายใต้อิมมูโนบล็อตติง (รูปที่ 6) ปริมาณของ Srt1-3HAp ค่อยๆ เพิ่มขึ้นตามระยะการเติบโต และถึงค่าสูงสุดในช่วงสุดท้ายของลอการิทึมและแบบอยู่กับที่ ในทางตรงกันข้าม ระดับสูงสุดของ 3HA-Rer2p ถูกตรวจพบในระยะลอการิทึมช่วงต้น ดังนั้น การแสดงออกของ two ซิส-prenyltransfrerases ถูกควบคุมแตกต่างกันในระหว่างวงจรชีวิตของยีสต์

ระดับการแสดงออกของ RER2 และ SRT1 แตกต่างกันไปตามระยะการเจริญเติบโต ไลเซตของเซลล์ทั้งหมด (60 ไมโครกรัม) ถูกเตรียมจาก Δrer2 Δsrt1 เซลล์แสดงออก 3HA-RER2 และ SRT1-3HA บนพลาสมิดสำเนาเดียว (SMY241) ที่จุดเวลาที่ระบุโดยลูกศรใน (A) และวิเคราะห์โดยอิมมูโนบล็อตติงโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีต้าน HA (B)

Srt1p ถูกแปลเป็นอนุภาคไขมัน

การทดลองแยกย่อยเซลล์โดยใช้ Δsrt1 เซลล์ที่อาศัยอยู่ SRT1-3HA บนพลาสมิดสำเนาเดียวเปิดเผยว่า Srt1-3HAp เกือบทั้งหมดถูกนำกลับคืนมาในส่วนของเมมเบรน คล้ายกับ 3HA-Rer2p (ไม่แสดงข้อมูล) การโลคัลไลซ์เซชั่นย่อยของ Srt1p ได้รับการประเมินเพิ่มเติมโดยกล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ทางอ้อม NS Δsrt1 เซลล์แสดงออก SRT1-3HA บนพลาสมิดสำเนาเดียวถูกโตสู่ระยะนิ่งและอยู่ภายใต้การสังเกตอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ด้วยแอนติบอดีต้าน HA Srt1-3HAp แสดงโครงสร้างแบบแบ่งส่วนและแบบวงแหวน ดังแสดงในรูปที่ 7A–Cโครงสร้างเหล่านี้มีลักษณะเป็นทรงกลม ซึ่งไม่น่าจะเป็นรูปแบบทั่วไปของ Golgi รูปแบบการย้อมสีนี้ค่อนข้างคล้ายกับอนุภาคไขมันที่สะสมในระยะนิ่งในยีสต์ เมื่อรวมกับข้อเท็จจริงที่ว่า Srt1p เพิ่มขึ้นในระยะที่อยู่กับที่ ผลลัพธ์เหล่านี้ทำให้เราคาดการณ์ว่า Srt1-3HAp ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังอนุภาคไขมัน ในการประเมินความเป็นไปได้นี้ เราได้ทำการทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์สองครั้งของ Srt1–3HAp และ sterol Δ 24 -methytransferase Erg6p ซึ่งเป็นโปรตีนเครื่องหมายของอนุภาคไขมันในยีสต์ ( Leber et al. 2541 ). ในการตรวจจับ Erg6p, 3myc-tagged ERG6 ถูกสร้างขึ้นซึ่งสามารถเสริมความไวของไซโคลเฮกซิไมด์ของ Δerg6 อย่างสมบูรณ์. การย้อมสีของ Srt1-3HAp ทับซ้อนกันได้ดีมากกับการย้อมสีของ Erg6-3mycp (รูปที่ 7D–F) เมื่อเซลล์ถูกรวบรวมที่ระยะลอการิทึมช่วงต้น การย้อมสีของ Srt1–3HAp นั้นอ่อนเกินไปที่จะตรวจจับการแปลเป็นภาษาท้องถิ่น

การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ Srt1-3HAp (A) อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ของ Srt1-3HAp Δsrt1 (SMY30) เซลล์ที่อาศัยอยู่ SRT1-3HA บนพลาสมิดสำเนาเดียวถูกโตไปยังเฟสที่อยู่นิ่งและอยู่ภายใต้การสังเกตอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ทางอ้อมด้วยโมโนโคลนัลแอนติบอดีต้าน HA (B) การย้อมสี DAPI ของฟิลด์เดียวกัน (C) ภาพ Nomarski ของเขตข้อมูลเดียวกัน (D, E) การย้อมสีสองครั้งของ Srt1-3HAp และ Erg6-3mycp Δsrt1 (SMY30) เซลล์ที่กักเก็บ SRT1-3HA และ ERG6-3myc บนพลาสมิดสำเนาเดียวถูกโตไปยังเฟสที่อยู่กับที่และสังเกตได้โดยกล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ทางอ้อมที่มีแอนติบอดีต้าน HA โมโนโคลนัล (D) และแอนติบอดีต้านมัยซี (E) (F) ภาพ Nomarski ของเขตข้อมูลเดียวกัน

การแปลความหมายของ Srt1p ยังถูกตรวจสอบโดยใช้ฟิวชันโปรตีนระหว่าง GFP และ Srt1p การแสดงออกของ GFP-SRT1 โดยแท้ SRT1 ผู้ก่อการสามารถปราบปราม rer2 อย่างไรก็ตาม การกลายพันธุ์ระดับของ GFP-Srt1p ไม่เพียงพอที่จะสังเกตสัญญาณของ GFP (ไม่แสดงข้อมูล) ดังนั้น, GFP-SRT1 ถูกแสดงออกมากเกินไปภายใต้ความแข็งแกร่ง TDH3 โปรโมเตอร์ใน Δsrt1 และสังเกตได้ในเซลล์ที่มีชีวิต GFP-Srt1p แสดงโครงสร้างเครื่องหมายวรรคตอนที่คล้ายกับอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ของ Srt1–3HAp (รูปที่ 8C) รูปแบบเครื่องหมายวรรคตอนดังกล่าวถูกสังเกตตลอดระยะการเจริญเติบโตเมื่อ GFP-SRT1 ถูกแสดงออกมากเกินไปภายใต้ TDH3 โปรโมเตอร์ เราเปรียบเทียบการแปล subcellular ของ Srt1p กับ Rer2p ก่อนหน้านี้เรารายงานว่า 3HA-Rer2p ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นเพื่อแบ่งโครงสร้างที่ดูเหมือนจะทับซ้อนกันหรือสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับ ER เมื่อสังเกตโดย immunofluorescence ( Sato et al. 2542 ). ในการศึกษานี้ เราสร้าง GFP ฟิวชันด้วย Rer2p เช่นกัน และยืนยันว่าใช้งานได้ (ไม่แสดงข้อมูล) เมื่อไหร่ GFP-RER2 ถูกแสดงออกมากเกินไปภายใต้ TDH3 โปรโมเตอร์ใน Δrer2รูปแบบ ER แบบต่อเนื่องและบางจุดที่เกี่ยวข้องกับ ER ถูกสังเกตพบในเฟสลอการิทึมช่วงต้น (รูปที่ 8A) ในทางตรงกันข้าม GFP-Srt1p ไม่ได้แสดงรูปแบบ ER ที่ต่อเนื่องกัน (รูปที่ 8C) สีย้อมที่ไม่ชอบน้ำ Nile Red ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าเป็นคราบอนุภาคไขมัน ( Greenspan et al. 1985 ) ให้รูปแบบที่คล้ายกับ GFP-Srt1p มาก (รูปที่ 8E) ซึ่งสนับสนุนข้อสรุปของเราว่า Srt1p ส่วนใหญ่อยู่ในอนุภาคไขมัน นอกจากนี้ ควรสังเกตด้วยว่าบางครั้งอนุภาคไขมันสามารถมองเห็นได้ชัดเจนในภาพ Nomarski (รูปที่ 8E,F) ซึ่งซ้อนทับกับ GFP-Srt1p อีกครั้ง

การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของโปรตีนหลอมรวม GFP-Srt1 และ GFP-Rer2 rer2-2 (SNH23-7D) แสดง GFP-Rer2p (A และ B) และ Δsrt1 (SMY13) ที่แสดง GFP-Srt1p (C และ D) ถูกสังเกตพบสำหรับการเรืองแสง GFP สำหรับการเปรียบเทียบ เซลล์ชนิดพันธุ์ป่า (SNY9) ถูกย้อมด้วย Nile Red เพื่อแสดงภาพอนุภาคไขมัน (E และ F) การรวม GFP ถูกแสดงภายใต้ TDH3 โปรโมเตอร์บนพลาสมิดสำเนาเดียว (A และ C) GFP เรืองแสง (E) การย้อมสีไนล์เรด. (B, D และ F) ภาพ Nomarski ของฟิลด์เดียวกัน


ความเข้มข้นของไอโซพรีนอยด์ไดฟอสเฟตในยีสต์ saccharomyces cerevisiae - ชีววิทยา

หัวหน้า: ศาสตราจารย์ Grazyna Palamarczyk

จุดเน้นโดยรวมของงานของเรามุ่งเน้นไปที่การศึกษาขั้นพื้นฐานเกี่ยวกับไกลโคซิเลชันและการควบคุมไกลโคโปรตีนของผนังเซลล์ การวิจัยที่มีความสัมพันธ์กันสองสายเกี่ยวข้องกับบทบาทของโปรตีนไกลโคซิเลชันสำหรับการดื้อยาต้านเชื้อราและการเกิดโรค (นำโดย G.Palamarczyk) และวิศวกรรมเมตาบอลิซึมของ Trichoderma sp. โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อปรับปรุงคุณสมบัติทางเทคโนโลยีชีวภาพของสายพันธุ์ (นำโดย J. ครูซเซวสกา)

กลไกระดับโมเลกุลในโปรตีนไกลโคซิเลชันในยีสต์: Saccharomyces cerevisiae และ Candida albicans

หัวหน้ากลุ่ม: ศ.กราซีนา ปาลามาร์ซีค
พนักงาน: ดร.แอนนา จานิก, Ph.D. นักศึกษา: วท.บ. โมนิกา ปาสิโควสกา วท.ม. Mateusz Juchimiuk

โครงงานนี้เกี่ยวข้องกับการศึกษาขั้นพื้นฐานเกี่ยวกับไกลโคซิเลชันและการควบคุมไกลโคโปรตีนของผนังเซลล์และผลกระทบต่อความสมบูรณ์ของผนังเซลล์ บริเวณนี้ถึงแม้จะมีความสำคัญ แต่ก็ยังเข้าใจเพียงบางส่วนแม้ในจุลินทรีย์ที่ติดตามได้จากพันธุกรรมเช่น S. cerevisiaeและถึงแม้จะมีความสำคัญในด้านเชื้อราทางการแพทย์ แต่ก็ยังไม่ได้สำรวจในเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคในมนุษย์เช่น C. albicans.

ยูคาริโอตส่วนใหญ่ (เชื้อรา พืช สัตว์) สังเคราะห์แอสพาราจีน (Asn) ที่เชื่อมโยงกับ N-glycans โดยใช้สารตั้งต้นของไขมัน dolichyl-phosphate ที่เชื่อมโยงกับโอลิโกแซ็กคาไรด์ ลิปิดไอโซพรีนอยด์ โดลิชิล ฟอสเฟต ยังเกี่ยวข้องกับวิถี O-mannosylation ซึ่งจำเป็นสำหรับการบำรุงรักษาความสมบูรณ์ของผนังเซลล์

เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่าข้อบกพร่องของไกลโคซิเลชันที่เกิดจากการสังเคราะห์โดลิซิล ฟอสเฟตส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของ S. cerevisiae โครงสร้างและองค์ประกอบของผนังเซลล์ (Orłowski et al.2007)

ต่อจากนี้ เราอยากจะอธิบายลักษณะเฉพาะของขั้นตอนสำคัญในการสังเคราะห์ด้วยโดลิคอลและไกลโคซิเลชันที่ขึ้นกับโดลิคอล และกำหนดว่าการเปลี่ยนแปลงในปฏิกิริยาเหล่านี้ส่งผลต่อผนังเซลล์และการเกิดโรคของ C. albicans.

ข้อมูลดังกล่าวจะแจ้งด้านปฏิสัมพันธ์ของโฮสต์/เชื้อราที่ก่อโรค และอาจใช้ประโยชน์ได้โดยอุตสาหกรรมยาต้านเชื้อรา

ด้วยเหตุนี้ เราจึงได้แยกยีนที่เกี่ยวข้องกับโดลิคอลและการสร้างโดลิชิลฟอสเฟต และแสดงให้เห็นว่าการสังเคราะห์โดลิคอลบกพร่องส่งผลต่อการก่อตัวของรูปแบบไฮฟาล (รุนแรง) ของ C. albicans (Orłowski 2008, วิทยานิพนธ์ระดับปริญญาเอก). ต่อจากนั้น เราวางแผนที่จะสร้างชุดของการกลายพันธุ์ของไกลโคซิเลชันและทดสอบความไวของพวกมันต่อยาต้านเชื้อรารวมถึงความเป็นพิษ

โครงการนี้ร่วมกันจะเพิ่มความเข้าใจพื้นฐานของเราเกี่ยวกับการควบคุมระดับโมเลกุลและชีวเคมีของการประกอบไกลโคโปรตีนผนังเซลล์ใน C. albicans โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อทำความเข้าใจการก่อโรคของเชื้อราและการเลือกเป้าหมายในการรักษาด้วยยาต้านเชื้อราให้ดียิ่งขึ้น

ทุนวิจัย:
2547-2548 "กำแพงเซลล์ยูโร ผนังเซลล์เชื้อราเป็นเป้าหมายของการรักษาด้วยยาต้านจุลชีพ" (5FP UE)
2548-2551 "การประกอบผนังเซลล์ใน S. cerevisiae และ C. albicans เป็นเป้าหมายของยาต้านเชื้อรา"
(กระทรวงวิทยาศาสตร์และอุดมศึกษา)

สิ่งพิมพ์ที่เลือก:

  1. Kuranda K. , François J. , Palamarczyk G. วิถี isoprenoid และการตอบสนองการถอดรหัสต่อสารยับยั้งในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae. FEMS ยีสต์ Res. (2009) - Epub ก่อนพิมพ์
  2. Kuranda K. , Grabinska K. , Berges T. , Karst F. , Leberre V. , Sokol S. , François J. , Palamarczyk G. ยีน YTA7 เกี่ยวข้องกับการควบคุมวิถีทางไอโซพรีนอยด์ในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae. FEMS ยีสต์ Res. (2009) 9(3): 381-90
  3. Orłowski J. , Machula K. , Janik A. , Zdebska E. , Palamarczyk G. การแยกบทบาทของ dolichol ในการประกอบผนังเซลล์ในการกลายพันธุ์ของยีสต์ที่บกพร่องในปฏิกิริยาไกลโคซิเลชันในระยะแรก ยีสต์ (2007) 24(4): 239-52
  4. Kuranda K. , Leberre V. , Sokol S. , Palamarczyk G. , François J. การตรวจสอบผลกระทบของคาเฟอีนในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae นำข้อมูลเชิงลึกใหม่ๆ มาสู่การเชื่อมต่อระหว่างเส้นทางการส่งสัญญาณ TOR, PKC และ Ras/cAMP โมล ไมโครไบโอล. (2006) 61(5): 1147-66
  5. Grabińska K. , Sosińska G. , Orłowski J. , Swiezewska E. , Berges T. , Karst F. , Palamarczyk G. ความสัมพันธ์เชิงหน้าที่ระหว่าง Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferases ที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์สาร dolichol แอคตา ไบโอชิม. พล. (2005) 52(1): 221-32
  6. Kamińska J. , Kwapisz M. , Grabińska K. , Orłowski J. , Boguta M. , Palamarczyk G. , Zoładek T. Rsp5 ubiquitin ligase ส่งผลต่อวิถี isoprenoid และการจัดระเบียบผนังเซลล์ใน S. cerevisiae. พล.ต.อ.แอคตา ไบโอชิม (2005) 52(1): 207-20
  7. Grabińska K., Palamarczyk G. Dolichol การสังเคราะห์ทางชีวภาพในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae: ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับบทบาทการกำกับดูแลของฟาร์เนซิล ไดฟอสเฟต ซินเทส FEMS ยีสต์ Res. (2002) 2(3): 259-65
  8. Janik A. , Sosnowska M. , Kruszewska J. , Krotkiewski H. , Lehle L. , Palamarczyk G. การแสดงออกมากเกินไปของ GDP-mannose pyrophosphorylase ใน Saccharomyces cerevisiae แก้ไขข้อบกพร่องในการสร้างแซ็กคาไรด์ที่เชื่อมโยงกับโดลิคอลและไกลโคซิเลชันของโปรตีน ไบโอชิม. ชีวฟิสิกส์ แอคตา (2003) 1621(1): 22-30

พันธุวิศวกรรมของเชื้อราที่สำคัญในด้านเทคโนโลยีชีวภาพและการควบคุมทางชีวภาพ

หัวหน้ากลุ่ม: รศ. ศ. Joanna Kruszewska

พนักงาน: Dr. Urszula Perlińska-Lenart ผู้ช่วยอาวุโส, Dr. Wioletta Górka-Nieć Senior Assistant, M.Sc. Patrycja Zembek ปริญญาเอก นักศึกษา วท.บ. Sebastian Graczyk ปริญญาเอก นักเรียน

เราได้ศึกษาอิทธิพลของการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางไกลโคซิเลชันต่อการผลิตและการหลั่งโปรตีน

การแสดงออกของยีน DPM1 ของยีสต์ (การเข้ารหัสสำหรับ DPM-synthase) ใน ต. รีเซย์ เพิ่มความเข้มข้นของโปรตีนไกลโคซิเลชั่นและการหลั่ง และทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างทางโครงสร้างภายในเซลล์ของเชื้อรา เราได้ดำเนินการแสดงลักษณะทางชีวเคมีและสัณฐานวิทยาเพิ่มเติมของการแสดง DPM1 ต. รีเซย์ สายพันธุ์ เราพบว่าองค์ประกอบคาร์โบไฮเดรตของผนังเซลล์ของเชื้อราเปลี่ยนแปลงไปตามปริมาณไคตินที่เพิ่มขึ้นและการเปลี่ยนแปลงในการกระจายตัวของไคติน นอกจากนี้ เรายังสังเกตเห็นความเข้มข้นของกลูแคนที่ละลายน้ำได้ของแมนโนสและแอลคาไลลดลง (1, 6) อีกด้วย การเปรียบเทียบการหลั่งโปรตีนจากโปรโตพลาสต์กับจากไมซีเลียพบว่าผนังเซลล์สร้างสิ่งกีดขวางสำหรับการหลั่งในทรานส์ฟอร์มแทนท์ DPM1

มันถูกสังเกตใน S. cerevisiae การหยุดชะงักของยีน PMT ซึ่งเข้ารหัสโปรตีน O-mannosyltransferases กระตุ้นการถ่ายโอน mannosyl ตกค้างแรกไปยังโปรตีนระหว่าง O-glycosylation ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของผนังเซลล์

การหยุดชะงักของยีน pmt1 ใน Trichoderma ทำให้กิจกรรมทั้งหมดของโปรตีน O-mannosyltransferases ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และนำไปสู่ความไวออสโมติกของความเครียด ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทสำคัญของกิจกรรมโปรตีน PMTI สำหรับการสังเคราะห์ผนังเซลล์ การหยุดชะงักของยีน pmt1 ช่วยลดการหลั่งโปรตีน แต่ไม่มีผลต่อไกลโคซิเลชันของโปรตีนที่หลั่งออกมา ซึ่งแสดงให้เห็นว่าโปรตีน PMTI O-mannosyltranferase ไม่มีส่วนร่วมในการไกลโคซิเลชันของโปรตีนเหล่านี้

เพื่อศึกษาอิทธิพลของกิจกรรมที่สูงขึ้นของโปรตีน O-mannosyltransferases ต่อการผลิตและการหลั่งโปรตีน เราได้รวมสำเนาเพิ่มเติมของยีน pmt1 เข้ากับจีโนม Trichoderma การรวมนี้ส่งผลให้เกิดการปิดเสียงของนิพจน์ pmt1 โดยไม่คาดคิด สายพันธุ์ที่มีสำเนาเพิ่มเติมของยีน pmt1 แสดงกิจกรรมรวมของโปรตีน O-mannosyltransferases ที่ต่ำกว่า O- และ N-glycosylation ที่ต่ำกว่าของโปรตีนที่หลั่งออกมา และแสดงข้อบกพร่องในองค์ประกอบของผนังเซลล์ของพวกมัน ในเวลาเดียวกัน สายพันธุ์เติบโตอย่างช้าๆ บนอาหารแข็งและไวต่อสารต้านเชื้อรา Calcofluor white ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าโปรตีน O-manosyltransferases จำเป็นสำหรับการสร้างผนังเซลล์ที่เหมาะสม และการออกฤทธิ์ที่ลดลงของพวกมันไม่เพียงส่งผลต่อ O- แต่ยังรวมถึง N-glycosylation ด้วย

นอกจากนี้เรายังได้โคลนและวิเคราะห์ฟังก์ชันของยีน dpm2 และ dpm3 ที่เข้ารหัสสำหรับหน่วยย่อยของการสังเคราะห์ DPM พบว่านอกเหนือจากหน่วยย่อยตัวเร่งปฏิกิริยา DPMI แล้ว หน่วยย่อย DPMIII ก็มีความจำเป็นในการสร้างการสังเคราะห์ DPM ที่ทำงานอยู่ในยีสต์ การแสดงออกเพิ่มเติมของโปรตีน DPMII ซึ่งถือเป็นหน่วยย่อยควบคุมของ DPM synthase ทำให้การทำงานของเอนไซม์ลดลง นอกจากนี้เรายังโดดเด่น S. cerevisiae สายพันธุ์ที่แสดงยีน dpm1,2,3 หรือ dpm1,3 และวิเคราะห์ผลของการแสดงออก dpm ต่อโปรตีน O- และ N-ไกลโคซิเลชัน ในร่างกาย และบนองค์ประกอบของผนังเซลล์

ทุนวิจัย:

2552-2555 "วิศวกรรมของสายพันธุ์ Trichoderma ด้วยความสามารถในการควบคุมทางชีวภาพที่เพิ่มขึ้น" (กองทุนโครงสร้าง, POIG,
Ośrodek Przetwarzania Informacji)

พ.ศ. 2549-2552 "การยกระดับความสามารถในการควบคุมทางชีวภาพของเชื้อราไตรโคเดอร์มา" (กระทรวงวิทยาศาสตร์และการอุดมศึกษา)

2548-2551 ส่วนหนึ่งของโครงการ“ ฟังก์ชันจีโนมของจุลินทรีย์แบบจำลองในการศึกษาระดับโมเลกุลของกรรมพันธุ์
โรคของมนุษย์และกลไกการเกิดโรค” (กระทรวงวิทยาศาสตร์และอุดมศึกษา)

สิ่งพิมพ์ที่เลือก:

  1. Górka-Nieć W. , Pniewski M. , Kania A. , Perlińska-Lenart U. , Palamarczyk G. , Kruszewska J.S. การหยุดชะงักของโปรตีนเข้ารหัสยีน Trichoderma reesei O-mannosyltransferase I ส่งผลให้กิจกรรมของเอนไซม์ลดลงและการเปลี่ยนแปลงขององค์ประกอบของผนังเซลล์ แอคตา ไบโอชิม.พล. (2008) 55: 251-260
  2. Kruszewska J.S. , Perlińska-Lenart U. , Górka-Nieć W. , Orłowski J. , Zembek P. Palamarczyk G. การเปลี่ยนแปลงในการหลั่งโปรตีนที่เกิดจากวิศวกรรมการเผาผลาญของเส้นทางไกลโคซิเลชันในเชื้อรา แอคต้า ไบโอชิม.พล. (2008) 55: 447-456
  3. Górka-Nieć W. , Bańkowska R, Palamarczyk G. , Krotkiewski H. , Kruszewska J.S. โปรตีนไกลโคซิเลชันในการกลายพันธุ์ pmt ของ Saccharomyces cerevisiae อิทธิพลของเซลโลบิโอไฮโดรเลส II ที่แสดงออกต่างกัน เชื้อรา Trichoderma reesei และระดับที่สูงขึ้นของกิจกรรม GDP mannose และ cis-prenyltransferase ไบโอชิม. ชีวฟิสิกส์ Acta (2007) 1770: 774–780
  4. Perlinska-Lenart U. , Bankowska R. , Palamarczyk G. , Kruszewska J.S. การแสดงออกมากเกินไปของ Saccharomyces cerevisiae ยีน RER2 ใน เชื้อรา Trichoderma reesei มีผลต่อเอนไซม์ที่ขึ้นกับโดลิคอลและโปรตีนไกลโคซิเลชัน ยีนของเชื้อรา ไบโอล. (2006) 43(6): 422-9
  5. Perlińska-Lenart U. , Orłowski J. , Laudy A.E. , Zdebska E. , Palamarczyk G. , Kruszewska J.S Glycoprotein hypersecretion เปลี่ยนแปลงผนังเซลล์ใน เชื้อรา Trichoderma reesei สายพันธุ์ที่แสดงออก Saccharomyces cerevisiae ยีนสังเคราะห์โดลิคิลฟอสเฟตแมนโนสซินเทส แอปพลิเค สิ่งแวดล้อม ไมโครไบโอล. (2006) 72: 7778-7784
  6. Perlińska-Lenart U. , Kurzątkowski W. , Janas P. , Kopińska A, Palamarczyk G. , Kruszewska J.S การผลิตโปรตีนและการหลั่งใน แอสเปอร์จิลลัส นิดูลานส์ การกลายพันธุ์บกพร่องในไกลโคซิเลชัน แอคตา ไบโอชิม. พล. (2005) 52: 195-205

สถาบันชีวเคมีและชีวฟิสิกส์ สถาบันวิทยาศาสตร์แห่งโปแลนด์
Pawinskiego 5a, 02-106 Warszawa, โปแลนด์
สวิตช์บอร์ด: +48 22 / 659 70 72 | เข้าสู่ระบบ


เอ็นไซม์นั่งร้าน

โครงสร้างโปรตีนที่ซึ่งเอ็นไซม์จำเพาะถูกคัดเลือกมาบนโครงสร้างสังเคราะห์ ถูกใช้เพื่อจำกัดตำแหน่งของเอ็นไซม์วิถีสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ที่ต้องการเพื่อปรับปรุงการสร้างผลิตภัณฑ์ผ่านช่องทางของซับสเตรต ดูเบอร์และคณะ (2009) ประสบความสำเร็จในการสาธิตการใช้โครงนั่งร้านสังเคราะห์ที่ประกอบด้วยโดเมนปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีนเมทาซัวและลิแกนด์ใน Escherichia coli, เพิ่มการผลิตเมวาโลเนต 77 เท่า มีความกังวลเกี่ยวกับประสิทธิภาพของแนวทางนี้สำหรับ S. cerevisiaeเนื่องจากโปรตีนพื้นเมืองอาจโต้ตอบกับโดเมนของโครง (Siddiqui et al., 2012) อย่างไรก็ตาม โครงสร้างนั่งร้านสังเคราะห์ metazoan ปรับปรุงการผลิต resveratrol ใน S. cerevisiae เพิ่มขึ้น 5 เท่าเมื่อเทียบกับระบบที่ไม่ใช่โครงนั่งร้าน และ 2.7 เท่าเมื่อเทียบกับกลยุทธ์การหลอมโปรตีน (Zhang et al., 2006 Wang and Yu, 2012) อย่างไรก็ตาม การปรับให้เหมาะสมของระบบยังคงมีความสำคัญโดยขึ้นอยู่กับปริมาณสัมพันธ์ของโดเมน SH3 และ pDZ ในโครงข่ายโปรตีน การเพิ่มขึ้นของการผลิต resveratrol แปรผันจาก 1.2 เป็น 5 เท่าเหนือกลุ่มควบคุม

อีกหนึ่งนั่งร้านสังเคราะห์ที่ประสบความสำเร็จใน S. cerevisiae ขึ้นอยู่กับการทำงานร่วมกันของ cohesin และ dockerin-enzyme ที่พบในเซลลูโลโซมพื้นผิวของ คลอสทริเดียม เซลลูโลโวแรน และจุลินทรีย์อื่นๆ (Mechaly et al., 2001) สารเชิงซ้อนที่มีลักษณะเหมือนเซลลูโซมที่ออกแบบทางวิศวกรรมซึ่งกำหนดตำแหน่งเซลลูโลสได้แสดงออกมาเรียบร้อยแล้วบนพื้นผิวของ S. cerevisiae เพื่อปรับปรุงการผลิตเอทานอล (Fan et al., 2012 Tsai et al., 2013 Tang et al., 2018) เมื่อเร็ว ๆ นี้ คอมเพล็กซ์เซลลูโลไลติกที่ใหญ่ที่สุด ” ประสบความสำเร็จในการสร้างบนพื้นผิวของยีสต์ Kluyveromyces marxianus (Anandharaj et al., 2020). อย่างไรก็ตาม การใช้อันตรกิริยาของด็อกเคอริน-โคฮีซินเป็นโครงนั่งร้านเมตาบอลิซึมภายในเซลล์ในยีสต์นั้นถูกจำกัด Kim และ Hahn (2014) ใช้ประโยชน์จากความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันสูงระหว่าง cohesion และ dockerin (Kd 㰐 � M) (Stahl et al., 2012) เพื่อสร้างโมดูลช่องสัญญาณซับสเตรตในไซโตซอลของ S. cerevisiae. จำนวนที่เพิ่มขึ้น (2, 3 หรือ 7) ของโดเมนโคเฮซินถูกรวมไว้บนโครงนั่งร้านและโปรตีนหลอมรวมเทอร์มินัล C ของด็อกเกอรินของโปรตีน AlsS, AlsD และโปรตีน Bdh1 ภายนอกร่างกายแสดงออกมากเกินไป การผลิต 2,3-บิวเทนไดออลเพิ่มขึ้น 37% เมื่อเทียบกับระบบปลอดนั่งร้านในการหมักแบบ fed-batch ด้วยการให้อาหารกลูโคสเป็นครั้งคราว แม้ว่าการเพิ่มขึ้นจะมีจำกัด นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่ใช้ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโคเฮซินและด็อกเคอรินในไซโตซอลของยีสต์และ สำหรับวิศวกรรมเมตาบอลิซึม ในการศึกษาติดตามผล (Kim et al., 2016) กลยุทธ์การจัดช่องสารตั้งต้นสังเคราะห์นี้ใช้เพื่อเปลี่ยนเส้นทางคาร์บอนฟลักซ์จากไพรูเวตเป็น 2,3-บิวเทนไดออลโดยใช้ AlsS ที่ต่างกันหรือให้น้ำนมโดยใช้ LdhA ที่ต่างกันแทนที่จะเป็นเอทานอล Pyk1 ดั้งเดิม (สำหรับการสังเคราะห์ไพรูเวต) ถูกหลอมรวมกับโดเมน cohesin และ AlsS กับโดเมน dockerin ที่รวบรวมเอนไซม์ทั้งสอง ส่งผลให้การผลิต 2,3-butanediol เพิ่มขึ้น 38% และการผลิตเอทานอลลดลง 46% เมื่อเทียบกับผลิตภัณฑ์ดั้งเดิม ความเครียด. อย่างไรก็ตาม, กลยุทธ์นี้ไม่ประสบความสำเร็จในการเปลี่ยนทิศทางฟลักซ์ไปสู่การก่อรูปแลคเตตที่ LdhA ที่หลอมรวมด็อกเซอรินมีกิจกรรมจำเพาะที่ต่ำกว่า Ϣ เท่าเมื่อเทียบกับ LdhA ชนิดพันธุ์ป่า (11.6 และ 27.9 U/nmol ตามลำดับ) ดังที่กล่าวไว้ในส่วนก่อนหน้า การลดลงของกิจกรรมของเอนไซม์ทำให้เกิดความท้าทายที่สำคัญต่อกลยุทธ์การโคโลคัลไลเซชันแบบฟิวชัน

ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Dockerin-cohesin ยังถูกใช้เพื่อทำให้เอ็นไซม์สังเคราะห์เอทิลอะซิเตทเป็นโคโลคัลไลซ์ลงบนพื้นผิวของหยดไขมัน (ด้วยเหตุนี้จึงรวมทั้งกลยุทธ์การนั่งร้านและออร์แกเนลล์) ส่งผลให้อัตราการผลิตเพิ่มขึ้น 2 เท่า (Lin et al., 2017) . ใน S. cerevisiaeเอทิลอะซิเตทถูกสังเคราะห์โดยเอ็นไซม์ Ald6, Acs1 และ Atf1 โดยมีเพียง Atf1 ที่กำหนดเป้าหมายไปที่หยดไขมัน ในการกำหนดเป้าหมาย Ald6 และ Acs1 ผู้เขียนได้คัดกรองและระบุโปรตีนโอลีโอซินว่าเป็นผู้สมัครที่มีแนวโน้มว่าจะควบคุมเอนไซม์ที่สนใจไปยังหยดไขมันโดเมนโคเฮซินถูกหลอมรวมกับโปรตีนโอลีโอซินในขณะที่โดเมนด็อคเคอรินที่สอดคล้องกันถูกหลอมรวมกับ Ald6 และ Acs1 หลังจากการคัดกรองอย่างครอบคลุมของโปรโมเตอร์และการเพิ่มประสิทธิภาพนั่งร้าน ไทเทอร์จำเพาะของเอทิลอะซิเตตเพิ่มขึ้น 1.7 เท่าเมื่อเทียบกับความเครียดที่ไม่มีนั่งร้าน

กลยุทธ์โครงนั่งร้านทางเลือกขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ระหว่างกลุ่มพันธมิตรและกลุ่มต่อต้านพฤติกรรมแปลก ๆ แอฟฟินิตี้ของ 58 เรซิดิว (หรือโดเมน Z) เป็นคลาสของโปรตีนอัฟฟินิตี้ที่ไม่ใช่อิมมูโนโกลบุลินที่ได้มาจาก Staphylococcus aureus โปรตีน A (Llom et al., 2010) พวกมันมีความจำเพาะสูงและมีความผูกพันกับโปรตีนเป้าหมาย (0.3 pM� μM) (Ståhl et al., 2017) ในการศึกษาล่าสุด Tippmann และคณะ (2017) ใช้Zตัก:anti-Zตัก (Kd = 0.7 μM) และ ZIgA:anti-Zอิกเอ (Kd = 0.9 μM) ปฏิสัมพันธ์เพื่อสร้างโครงนั่งร้านสังเคราะห์ที่ใช้งานได้ใน S. cerevisiae. นั่งร้านที่เชื่อมโยงกับ anti-Zตัก และต่อต้าน ZIgA, และ Zอิกเอ และ Zตัก ถูกหลอมรวมกับฟาร์นีซิล ไดฟอสเฟต ซินเทส และ ฟาร์นีซีน ซินเทส ตามลำดับ การเพิ่มประสิทธิภาพของตัวเชื่อมโยงกรดอะมิโนและอัตราส่วนของเอนไซม์:นั่งร้าน ทำให้ผลผลิตของฟาร์นีซีนต่อกลูโคสเพิ่มขึ้น 135% โครงนั่งร้านนี้ยังใช้งานได้ใน อี. โคไลซึ่งการใช้ประโยชน์ส่งผลให้การผลิต PHB เพิ่มขึ้น 7 เท่า แสดงให้เห็นถึงความเก่งกาจในฐานะแพลตฟอร์มนั่งร้านสำหรับวิศวกรรมเมตาบอลิซึม

นอกจากนี้ยังใช้นั่งร้านเพื่อสร้างสารเชิงซ้อน Gal2-xylose isomerase เทียมเพื่อปรับปรุงการใช้ไซโลสใน S. cerevisiae (Thomik et al., 2017). ในการศึกษานี้ WASP-โฮโมโลยี 1 (WH1) จากหนูแรท N-WASP ถูกใช้เป็นโครงสร้างนั่งร้านและไซโลสไอโซเมอเรส (XI) ถูกหลอมรวมกับลิแกนด์ WH1 (WH1L) ที่ปลาย N ในการรับสมัครคอมเพล็กซ์นั่งร้าน XI-WH1 กับโปรตีนทรานส์เมมเบรน Gal2 มีการใช้ซิปม้วนแบบสังเคราะห์ที่มีความสัมพันธ์กันสูง: SYNZIP1 (SZ1) และ SYNZIP2 (SZ2) (Reinke et al., 2010) ในการกำหนดค่านี้ Gal2 ถูกหลอมรวมกับ SZ2 ที่ปลาย N โดยใช้ตัวเชื่อมโยงแบบยืดหยุ่นหรือแบบเฮลิคัล ขณะที่โครงนั่งร้าน WH1 ใช้กับ SZ1 ที่ปลาย N โดยตัวเชื่อมโยงแบบยืดหยุ่น โครงนั่งร้านสังเคราะห์ยอมให้สารเชิงซ้อนของ Gal2-xylose isomerase ก่อตัวขึ้น ทำให้สายพันธุ์ของยีสต์ดูดซับและประมวลผลไซโลส ส่งผลให้อัตราส่วนเอทานอล/ไซลิทอลสูงขึ้น ซึ่งเป็นการวัดค่าพร็อกซีสำหรับการบริโภคไซโลส คัง et al. (2019) ใช้วิธีการอื่นในการแปลเอ็นไซม์วิถีเป็นคอมเพล็กซ์หลายเอนไซม์ผ่าน RIDD และ RIAD ซึ่งเป็นเปปไทด์สั้นที่มีสัมพรรคภาพสูง (KNS = 1.2 นาโนโมลาร์) เพื่อปรับปรุงการผลิตไลโคปีนใน S. cerevisiae. เอนไซม์หลักสองชนิดคือ Idi และ CrtE ถูกแท็กด้วย RIAD และ RIDD ตามลำดับ สารเชิงซ้อนที่เป็นผลลัพธ์ให้ไลโคปีน 2.3 กรัม/ลิตรหลังจากการหมัก 144 ชั่วโมง ซึ่งสูงกว่าสายพันธุ์ควบคุม 58%

ในการศึกษาล่าสุด Han et al. (2018) ใช้ Tya ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของ Ty1 retrotransposon เพื่อคัดเลือกเอนไซม์หลักในเชิงพื้นที่เพื่อปรับปรุงการผลิตฟาร์เนซีนและฟาร์นีซอลใน S. cerevisiae. Tya เป็นโปรตีนขนาด 49 kDa ที่ประกอบตัวเองเป็นเปลือก คล้ายกับอนุภาคคล้ายไวรัส (VLPs) (Marchenko et al., 2003) Tya ถูกหลอมรวมกับปลาย C หรือปลาย N ของเอนไซม์ไอโซพรีนอยด์หลักสามตัว: tHMG1 (รูปแบบที่ตัดทอนของ HMG-CoA reductase จาก S. cerevisiae), IspA (จาก อี. โคไล) และ AFS1 (จาก Malus domestica) หรือ DPP1 (จาก S. cerevisiae) เพื่อสร้างเมตาโบลอนสังเคราะห์เพื่อขับคาร์บอนฟลักซ์ไปทางฟาร์เนซีนหรือฟาร์นีซอล Titer ถึง 930± 40 มก./ลิตร ในสายพันธุ์ที่มีประสิทธิภาพดีที่สุด เพิ่มขึ้น 3.1 เท่าเมื่อเทียบกับ 300± 11 มก./ลิตร สำหรับเอ็นไซม์อิสระ สายพันธุ์ที่มีประสิทธิภาพดีที่สุดสำหรับการผลิตฟาร์นีซอลผลิตได้ 882 ± 15 มก./ลิตร สูงกว่าสายพันธุ์ควบคุมที่แสดงเอ็นไซม์อิสระ 3.8 เท่า (231 ± 14 มก./ลิตร)

ด้วยความสนใจที่เพิ่มขึ้นในโครงนั่งร้านเพื่อส่งสารตั้งต้นไปสู่การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนเพิ่มเติมจึงถูกคัดกรองเพื่อหาศักยภาพในการนั่งร้านของพวกมัน ความโค้งของโปรตีน Thylakoid1A (CURT1A) ที่แยกได้จากเยื่อหุ้มไทลาคอยด์ของ Arabidopsis thalianaได้รับการระบุว่าเป็นโมดูลนั่งร้านที่ผูกกับเมมเบรน (Behrendorff et al., 2019) CURT1A สามารถสร้างโฮโมโอลิโกเมอร์ในเมมเบรนได้ โดยการหลอมรวมโปรตีนเรืองแสงกับตัวแปรต่างๆ ของ CURT1A โปรตีนหลอมรวม CURT1A ถูกแสดงให้นั่งร้านบนเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมของ S. cerevisiaeส่งผลให้สัญญาณเรืองแสงถูกแปลไปยังเมมเบรน


ผลลัพธ์และการอภิปราย

การออกแบบและวิธีการทดลอง

ตามการกำหนดลำดับที่สมบูรณ์ของ S. cerevisiae จีโนม Affymetrix DNA microarrays ได้กลายเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการตรวจสอบรูปแบบการแสดงออกพร้อมกันของยีนยีสต์มากกว่า 6,000 ยีน (10, 14, 21, 33, 52) เนื่องจากขอบเขตของชุดข้อมูลแต่ละชุดที่ได้จากไมโครอาร์เรย์ไฮบริไดเซชัน การรักษาที่ใช้ในการศึกษานี้จึงจำกัดอยู่ที่ความเข้มข้นเดียวที่จุดเวลาเดียว สื่อสมบูรณ์ (YPD) ถูกใช้เพื่อไม่จำกัดอัตราการเติบโต และเลือกเวลาเพิ่มเป็นสองเท่า (90 นาที) สำหรับระยะเวลาของการสัมผัสกับสารที่ 0.5 เท่าของ MIC เซลล์ถูกเปิดเผยต่อสารและเก็บเกี่ยวในระหว่างระยะการเจริญเติบโตปานกลาง-ลอการิทึม

RNA ถูกเตรียมหลังจากการเผยสัมผัสของสายพันธุ์ต้นกำเนิด BY4743 กับหนึ่งในห้าของ azoles ที่มีลักษณะเฉพาะก่อนหน้านี้ (clotrimazole, fluconazole, itraconazole, ketoconazole และ voriconazole), imidazole นวนิยาย, PNU-144248E (แสดงในรูปที่ ​ รูปที่ 1 ), 1 ), อัลลิลามีน (เทอร์บินาไฟน์) หรือมอร์โฟลีน (อะโมรอลฟีน) ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ นอกจากนี้ RNA ถูกเตรียมจากสามสายพันธุ์แต่ละอันมีการลบโฮโมไซกัสของ ERG2, ERG5, หรือ ERG6 และจากสองวัฒนธรรมการควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา รูปที่ ​ รูปที่ 1 แสดงยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเออร์กอสเตอรอลจากฟาร์นีซิล ไพโรฟอสเฟตใน S. cerevisiae.

การรักษาที่ใช้ในการศึกษาและความสัมพันธ์กับการสังเคราะห์เออร์กอสเตอรอล ชื่อยีนตามที่ระบุไว้ในเอกสารอ้างอิง 9) ยีนในสายพันธุ์ที่ถูกลบนั้นเป็นตัวหนาและใส่กล่อง ลูกศรชี้ไปยังตำแหน่งที่ออกฤทธิ์ของสารต้านเชื้อรา โครงสร้างของ PNU-144248E แสดงอยู่ใต้กลุ่มอะโซล

การระบุรูปแบบการแสดงออกของยีน

ชุดจีโนมของยีสต์ Affymetrix แต่ละชุดแสดงถึง 6,593 ORF รวมถึงยีนควบคุม 172 ยีน ดังนั้น ชุดข้อมูล 11 ชุดจากการรักษาที่ประกอบรวมด้วยการศึกษานี้แสดงจุดข้อมูล 72,523 จุด ค่าความเข้มของการผสมพันธุ์จะแสดงเป็นหน่วย ADI ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ หลังจากการทำให้เป็นมาตรฐานเพื่อพิจารณาความแปรผันของความเข้มของชิป (อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ) ตัวกรองถูกนำไปใช้โดยกำหนดให้ค่า ADI ทดลองต้องมากกว่า 50 หน่วย ADI ดังนั้นจึงจำกัดข้อมูลไว้ที่ 29,428 จุด การใช้ตัวกรองที่สองซึ่งกำหนดให้ค่า ADI พื้นฐานมากกว่า 50 หน่วย ADI จำกัดข้อมูลไว้ที่ 20,697 จุด ค่า ADI ที่ใช้ในตัวกรองได้รับเลือกหลังจากตรวจสอบค่า ADI พื้นหลังที่คำนวณโดยซอฟต์แวร์ GeneChip และค่า ADI สำหรับยีนที่ไม่ได้แสดงที่เลือกไว้ (เช่น ยีนที่จำเพาะของเดี่ยวในเซลล์ดิพลอยด์ 寚ta ไม่แสดง) ด้วยทั้งสองวิธี ค่าหน่วย ADI สูงถึง � ไม่มีสัญญาณ

ยีนที่อัตราส่วน ADI เปลี่ยนแปลงเกินกว่า 1 ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานถือว่าตอบสนองต่อการรักษา จากเกณฑ์นี้ ยีน 1,154 ตัวตอบสนองด้วยระดับ mRNA ที่เพิ่มขึ้นในการรักษาอย่างน้อยหนึ่งครั้ง ยีน 1,358 ตัวตอบสนองด้วยระดับ mRNA ที่ลดลงเมื่อเทียบกับการตรวจวัดพื้นฐาน เพื่อแยกแยะการตอบสนองของยีนต่อการรบกวนในการสังเคราะห์ ergosterol จากการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสอื่น ๆ ยีนที่ตอบสนองอย่างน้อย 5 จาก 11 การทดลองทดลองได้รับการพิจารณาในการวิเคราะห์ที่ตามมา ความตั้งใจในการเลือกตามเกณฑ์เหล่านี้คือการระบุยีนที่มีรูปแบบการแสดงออกที่บรรจบกันในแต่ละการรักษา ซึ่งอาจบ่งบอกถึงการตอบสนองร่วมกัน

ยีนทั้งหมด 156 ตัวแสดงระดับการถอดรหัสเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในห้าการรักษาหรือมากกว่า และ 78 รายการแสดงระดับการถอดรหัสที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในห้าการรักษาหรือมากกว่า สิ่งเหล่านี้ถูกใส่คำอธิบายประกอบโดยใช้บทบาททางชีววิทยาที่กำหนดโดยฐานข้อมูลโปรตีนยีสต์ (YPD) (18) จำนวนและลักษณะของยีนที่ตอบสนองซึ่งจัดกลุ่มตามบทบาททางชีววิทยาแสดงไว้ในตาราง ​ ตารางที่ 1 1 . หมวดหมู่ที่มีจำนวนการตอบสนองมากที่สุดคือ “unknown” กลุ่ม 53 ยีน รองลงมาคือยีนยลที่ตอบสนอง 36 ยีน ตามด้วยยีน 22 ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ไขมัน กรดไขมัน และสเตอรอล กลุ่มนี้มีเก้ายีนในวิถีทางเออร์กอสเตอรอล หมวดหมู่ ȁ ยีนที่เกี่ยวข้องกับยีน” หมายถึงยีนที่เกี่ยวข้องกับการรบกวนของเออร์กอสเตอรอลโดยผลการทดลองอื่น ๆ ยีนเหล่านี้อธิบายไว้ในตาราง ​ ตารางที่ 2 และ ​ และ 3 3 และ รูปที่ ​ รูปที่ 2 และ ​ และ3. 3 . หมวดหมู่ ȁยีนอื่นๆ ” รวมถึงยีนที่ตอบสนอง ซึ่งแต่ละยีนเป็นตัวแทนของวิถีทางชีววิทยาเฉพาะเพียงอย่างเดียว และไม่สามารถมองเห็นความสัมพันธ์กับการรบกวนของเออร์กอสเตอรอลได้

ตารางที่ 1

ยีนตอบสนองในห้าหรือมากกว่า การรักษา

บทบาททางชีวภาพ a จำนวนยีน b จำนวนครั้ง c อัตราส่วนการตี/ยีนจำนวนการติดยา d อัตราส่วนการตีต่อยา/ยีนจำนวนการตี KO e KO ตี/อัตราส่วนยีนจำนวน (%) ของยีนที่ตอบสนองต่อวัฒนธรรมอิ่มตัว% ของยีนที่ตอบสนองต่อ: ทิศทางการเปลี่ยนแปลง f
การรักษาด้วยยาKO
ไม่ทราบ f g
 Up261545.921244.77301.150 (0)8020ขึ้น
 ขึ้น/นั่งลง8526.50354.38172.138 (100)6733ขึ้น
 ลง11676.09565.09111.000 (0)8416ลง
 ลง/นั่งลง8506.25415.1391.138 (100)8218ลง
ไมโตคอนเดรีย321946.061454.53491.5323 (72)7525ขึ้น
4256.25205.0051.251 (25)8020ลง
ลิปิด/กรดไขมัน/สเตอรอล161016.31633.94382.381 (6)6238ขึ้น
6376.16284.6791.502 (33)7624ลง
การสังเคราะห์และแปรรูปโปรตีน15906.00734.87171.130 (0)8119ขึ้น
9546.00424.67121.336 (67)7822ลง
ความเครียด15906.00593.93312.075 (33)6634ขึ้น
5316.20255.0061.204 (80)8119ลง
เมมเบรนที่เกี่ยวข้อง8455.62394.8860.750 (0)8713ขึ้น
8506.25364.50141.753 (38)7228ลง
การสังเคราะห์กรดอะมิโน9586.44434.78151.677 (78)7426ขึ้น
การควบคุมวัฏจักรเซลล์7385.43314.4371.000 (0)8218ขึ้น
ที่เกี่ยวข้องกับโครมาติน6355.83294.8361.000 (0)8317ขึ้น
เมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรต6355.83244.00111.835 (83)6931ขึ้น
ถุงที่เกี่ยวข้อง5295.80234.0061.200 (0)7921ลง
การสังเคราะห์ผนังเซลล์5336.60265.2071.403 (60)7921ขึ้น
เมแทบอลิซึมของนิวคลีโอไทด์5285.60193.8091.803 (60)6832ลง
ยีนอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง4246.00194.7551.251 (25)7921ลง
3175.67113.6762.001 (33)6535ขึ้น
ยีนอื่นๆ12665.50584.8380.672 (17)8812ลง

ตารางที่ 2

ยีนเข้ารหัสผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างเซลล์ซองจดหมายหรือ ฟังก์ชั่น

หน้าที่ของผลิตภัณฑ์ยีน ยีน a
เกี่ยวข้องกับโปรตีนไกลโคซิเลชัน ALG5 2,4 , ALG3, ALG9, ALG6 3,3 , ALG8 1,4 , ALG10, โอน (PMT ตระกูล PMT2 3,2 ) CWH41, GLS2 1,5 , MNS1
โปรตีนโอไกลโคซิเลตAGA1, AGA2, BAR1, CTR1, CTS1 2,3 , CWP1, CWP2, DAN1, FET3, FLO1, FLO5, FLO9, FLO10, FUS1, GAS1, GIT1, HKR1, HSP150, KEX2, KNH1, KRE1 3,4 , KRE9 2,3 , MID2, MSB2, PEX15, PGM1, PGM2, PIR1, PIR3, PRB1 1,4 , SAG1, ก.ล.ต.20, SED1, SED4, SLG1, SRO4, SSR1, STA1, STA2, TIP1 2,5 , TIR1 3,3 , TIR2, YLR110C
โปรตีนเมมเบรนตอบสนอง b BAP2 2,3 , BAP3 0,6 , DIP5 3,4 , FET4 1,7 , HNM1 3,5 , HXT1 0,5 , HXT3 2,4 , PHO87 0,5 , RCS1 1,4 , SMF1 3,4 , YDR373W 1,4 , YGR138C 0,5 , YKL146W 1,4 , YNL065W 0,6 , YNL321W 2,3 , YOR161C 2,3 , YOR271C 2,4
โปรตีนยึดเกาะ GPIAGa1, AGA1, CWP1, CWP2, EGT2 1,4 , FLO1, FLO5, FLO9, GAS1, ICWP, KRE1 3,4 , PRY3, SED1, TIP1 2,5 , TIR1 3,3 , TIR2, YAP3, YCR089W, YDR055W 0,5 , YDR134C, YDR534C, YEL040W, YER150W 0,5 , YGR189C, YJR151C, YLR110C, YNL300W 3,7 , YOR009W, YOR214C
มีส่วนร่วมในการสังเคราะห์ β-1,6-glucanCWH53, FKS2, KNR4, HKR1, KRE1 3,4 , KRE5, KRE6, KRE9 2,3 , KRE11, SKN1
ออสโมติกความเครียดที่เกี่ยวข้อง
 ส่วนหนึ่งของเส้นทางสัญญาณตอบสนองความเค้นออสโมติกHOG1 2,3
 ปัจจัยการถอดความที่มีบทบาทในการทนต่อเกลือ CIN5 1,6
 เกิดจากความเครียดออสโมติกDDR48 3,4 , DDR2, GRE1, GRE2 3,4 , GRE3, HOT1, PTP2, PTP3, SIP18, SKN7, SKK2, SSK1, STE11, SLN1, SHO1, YPD1
โปรตีนตอบสนองที่เกี่ยวข้องกับการหลั่ง b VID24 0,7 , RET2 3,4 , ก.ล.ต.17 0,5 , COP1 2,5 , LST8 3,4 , NHX1 0,5 , YGL054C 0,6 , YHR138C 0,5

ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเออร์กอสเตอรอลและส่วนประกอบเมมเบรน ยีนตัวหนามีการตอบสนองในการศึกษา ตัวเอียง ตัวหนาบ่งชี้ยีนที่มีระดับการถอดรหัสลดลง ตัวยกระบุจำนวนการรักษาที่ยีนตอบสนอง ตัวเลขแรกในแต่ละตัวยกคือจำนวนการรบกวนทางพันธุกรรม (จากทั้งหมดสาม) ที่ทำให้เกิดการตอบสนอง และจำนวนที่สองคือจำนวนการรักษาด้วยยา (จากทั้งหมดแปดครั้ง) ที่ทำให้เกิดการตอบสนอง รายชื่อยีนได้มาจาก YPD (18) และการอ้างอิง 9

ตารางที่ 3

ยีนที่เข้ารหัสไมโตคอนเดรีย โปรตีน

ผลิตภัณฑ์ยีน ยีน a
สารเชิงซ้อนการขนส่งอิเล็กตรอน เยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นใน:
  ยูบิควินอล ไซโตโครม รีดักเตส คอมเพล็กซ์ IIIซัง, CYT1 2,4 , COR1 2,3 , QCR2, QCR6 1,4 , QCR7, QCR8, QCR9, QCR10, RIP1 1,5
 ไซโตโครม (ไอโซฟอร์มแบบไม่ใช้ออกซิเจน) CYC7 1,5
 ไซโตโครม ออกซิเดสCOX1, COX2, COX3, COX4 3,4 , COX5A 2,4 , COX5B 1,8 , COX6, COX7, COX8 0,5 , COX9, COX12, COX13 3,4
𠀺TP สังเคราะห์ATP1 3,5 , ATP2, ATP3, ATP4, ATP5, ATP6, ATP7, ATP8, ATP9, ATP14 0,6 , ATP15 3,4 , ATP16 0,5 , ATP17, ATP20, INH1 0,6 , TIM11
�P/ATP ตัวพาโปรตีนAAC1, AAC3 1,4 , PET9 3,3 , YPL134C 1,4 , YPR021C
องค์ประกอบของวัฏจักร TCACIT1, ACO1 2,4 , IDH1, IDH2, KGD1 1,5 , KGD2, LPD1, LSC1, LSC2, SDH1 2,4 , SDH2, SDH3, SDH4, FUM1 2,4 , MDH1
โปรตีนไมโตคอนเดรียที่ตอบสนองอื่นๆARG5,6 0,5 , ARG7 1,6 , COT1 3,5 , GPD2 3,4 , IDP1 0,5 , ILV5 2,3 , ILV6 3,5 , MRP1 0,6 , PFK27 0,6 , SHM1 1,4 , SOM1 0,6 , SOD2 2,4 , TIM23 3,3 , YAH1 2,3 , YIL154C 0,6

ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์และการใช้ประโยชน์ของ heme ตัวหนา ตัวเอียง และตัวยกเป็นไปตามที่อธิบายไว้สำหรับรูปที่ ​ รูปที่ 2 2 . รายชื่อยีนได้มาจาก YPD (18)

ยีนยังถูกจัดประเภทตามจำนวนสัมพัทธ์ของการตอบสนองอันเนื่องมาจากการรบกวนทางเคมีกับการรบกวนทางพันธุกรรม เปอร์เซ็นต์ของการตอบสนองที่เกิดจากการรบกวนทางเคมีมีตั้งแต่เสียงสูง 87 ถึง 88% ในกรณีของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเยื่อหุ้มเซลล์ ไปจนถึงระดับต่ำที่ 62% สำหรับระดับของไขมัน กรดไขมัน หรือสเตอรอล - ยีนที่เกี่ยวข้อง วิเคราะห์โดยใช้ a k- หมายถึงอัลกอริธึมไม่เปิดเผยรูปแบบการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับคลาสการรักษาเฉพาะ (ไม่แสดงข้อมูล) ที่น่าสนใจคือ ยีนเออร์กอสเตอรอลมีการตอบสนองสูงต่อการหยุดชะงักของยีน ERG2, ERG5, และ ERG6. ยีน ergosterol ที่ตอบสนอง 10 ยีนมีระดับการถอดรหัสเพิ่มขึ้นในสายพันธุ์กลายพันธุ์ทั้งสาม (รูปที่ ​ (รูปที่ 2) 2 ) ยกเว้นยีนเฉพาะที่ถูกรบกวนในแต่ละสายพันธุ์

ในการประเมินความจำเพาะของการตอบสนองของ ergosterol ที่ระบุไว้ในการศึกษานี้ พฤติกรรมของยีนที่ตอบสนองเหล่านี้ได้รับการตรวจสอบหลังจากการเปลี่ยนแปลงจากการเติบโตแบบลอการิทึมไปสู่ความอิ่มตัว ตาราง ​ ตารางที่ 1 1 แสดงจำนวนยีนที่ตอบสนองในแต่ละหมวดหมู่ซึ่งระดับการถอดรหัสเปลี่ยนไปเมื่อเซลล์เข้าสู่การเติบโตที่อิ่มตัวและผ่านการเปลี่ยนแปลงของไดออกซิก (10, 18 G. F. Bammert และ J. M. Fostel, ข้อมูลที่ไม่ได้เผยแพร่) สัดส่วนของยีนที่ตอบสนองซึ่งเปลี่ยนแปลงไปตามการเจริญเติบโตที่อิ่มตัวนั้นแตกต่างกันไปตั้งแต่ 0% ของยีนในหลายเส้นทางจนถึงระดับสูงสุดที่ 78 และ 83 ของยีนที่ตอบสนองต่อเออร์กอสเตอรอลที่เกี่ยวข้องกับกรดอะมิโนและเมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรต ตามลำดับ นี่ชี้ให้เห็นว่าสำเนาบันทึกบางกลุ่มอาจตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงของอัตราการเผาผลาญมากกว่าการรบกวนของ ergosterol โดยตรง

ยีนที่ตอบสนองในวิถีของเออร์กอสเตอรอล

รูปที่ ​ รูปที่ 2 แสดงยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเออร์กอสเตอรอลจากเอซิลโคเอ็นไซม์ A (เอซิล-CoA) ซึ่งเน้นยีนที่ตอบสนองบางตัวที่ระบุไว้ข้างต้น ยีนเก้าตัวในวิถีทางเออร์กอสเตอรอลตอบสนองด้วยระดับการถอดรหัสที่เพิ่มขึ้นตามเงื่อนไขที่ใช้ในการศึกษานี้ วิถีทางเออร์กอสเตอรอลแสดงถึงสัดส่วนสูงสุดของยีนที่ตอบสนองตามที่ระบุ โดยสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงว่าวิถีทางนี้เป็นเป้าหมายของอะโซลและตอบสนองต่อการปรับระดับของเออร์กอสเตอรอล

การสังเคราะห์ทางชีวภาพของเออร์กอสเตอรอลเกี่ยวข้องกับการประสานงานของปัจจัยหลายอย่างโดยที่เซลล์ควบคุมการสังเคราะห์องค์ประกอบที่จำเป็นนี้ ERG19 มีรายงานว่ามีส่วนในการควบคุมการไหลผ่านทางเดิน mevalonate (3) และเพิ่มขึ้นเพื่อตอบสนองต่อการรบกวนที่นี่ ERG3 การแสดงออกเพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วยยาต้านเชื้อรา (43) และในสายพันธุ์ที่มีการกลายพันธุ์ใน ERG2, ERG5, และ ERG6 (2). ข้อมูลเหล่านี้ได้รับการสนับสนุนโดยข้อสังเกตที่รายงานที่นี่: ERG3 การแสดงออกเพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วยยาและในสาม ERG การลบสายพันธุ์ นอกจากนี้การแสดงออกของ NCP1ซึ่งเข้ารหัส NADP-cytochrome P450 reductase และผู้บริจาคอิเล็กตรอนสำหรับ squalene epoxidase, lanosterol 14α-demethylase และ sterol C-22 desaturase (45) เพิ่มขึ้นห้าเท่าในสายพันธุ์ที่มีการแสดงออกมากเกินไป ERG11 (48) สอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของระดับการถอดรหัสของยีนทั้งสองนี้ในการศึกษานี้

การวัดโดยใช้โปรโมเตอร์ฟิวชันในภูมิหลังทางพันธุกรรมต่างๆ พบว่ามียีนจำนวนหนึ่งที่ส่งผลต่อ ERG9 นิพจน์ (23) การรักษาสองวิธีทับซ้อนกันที่รายงานไว้ที่นี่: การสัมผัสกับคีโตโคนาโซลและการแสดงออกใน ERG2 ก่อกวน ในทั้งสองกรณี ERG9 การแสดงออกเพิ่มขึ้น (23) ในขณะที่ ERG9 ไม่เป็นไปตามเกณฑ์ของการเปลี่ยนแปลงในการรักษาตั้งแต่ 5 วิธีขึ้นไปที่ใช้ในที่นี้ ระดับของ ERG9 การถอดเสียงเพิ่มขึ้นในสี่การรักษา: ERG2 และ ERG6 สิ่งที่น่าพิศวงและการสัมผัสกับ fluconazole หรือ PNU-144248E ความแตกต่างในการรักษา ketoconazole ที่ใช้ในการศึกษาทั้งสอง (18 ชั่วโมงของการศึกษาที่รายงานในการอ้างอิง 23 เทียบกับ 90 นาทีที่นี่) อาจเป็นสาเหตุของความแตกต่าง ดังที่สังเกตได้จากรูปที่ ​ รูปที่ 5 สำหรับ ERG25.

หลักสูตรการแสดงออกหลังจากได้รับ ketoconazole (A) OD ของวัฒนธรรม ณ เวลาที่สุ่มตัวอย่าง (แท่งที่เป็นของแข็ง, แท่งที่มีการแรเงาอย่างหนักของวัฒนธรรมที่ไม่ผ่านการบำบัด, 4 μM ketoconazole open bar, 8 μM ketoconazole light shaded bar, 16 μM ketoconazole) และการเปลี่ยนแปลงใน TEF1 ระดับเมื่อวัฒนธรรมเข้าสู่ความอิ่มตัว (เส้น ค่าเฉลี่ยของการวัดการเพาะเลี้ยงที่ไม่ผ่านการบำบัด 3 ครั้งในแถบข้อผิดพลาด B, C และ D ข้อผิดพลาดมาตรฐาน) (B ถึง D) คำตอบของ ERG25, YER067W, และ YNL300W ใบรับรองผลการเรียน (สัญลักษณ์ที่เป็นของแข็ง) และภายใน TEF1 การควบคุม (สัญลักษณ์เปิด) การเพาะเลี้ยงไม่ถูกบำบัด (วงกลม) หรือบำบัดด้วยคีโตโคนาโซลที่ 4 μM (สามเหลี่ยม), 8 μM (สี่เหลี่ยม) หรือ 16 μM (เพชร)

ยีนอื่นในทางเดิน ERG1ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในการรักษาใดๆ ที่ใช้ในที่นี้ รวมถึง terbinafine แม้ว่ากิจกรรมของเอนไซม์ Erg1p จะเพิ่มขึ้นตามการได้รับสาร terbinafine (28) กิจกรรม Erg1p ตอบสนองต่อข้อจำกัดของออกซิเจนและสเตอรอล (34) และดูเหมือนว่าจะถูกควบคุมโดยการแปลโปรตีนหรือปัจจัยอื่นๆ (28) เมื่อนำมารวมกัน การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรม Erg1p เกิดขึ้นจากกฎข้อบังคับหลังการถอดเสียง

ในการศึกษาโดยใช้การหลอมรวมโปรโมเตอร์เพื่ออ่านค่าการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัส Dimster-Denk และคณะ (11) สังเกต 19 ยีนที่มีการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกมากกว่า 1.5 เท่าหลังได้รับ fluconazole 21 h เทียบกับระดับการแสดงออกในเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษา จากยีนที่ตอบสนองต่อ 19 ยีนเหล่านี้ พบว่า 7 ยีนมีการตอบสนองในการศึกษานี้ (ERG2, ERG3, ERG4, ERG5, ERG6, ERG11, และ ERG19) และ ERG9 การแสดงออกเปลี่ยนไปในสี่การรักษา ยีนอีก 11 ยีนมีระดับการถอดรหัสต่ำเกินไปที่จะวัดได้อย่างน่าเชื่อถือ ซึ่งรวมถึงยีนที่ตอบสนองต่อการผสมพันธุ์ 5 ยีนที่ไม่ได้แสดงออกในสายพันธุ์ดิพลอยด์ที่ใช้ที่นี่ (ERG8, ERG12, ARE2, COQ7 หรือเรียกอีกอย่างว่า CAT5], FAR3, รูปที่1, HEM14, MFA1, MFA2, MOD5, และ STE2). ตอบกลับโดย ERG24 และ ERG25 ถูกพบใน microarray แต่ไม่ได้รายงานโดย Dimster-Denk et al ดังนั้น ทั้งสองวิธีจึงสอดคล้องกันในการระบุยีนที่ตอบสนองระหว่างยีนที่ตรวจพบโดยทั้งคู่ อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงระดับการถอดเสียงไม่ได้ไปในทิศทางเดียวกันเสมอไปในการศึกษาทั้งสอง ลดลงใน ERG3, ERG4, ERG5, ERG6, และ ERG11 Dimster-Denk และคณะรายงานระดับการถอดเสียงที่ 21 ชั่วโมง (11) ในขณะที่ยีนเหล่านี้แสดงระดับการถอดรหัสเพิ่มขึ้นหลังจากสัมผัส 90 นาทีซึ่งวัดโดยไมโครเรย์ มีแนวโน้มมากขึ้นที่สิ่งนี้สะท้อนถึงความแตกต่างระหว่างการตอบสนองทางชีวภาพของยีนเหล่านี้ในช่วงเวลาที่ได้รับแสงที่ต่างกันมากกว่าความคลาดเคลื่อนระหว่างวิธีการที่ใช้ในการวัดการแสดงออก

ยีนตอบสนองอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับไขมัน กรดไขมัน และการสังเคราะห์ทางสเตอรอล

นอกจากการมีส่วนร่วมในเยื่อหุ้มเซลล์แล้ว ยังพบ esterified ergosterol ในอนุภาคไขมัน ซึ่งอาจทำหน้าที่เป็นแหล่งกักเก็บหรือเป็นตัวกลางในการขนส่งภายในเซลล์ (53, 55) ARE1 เป็นหนึ่งในสองยีนที่รับผิดชอบในการสร้างเอสเทอริฟิเคชันของเออร์กอสเตอรอล ซึ่งเป็นขั้นตอนสุดท้ายในวิถีทางที่นำไปสู่เออร์กอสเตอริล และตอบสนองในการศึกษานี้ ยีนตอบสนองอีกตัวหนึ่ง CYB5 (การเข้ารหัสไซโตโครม NS5) ระบุได้ด้วยความสามารถในการเอาชนะภาวะภูมิไวเกินของคีโตโคนาโซลเมื่อแสดงออกมากเกินไปในพื้นหลังของ erg11 (47) และอาจช่วยปกป้องสิ่งมีชีวิตจากการได้รับเอโซล ACH1 (การเข้ารหัสอะเซทิล-CoA ไฮโดรเลส) อาจตอบสนองต่อการผลิตที่มากเกินไปของตัวกลางสเตอรอลที่เกิดขึ้นระหว่างการยับยั้งวิถี FAS1 (การเข้ารหัสการสังเคราะห์ fat-acyl-CoA synthase) ทำให้ระดับ ergosterol esters และ sphingolipids ลดลง ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทที่เป็นไปได้ในการสังเคราะห์ไขมันและเมแทบอลิซึม (9) LCB1 เข้ารหัสซีรีน -palmitoyltransferase เอนไซม์ตัวแรกที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของส่วนประกอบพื้นฐานสายยาวของสฟิงโกลิปิด การเพิ่มขึ้นของระดับการถอดเสียงของทรานสเฟอร์เรสนี้ภายหลังการรบกวนของวิถีทางเออร์กอสเตอรอลชี้ให้เห็นถึงปฏิสัมพันธ์ระหว่างวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของเออร์กอสเตอรอลและสฟิงโกลิปิดในยีสต์

ระดับการถอดเสียงของยีนอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญไขมัน กรดไขมัน และสเตอรอลลดลงในการศึกษานี้ NS SUR2 ผลิตภัณฑ์ไฮดรอกซีเลตที่สฟิงกอยด์ C-4 ของเซราไมด์ (15) และการลดลงที่สังเกตได้ในระดับของการถอดเสียงนี้ชี้ให้เห็นถึงปฏิกิริยาระหว่างวิถีทางสฟิงโกลิปิดและสเตอรอล ELO1 เข้ารหัสเอนไซม์ที่มีหน้าที่ในการยืดตัวของกรดไขมัน ระดับของการถอดเสียงที่ลดลงภายใต้เงื่อนไขของการศึกษานี้อาจบ่งชี้ถึงการตอบสนองการชดเชยในปริมาณกรดไขมันในเซลล์ต่อสเตอรอลที่จำกัดหลังจากการรบกวนของวิถีทางเออร์กอสเตอรอล OLE1การเข้ารหัส δ-9 desaturase จำเป็นสำหรับการก่อตัวของกรดไขมันไม่อิ่มตัว และยังแสดงระดับการถอดรหัสที่ลดลงที่นี่ OLE1 ถูกยับยั้งโดยการปรากฏตัวของกรดไขมันอิ่มตัว (12) ดังนั้นการลดลงใน OLE1 ระดับการถอดเสียงอาจบ่งบอกถึงการเพิ่มขึ้นของระดับกรดไขมันอิ่มตัว ซึ่งอาจเป็นการชดเชยการตอบสนองต่อเออร์กอสเตอรอลที่เปลี่ยนแปลงไปอีกอย่างหนึ่ง ที่น่าสนใจคือ การปราบปรามของ . ที่ตอบสนองต่อกรดไขมัน OLE1 เป็นสื่อกลางผ่าน FAA1 และ FAA4 สินค้า (7) และระดับของ FAA4 การถอดเสียงลดลงที่นี่ การเชื่อมโยงของกรดไขมันกับการรบกวนทางเดินของ ergosterol อาจแนะนำการปรับโครงสร้างเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อตอบสนองต่อระดับ ergosterol ที่ลดลง

แนวทางตอบสนองอื่นๆ

แม้ว่า ergosterol จะพบได้ทั่วเยื่อหุ้มเซลล์ แต่ก็มีมากที่สุดในพลาสมาเมมเบรนและถุงน้ำหลั่ง และมีความสำคัญต่อการหายใจของไมโตคอนเดรีย (9, 36, 55) การลดลงของ ergosterol ที่มีการสะสมของ sterol ตัวกลางอาจส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในหน้าที่ของเมมเบรน การสังเคราะห์และการทำงานของเอนไซม์ที่จับกับเมมเบรน และกิจกรรมของไมโทคอนเดรีย เช่นเดียวกับในพฤติกรรมที่ไม่พร้อมเพรียงกันของเซลล์ยีสต์ (36, 49) การเปลี่ยนแปลงในรูปแบบการถอดเสียงที่รายงานในตาราง ​ ตารางที่ 3 3 อาจสะท้อนถึงความเครียดเหล่านี้

สามารถคาดการณ์ได้ว่าการรบกวนของระดับ ergosterol ภายในเซลล์อาจส่งผลต่อการทำงานของเอนไซม์ยล รูปแบบนี้เกิดขึ้นจริงด้วยการเพิ่มขึ้นของระดับการถอดรหัสของส่วนประกอบต่างๆ ของระบบขนส่งอิเล็กตรอนในไมโตคอนเดรีย ดังที่แสดงในตาราง ​ ตารางที่ 3 3 . ระดับการถอดเสียงของสมาชิกทั้งสี่ของไซโตโครม คอมเพล็กซ์ออกซิเดส, COX4, COX5A, COX8, และ COX13, เพิ่มขึ้น. ในทำนองเดียวกัน ระดับการถอดเสียงเพิ่มขึ้นสำหรับสมาชิกของไซโตโครมสี่ตัว รีดักเทสคอมเพล็กซ์, RIP1, CYT1, QCR6, และ COR1และยีนห้าตัวที่เข้ารหัสหน่วยย่อยของ ATP synthase ATP1, ATP14, ATP15, ATP16, และ INH1. ยีนอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการสร้างพลังงานที่มีระดับการถอดรหัสเพิ่มขึ้นแสดงอยู่ในตารางที่ ​ ตารางที่ 3, 3 เช่นเดียวกับยีนที่ตอบสนองต่อยีนอื่นๆ จำนวนหนึ่งซึ่งเข้ารหัสโปรตีนไมโตคอนเดรีย

ระดับการถอดเสียงจากสมาชิกสี่ในห้าของตระกูลยีนขาดออกซิเจน (ANB1, COX5b, CYC7, และ HEM13) ลดลงในการตอบสนองต่อการรักษาที่ใช้ในการศึกษานี้ (ตารางที่ ​ (ตารางที่ 4). 4) ยีนสองตัวนี้ CYC7 และ COX5b, เข้ารหัสไอโซฟอร์มที่ขาดออกซิเจนของไซโตโครม และไซโตโครม ออกซิเดส เนื่องจากระดับการแสดงออกขึ้นอยู่กับระดับของออกซิเจนที่มีอยู่ (6, 25) การลดลงของระดับการถอดรหัสของยีนที่เกิดจากภาวะไร้ออกซิเจนเหล่านี้อาจเกิดขึ้นในการตอบสนองต่อระดับออกซิเจนในเซลล์ที่เพิ่มขึ้น หลักฐานอีกบรรทัดหนึ่งที่สนับสนุนสมมติฐานนี้คือการสังเกตว่าการถอดเสียงจากยีนสามตัวที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของความเครียดออกซิเดชัน (GRE2, YDR453C, และ SOD2) เพิ่มขึ้น (ตาราง ​ (ตาราง 4). 4 ). ในระหว่างการเร่งปฏิกิริยาปกติ ไซโตโครม ออกซิเดสจะถ่ายเทอิเล็กตรอน 2 ตัวไปยังโมเลกุลออกซิเจน และปฏิกิริยาที่ไม่สมบูรณ์อาจส่งผลให้เกิดออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาได้ มาชิดะ และคณะ (32) ได้แสดงให้เห็นว่าการได้รับ Farnesol ส่งผลให้เกิดการสร้างสายพันธุ์ออกซิเจนที่มีปฏิกิริยาผ่านผลกระทบทางอ้อมต่อการขนส่งอิเล็กตรอนในไมโตคอนเดรีย Farnesol สามารถสร้างขึ้นจาก farnesyl pyrophosphate ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของ sterols ซึ่งอาจสะสมได้หากยับยั้งการสังเคราะห์ ergosterol ในระยะสุดท้าย การสังเกตทั้งหมดเหล่านี้สอดคล้องกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้นหลังจากการรบกวนของการสังเคราะห์ทางเออร์กอสเตอรอล

ตารางที่ 4

ยีนที่ตอบสนองต่อออกซิเจน ความเครียด

ฟังก์ชั่นหรือการตอบสนอง ยีน a
เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนAAC1, ANB1, COX5B 1,8 , CPR1, CYC7 1,5 , ERG11 3,3 , HEM13 0,7 , HMG2, OLE1 2,7 , ROX1, มทส1
กระตุ้นโดยแอนแอโรไบโอซิสCYB2, ERG11 3,3 , TIP1 2,5 , TIR2, TIR1 3,3
ทางแยกทางเดินเพนโทสฟอสเฟตZWF1 3,4
เอนไซม์กำจัดออกซิไดซ์ที่สำคัญCCP1, CTT1, TSA1, SOD1, SOD2 2,4 , TRR1, TRX1, TRX2, GLR1, YDR453C 2,4 , YCL035, AHP1, GRE2 3,4

การรบกวนของการขนส่งอิเล็กตรอนในไมโตคอนเดรียอาจเกิดขึ้นจากการลดลงของระดับ ergosterol ในเยื่อหุ้มชั้นในอันเนื่องมาจากการแทรกแซงการสังเคราะห์ ergosterol หรือจากปฏิกิริยาโดยตรงระหว่างสารเคมีที่ใช้กับสารเชิงซ้อนของเอนไซม์ยล ตัวอย่างเช่น ยาคีเลตโลหะบล็อกรีดักชันที่ไซต์ออกซิเดชัน ubiquinol ของไซโตโครม คอมเพล็กซ์ (5) และ azoles ยับยั้ง lanosterol demethylase เป้าหมายผ่านการโต้ตอบกับส่วนประกอบ heme iron ของสารเชิงซ้อน (54) เนื่องจากมากกว่าครึ่งของยีนไมโตคอนเดรียที่ตอบสนองต่อการตอบสนองทั้งต่อการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมและการรักษาด้วยยา จึงมีแนวโน้มว่าผลดังกล่าวจะเป็นสื่อกลางผ่านการสังเคราะห์ทางเออร์กอสเตอรอล และไม่ได้เกิดขึ้นเพียงผลโดยตรงจากการกระทำของยา

ที่น่าสนใจคือ มีการสังเกตรูปแบบเฉพาะของยาหนึ่งรูปแบบ ระดับการถอดเสียงของ HEM1 ซึ่งเป็นยีนตัวแรกที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวเคมีของ heme เพิ่มขึ้นในการรักษาด้วยยาแปดครั้ง แต่ไม่ใช่ในสามการลบ นี่แสดงให้เห็นการตอบสนองที่ชดเชยต่อการรักษาด้วยยาที่ไม่ได้แสดงอยู่ในสายพันธุ์กลายพันธุ์ ระดับการถอดเสียงของ HEM13, ขั้นตอนการจำกัดอัตราของการสังเคราะห์ heme (57) ลดลงในการตอบสนองต่อการรักษาด้วยยาเจ็ดครั้ง และอีกครั้งในสายพันธุ์ที่ไม่มีการลบ HEM13 ถูกกดขี่โดย heme และออกซิเจน (1, 22) ทำให้มีความเป็นไปได้ที่ระดับหนึ่งหรือทั้งสองจะเพิ่มขึ้นหลังการรักษา สิ่งนี้สอดคล้องกับสมมติฐานของการเพิ่มออกซิเจนภายในเซลล์ที่แนะนำโดยการตอบสนองของยีนที่เกิดจากภาวะไร้ออกซิเจนและความเครียดของออกซิเจนที่อธิบายไว้ข้างต้น Heme ยังมีบทบาทในการตรวจจับระดับออกซิเจนภายในเซลล์ (57)

Heme มีบทบาทสำคัญในการสังเคราะห์สเตอรอลและควบคุมการถอดรหัสของยีนหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการนี้ (37, 46) การสะสมของกรด 5-aminolevulenic ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ของ Hem1p ยับยั้ง 3-hydroxy-3-methyl-glytaryl CoA reductase ส่งผลให้ระดับ 2,3-oxidosqualene เพิ่มขึ้น (31) Heme จำเป็นสำหรับกิจกรรมของเอนไซม์ของ Erg3p (C-5 sterol desaturase) และ Erg5p (C-22,23 desaturase) (36) Erg11p ยังมี heme และแสดงนิพจน์ที่ควบคุมด้วย heme (48) ยีนอื่นๆ ที่ควบคุมโดย heme แสดงไว้ในรูปที่ ​ รูปที่ 3 3 . ในการศึกษานี้ ระดับของข้อความถอดเสียงจากยีนที่เหนี่ยวนำด้วยฮีม 4 ยีนเพิ่มขึ้น และระดับของข้อความถอดเสียงจากยีนที่กดทับด้วยฮีม 3 ยีนลดลง สอดคล้องกับการชักนำของการแสดงออกที่ควบคุมด้วยฮีม และแนะนำระดับฮีมภายในเซลล์ที่เพิ่มขึ้นหลังการรักษา โดยเฉพาะอย่างยิ่งการรักษาด้วย สารเคมี

ความสัมพันธ์ของรูปแบบการแสดงออกของ azole ใหม่กับเงื่อนไขอื่น

ที่รวมอยู่ในการวิเคราะห์นี้คือโปรไฟล์การแสดงออกในการตอบสนองต่อการบำบัดด้วยสารประกอบที่มีอะโซลมอยอิตี PNU-144248E มีวงแหวนอิมิดาโซล แต่มีความแตกต่างทางโครงสร้างจากอะโซลอื่นๆ ที่ทดสอบ เหตุผลในการรวมไว้ในการศึกษานี้คือการพิจารณาว่าการได้รับสารนี้จะส่งผลให้เกิดรูปแบบการแสดงออกที่คล้ายกับที่เห็นในการตอบสนองต่อการบำบัดโดยใช้ azoles ที่มีฟังก์ชันทางชีวเคมีที่ทราบหรือไม่ ซึ่งแสดงถึงรูปแบบการกระทำที่คล้ายคลึงกัน ข้อมูลนี้สามารถใช้เพื่อประเมินความสามารถในการคาดการณ์ของโปรไฟล์การแสดงออกที่สังเกตได้ในการตอบสนองต่อตัวแทนที่มีโหมดการทำงานที่ไม่รู้จัก จากยีน 156 ยีนที่มีระดับการถอดรหัสเพิ่มขึ้นหลังจากการรบกวนของ ergosterol 144 หรือ 92% มีระดับการถอดรหัสเพิ่มขึ้นในการตอบสนองต่อการรักษาด้วย PNU-144248E ยีนเมตาบอลิซึมของเออร์กอสเตอรอล ลิพิด กรดไขมัน และสเตอรอลทั้งหมด และยีน 17 จาก 19 ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างพลังงานรวมอยู่ด้วย (ข้อยกเว้นคือ QCR6 และ COX13). รวมยี่สิบเก้าจาก 34 ตัวที่ไม่รู้จักด้วย จากชุดยีน 78 ยีนที่มีระดับการถอดรหัสลดลงหลังจากการรบกวนของ ergosterol 40 หรือ 51% ก็มีระดับการถอดรหัสลดลงด้วยหลังการรักษาด้วย PNU-144248E ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า PNU-144248E มีพฤติกรรมเป็น azole ตามที่วัดโดยการตอบสนองของเซลล์ที่ระดับการถอดรหัสยีน

สปป.5 ระดับการถอดเสียงเพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วย PNU-144248E ยีนนี้เข้ารหัสสมาชิกของตระกูลปั๊มดื้อยาหลายตัวที่คล้ายคลึงกันกับยีนซึ่งได้รับการควบคุมในไอโซเลตที่ดื้อต่ออะโซลของ C. albicans (41). ก็อาจจะคาดเดาได้ว่า สปป.5 ระดับการถอดรหัสเพิ่มขึ้นในการรักษาด้วยยาทั้งหมด อย่างไรก็ตาม การรักษาอื่นๆ ที่ใช้ในการศึกษานี้ไม่เปลี่ยนแปลง เป็นไปได้ว่า สปป.5 ต้องใช้เวลาเปิดรับแสงนานขึ้นสำหรับการเหนี่ยวนำเต็มที่ และ PNU-144248E เป็นเพียงการบำบัดที่มีศักยภาพเพียงพอที่จะกระตุ้นการตอบสนองใน 90 นาทีของการสัมผัสที่ใช้ที่นี่ สปป.5 ระดับการถอดรหัสในเซลล์ที่รักษาด้วย mucidin ไม่เพิ่มขึ้นจนกว่าจะได้รับสัมผัส 2 ชั่วโมง (35) และการตอบสนองต่อการรบกวนของ ergosterol อาจเป็นไปตามจลนพลศาสตร์ที่คล้ายคลึงกัน

การเปรียบเทียบการวัด microarray กับการวัด PCR ของระดับการถอดรหัส

Microarrays เป็นตัวแทนของเทคโนโลยีใหม่สำหรับการวัดระดับการถอดเสียง การทดลองควบคุมระบุว่าการวัดโดยใช้เทคนิคนี้เป็นเชิงปริมาณ อย่างไรก็ตาม การทดลองเหล่านี้ได้ดำเนินการสำหรับชุดย่อยที่จำกัดของยีนในอาร์เรย์ (52) เป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะเปรียบเทียบการวัด microarray ADI สำหรับยีนที่ตอบสนองต่อการวัดการเตรียม RNA เดียวกันโดยใช้ระบบ PCR เชิงปริมาณของ Taqman สิ่งนี้ดำเนินการสำหรับสองยีนที่น่าสนใจ ERG25 และ YER067 (รูปที่ ​ (รูปที่ 4), 4 ) อันหนึ่งแสดงการตอบสนองต่อการรักษาที่เพิ่มขึ้นและอีกอันหนึ่งลดลง

การเปรียบเทียบการวัดนิพจน์โดย RT-PCR และไมโครอาร์เรย์ จุดข้อมูลแต่ละจุดแสดงถึงการวัดยีนที่กำหนดโดยแต่ละวิธีภายใต้การบำบัดเฉพาะตามที่ระบุในฉลาก สี่เหลี่ยม ERG25 วงกลม YER067W สัญลักษณ์ที่มั่นคง การควบคุมที่ไม่ผ่านการบำบัด แกนตั้งคือการเปลี่ยนแปลงจาก TEF1 ระดับที่มากขึ้นหมายถึงจำเป็นต้องมีรอบมากขึ้นและทำให้วัสดุเริ่มต้นในตัวอย่างน้อยลง แกนนอนระบุความเข้มของไมโครอาร์เรย์ในหน่วย ADI ซึ่งปรับให้เป็นมาตรฐานตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ หน่วย ADI เป็นสัดส่วนกับระดับการถอดเสียง

ข้อมูลจากการทดลองที่แสดงในรูปที่ ​ รูปที่ 4 4 ถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ การวัด Microarray ADI เป็นสัดส่วนกับปริมาณการถอดรหัส ในขณะที่ PCR วัดจาก NS เป็นสัดส่วนผกผัน กล่าวคือ การถอดเสียงที่มากขึ้นต้องการวงจรน้อยลงเพื่อให้ได้ระดับที่ตรวจพบได้ และด้วยเหตุนี้ NS ต่ำกว่าวัสดุที่มีปริมาณน้อย ด้วยเหตุผลนี้ ความสัมพันธ์ที่เห็นในรูปที่ ​ รูปที่ 4 4 แสดงให้เห็นข้อตกลงที่ดีระหว่างการวัดระดับการถอดเสียงโดยสองวิธีนี้

การเปลี่ยนแปลงระดับการถอดเสียงเมื่อเวลาผ่านไป

เลือกเวลาเพิ่มเป็นสองเท่าในช่วงเวลาของการรักษาด้วยสารเคมีในการศึกษานี้ มีแนวโน้มว่าการถอดเสียงที่แตกต่างกันอาจตอบสนองได้เร็วหรือช้ากว่านั้น และการถอดเสียงที่ตอบสนองที่ตรวจพบในที่นี้อาจสูงสุดในเวลาอื่นที่ไม่ใช่ 90 นาที เพื่อประเมินจลนพลศาสตร์ของการตอบสนองสำหรับยีนที่สนใจ การวัดผลการถอดเสียงจากยีนที่ตอบสนองได้เกิดขึ้นในช่วงเวลาต่างๆ ของการสัมผัสกับสารหลายตัวที่ใช้ในการศึกษานี้ ERG25 เป็นการถอดเสียงระยะสุดท้ายในทางเดินของ ergosterol และก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าตอบสนองต่อระดับ ergosterol (29) YER067W และ YNL300W เป็น ORF ที่ไม่มีลักษณะเฉพาะซึ่งตอบสนองต่อการรบกวนของ ergosterol แต่ไม่เปลี่ยนแปลงในการรักษาอื่นๆ ที่ทดสอบ (ไม่แสดงข้อมูล) YER067W เป็นยีนที่ควบคุมด้วยพลอย (13) YNL300W ถูกคาดการณ์ว่าเป็นโปรตีนที่ยึดเกาะไกลโคซิลฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล (GPI) (16) ที่มีความคล้ายคลึงกันที่อ่อนแอกับเซ็นเซอร์ความเค้นผนังเซลล์ที่มีศักยภาพ Mid2p (18, 24) การวัดไมโครเรย์แสดงให้เห็นว่าทั้งสอง ERG25 และ YNL300W การถอดเสียงจะลดลงภายใต้สภาวะที่อัตราการเติบโตช้าลง เช่น การเข้าสู่ระยะนิ่งในขณะที่ YER067W ระดับการถอดเสียงจะเพิ่มขึ้นภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ (ไม่แสดงข้อมูล) ซึ่งตรงกันข้ามกับทิศทางของการตอบสนองต่อการรบกวนของ ergosterol ซึ่งข้อมูล microarray แสดงให้เห็นว่า YER067W ระดับเพิ่มขึ้นและ ERG25 และ YNL300W การถอดเสียงลดลง

รูปที่ ​ รูปที่ 5 5 แสดงจลนพลศาสตร์ของการตอบสนองสำหรับยีนสามตัวนี้ในระหว่างการเผยสัมผัสคีโตโคนาโซลเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แผง A แสดงการเติบโตของวัฒนธรรมที่ใช้ในการทดลองนี้ทั้งโดย OD และโดยการเปลี่ยนแปลงร่วมกันใน TEF1 ระดับเมื่อวัฒนธรรมอิ่มตัวระหว่าง 5 ถึง 24 ชั่วโมง แผง B, C และ D แสดงมาตรการ PCR ของ ERG25, YER067W, และ YNL300W RNA ตามลำดับจากเซลล์ที่สัมผัสกับ ketoconazole ในปริมาณที่แตกต่างกันสามขนาด ทั้งหมดแสดง TEF1 การวัดและการถอดเสียงการทดลอง ในทุกกรณี, TEF1 ค่อนข้างไม่เปลี่ยนแปลงโดยการรักษาและทำหน้าที่เพื่อทำให้ความแตกต่างเล็กน้อยใน RNA ทั้งหมดเป็นปกติในหลอดปฏิกิริยาแต่ละหลอดในระหว่างการเติบโตลอการิทึม (0, 60, 90, 180 และ 300 นาที) ในทางตรงกันข้าม การสัมผัสกับความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ ketoconazole ส่งผลให้เกิดการตอบสนองที่ขึ้นกับขนาดยาเกือบทั้งหมดในการถอดรหัสทั้งสามที่วัด และทิศทางของการเปลี่ยนแปลงจะตรงกันข้ามกับที่เห็นในระหว่างการอิ่มตัวของการเจริญเติบโต

ข้อยกเว้นที่น่าสนใจอย่างหนึ่งคือ ERG25 การตอบสนอง. การวัด microarray เริ่มต้นพบว่าเพิ่มขึ้น 1.8 เท่าหลังการรักษาด้วย ketoconazole 90 นาที และได้รับการยืนยันโดย PCR (รูปที่ ​ (รูปที่ 4). 4 ) ในช่วงเวลาทดลองแสดงในรูปที่ ​ รูปที่ 5, 5 อย่างไรก็ตาม ERG25 ระดับไม่ถูกสังเกตให้เพิ่มขึ้นจนถึงจุด 3 ชั่วโมง เมื่อพวกมันเป็น 2.5 รอบหรือเพิ่มขึ้นประมาณ 5.6 เท่าเมื่อเทียบกับระดับในเซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัด สิ่งนี้น่าจะสะท้อนถึงความแตกต่างในความไว (การเปลี่ยนแปลง 1.8 เท่าภายในวงจร PCR เดียว) หรือความแตกต่างเล็กน้อยระหว่างวัฒนธรรมที่ใช้ในการทดลองทั้งสอง การทดลองนี้แสดงให้เห็นถึงจุดแข็งที่แตกต่างกันของทั้งสองวิธีที่ใช้ Microarrays เปิดเผยโปรไฟล์การถอดเสียงในเวลาและสถานะเฉพาะ และสามารถใช้เพื่อระบุการถอดเสียงทั้งหมดที่ตอบสนองภายใต้เงื่อนไขของการศึกษา จากนั้นจึงสร้างโพรบ PCR เชิงปริมาณเพื่อติดตามจลนศาสตร์ของการแสดงออกของการถอดเสียงที่น่าสนใจ ซึ่งช่วยให้วัดการตอบสนองต่อการรักษาที่หลากหลายได้ง่าย

บทสรุป

การเปลี่ยนแปลงการถอดความทั้งจีโนมใน S. cerevisiae สังเกตการตอบสนองต่อการรักษาเซลล์ด้วยสารเคมีมีความสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในวิถีทางสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์เดียวกันมีการระบุยีนตอบสนองจำนวนหนึ่งซึ่งเข้ารหัสผลิตภัณฑ์ที่มีฟังก์ชันขัดขวางการสังเคราะห์ ergosterol หรือผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างและหน้าที่ของเมมเบรน สิ่งนี้สนับสนุนการตีความโปรไฟล์การแสดงออกเพื่อกำหนดรูปแบบการทำงานของยา นอกเหนือจากการเปลี่ยนแปลงระดับการถอดเสียงที่เกี่ยวข้องโดยตรงกับการสังเคราะห์ ergosterol แล้ว การแสดงออกยังเปลี่ยนแปลงที่บ่งบอกถึงการหยุดชะงักของการสังเคราะห์ heme และความตึงเครียดของออกซิเจนภายในเซลล์ที่เพิ่มขึ้นอีกด้วย ซึ่งบ่งชี้ถึงผลกระทบเพิ่มเติมที่รบกวนเส้นทางของ ergosterol วิธีการที่ใช้ในการระบุยีนที่ตอบสนองต่อการรักษาที่ศึกษาไม่ได้อาศัยความเข้าใจล่วงหน้าเกี่ยวกับผลกระทบทางชีวภาพของการรักษา ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่จะใช้วิธีการนี้ในการทำนายโหมดการทำงานของสารใหม่ ๆ ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อรา azole PNU-144248E ใหม่ได้ให้การตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการนี้ ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสที่มีความสัมพันธ์ในระดับสูงกับสิ่งที่พบภายหลังการรักษาด้วย azoles อื่นๆ ที่มีผลทางชีวภาพที่ทราบ การศึกษานี้ได้สรุปวิธีการระบุยีนที่น่าสนใจซึ่งพบได้บ่อยในการตอบสนองของเซลล์โดยเฉพาะ ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการศึกษาสารประกอบต้านเชื้อราชนิดใหม่ในอนาคต


เชิงนามธรรม

การติดฉลากโฟโตแอฟฟินิตีเป็นเทคนิคที่มีประโยชน์ซึ่งใช้ในการระบุอันตรกิริยาระหว่างโปรตีน-ลิแกนด์และโปรตีน-โปรตีนที่ไม่มีโควาเลนต์ การทดลองการติดฉลากด้วยแสงเป็นข้อมูลเฉพาะสำหรับการตรวจสอบโปรตีนที่จับกับเมมเบรน ซึ่งข้อมูลโครงสร้างนั้นหาได้ยาก คลาสของฟังก์ชันโฟโตแอกทีฟที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ได้แก่ aryl azides, diazocarbonyls, diazirines และ benzophenones ไดอะซิรีนมีขนาดเล็กกว่าเบนโซฟีโนนโดยเนื้อแท้ และสร้างคาร์บีนจากโฟโตไลซิสที่ทำปฏิกิริยากับสายโซ่ข้างของกรดอะมิโนที่กว้างกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับไดเรดิคัลที่ได้มาจากเบนโซฟีโนน ซึ่งทำให้ไดอะซิรีนมีศักยภาพในการติดฉลากโฟโตแอฟฟินิตี้ทั่วไปมากขึ้น ในบทความนี้ เราจะอธิบายการพัฒนาและการประยุกต์ใช้ไอโซพรีนอยด์อะนาล็อกแบบใหม่ที่มีไดอะซิรีนมอยอิตีที่เตรียมในหกขั้นตอนและรวมเข้ากับ NS- เปปไทด์ที่ได้มาจากแฟคเตอร์ซึ่งผลิตผ่านการสังเคราะห์แบบโซลิดเฟส นอกจากมอยอิตีไดอะซิรีนแล้ว กลุ่มฟลูออเรสซีนและไบโอตินยังถูกรวมเข้าไว้ในเปปไทด์เพื่อช่วยในการตรวจหาและเพิ่มคุณค่าของผลิตภัณฑ์ที่เชื่อมขวางด้วยภาพถ่าย เปปไทด์ที่ประกอบด้วยไดอะซิรีนหลายชนิดนี้เป็นสารตั้งต้นสำหรับ Ste14p ซึ่งเป็นยีสต์ที่คล้ายคลึงกันของ Icmt ที่เป็นเป้าหมายในการต้านมะเร็งด้วย KNS (6.6 ไมโครโมลาร์) และ วีmax (947 pmol min –1 mg –1) มีค่าเทียบเท่าหรือดีกว่า NS- เปปไทด์แฟคเตอร์ทำงานด้วยไอโซพรีนอยด์ที่มีเบนโซฟีโนนเป็นพื้นฐาน การทดลองการเชื่อมโยงข้ามภาพถ่ายแสดงให้เห็นว่าโพรบไดอะซิรีนเชื่อมขวางภาพถ่ายกับ Ste14p ที่มีประสิทธิภาพสูงกว่าที่สังเกตได้ชัดเจนกว่าที่ประกอบด้วยเบนโซฟีโนน NS- ปัจจัยเปปไทด์


อ้างอิง

เรนส์ฟอร์ด, เค.ดี. แอสไพรินและยาที่เกี่ยวข้อง (CRC Press, 2004).

Garavito, R. M. Working Knowledge: แอสไพริน วิทย์. เป็น. 280, 108 (1999).

Gerhardt, C. Untersuchungen über die wasserfreien organischen Säuren. Justus Liebigs Annalen Chemie 87, 57–84 (ในภาษาเยอรมัน) (1853)

White, N.J. Qinghaosu (artemisinin): ราคาของความสำเร็จ ศาสตร์ 320, 330–334 (2008). การทบทวนประวัติและคุณสมบัติของอาร์เทมิซินิน

Li, Y. & Wu, Y. L. นักวิทยาศาสตร์ชาวจีนค้นพบ qinghaosu (artemisinin) และพัฒนาอนุพันธ์ได้อย่างไร? มุมมองในอนาคตเป็นอย่างไร? เมดิ. ทรอป. 58, 9–12 (1998).

องค์การอนามัยโลก. แนวทางการรักษาโรคมาลาเรีย. ฉบับที่ 2 (WHO, 2010).

องค์การอนามัยโลก. การปรึกษาหารืออย่างไม่เป็นทางการของ WHO กับผู้ผลิตผลิตภัณฑ์ยาที่ใช้อาร์เทมิซินินเพื่อใช้ในการรักษาโรคมาลาเรีย (WHO, 2007).

Hale, V. , Keasling, J. D. , Renninger, N. & Diagana, T. T. อาร์เตมิซินินที่ได้จากจุลินทรีย์: โซลูชันเทคโนโลยีชีวภาพสำหรับปัญหาระดับโลกในการเข้าถึงยาต้านมาเลเรียราคาไม่แพง เป็น. เจ. ทรอป. เมดิ. ไฮก. 77, 198–202 (2007).

องค์การอนามัยโลก. รายงานโรคมาลาเรียโลก พ.ศ. 2555 (องค์การอนามัยโลก, 2555).

Hsu, E. ไตร่ตรองเกี่ยวกับ 'การค้นพบ' ของชิงห่าวต้านมาเลเรีย บรา เจ. คลิน. ฟา. 61, 666–670 (2006).

กลุ่มวิจัยการประสานงานต้านมาลาเรียของ Qinghaosu ยาต้านมาลาเรียศึกษา Qinghaosu คาง. เมดิ. NS. 12, 811–816 (1979).

Klayman, D. L. Qinghaosu (artemisinin): ยาต้านมาเลเรียจากประเทศจีน ศาสตร์ 228, 1049–1055 (1985).

ดัลริมเพิล, ดี. Artemisia Annua, artemisinin, ACTs และการควบคุมโรคมาลาเรียในแอฟริกา. ประเพณี วิทยาศาสตร์ และนโยบายสาธารณะ [ออนไลน์], (2012).

Cui, L. & Su, X. Z. การค้นพบ กลไกการออกฤทธิ์และการบำบัดแบบผสมผสานของอาร์เตมิซินิน ผู้เชี่ยวชาญ Rev. Anti-Infective Ther. 7, 999–1013 (2009).

Barnes, K. I. , Chanda, P. & Ab Barnabas, G. ผลกระทบของการนำ artemether/lumefantrine ไปใช้ในวงกว้างต่อภาระโรคมาลาเรียในแอฟริกา: กรณีศึกษาของแอฟริกาใต้ แซมเบีย และเอธิโอเปีย มาลา เจ. 8, S8 (2009).

คนชีส, I. H. et al. บริเวณจีโนมที่สำคัญซึ่งมีการดื้อยาอาร์เทมิซินินในมาลาเรีย ศาสตร์ 336, 79–82 (2012).

Dondorp, A. M. และคณะ การต่อต้านอาร์เทมิซินิน: สถานะปัจจุบันและสถานการณ์สำหรับการกักกัน รายได้ธรรมชาติ Microbiol. 8, 272–280 (2010).

Fairhurst, R. M. และคณะ มาลาเรียที่ดื้อต่ออาร์เทมิซินิน: ความท้าทายด้านการวิจัย โอกาส และผลกระทบด้านสาธารณสุข เป็น. เจ. ทรอป. เมดิ. ไฮก. 87, 231–241 (2012).

ทาคาลา-แฮร์ริสัน, S. et al. ตำแหน่งทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับการกวาดล้างล่าช้าของ พลาสโมเดียม ฟัลซิปารัม หลังการรักษาด้วยอาร์เทมิซินินในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. 110, 240–245 (2013).

Miotto, O. และคณะ ประชากรจำนวนมากที่ดื้อต่ออาร์เทมิซินิน พลาสโมเดียม ฟัลซิปารัม ในประเทศกัมพูชา ยีนธรรมชาติ 45, 648–655 (2013).

Ariey, F. และคณะ เครื่องหมายโมเลกุลของการดื้อต่ออาร์เทมิซินิน พลาสโมเดียม ฟัลซิปารัม มาลาเรีย. ธรรมชาติ 505, 50–55 (2014). เอกสารนี้รายงานการระบุตัวบ่งชี้ระดับโมเลกุลสำหรับมาลาเรียที่ดื้อต่ออาร์เตมิซินิน ซึ่งจะมีความสำคัญต่อการติดตามและกำจัดปรสิตที่ดื้อต่ออาร์เตมิซินิน

Shretta, R. & Yadav, P. การรักษาเสถียรภาพของการจัดหาอาร์เทมิซินินและการบำบัดแบบผสมผสานที่อิงจากอาร์เตมิซินินในยุคของการขยายสเกลในวงกว้าง มาลา เจ. 11, 399 (2012).

ที่ปรึกษาการพัฒนาระดับโลกของ Dahlberg การทบทวนระยะกลางอย่างอิสระของโครงการ Artemisinin Supply System (A2S2) ที่มั่นใจ. เจนีวา: UNITAID [ออนไลน์], (2012).

มั่นใจระบบการจ่ายอาร์เทมิซินิน อาร์เทมิซินินนำเข้าอินเดีย [ออนไลน์], (ปรับปรุง 13 มกราคม 2014).

การจัดหาเงินทุนด้านสุขภาพขององค์การอนามัยโลก ค่าใช้จ่ายด้านสุขภาพทั้งหมดต่อหัวที่อัตราแลกเปลี่ยนเฉลี่ย (US $) [ออนไลน์], (2011).

ธนาคารโลก. ค่าใช้จ่ายด้านสุขภาพต่อหัว (US$ ในปัจจุบัน). [ออนไลน์] (2013).

Bertea, C. M. และคณะ การระบุตัวกลางและเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนแรกของการสังเคราะห์อาร์เทมิซินินใน Artemisia annua. แพลนตา เมด. 71, 40–47 (2005).

Brown, G. D. การสังเคราะห์ทางชีวเคมีของอาร์เตมิซินิน (Qinghaosu) และพฤกษเคมีของ Artemisia annua ล. (ชิงห่าว). โมเลกุล 15, 7603–7698 (2010).

Bouwmeester, H. J. และคณะ Amorpha-4,11-diene synthase กระตุ้นขั้นตอนแรกที่เป็นไปได้ในการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของอาร์เทมิซินิน ไฟโตเคมี 52, 843–854 (1999).

Covello, P. S. , Teoh, K. H. , Polichuk, D. R. , Reed, D. W. & Nowak, G. ฟังก์ชันจีโนมและการสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของอาร์เตมิซินิน ไฟโตเคมี 68, 1864–1871 (2007).

Paddon, C. และคณะ ใน การสังเคราะห์ไอโซพรีนอยด์ในพืชและจุลินทรีย์ (eds Bach, T. J. & Rohmer, M. ) 91–106 (Springer, 2013).

Zhang, Y. และคณะ การโคลนโมเลกุลของอาร์เทมิซินิกอัลดีไฮด์ Δ11(13) รีดักเตสและบทบาทในการสังเคราะห์อาร์เตมิซินินที่ขึ้นกับต่อมไทรอยด์ใน Artemisia annua. เจ. ไบโอล. เคมี. 283, 21501–21508 (2008).

Zhao, L. , Chang, W. C. , Xiao, Y. , Liu, H. W. & Liu, P. Methylerythritol phosphate pathway ของการสังเคราะห์ไอโซพรีนอยด์ อันนุ. รายได้ Biochem. 82, 497–530 (2013).

Reiling, K. K. และคณะ การผลิตโมโนและไดเทอร์พีนใน Escherichia coli. เทคโนโลยีชีวภาพ เบียง. 87, 200–212 (2004).

Martin, V. J. , Pitera, D. J. , Withers, S. T. , Newman, J. D. & Keasling, J. D. วิศวกรรมเส้นทาง mevalonate ใน Escherichia coli สำหรับการผลิตสารเทอร์พีนอยด์ ธรรมชาติไบโอเทค. 21, 796–802 (2003). เอกสารนี้ให้คำอธิบายเกี่ยวกับเส้นทางการผลิตอะมอร์ฟาไดอีนเริ่มต้นใน อี. โคไล.

Martin, V.J., Yoshikuni, Y. & Keasling, J.D. The ในร่างกาย การสังเคราะห์ sesquiterpenes ของพืชโดย Escherichia coli. เทคโนโลยีชีวภาพ เบียง. 75, 497–503 (2001).

นิวแมน เจ.ดี.และคณะ การผลิตระดับสูงของ amorpha-4,11-diene ในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพแบบแบ่งพาร์ติชันแบบสองเฟสของการออกแบบทางเมแทบอลิซึม Escherichia coli. เทคโนโลยีชีวภาพ เบียง. 95, 684–691 (2006).

Pitera, D. J. , Paddon, C. J. , Newman, J. D. & amp Keasling, J. D. สร้างสมดุลระหว่างเส้นทาง mevalonate ที่แตกต่างกันสำหรับการผลิต isoprenoid ที่ดีขึ้นใน Escherichia coli. เมตาบ อังกฤษ 9, 193–207 (2007).

Pfleger, B. F. , Pitera, D. J. , Smolke, C. D. & Keasling, J. D. วิศวกรรมผสมผสานของภูมิภาค intergenic ในโอเปอเรเตอร์ปรับแต่งการแสดงออกของยีนหลายตัว ธรรมชาติไบโอเทค. 24, 1027–1032 (2006).

Pfleger, B. F. , Pitera, D. J. , Newman, J. D. , Martin, V. J. & Keasling, J. D. เซ็นเซอร์จุลินทรีย์สำหรับโมเลกุลขนาดเล็ก: การพัฒนาไบโอเซ็นเซอร์ mevalonate เมตาบ อังกฤษ 9, 30–38 (2007).

Kizer, L. , Pitera, D. J. , Pfleger, B. F. & Keasling, J. D. การประยุกต์ใช้จีโนมเชิงฟังก์ชันเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพทางเดินสำหรับการผลิตไอโซพรีนอยด์ที่เพิ่มขึ้น แอปพลิเค สิ่งแวดล้อม ไมโครไบโอล 74, 3229–3241 (2008).

Tabata, K. & Hashimoto, S. การผลิต mevalonate โดยวิศวกรรมการเผาผลาญอาหาร Escherichia coli. เทคโนโลยีชีวภาพ เลตต์. 26, 1487–1491 (2004).

Hedl, M. , Tabernero, L. , Stauffacher, C. V. & Rodwell, V. W. Class II 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases เจ แบคทีเรีย. 186, 1927–1932 (2004).

Tsuruta, H. และคณะ การผลิตระดับสูงของ amorpha-4,11-diene ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของ artemisinin ตัวแทนต้านมาลาเรียใน Escherichia coli. PLOS ONE 4, e4489 (2009). การศึกษานี้รายงานวิศวกรรมความเครียดและการพัฒนาการหมัก ซึ่งมีผลสูงสุดในการผลิต 25 กรัมต่อลิตร amorphadiene ใน อี. โคไล.

Roth, R. J. & Acton, N. การแปลงกรดอาร์เทมิซินิกอย่างง่ายเป็นอาร์เตมิซินิน เจ. เนเจอร์ โปรดักชั่น. 52, 1183–1185 (1989).

Roth, R.J. & Roth, N.A. การเปลี่ยนกรดอาร์เทมิซินิกอย่างง่ายเป็นอาร์เทมิซินิน. สิทธิบัตรสหรัฐอเมริกา 4992561 (1991).

Ro, D.K. และคณะ การผลิตสารตั้งต้นของยาต้านมาเลเรีย กรดอาร์เทมิซินิกในยีสต์วิศวกรรม ธรรมชาติ 440, 940–943 (2006). บทความนี้อธิบายการแยกตัวของ CYP71AV1 ซึ่งเป็นเอนไซม์ cytochrome P450 ที่ออกซิไดซ์ amorphadiene และให้การสาธิตครั้งแรกของการผลิตกรดอาร์เตมิซินิกใน S. cerevisiae.

Chang, M. C. , Eachus, R. A. , Trieu, W. , Ro, D. K. & Keasling, J. D. Engineering Escherichia coli สำหรับการผลิตเทอร์พีนอยด์ที่ทำหน้าที่ได้โดยใช้พืช P450 เคมีธรรมชาติ. ไบโอล. 3, 274–277 (2007).

Lenihan, J. R. , Tsuruta, H. , Diola, D. , Renninger, N. S. & Regentin, R. การพัฒนากระบวนการหมักกรดอาร์เทมิซินิกทางอุตสาหกรรมเพื่อสนับสนุนการผลิตการบำบัดแบบผสมผสานที่ใช้อาร์เตมิซินินในราคาประหยัด เทคโนโลยีชีวภาพ โปรแกรม 24, 1026–1032 (2008).

Mortimer, R. K. & amp Johnston, J. R. ลำดับวงศ์ตระกูลของสายพันธุ์หลักของศูนย์พันธุกรรมของยีสต์ พันธุศาสตร์ 113, 35–43 (1986).

Goffeau, A. et al. ชีวิตที่มี 6000 ยีน ศาสตร์ 274, 563–567 (1996).

Ben-Ari, G. และคณะ ยีนที่เชื่อมโยงกันสี่ยีนมีส่วนร่วมในการควบคุมประสิทธิภาพการสร้างสปอร์ในยีสต์ที่แตกหน่อ ป.ล. เจเนท 2, e195 (2006).

ฟาน ไดจ์เก้น, เจ. พี. และคณะ การเปรียบเทียบระหว่างห้องปฏิบัติการของคุณสมบัติทางสรีรวิทยาและพันธุกรรมของสี่ Saccharomyces cerevisiae สายพันธุ์ เอนไซม์ไมโครบ. เทคโนโลยี 26, 706–714 (2000).

Westfall, P. J. และคณะ การผลิตอะมอร์ฟาไดอีนในยีสต์ และเปลี่ยนเป็นกรดไดไฮโดรอาร์เตมิซินิก ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของอาร์เตมิซินินที่มีฤทธิ์ต้านมาลาเรีย Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 109, E111–E118 (2012). บทความนี้จะอธิบายเกี่ยวกับวิศวกรรมความเครียดและการพัฒนาการหมัก ซึ่งทำให้สามารถผลิตอะมอร์ฟาไดอีนได้ 40 กรัมต่อลิตรใน S. cerevisiae ตามด้วยการเปลี่ยนทางเคมีของ amorphadiene เป็นกรด dihydroartemisinic

Paddon, C.J. และคณะ การผลิตสารกึ่งสังเคราะห์ระดับสูงของอาร์เตมิซินินต้านมาลาเรียที่มีศักยภาพ ธรรมชาติ 496, 528–532 (2013). บทความนี้จะอธิบายเกี่ยวกับวิศวกรรมความเครียดและการพัฒนาการหมัก ซึ่งทำให้สามารถผลิตกรดอาร์เทมิซินิกได้ 25 กรัมต่อลิตรใน S. cerevisiae — และการแปลงอาร์เทมิซินินแบบไม่ใช้โฟโตเคมีอย่างมีประสิทธิภาพ

Ro, D.K. และคณะ การชักนำให้เกิดยีนต้านทานยา pleiotropic หลายยีนในยีสต์ที่ออกแบบมาเพื่อให้สารตั้งต้นของยาต้านมาเลเรียเพิ่มขึ้น นั่นคือ กรดอาร์เตมิซินิก บีเอ็มซี ไบโอเทค 8, 83 (2008).

Zangar, R. C. , Davydov, D. R. & Verma, S. กลไกที่ควบคุมการผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาโดย cytochrome P450 ท็อกซิคอล แอปพลิเค ฟา. 199, 316–331 (2004).

Peterson, J. A. , Ebel, R. E. , O'Keeffe, D. H. , Matsubara, T. & Estabrook, R. W. การพึ่งพาอุณหภูมิของการลดไซโตโครม P-450 แบบจำลองสำหรับการโต้ตอบ NADPH-cytochrome P-450 reductase:cytochrome P-450 เจ. ไบโอล. เคมี. 251, 4010–4016 (1976).

Schenkman, J. B. & amp Jansson, I. บทบาทมากมายของไซโตโครม NS5 . ฟา. เธอ. 97, 139–152 (2003).

Zhang, H. , Im, S. C. และ Waskell, L. Cytochrome NS5 เพิ่มอัตราการก่อตัวของผลิตภัณฑ์โดย cytochrome P450 2B4 และแข่งขันกับ cytochrome P450 reductase สำหรับตำแหน่งการจับบน cytochrome P450 2B4 เจ. ไบโอล. เคมี. 282, 29766–29776 (2007).

Teoh, K. H. , Polichuk, D. R. , Reed, D. W. & Covello, P. S. การโคลนโมเลกุลของอัลดีไฮด์ดีไฮโดรจีเนสที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์อาร์เตมิซินินใน Artemisia annua. พฤกษศาสตร์ 87, 635–642 (2009). การศึกษานี้รายงานการระบุตัวตนของ ก. ปี aldehyde dehydrogenase ซึ่งจำเป็นสำหรับการผลิตกรด artemisinic ในระดับสูง S. cerevisiae.

ซาโนฟี่. Prix ​​Potier 2012 (ภาษาฝรั่งเศส) [ออนไลน์], (2012)

โครงการ Prequalificaion of Medicines ของ WHO การยอมรับอาร์เทมิซินินที่ไม่ได้มาจากพืชช่วยเพิ่มการเข้าถึงการรักษาโรคมาลาเรีย [ออนไลน์], (2013).

Ajikumar, P. K. และคณะ การเพิ่มประสิทธิภาพเส้นทางไอโซพรีนอยด์สำหรับการผลิตสารตั้งต้นของแท็กซอลมากเกินไปใน อี. โคไล. ศาสตร์ 330, 70–74 (2010).

Engels, B. , Dahm, P. & Jennewein, S. วิศวกรรมเมตาบอลิซึมของการสังเคราะห์แทกซาไดอีนในยีสต์เป็นก้าวแรกสู่การผลิต Taxol (Paclitaxel) เมตาบ อังกฤษ 10, 201–206 (2008).

Hawkins, K. M. & Smolke, C. D. การผลิตเบนซิลโซควิโนลีนอัลคาลอยด์ใน Saccharomyces cerevisiae. เคมีธรรมชาติ. ไบโอล. 4, 564–573 (2008).

มินามิ, เอช. และคณะ การผลิตจุลินทรีย์ในพืช benzylisoquinoline alkaloids Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 105, 7393–7398 (2008).

Glenn, W. , Runguphan, W. & O'Connor, S. ความคืบหน้าล่าสุดในด้านวิศวกรรมการเผาผลาญของอัลคาลอยด์ในระบบพืช สกุลเงิน ความคิดเห็น เทคโนโลยีชีวภาพ 24, 354–365 (2013).

Nakagawa, A. และคณะ แพลตฟอร์มแบคทีเรียสำหรับการผลิตอัลคาลอยด์จากพืชหมัก ชุมชนธรรมชาติ 2, 326 (2011).

DiCarlo, J. E. และคณะ วิศวกรรมจีโนมใน Saccharomyces cerevisiae โดยใช้ระบบ CRISPR–Cas กรดนิวคลีอิก 41, 4336–4343 (2013). บทความนี้รายงานการใช้ระบบ CRISPR–Cas ในยีสต์ ซึ่งมีศักยภาพที่จะพัฒนาวิศวกรรมจีโนมในสิ่งมีชีวิตนี้ได้อย่างชัดเจน

Jiang, W. , Bikard, D. , Cox, D. , Zhang, F. & Marraffini, L. A. การแก้ไขจีโนมแบคทีเรียด้วย RNA โดยใช้ระบบ CRISPR–Cas ธรรมชาติไบโอเทค. 31, 233–239 (2013).

วัง H. H. et al. การเขียนโปรแกรมเซลล์โดยวิศวกรรมจีโนมมัลติเพล็กซ์และวิวัฒนาการแบบเร่ง ธรรมชาติ 460, 894–898 (2009).

Dicarlo, J. E. และคณะ วิศวกรรมจีโนมที่อาศัยยีสต์โอลิโก (YOGE) เอซีเอส ซินธ์ ไบโอล. 2, 741–749 (2013).

แท้จริงแล้ว H.C. และคณะ กลุ่มยีนที่แยกจากกันสองกลุ่มเข้ารหัสวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพสำหรับ meroterpenoids austinol และ dehydroaustinol ใน แอสเปอร์จิลลัส นิดูลานส์. แยม. เคมี. ซ. 134, 4709–4720 (2012).

Ahuja, M. และคณะ ส่องสว่างความหลากหลายของอะโรมาติกพอลิคีไทด์สังเคราะห์ใน แอสเปอร์จิลลัส นิดูลานส์. แยม. เคมี. ซ. 134, 8212–8221 (2012).

Ma, H. , Kunes, S. , Schatz, P. J. & Botstein, D. Plasmid การสร้างโดยการรวมตัวกันอีกครั้งในยีสต์ ยีน 58, 201–216 (1987).

Oldenburg, K. R. , Vo, K. T. , Michaelis, S. & Paddon, C. โครงสร้างพลาสมิดที่ควบคุมด้วย PCR ที่นำกลับมาใช้ใหม่ ในร่างกาย ในยีสต์ กรดนิวคลีอิก 25, 451–452 (1997).

Shao, Z. & Zhao, H. DNA assembler, และ ในร่างกาย วิธีทางพันธุกรรมสำหรับการสร้างวิถีทางชีวเคมีอย่างรวดเร็ว กรดนิวคลีอิก 37, e16 (2009).

Luo, Y. และคณะ การเปิดใช้งานและการกำหนดลักษณะของคลัสเตอร์ยีนสังเคราะห์ทางชีวภาพ polycyclic tetramate macrolactam ที่คลุมเครือ ชุมชนธรรมชาติ 4, 2894 (2013).

Kuijpers, N. et al. กลยุทธ์ที่หลากหลายและมีประสิทธิภาพสำหรับการประกอบเวกเตอร์นิพจน์หลายส่วนใน Saccharomyces cerevisiae โดยใช้ลำดับการรวมตัวสังเคราะห์ 60-bp ไมโครบ. โรงงานเซลล์ 12, 47 (2013).

Pachuk, C. J. และคณะ การโคลนปฏิกิริยาลูกโซ่: วิธีการหนึ่งขั้นตอนสำหรับการแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอหลายชิ้นแบบกำหนดทิศทาง ยีน 243, 19–25 (2000).

Quan, J. & Tian, ​​J. การโคลนส่วนขยายโพลีเมอเรสแบบวงกลมของไลบรารียีนที่ซับซ้อนและวิถีทาง PLOS ONE 4, e6441 (2009).

Gibson, D. G. และคณะ การรวมตัวของโมเลกุลดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์สูงถึงหลายร้อยกิโลเบส วิธีธรรมชาติ 6, 343–345 (2009).

de Kok, S. และคณะ การประกอบ DNA ที่รวดเร็วและเชื่อถือได้ผ่านปฏิกิริยาการปั่นจักรยานของ ligase เอซีเอส ซินเทต ไบโอล. 3, 97–106 (2014).

Leguia, M. , Brophy, J. , Densmore, D. & Anderson, J. C. การประกอบชิ้นส่วนชีวภาพมาตรฐานอัตโนมัติ วิธีการ เอนไซม์. 498, 363–397 (2011).

Nielsen, J. & Keasling, J. D. Synergies ระหว่างชีววิทยาสังเคราะห์และวิศวกรรมการเผาผลาญ ธรรมชาติไบโอเทค. 29, 693–695 (2011).

Bailey, J. E. สู่ศาสตร์แห่งวิศวกรรมการเผาผลาญ ศาสตร์ 252, 1668–1675 (1991). บทความนี้ให้คำอธิบายเบื้องต้นและวิสัยทัศน์เกี่ยวกับวิศวกรรมการเผาผลาญ

Woolston, B. M. , Edgar, S. & Stephanopoulos, G. วิศวกรรมเมตาบอลิ: อดีตและอนาคต อันนุ. รายได้เคมี. ไบโอมอล อังกฤษ 4, 259–288 (2013).

Nakamura, C. E. & Whited, G. M. วิศวกรรมเมตาบอลิซึมสำหรับการผลิตจุลินทรีย์ 1,3-propanediol สกุลเงิน ความคิดเห็น เทคโนโลยีชีวภาพ 14, 454–459 (2003).

Chen, J. , Densmore, D. , Ham, T. S. , Keasling, J. D. & Hillson, N. J. DeviceEditor ผ้าใบ CAD ชีวภาพเชิงภาพ เจ. ไบโอล. อังกฤษ 6, 1 (2012).

Hillson, N. J. , Rosengarten, R. D. & amp Keasling, J. D. j5 ซอฟต์แวร์ออกแบบการประกอบ DNA อัตโนมัติ เอซีเอส ซินธ์ ไบโอล. 1, 14–21 (2012).

แฮม, T. S. et al. การออกแบบ การใช้งาน และการปฏิบัติของ JBEI-ICE: แพลตฟอร์มและเครื่องมือการลงทะเบียนส่วนชีวภาพแบบโอเพนซอร์ส กรดนิวคลีอิก 40, e141 (2012).

Linshiz, G. และคณะ แพลตฟอร์มอัตโนมัติสำหรับห้องปฏิบัติการ PaR–PaR เอซีเอส ซินธ์ ไบโอล. 2, 216–222 (2013).

Mutalik, V. K. และคณะ การประมาณเชิงปริมาณของกิจกรรมและคุณภาพของการรวบรวมองค์ประกอบทางพันธุกรรมเชิงหน้าที่ วิธีธรรมชาติ 10, 347–353 (2013).

Endy, D. รากฐานสำหรับชีววิทยาวิศวกรรม ธรรมชาติ 438, 449–453 (2005).

Gardner, T. S. ชีววิทยาสังเคราะห์: จากโฆษณาสู่ผลกระทบ เทรนด์ไบโอเทค 31, 123–125 (2013).

Andrianantoandro, E. , Basu, S. , Karig, D. K. & Weiss, R. ชีววิทยาสังเคราะห์: กฎวิศวกรรมใหม่สำหรับวินัยที่เกิดขึ้นใหม่ มล. ระบบ ไบโอล. 2, 2006.0028 (2006).

Stephanopoulos, G. ชีววิทยาสังเคราะห์และวิศวกรรมการเผาผลาญ เอซีเอส ซินธ์ ไบโอล. 1, 514–525 (2012).

Gardner, T. S. , Cantor, C. R. & amp Collins, J. J. การสร้างสวิตช์สลับพันธุกรรมใน Escherichia coli. ธรรมชาติ 403, 339–342 (2000).

Elowitz, M. B. & Leibler, S. เครือข่ายการสั่นสังเคราะห์ของตัวควบคุมการถอดรหัส ธรรมชาติ 403, 335–338 (2000). การอ้างอิง 99 และ 100 เป็นสิ่งพิมพ์สองฉบับเกี่ยวกับชีววิทยาสังเคราะห์ที่เก่าแก่ที่สุดและแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการประยุกต์ใช้หลักการทางวิศวกรรมกับชีววิทยา

Stemmer, W. P. C. , Crameri, A. , Ha, K. D. , Brennan, T. M. & Heyneker, H. L. การประกอบขั้นตอนเดียวของยีนและพลาสมิดทั้งหมดจาก oligodeoxyribonucleotides จำนวนมาก ยีน 164, 49–53 (1995).

Mutalik, V. K. และคณะ การแสดงออกของยีนที่แม่นยำและเชื่อถือได้ผ่านการถอดความมาตรฐานและองค์ประกอบการเริ่มต้นการแปล วิธีธรรมชาติ 10, 354–360 (2013).

Bonnet, J., Subsoontorn, P. & Endy, D. การจัดเก็บข้อมูลดิจิทัลแบบเขียนซ้ำได้ในเซลล์ที่มีชีวิตผ่านการควบคุมเชิงวิศวกรรมของทิศทางการรวมตัวใหม่ Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. 109, 8884–8889 (2012).

Bonnet, J. , Yin, P. , Ortiz, M. E. , Subsoontorn, P. & Endy, D. ขยายประตูตรรกะทางพันธุกรรม ศาสตร์ 340, 599–603 (2013).

Ajikumar, P. K. และคณะ Terpenoids: โอกาสในการสังเคราะห์ทางชีวภาพของยาผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติโดยใช้จุลินทรีย์ที่ออกแบบ มล. เภสัช. 5, 167–190 (2008).

Paltauf, F. , Kohlwein, S. D. & Henry, S. A. ใน ชีววิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์ของยีสต์ Saccharomyces (eds Jones, E. W. , Pringle, J. R. & Broach, J. R. ) 425–500 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)

Shiba, Y. , Paradise, E. M. , Kirby, J. , Ro, D. K. & Keasling, J. D. วิศวกรรมของไพรูเวตดีไฮโดรจีเนสบายพาสใน Saccharomyces cerevisiae สำหรับการผลิตไอโซพรีนอยด์ในระดับสูง เมตาบ อังกฤษ 9, 160–168 (2006).

Eisenreich, W. , Bacher, A. , Arigoni, D. & Rohdich, F. การสังเคราะห์ทางชีวเคมีของไอโซพรีนอยด์ผ่านวิถีที่ไม่ใช่เมวาโลเนต เซลล์. มล. วิทย์ชีวิต. 61, 1401–1426 (2004).

Putra, S. R. , Disch, A. , Bravo, J. M. & Rohmer, M. การกระจายของเส้นทาง mevalonate และ glyceraldehyde 3-phosphate/pyruvate สำหรับการสังเคราะห์ไอโซพรีนอยด์ในแบคทีเรียแกรมลบและมัยโคแบคทีเรียบางชนิด FEMS ไมโครไบโอล เลตต์. 164, 169–175 (1998).

Lichtenthaler, H. K. วิถีทาง 1-deoxy- D -xylulose-5-phosphate ของการสังเคราะห์ไอโซพรีนอยด์ในพืช อันนุ. รายได้ Plant Physiol. พืชโมล ไบโอล. 50, 47–65 (1999).

Carlsen, S. และคณะ การแสดงออกที่แตกต่างกันและการกำหนดลักษณะเฉพาะของวิถี 2-C-methyl- D -erythritol-4-phosphate ของแบคทีเรียใน Saccharomyces cerevisiae. แอปพลิเค ไมโครไบโอล เทคโนโลยีชีวภาพ 97, 5753–5769 (2013).

Lill, R. & Muhlenhoff, U. การเจริญเติบโตของโปรตีนเหล็ก–กำมะถันในยูคาริโอต: กลไก กระบวนการที่เชื่อมโยงกัน และโรคต่างๆ อันนุ. รายได้ Biochem. 77, 669–700 (2008).

Paradise, E. M. , Kirby, J. , Chan, R. & Keasling, J. D. การเปลี่ยนเส้นทางของฟลักซ์ผ่านจุดสาขา FPP ใน Saccharomyces cerevisiae โดยควบคุมการสังเคราะห์สควาลีนลง เทคโนโลยีชีวภาพ เบียง. 100, 371–378 (2008).

Asadollahi, M. A. และคณะ การผลิต sesquiterpenes ของพืชใน Saccharomyces cerevisiae: ผลของการปราบปราม ERG9 ต่อการสังเคราะห์สารเซสควิเทอร์พีน เทคโนโลยีชีวภาพ เบียง. 99, 666–677 (2008).

Noble, M. A. และคณะ บทบาทของสารตกค้างในไซต์ที่ใช้งานอยู่ใน flavocytochrome P450 BM3 ไบโอเคมี. NS. 339, 371–379 (1999).

Glieder, A. , Farinas, E. T. & amp Arnold, F. H. วิวัฒนาการในห้องปฏิบัติการของอัลเคนไฮดรอกซีเลสที่ละลายน้ำได้ แบบพอเพียงและแอคทีฟสูง ธรรมชาติไบโอเทค. 20, 1135–1139 (2002).

ดีทริช, เจ. เอ. และคณะ เส้นทางกึ่งสังเคราะห์ทางชีวภาพแบบใหม่สำหรับการผลิตอาร์เตมิซินินโดยใช้สารตั้งต้นทางวิศวกรรม P450(BM3) เอซีเอส เคม. ไบโอล. 4, 261–267 (2009). บทความนี้อธิบายการปรับตัวของเอนไซม์ไซโตโครม P450 ของแบคทีเรียที่มีฤทธิ์สูงสำหรับการผลิตสารตั้งต้นอาร์เตมิซินินที่ถูกออกซิไดซ์

Ting, H. M. และคณะ เคมีของเมแทบอไลต์ของ Nicotiana benthamiana การแสดงออกของยีนวิถีสังเคราะห์ทางชีวสังเคราะห์ของอาร์เตมิซินินชั่วคราวนั้นเป็นหน้าที่ของชนิด CYP71AV1 และปริมาณยีนสัมพัทธ์ นิวไฟทอล 199, 352–366 (2013).


สังกัด

สถาบันวิศวกรรมชีวภาพ วิทยาลัยวิศวกรรมเคมีและชีวภาพ มหาวิทยาลัยเจ้อเจียง หางโจว 310027 ประเทศจีน

Xiaomei Lv, Fan Wang, Pingping Zhou, Lidan Ye, Wenping Xie, Haoming Xu & amp Hongwei Yu

ห้องปฏิบัติการหลักของวิศวกรรมเคมีชีวมวลของกระทรวงศึกษาธิการ มหาวิทยาลัยเจ้อเจียง หางโจว 310027 ประเทศจีน

คุณยังสามารถค้นหาผู้เขียนคนนี้ใน PubMed Google Scholar

คุณยังสามารถค้นหาผู้เขียนคนนี้ใน PubMed Google Scholar

คุณยังสามารถค้นหาผู้เขียนคนนี้ใน PubMed Google Scholar

คุณยังสามารถค้นหาผู้เขียนคนนี้ใน PubMed Google Scholar

คุณยังสามารถค้นหาผู้เขียนคนนี้ใน PubMed Google Scholar

คุณยังสามารถค้นหาผู้เขียนคนนี้ใน PubMed Google Scholar

คุณยังสามารถค้นหาผู้เขียนคนนี้ใน PubMed Google Scholar

ผลงาน

H.Y. , X.L. และ W.X. คิดโครงการและออกแบบการทดลอง XL, F.W. และ P.Z. ได้ทำการทดลอง XL, L.Y. และ H.X. เขียนและแก้ไขต้นฉบับ ผู้เขียนทั้งหมดอภิปรายผลและแสดงความคิดเห็นในต้นฉบับ

ผู้เขียนที่สอดคล้องกัน


ดูวิดีโอ: ผลขางเคยง และอนตรายจากโปรไบโอตค. Risks and Side Effects of Probiotics (อาจ 2022).