ข้อมูล

ไมโครอินเจคชั่นลำไส้ออร์แกนอยด์

ไมโครอินเจคชั่นลำไส้ออร์แกนอยด์


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ฉันกำลังพยายามฉีดอวัยวะขนาดเล็กในลำไส้เล็กโดยใช้เครื่องฉีดขนาดเล็ก Eppendorf FemtoJet 4i และเส้นเลือดฝอย Femtotip และพบปัญหาหลายประการ นี่เป็นการตั้งค่าใหม่ในห้องแล็บของเรา และฉันเป็นคนแรกที่พยายามทำ ดังนั้นฉันต้องขออภัยสำหรับคำถามพื้นฐาน

เมื่อพยายามเติม Femtotip capillary ด้วยเข็มหรือ Western blot ของเหลวจะสำรองและไม่เติม capillary ทำให้เกิดฟองอากาศขนาดใหญ่ นี่เป็นปัญหาทั่วไปของเส้นเลือดฝอย Femtotip หรือไม่ มีวิธีอื่นในการเติมไหม (ที่ไม่ต้องใช้ไมโครโหลดเดอร์เฉพาะทาง)?

เมื่อฉันพยายามใช้ทิปโดยปล่อยให้ของเหลวถูกแรงโน้มถ่วงดึงลงด้านล่าง ฉันมีปัญหากับการรั่วไหลออกจากด้านล่างของส่วนปลาย เพื่อให้ชัดเจนที่สุด จำเป็นต้องเติมของเหลวทั้งปลายก่อนฉีด (ไม่มีฟองอากาศ) หรือไม่?

สุดท้ายนี้ ฉันจะขอบคุณสำหรับคำแนะนำเกี่ยวกับแรงดันในการฉีดและเวลาที่ใช้สำหรับสารอินทรีย์

ขอขอบคุณ


ฉันพบว่าการใช้ Femtotip loaders ให้บล็อกของเหลวอย่างต่อเนื่อง ซึ่งสามารถเคลื่อนไปที่ส่วนท้ายของทิปได้โดยการฉีดหลายครั้ง เป็นการดีที่จะมีอากาศเหนือของเหลวที่ปลาย


แบบจำลองลำไส้ของมนุษย์เพื่อศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างลำไส้กับจุลินทรีย์

Instituto Mexicano del Seguro Social, Unidad de Investigación Médica en Medicina Reproductiva, Unidad Médica de Alta Especialidad en Ginecología และ Obstetricia No. 4 ‘Dr. หลุยส์ กัสเตลาโซ อายาลา อ. Río Magdalena No. 289, พ.อ. Tizapán San Ángel, C.P. 01090 ซิวดัด เด เม็กซิโก, เม็กซิโก

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 ปารีส, ฝรั่งเศส

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 ปารีส, ฝรั่งเศส

Centre National de la Recherche Scientifique, UMR3691, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, ฝรั่งเศส

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 ปารีส, ฝรั่งเศส

Centre National de la Recherche Scientifique, ERL9195, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, ฝรั่งเศส

Instituto Mexicano del Seguro Social, Unidad de Investigación Médica en Medicina Reproductiva, Unidad Médica de Alta Especialidad en Ginecología และ Obstetricia No. 4 ‘Dr. หลุยส์ กัสเตลาโซ อายาลา อ. Río Magdalena No. 289, พ.อ. Tizapán San Ángel, C.P. 01090 ซิวดัด เด เม็กซิโก, เม็กซิโก

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 ปารีส, ฝรั่งเศส

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 ปารีส, ฝรั่งเศส

Centre National de la Recherche Scientifique, UMR3691, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, ฝรั่งเศส

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 ปารีส, ฝรั่งเศส

Centre National de la Recherche Scientifique, ERL9195, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, ฝรั่งเศส


ศัพท์เฉพาะสำหรับวัฒนธรรมลำไส้สามมิติ

คำว่า “ออร์แกนอยด์” ถูกใช้ครั้งแรกในปี 1987 เพื่ออธิบายการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองที่ได้มาจากนิวโรบลาสโตมา (46) และปอด (134) การเพาะเลี้ยงลำไส้ระยะสั้นได้รับการอธิบายครั้งแรกโดย Evans et al (25) ซึ่งกำหนดออร์กานอยด์ในลำไส้เป็นโครงสร้างของสัจจะและวิลลี่ที่เติบโตในหลอดทดลอง Sato และ Clevers อธิบายการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดจากลำไส้สามมิติ (ISC) สามมิติในปี 2552 ว่าเป็น “ออร์กานอยด์” และยังคงอ้างถึงการเพาะเลี้ยงเยื่อบุผิวอย่างหมดจดว่าเป็นออร์กานอยด์ (95a) ในปีเดียวกันนั้น Ootani และ Kuo ได้รายงานการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนลำไส้สามมิติ ซึ่งพวกมันยังอ้างถึงออร์กานอยด์ (65) ในปี 2555 Intestinal Stem Cell Consortium ได้ตีพิมพ์แนวทางการตั้งชื่อเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างประเภทของวัฒนธรรมในลำไส้ (109) ผู้เขียนงานนี้แนะนำคำว่า "ออร์แกนอยด์" สำหรับวัฒนธรรมที่มีเซลล์หลายประเภท รวมทั้งเยื่อบุผิวและเยื่อหุ้มเซลล์ ในขณะที่วัฒนธรรมของประชากรเยื่อบุผิวบริสุทธิ์จะถูกกำหนดให้เป็น "ลำไส้" หรือ "ลำไส้ใหญ่" หากได้มาจากลำไส้เล็กหรือลำไส้ใหญ่ ตามลำดับ คำว่า “ทรงกลม” ยังถูกใช้เพื่อแสดงถึงวัฒนธรรมสามมิติของเยื่อบุผิว (76) ในการทบทวนนี้ โครงสร้างอวัยวะสามมิติทั้งหมดจะเรียกว่า “ออร์กานอยด์” และมีคุณสมบัติตามตำแหน่งของเนื้อเยื่อ สปีชีส์ และประเภทของเนื้อเยื่อ (เช่น “ออร์กานอยด์ของเนื้องอกลำไส้ใหญ่”)


แนวทางส่งเสริมการเจริญเติบโตของสารอินทรีย์

Organoids แสดงการเจริญเติบโตที่ จำกัด ในหลอดทดลอง เนื่องจากต้องอาศัยการแพร่ของออกซิเจนและสารอาหารจากภายนอกเพื่อความอยู่รอด นอกจากนี้ แบบจำลองออร์แกนอยด์ที่ได้มาจาก hPSC หลายๆ แบบมีลักษณะคล้ายเนื้อเยื่อที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะและไม่สามารถเจริญเต็มที่โดยไม่คำนึงถึงระยะเวลาในการเพาะเลี้ยง อย่างไรก็ตาม การย้ายอวัยวะไปยังตำแหน่งต่างๆ ในโฮสต์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้ส่งผลให้เกิดการเจริญเต็มที่ของอวัยวะภายในและการทำงานของเนื้อเยื่อที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 2) ออร์แกนอยด์ได้รับการปลูกถ่ายทั้งแบบออร์โธโทเปีย (เช่น ในลักษณะคล้ายคลึงกัน) ในร่างกาย ที่ตั้ง) และ ectopically (เช่น ในภูมิภาคนอกถิ่นกำเนิด ในร่างกาย สิ่งแวดล้อม) และวิธีการปลูกถ่ายทั้งสองวิธีอนุญาตให้เจริญเติบโตเต็มที่ (Dye et al., 2016 Finkbeiner et al., 2015b Sugimoto et al., 2018 Takebe et al., 2013 van den Berg et al., 2018) การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าโมเดลออร์กานอยด์สามารถเติบโตเต็มที่เมื่อได้รับสัญญาณเพิ่มเติมจาก ในร่างกาย สิ่งแวดล้อมจึงเพิ่มความน่าสนใจในการศึกษาการสร้างอวัยวะของมนุษย์และเพื่อใช้เป็นแบบอย่างก่อนคลินิกหรือในเวชศาสตร์ฟื้นฟู ที่นี่ เราจะหารือเกี่ยวกับวิธีการปรับปรุงความซับซ้อนและการเจริญเติบโตของออร์แกนอยด์ผ่านการปลูกถ่าย ในร่างกาย.

การปลูกถ่ายอวัยวะออร์โธโทปิกและนอกมดลูกของมนุษย์ ทั้ง hPSC และเนื้อเยื่อปฐมภูมิได้รับการปลูกถ่ายในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง สีเป็นตัวแทนของออร์กานอยด์ประเภทต่างๆ ทั้งที่ได้จากปฐมภูมิและ/หรือที่ได้รับ hPSC ที่ได้รับการปลูกถ่ายในตำแหน่งที่ระบุ การปลูกถ่ายออร์โธโทปิกหมายถึงการปลูกถ่ายในลักษณะที่คล้ายคลึงกัน ในร่างกาย ตำแหน่งในขณะที่การปลูกถ่ายนอกมดลูกหมายถึงการปลูกถ่ายไปยังภูมิภาคนอกพื้นเมือง ในร่างกาย สิ่งแวดล้อม (เช่น ใต้แคปซูลไต ภายในแผ่นไขมัน)

การปลูกถ่ายอวัยวะออร์โธโทปิกและนอกมดลูกของมนุษย์ ทั้ง hPSC และเนื้อเยื่อปฐมภูมิได้รับการปลูกถ่ายในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง สีเป็นตัวแทนของออร์กานอยด์ประเภทต่างๆ ทั้งที่ได้จากปฐมภูมิและ/หรือที่ได้รับ hPSC ที่ได้รับการปลูกถ่ายในตำแหน่งที่ระบุ การปลูกถ่ายออร์โธโทปิกหมายถึงการปลูกถ่ายในลักษณะที่คล้ายคลึงกัน ในร่างกาย ตำแหน่งในขณะที่การปลูกถ่ายนอกมดลูกหมายถึงการปลูกถ่ายไปยังภูมิภาคนอกพื้นเมือง ในร่างกาย สิ่งแวดล้อม (เช่น ใต้แคปซูลไต ภายในแผ่นไขมัน)

การปลูกถ่ายอวัยวะนอกมดลูก

การทดลองจำนวนมากได้ปลูกถ่ายอวัยวะในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องเพื่อให้เจริญเติบโตเต็มที่ โดยทั่วไปแล้ว อวัยวะออร์แกนอยด์จะถูกย้ายไปยังตำแหน่งที่มีหลอดเลือดสูง ซึ่งเหมาะสำหรับการปลูกถ่ายอวัยวะและการเจริญเติบโตเป็นเวลาหลายเดือน โดยไม่ขัดขวางการทำงานของอวัยวะของหนูที่จำเป็น ไซต์ดังกล่าวรวมถึงแผ่นไขมันบริเวณท่อน้ำอสุจิ (Dye et al., 2016) และใต้แคปซูลไต (Finkbeiner et al., 2015a,b Múnera et al., 2017 Trisno et al., 2018 Tsai et al., 2017 Watson et al., 2014 Workman et al., 2016). แท้จริงแล้ว ความซับซ้อนของวัฒนธรรมร่วมที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สามารถปรับปรุงเพิ่มเติมได้โดยการปลูกถ่าย (Schlieve et al., 2017 Takebe et al., 2013 Workman et al., 2016)

HIOs เป็นตัวอย่างของโมเดลออร์กานอยด์ที่แสดงให้เห็นการเจริญเติบโตอย่างมีนัยสำคัญหลังการปลูกถ่ายแคปซูลไตเป็นเวลาหลายสัปดาห์ (Finkbeiner et al., 2015b Watson et al., 2014) ทั้งเยื่อบุผิวและเยื่อหุ้มเซลล์ของ HIO ที่ปลูกถ่าย (tHIO) แสดงให้เห็นถึงการจัดระเบียบที่ดีขึ้น ด้วยการเกิดขึ้นของสถาปัตยกรรม villus-crypt ที่มีลวดลายอย่างเหมาะสมภายในเยื่อบุผิวที่ไม่ชัดเจนก่อนการปลูกถ่าย นอกจากนี้ แอคตินของกล้ามเนื้อเรียบ (SMA)- และตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของเกล็ดเลือดที่ได้รับ alpha (PDGFRA) ซึ่งแสดงออกถึงสายเลือดมีเซนไคม์ได้รับการจัดระเบียบในลักษณะที่แยกไม่ออกจากลำไส้ของมนุษย์โดยกำเนิด (Finkbeiner et al., 2015b) การสร้างหลอดเลือดโดยหลอดเลือดของหนูเมาส์สนับสนุนการเติบโตที่สำคัญของ HIO ที่ปลูกถ่ายได้สูงถึง 100 เท่า (Watson et al., 2014) เมื่อเร็ว ๆ นี้ HIO ประสบความสำเร็จในการปลูกถ่ายเข้าไปในน้ำเหลืองในลำไส้และแสดงให้เห็นถึงลักษณะการเจริญเติบโตและการสุกที่คล้ายคลึงกันเช่นเดียวกับการปลูกถ่ายใต้แคปซูลไต (Cortez et al., 2018 Finkbeiner et al., 2015a) น้ำเหลืองในลำไส้จึงเป็นพื้นที่ปลูกถ่ายเสริมที่อาจมีความเกี่ยวข้องทางสรีรวิทยามากขึ้นสำหรับการศึกษาการแปลในอนาคตเนื่องจากอยู่ใกล้กับลำไส้พื้นเมือง

อวัยวะในปอดที่ได้รับ hPSC (HLO) เป็นอีกชนิดหนึ่ง ในหลอดทดลอง แบบจำลองที่แสดงให้เห็นโครงสร้างเนื้อเยื่อที่ดีขึ้นและการเจริญเติบโตเมื่อปลูกถ่าย น่าสนใจ ไม่เหมือนกับโมเดลออร์กานอยด์อื่นๆ HLO ไม่สามารถรอดจากการปลูกถ่ายใต้แคปซูลไต (Dye et al., 2016) polylactide-co-glycolide (PLG) microporous ซึ่งมักใช้ในการปลูกถ่ายเซลล์เบต้าตับอ่อน (Gibly et al., 2011 Hlavaty et al., 2014) เพื่อสนับสนุนการปลูกถ่าย HLO โครงนั่งร้าน PLG ทำหน้าที่เป็นช่องเฉพาะทางกายภาพเพื่อรองรับการอยู่รอดและการเจริญเติบโตของ HLO ที่ปลูกถ่าย ซึ่งแสดงการจัดระเบียบของเยื่อบุผิว สัณฐานวิทยา และความแตกต่างของสายเลือดส่วนต้น (เช่น หลอดลม/หลอดลม) ที่ใกล้เคียงกับทางเดินหายใจส่วนต้นของมนุษย์ที่เจริญเต็มที่มากกว่า HLO ที่ปลูก ในหลอดทดลอง. ผลลัพธ์นี้ชี้ให้เห็นว่า ในร่างกาย จำเป็นต้องมีตัวชี้นำพร้อมกับโครงนั่งร้านเพื่อรองรับการเจริญเติบโตของ HLO แม้ว่าเชื้อสายของถุงจะมีอยู่ใน ในหลอดทดลอง ชุด HLOs ประเภทและโครงสร้างของเซลล์ถุงไม่รองรับใน HLO ที่ปลูกถ่าย (Dye et al., 2015, 2016) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง HLOs จะต้องได้รับการปลูกถ่ายภายในแผ่นไขมันบริเวณท่อน้ำอสุจิ เนื่องจากช่องแคปซูลไตไม่ใหญ่พอที่จะรองรับโครงนั่งร้าน แม้จะมีความแตกต่างในตำแหน่งการปลูกถ่าย คล้ายกับออร์กานอยด์ในลำไส้ แต่ HLO ถูกทำให้หลอดเลือดขยายตัวอย่างกว้างขวางโดยเส้นเลือดของโฮสต์ และทั้งส่วนประกอบเยื่อบุผิวและเยื่อหุ้มชั้นในก็เจริญเต็มที่หลังจากนั้น ในร่างกาย การเจริญเติบโต (Dye et al., 2016 Finkbeiner et al., 2015b Watson et al., 2014). การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงความต้องการของช่องทางกายภาพเพื่อรองรับการอยู่รอด ความแตกต่าง และการเจริญเติบโตของ HLO ที่ปลูกถ่าย

การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า vascularization เป็นกุญแจสำคัญสำหรับการปลูกถ่าย การเจริญเติบโต และการอยู่รอดของเนื้อเยื่อออร์แกนอยด์ที่ปลูกถ่าย แต่การสร้างหลอดเลือดอาจช้าและ/หรือไม่มีประสิทธิภาพสำหรับระบบออร์กานอยด์ที่ไม่มีหลอดเลือดก่อนการปลูกถ่าย อวัยวะในตาของตับที่มีเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่มีอยู่ก่อนแล้ว (HUVECs) สลักและสร้างการไหลเวียนของเลือดภายในเวลาเพียงไม่กี่วัน (Takebe et al., 2013) นอกจากนี้ การปลูกถ่ายเข้าไปในช่องกะโหลกช่วยให้สามารถถ่ายภาพอวัยวะที่เป็นอวัยวะได้ และแสดงให้เห็นว่า HUVEC สร้างการเชื่อมต่อของหลอดเลือดที่เสถียรกับโฮสต์

ข้อมูลชี้ให้เห็นว่าโมเดลออร์แกนอยด์ส่วนใหญ่ไม่มีเส้นเลือด อย่างไรก็ตาม เซลล์หลอดเลือดภายในร่างกายมีอยู่ภายในอวัยวะไตที่ได้มาจาก hPSC สิ่งนี้น่าจะเป็นผลมาจากแนวทางการสร้างความแตกต่างโดยตรงซึ่งผลัก hPSCs ไปสู่ชะตากรรมของ mesoderm ระดับกลางสร้างเชื้อสาย nephrogenic เช่นเดียวกับเซลล์บุผนังหลอดเลือด (Freedman et al., 2015 Takasato et al., 2015, 2016) หลังการปลูกถ่ายใต้แคปซูลไต อวัยวะในไตได้รับการขยายหลอดเลือดอย่างกว้างขวางโดยเซลล์บุผนังหลอดเลือดทั้งโฮสต์และออร์แกนอยด์ที่คงอยู่เป็นเวลาอย่างน้อย 2 สัปดาห์ของการปลูกถ่าย (van den Berg et al., 2018) ยิ่งไปกว่านั้น การใช้หน้าต่างถ่ายภาพช่องท้องช่วยให้สามารถถ่ายภาพอวัยวะแบบสดได้ตลอดการปลูกถ่าย การแช่เดกซ์แทรนเรืองแสงในเลือดช่วยให้มองเห็นภาพการไหลเวียนของเลือดและช่วยแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างของไตภายในออร์กานอยด์ของไตซึ่งทำหน้าที่กรองปัสสาวะออกจากเลือดกลายเป็นหลอดเลือด สิ่งนี้นำไปสู่การเจริญเติบโตของไตที่ดีขึ้น รวมถึงการสะสมของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไตและ endothelium ที่มีฟีเนสเทรตภายในออร์กานอยด์ที่ปลูกถ่าย

การปลูกถ่ายอวัยวะออร์โธปิดิกส์

แม้ว่าการปลูกถ่ายนอกมดลูกเป็นเครื่องมืออันมีค่าที่ช่วยให้เกิดการเจริญเต็มที่ของอวัยวะภายใน แต่ก็มีความสนใจในการปลูกถ่ายอวัยวะออร์โธโทปิกหรือชนิดเซลล์ที่ได้มาจากออร์โธปิดิกส์เพื่อพัฒนาความเข้าใจของเราในเรื่อง ในร่างกาย ช่องทางในการควบคุมการเจริญเติบโตของออร์แกนอยด์ เช่นเดียวกับการเพิ่มศักยภาพการแปลของแบบจำลองออร์กานอยด์สำหรับการบำบัดทดแทนอวัยวะ แบบจำลองการบาดเจ็บถูกนำมาใช้ในระบบอวัยวะต่างๆ เพื่อสร้างช่องที่อนุญาตสำหรับการปลูกถ่ายอวัยวะทั้งแบบปฐมภูมิและที่ได้รับ hPSC ในไซต์ที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยาในแบบจำลองเมาส์สำหรับผู้ใหญ่ (Huch et al., 2015 Miller et al., 2018 Sampaziotis et al., 2017 Sugimoto et al., 2018). ตัวอย่างเช่น ความพยายามเมื่อเร็วๆ นี้ประสบความสำเร็จในการปลูกถ่ายอวัยวะออร์โธปิดิกส์จากเยื่อบุผิวลำไส้ใหญ่ที่ได้รับจากเนื้อเยื่อหลักของมนุษย์เข้าไปในลำไส้ใหญ่ของหนูหลังจากการหยุดชะงักของเยื่อบุผิวภายใน (Sugimoto et al., 2018) ในที่นี้ แสดงให้เห็นว่าจำเป็นต้องมีพื้นที่บาดเจ็บที่สำคัญเพื่อสร้างโพรงที่ใหญ่พอที่จะส่งเสริมการแทรกซึมและการคงอยู่ของเนื้อเยื่อของมนุษย์ในช่วงหลายเดือน อาการบาดเจ็บเล็กๆ น้อยๆ ยังอนุญาตให้ฝังได้ แต่ในที่สุดเนื้อเยื่อของมนุษย์ที่สลักไว้ก็หายไปตามกาลเวลา การติดตามเชื้อสายของเซลล์ต้นกำเนิดในลำไส้โดยใช้ LGR5-CreER เฉพาะเซลล์ต้นกำเนิดจากลำไส้ที่ออกแบบโดยจีโนมและนักข่าวเชื้อสายในออร์กานอยด์ในลำไส้ใหญ่ของมนุษย์เผยให้เห็นความแตกต่างเฉพาะสปีชีส์ที่สำคัญในระยะเวลาการปั่นจักรยานระหว่างเซลล์ต้นกำเนิดจากหนูและเซลล์ต้นกำเนิดจากลำไส้ของมนุษย์ (Sugimoto et al., 2018 ). ความเข้าใจอย่างลึกซึ้งเกี่ยวกับช่องเซลล์ต้นกำเนิดในลำไส้จะเป็นไปไม่ได้ด้วยการปลูกถ่ายนอกมดลูก

มีการใช้วิธีการแกะสลักการบาดเจ็บที่คล้ายกันเพื่อแนะนำออร์แกนอยด์ต้นกำเนิดเยื่อบุผิวของมนุษย์ที่ได้รับ hPSC เข้าไปในปอดของหนูผู้ใหญ่ที่ได้รับบาดเจ็บ (Miller et al., 2018 Miller et al., 2019) ต้นกำเนิดจากปลายตาของปอดของมนุษย์สามารถแทรกซึมเข้าไปในหลอดลมและทางเดินหายใจส่วนต้นของปอดของหนูเมาส์หลังจากได้รับบาดเจ็บจากหลอดลมที่เกิดจากสารเคมี นอกจากนี้ เซลล์เหล่านี้ยังแสดงให้เห็นศักยภาพในการสร้างความแตกต่างแบบหลายสายในฟีโนไทป์ของสายเลือดใกล้เคียงหลายสายพันธุ์ ซึ่งรวมถึงเซลล์ที่ผลิตเมือก เซลล์ที่มีเซลล์ ciliated และเซลล์ประสาทต่อมไร้ท่อหลังจาก 6 สัปดาห์หลังได้รับบาดเจ็บ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง บรรพบุรุษเหล่านี้แสดงให้เห็น ในหลอดทดลอง ความสามารถในการสร้างความแตกต่างของถุงลม แต่ไม่พบการสืบเชื้อสายดังกล่าว น่าจะเป็นเพราะเซลล์ไม่ได้ปักชำในบริเวณถุงลมซึ่งไม่มีการบาดเจ็บในแบบจำลองการบาดเจ็บโดยเฉพาะนี้ ผลลัพธ์นี้เน้นถึงความสำคัญของ ในร่างกาย microenvironment ในการไกล่เกลี่ยการสร้างความแตกต่างของบรรพบุรุษของอวัยวะ (Miller et al., 2018) ในที่สุด ออร์แกนอยด์จากเนื้อเยื่อท่อน้ำดีนอกตับจากเนื้อเยื่อหลักที่เพาะบนโครงนั่งร้านสามารถฝังเข้าไปในเยื่อบุผิวของถุงน้ำดีและท่อน้ำดีทั่วไปเพื่อช่วยแบบจำลองการทำงานของหนูเมาส์ที่มีอาการบาดเจ็บทางเดินน้ำดีนอกตับ (Sampaziotis et al., 2017)

อวัยวะในสมองที่ได้รับ hPSC ของมนุษย์ได้รับการปลูกถ่ายในสมองของหนูที่โตเต็มวัยด้วยการปลูกถ่ายอวัยวะที่แข็งแรงและอัตราการรอดชีวิตของโฮสต์ แม้ว่าจะมีการรุกรานของกระบวนการก็ตาม (Mansour et al., 2018) เมื่อเทียบกับอายุที่ตรงกัน ในหลอดทดลอง- ออร์กานอยด์ในสมองที่โตแล้ว ออร์กานอยด์ในสมองที่ปลูกถ่ายมีสัดส่วนที่สูงขึ้นของชะตากรรมของเซลล์ประสาทที่โตเต็มที่ซึ่งรวมถึงแอสโตรไซต์และโอลิโกเดนโดรไซต์ เมื่อเทียบกับสารตั้งต้นของเซลล์ประสาทที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ ในหลอดทดลอง. นอกจากนี้ การคาดการณ์ของแอกซอนยังแสดงให้เห็นการบุกรุกบริเวณต่างๆ ของสมองโฮสต์ และการวิเคราะห์ด้วยเครื่องหมายบ่งชี้ว่าแอกซอนที่ได้มาจากออร์แกนอยด์ของมนุษย์เหล่านี้สร้างการเชื่อมต่อแบบซินแนปติกกับเซลล์ประสาทของหนู การศึกษาเบื้องต้นแสดงให้เห็นว่าอวัยวะในสมองที่ปลูกถ่ายตอบสนองต่อการกระตุ้นแคลเซียมจากภายนอกในรูปแบบที่ซิงโครไนซ์มากที่สุดซึ่งคล้ายกับการพัฒนาของสมองมากกว่าสมองที่โตเต็มที่ ดังนั้น แม้ว่านี่จะเป็นความก้าวหน้าที่น่าประทับใจในอวัยวะในสมอง แต่วิธีการปลูกถ่ายในปัจจุบันส่งผลให้เกิดการเจริญเติบโตเพียงบางส่วนเท่านั้น (Mansour et al., 2018) ความพยายามยังได้รับออร์แกนอยด์ในสมองที่มีเซลล์บุผนังหลอดเลือดจาก hPSC ที่สามารถเพาะเลี้ยงร่วมกันได้ ในหลอดทดลอง นานถึง 5 สัปดาห์และย้ายไปยังโฮสต์ของหนูเป็นเวลาอย่างน้อย 2 สัปดาห์ แสดงให้เห็นถึงการพิสูจน์หลักการสำหรับการสร้างหลอดเลือดของมนุษย์ในอวัยวะในสมองที่ปลูกถ่าย (Pham et al., 2018)

โดยรวมแล้ว การจัดตั้งแนวทางการปลูกถ่ายออร์โธโทปิกช่วยให้สามารถศึกษาการเจริญเติบโตของออร์กานอยด์ภายในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้อเยื่อพื้นเมือง และในขณะเดียวกันก็ทำให้นักวิจัยเข้าใกล้การประยุกต์ใช้การแปลเทคโนโลยีออร์แกนอยด์มากขึ้นไปอีกขั้น ทั้งในแนวทางนอกมดลูกและทางออร์โธปิกส์ การระบุปัจจัยที่แน่นอนใน .นั้นเป็นเรื่องยาก ในร่างกาย สภาพแวดล้อมของโฮสต์ที่รับผิดชอบการเจริญเติบโตของสารอินทรีย์ การก้าวไปข้างหน้าเป็นสิ่งสำคัญที่จะเริ่มจัดการกับสิ่งเหล่านี้ ในร่างกาย ปฏิสัมพันธ์เพื่อใช้หลักการของการเจริญเติบโตเพื่อสร้างออร์แกนอยด์ที่โตเต็มที่ในจาน เพื่อตอบคำถามเหล่านี้ การทดลองในอนาคตอาจสร้างออร์กานอยด์จากห้องสมุดที่น่าพิศวง CRISPR หรือคัดกรองไลบรารีโมเลกุลขนาดเล็กเพื่อประเมินปัจจัยในการเจริญเติบโตอย่างอิสระ

วิธีการปลูกถ่ายทางวิศวกรรมเพื่อเพิ่มวุฒิภาวะออร์กานอยด์

อวัยวะภายในลำไส้เป็นแหล่งของเนื้อเยื่อทดแทนสำหรับสภาวะต่างๆ เช่น อาการลำไส้สั้น แต่การดำเนินการทางคลินิกจะต้องเพิ่มขนาดและวุฒิภาวะเพื่อผลิตเนื้อเยื่อในลำไส้ที่ใช้งานได้ แนวทางหนึ่งในการแก้ไขปัญหานี้ใช้ HIO ที่เพาะบนโครงนั่งร้านเพื่อผลิตลำไส้เล็กที่ออกแบบโดยเนื้อเยื่อ (TESI) (Finkbeiner et al., 2015a) HIO ถูกเพาะบนเมทริกซ์ลำไส้ของสุกรที่ไม่มีเซลล์รวมทั้งโครงสังเคราะห์ที่ประกอบรวมด้วยกรดแลคติกโพลีไกลโคลิก/โพลีแอล (PGA/PLLA) โดยใช้วิธีการนี้ HIO ได้สำเร็จ reseed เมทริกซ์ acellular ในหลอดทดลอง แต่ไม่คงอยู่หรือคงไว้ซึ่งเอกลักษณ์ของลำไส้เมื่อปลูกถ่ายในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง ประสิทธิภาพที่ต่ำของเมทริกซ์ที่ไม่มีเซลล์อาจเกิดจากการลบคำแนะนำในระหว่างการลดระดับเซลล์หรือการอุดตันของการแทรกซึมของหลอดเลือดไปยัง HIO โดยเมทริกซ์ อย่างไรก็ตาม HIOs ที่เพาะบนเมทริกซ์สังเคราะห์ก็เจริญรุ่งเรือง ในร่างกาย และมีการเจริญของเยื่อบุผิวทำให้เกิดเนื้อเยื่อที่คล้ายกับลำไส้ของผู้ใหญ่ โครงสร้างรูปท่อเหล่านี้เป็นวิธีที่มีแนวโน้มในการเพาะ HIO หลายตัว และสร้างเนื้อเยื่อลำไส้ที่ยาวขึ้นและโตเต็มที่ ในหลอดทดลอง. แม้ว่า TESI ที่อธิบายไว้ในที่นี้ไม่มีเซลล์ในลำไส้ที่สำคัญ เช่น ระบบประสาทในลำไส้ แต่ก็สามารถเอาชนะได้ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (Schlieve et al., 2017 Workman et al., 2016)

แนวทางล่าสุดในการสร้างเนื้อเยื่อลำไส้ที่ปรับขนาดได้และโตเต็มที่จาก HIO ที่รวมความเครียดทางกลโดยใช้สปริงที่ยาวขึ้น (Poling et al., 2018) ความเครียดทางกลมีบทบาทในการพัฒนาลำไส้ (Kurpios et al., 2008 Savin et al., 2011 Shyer et al., 2015, 2013) และอุปกรณ์เพิ่มความยาวแบบสปริงหรือแบบยืดได้ได้รับการออกแบบเป็นวิธีการรักษาสำหรับ อาการลำไส้สั้น (Demehri et al., 2015, 2014 Ralls et al., 2012 Rouch et al., 2016 Stark et al., 2012 Sueyoshi et al., 2013) ในแนวทางนี้ HIO ถูกปลูกถ่ายในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องเป็นเวลา 10 สัปดาห์ หลังจากเวลานี้ สปริงนิทินอลที่ถูกบีบอัดถูกใส่โดยการผ่าตัดเข้าไปใน HIO ที่ปลูกถ่ายเป็นเวลาอีก 14 วัน HIO ที่ปลูกถ่ายที่ได้รับความเครียดแสดงความยาวของลำไส้เพิ่มขึ้น วิลไลที่ใหญ่ขึ้น และฝังศพใต้ถุนโบสถ์ที่ลึกกว่า และดูเหมือนจะโตเต็มที่กว่าโดยอิงจากลายเซ็นของยีนทั่วโลก เมื่อเทียบกับ HIO ที่ปลูกถ่ายโดยไม่มีสปริง การศึกษาเหล่านี้เน้นย้ำถึงแนวทางวิศวกรรมชีวภาพเพื่อส่งเสริมการประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ HIO และแสดงให้เห็นถึงความสำคัญของทั้งตัวชี้นำทางชีววิทยาและทางกลในการส่งเสริมการเจริญเติบโตของอวัยวะภายใน


อวัยวะในลำไส้โดยการฉีดไมโครฉีด - ชีววิทยา

รหัสนี้เกี่ยวข้องกับบทความจาก Hill et al. "การล่าอาณานิคมของแบคทีเรียกระตุ้นการตอบสนองทางสรีรวิทยาที่ซับซ้อนในเยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ" eLife, 2017. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.29132

การวัดแบบเรียลไทม์ของการซึมผ่านของเยื่อบุผิวในอวัยวะในลำไส้ของมนุษย์

David R. Hill 1# , Sha Huang 1 , Yu-Hwai Tsai 1 , Jason R. Spence 1,2 และ Vincent B. Young 1,3,4 ,

1 Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, Ann Arbor MI 48109 2 Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor MI 48109 3 ภาควิชาอายุรศาสตร์ กองโรคติดเชื้อ มหาวิทยาลัยมิชิแกน แอน Arbor MI 48109 4 ภาควิชาจุลชีววิทยาและวิทยาภูมิคุ้มกัน, University of Michigan, Ann Arbor MI 48109

# ผู้เขียนจดหมายโต้ตอบ: David R. Hill ([email protected])

โปรโตคอลนี้อธิบายการวัดความสามารถในการซึมผ่านของเยื่อบุผิวแบบเรียลไทม์หลังการรักษาทางเภสัชวิทยาในอวัยวะในลำไส้ของมนุษย์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและกล้องจุลทรรศน์เซลล์ที่มีชีวิต

ความก้าวหน้าในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อลำไส้แบบสามมิติที่ได้จากการตัดชิ้นเนื้อหรือสร้างจากเซลล์ต้นกำเนิดที่มีพลูริโพเทนต์ผ่านการสร้างความแตกต่างโดยตรงส่งผลให้เกิดความซับซ้อน ในหลอดทดลอง แบบจำลองของเยื่อบุลำไส้ การใช้ประโยชน์จากระบบแบบจำลองที่เกิดขึ้นใหม่เหล่านี้จะต้องมีการปรับเครื่องมือและเทคนิคที่พัฒนาขึ้นสำหรับระบบวัฒนธรรม 2 มิติและสัตว์ ในที่นี้ เราอธิบายเทคนิคในการวัดความสามารถในการซึมผ่านของเยื่อบุผิวในอวัยวะในลำไส้ของมนุษย์แบบเรียลไทม์ ทำได้โดยการฉีดเดกซ์แทรนขนาดเล็กที่ติดฉลากเรืองแสงและการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวซึ่งติดตั้งฟิลเตอร์อีพิฟลูออเรสเซนต์ การวัดค่าการซึมผ่านของสิ่งกีดขวางในออร์กานอยด์ในลำไส้แบบเรียลไทม์ช่วยให้สร้างข้อมูลชั่วคราวที่มีความละเอียดสูงในเนื้อเยื่อเยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์ได้ แม้ว่าเทคนิคนี้ยังสามารถนำไปใช้กับวิธีการสร้างภาพไทม์พอยต์แบบตายตัวได้ โปรโตคอลนี้สามารถปรับเปลี่ยนได้อย่างง่ายดายสำหรับการวัดความสามารถในการซึมผ่านของสิ่งกีดขวางของเยื่อบุผิวหลังจากการสัมผัสกับสารทางเภสัชวิทยา ผลิตภัณฑ์จากแบคทีเรียหรือสารพิษ หรือจุลินทรีย์ที่มีชีวิต ด้วยการดัดแปลงเล็กน้อย โปรโตคอลนี้ยังสามารถทำหน้าที่เป็นไพรเมอร์ทั่วไปในการฉีดไมโครออร์กานอยด์ในลำไส้ และผู้ใช้อาจเลือกที่จะเสริมโปรโตคอลนี้ด้วยการใช้งานปลายน้ำเพิ่มเติมหรือทางเลือกหลังการฉีดไมโคร

NS ออร์แกนอยด์ในลำไส้ของมนุษย์ (HIO) ที่ได้จากสเต็มเซลล์ที่ฉีดด้วย FITC-dextran (4 kDa) 2 มก./มล. เป็นเวลา 20 ชั่วโมง HIO ยังถูกฉีดไมโครด้วย PBS (กลุ่มควบคุม) หรือ คลอสทริเดียม ดิฟิไซล์ ทอกซิน TcdA (12.8 นาโนกรัม/ไมโครลิตร) หรือบำบัดด้วย EGTA 2 มิลลิโมลาร์ที่เติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อภายนอก กำลังขยาย 4X NS พล็อตของความเข้มข้นของ FITC ที่ทำให้เป็นมาตรฐานเฉลี่ยเมื่อเวลาผ่านไปใน HIO ที่บำบัดด้วย PBS (การควบคุม), TcdA หรือ EGTA แถบข้อผิดพลาดแสดงถึง SEM และ N = 4-6 HIO ต่อกลุ่ม

โปรโตคอลนี้อยู่บน GitHub ด้วยเหตุผลบางประการ เราขอเชิญคุณถามคำถาม เสนอแนะ และมีส่วนร่วมกับวิทยาศาสตร์ที่นำเสนอที่นี่ ใช้คุณลักษณะ "ปัญหา" ของ GitHub เพื่อโพสต์คำถามและความคิดเห็นที่คุณต้องการให้พร้อมสำหรับการสนทนาสาธารณะ ติดต่อผู้เขียนหากคุณต้องการได้รับการเพิ่มเป็นผู้มีส่วนร่วมในที่เก็บนี้ ส่งคำขอดึง หรือแยกที่เก็บนี้และทำการเปลี่ยนแปลงของคุณเอง

เราสงสัยว่าผู้ใช้ส่วนใหญ่จะต้องการดาวน์โหลดต้นฉบับในเวอร์ชัน PDF ไปหามัน!

หากคุณสนใจที่จะเข้าใจการทำงานภายในของรหัสสำหรับการวิเคราะห์และสร้างบทความ (คุณเคยได้ยินเกี่ยวกับสิ่งนี้ที่เรียกว่า "การวิจัยที่ทำซ้ำได้" หรือไม่) คุณอาจต้องการลองโคลนที่เก็บนี้ในคอมพิวเตอร์ของคุณและรวบรวมกระดาษ .

ในการรวบรวมบทความจากแหล่งที่มา คุณจะต้องใช้เครื่องมือต่อไปนี้:

จากนั้นไปที่โคลนโลคัลของที่เก็บนี้และพิมพ์ต่อไปนี้ในพร้อมท์คำสั่ง:

Hill, D. R. , Huang, S. , Tsai, Y. H. , Spence, J. R. , Young, V. B. การวัดการซึมผ่านของเยื่อบุผิวตามเวลาจริงในอวัยวะในลำไส้ของมนุษย์ เจ. วิส. ประสบการณ์ (), e56960, ดอย: 10.3791/56960 (2017).


การตรวจคัดกรอง Organoids ในห้องใต้ดินของลำไส้: การอ่านข้อมูลอย่างง่ายสำหรับชีววิทยาที่ซับซ้อน

เยื่อบุช่องปากและลำไส้อักเสบเป็นผลข้างเคียงที่ทำให้ร่างกายทรุดโทรมจากการฉายรังสี แบบจำลองหนูเมาส์ของโรคเยื่อเมือกที่เกิดจากรังสีทำให้น้ำหนักลดลงและเนื้อเยื่อเสียหาย ซึ่งสะท้อนถึงอาการเจ็บป่วยของมนุษย์เมื่อตอบสนองต่อปัจจัยการเจริญเติบโตของเคราติโนไซต์ (KGF) ซึ่งเป็นการรักษามาตรฐานในการดูแล Organoids ฝังศพใต้ถุนโบสถ์ที่เพาะเลี้ยงอนุญาตให้มีการพัฒนาการตรวจวิเคราะห์เพื่อติดตามผลของการรักษาเยื่อบุผิวในลำไส้ต่อความเสียหายที่เกิดจากรังสี การทดสอบในหลอดทดลองนี้คล้ายกับโมเดลของเมาส์เนื่องจาก KGF และ spondin-1 เฉพาะแผ่นหลังคา (RSPO1) ที่ปรับปรุงการกู้คืนออร์แกนอยด์ของ crypt หลังจากการแผ่รังสี การตรวจคัดกรองระบุสารประกอบที่เพิ่มการรอดชีวิตของออร์แกนอยด์ภายหลังการแผ่รังสี การทดสอบสารประกอบเหล่านี้พบว่าออร์กานอยด์เปลี่ยนแปลงการตอบสนองเมื่อเวลาผ่านไป การวิเคราะห์การถอดรหัสแบบเป็นกลางได้ดำเนินการบนวัฒนธรรมออร์แกนอยด์ที่ฝังรากลึก ณ จุดเวลาต่างๆ ในวัฒนธรรมเพื่อตรวจสอบพฤติกรรมการปรับตัวนี้ พบว่ายีนและวิถีจำนวนหนึ่งถูกมอดูเลตเมื่อเวลาผ่านไป โดยให้เหตุผลสำหรับความไวที่เปลี่ยนแปลงไปของวัฒนธรรมออร์กานอยด์ รายงานนี้อธิบายการทดสอบในหลอดทดลองที่สะท้อนถึงแง่มุมต่างๆ ของโรคในมนุษย์ การทดสอบนี้ใช้เพื่อระบุสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ซึ่งทำหน้าที่เป็นโพรบเพื่อสอบปากคำทางชีววิทยาของออร์แกนอยด์ที่ฝังรากลึกในวัฒนธรรมที่ยืดเยื้อ เส้นทางที่เปลี่ยนแปลงไปตามกาลเวลาอาจเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคเยื่อเมือก

คำสำคัญ: KGF RSPO mucositis หลัก 3D เซลล์เพาะเลี้ยงลำไส้เล็ก organoids ฝังศพใต้ถุนโบสถ์


มาตรฐานยังคงเป็นความท้าทายที่สำคัญสำหรับ ในหลอดทดลอง แบบจำลองการอักเสบ

ตามที่ระบุไว้ ความก้าวหน้าอย่างมากในด้านสเต็มเซลล์และฟิลด์ออร์กานอยด์ได้เกิดขึ้นแล้ว และศักยภาพของพวกมันในการวิจัยเชิงแปล และแม้แต่การดูแลสุขภาพก็ชัดเจน อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดในปัจจุบันของออร์กานอยด์ยังคงเป็นข้อแม้ที่สำคัญ (รูปที่ 2B)

ข้อจำกัดทั่วไปของการกำเนิดออร์กานอยด์คือความแปรปรวนสูงของฟีโนไทป์ที่พวกมันสามารถผลิตได้ ระบบการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดและออร์แกนอยด์และผลลัพธ์ระดับโมเลกุลนั้นขึ้นอยู่กับคุณภาพและคุณสมบัติของเนื้อเยื่อตัวอย่าง ความแปรปรวนในระยะก่อนการประมวลผลรบกวนลายเซ็นภูมิคุ้มกันของตัวอย่างเหล่านี้อย่างมาก นอกจากนี้ เนื้อเยื่อที่อักเสบมีแนวโน้มที่จะได้รับการตายของเซลล์ อาจมีความต้องการสารอาหารและการเพาะเลี้ยงที่แตกต่างกัน ดังนั้นอัตราการฟื้นตัวของอวัยวะสำคัญจากเนื้อเยื่ออักเสบจึงลดลงอย่างมาก (60) ในขณะที่ลายเซ็นอักเสบ อดีตร่างกาย คล้ายกับของพวกเขา ในร่างกาย ต้นกำเนิด (9) โดยเฉพาะอย่างยิ่งโรคที่ซับซ้อนเช่น IBD มีลักษณะเฉพาะด้วยความหลากหลายของรสชาติอักเสบ นอกจากนี้ การตรวจชิ้นเนื้อยังสะท้อนถึงชีววิทยาของพื้นที่ตัวอย่าง ดังนั้นควรเก็บสเต็มเซลล์/ออร์แกนอยด์จากภูมิภาคต่างๆ เมื่อใช้ iPSC จะมีความผันแปรในออร์กานอยด์ขึ้นอยู่กับภูมิหลังทางพันธุกรรมของแต่ละบุคคลและโปรโตคอลการเพาะเลี้ยงที่ใช้โดยห้องปฏิบัติการ สร้างเส้น isogenic ทาง วิธีการแก้ไขยีนสามารถจำกัดความแปรปรวนนี้ในส่วนที่เกี่ยวกับความแตกต่างทางพันธุกรรม

เนื่องจากออร์กานอยด์จาก iPSC เกิดขึ้นจากการสร้างความแตกต่างของประชากรที่เป็นเนื้อเดียวกัน ชนิดของเซลล์ที่จำเพาะต่อเนื้อเยื่อและสภาพแวดล้อมจุลภาคจะต้องถูกสร้างขึ้นใหม่ สิ่งนี้ท้าทายการใช้ iPSC และถึงแม้จะมีโครงสร้างและการทำงานที่คล้ายคลึงกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างเนื้อเยื่อออร์แกนอยด์และเนื้อเยื่อของผู้ใหญ่ แต่ออร์แกนอยด์มักจะรักษาลักษณะที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ ทำให้พวกมันคล้ายกับเนื้อเยื่อของทารกในครรภ์มากขึ้น ในตัวอย่างของออร์กานอยด์ในลำไส้ที่ได้รับ iPSC ข้อจำกัดนี้สามารถแก้ไขได้โดยการเพาะเลี้ยงร่วมกับทีเซลล์ซึ่งให้ช่องการเจริญเติบโตที่สมจริงมากขึ้น (61) วิศวกรรมโครงสร้าง 3D ที่ซับซ้อนมากขึ้นเพื่อปรับปรุงสถาปัตยกรรมออร์แกนอยด์ และด้วยเหตุนี้จึงเพิ่มความคล้ายคลึงกันกับ เนื้อเยื่อเดิม ในร่างกาย (62, 63) หรือ ในร่างกาย การปลูกถ่าย ซึ่งส่งผลให้เกิดเยื่อบุผิวในลำไส้ที่โตเต็มที่ด้วยช่องสเต็มเซลล์ของลำไส้ที่เก็บรักษาไว้ สถาปัตยกรรมแบบฝังศพใต้ถุนโบสถ์/วิลลัส และเยื่อมีเซนไคม์ของมนุษย์ที่เคลือบลามิเนต ทั้งคู่สนับสนุนโดยการงอกของหลอดเลือดของหนูเมาส์ (64) นอกเหนือจากลักษณะที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะแล้ว ออร์กานอยด์มักแสดงอายุขัยที่จำกัดเมื่อถึงขนาดที่กำหนด เนื่องจากขาดการแพร่กระจาย เซลล์จึงไม่ได้รับสารอาหารเพียงพอที่จะสนับสนุนการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง การใช้เครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพสามารถปรับปรุงการจัดหาสารอาหารได้ ตามหลักการแล้ว ออร์กานอยด์ได้รับการออกแบบมาเพื่อกระตุ้นการพัฒนาของเอนโดทีเลียมซึ่งส่งผลให้เกิดการสร้างหลอดเลือดดังที่แสดงเมื่อเร็วๆ นี้ (41) อีกกลยุทธ์หนึ่งคือการรวมเซลล์บุผนังหลอดเลือดหรือต้นกำเนิดของพวกมัน ในระหว่างการพัฒนาออร์แกนอยด์ และรวมวิธีการพิมพ์ทางชีวภาพเพื่อออกแบบโครงสามมิติสำหรับเซลล์บุผนังหลอดเลือด (65, 66) อย่างไรก็ตาม เนื้อเยื่อที่เป็นต้นฉบับของออร์แกนอยด์ที่ได้มาจาก iPSC มักจะไม่เกิดการอักเสบ เซลล์ไฟโบรบลาสต์ของผิวหนัง ได้รับการตั้งโปรแกรมใหม่และเพาะเลี้ยงเป็นเวลาหลายสัปดาห์ถึงหลายเดือนในกรณีที่ไม่มีสภาพแวดล้อมการอักเสบ สำหรับการศึกษาการอักเสบแบบหลายปัจจัยที่ซับซ้อน ระบบที่ได้มาจาก iPSC จึงไม่ใช่ตัวเลือกแรกในแง่ของแบบจำลอง ในทางกลับกัน ออร์แกนอยด์ที่ได้จาก iPSC อาจเป็นเครื่องมือที่ยอดเยี่ยมในการศึกษาความผิดปกติของการอักเสบที่เกิดจากพันธุกรรมเป็นหลัก เช่น monogenic IBD

ความท้าทายที่สำคัญอีกประการหนึ่งคือขนาดของความพยายาม เวลา และค่าใช้จ่ายที่ใช้กับวัฒนธรรมออร์แกนอยด์ แม้ว่าจะมีโปรโตคอลที่ค่อนข้างง่ายสำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ทั่วไปในราคาที่จัดการได้ โปรโตคอลการสร้างความแตกต่างก็รวมถึงปัจจัยที่มีราคาแพงหรือสื่อการเพาะเลี้ยง หรือต้องการสื่อที่ปรับสภาพแล้ว ซึ่งจำเป็นต้องผลิตโดยสายเซลล์ของฟีดเดอร์ ระบบการเพาะเลี้ยงร่วมกันมักมีโมเดล 2 มิติ ซึ่งต้องใช้ความพยายามและเวลาในการเพาะเลี้ยงที่สูงกว่ามาก การเพิ่มความท้าทายนี้ การสร้าง iPSC และการสร้างความแตกต่างในเนื้อเยื่อเฉพาะมักต้องใช้เวลาหลายสัปดาห์ของการเพาะเลี้ยงอย่างเข้มข้น ซึ่งจะเพิ่มความเสี่ยงของเหตุการณ์ไม่พึงประสงค์ เช่น การปนเปื้อนหรือความแตกต่างที่ไม่ต้องการ

เพื่อต่อสู้กับปัญหาดังกล่าว ความร่วมมืออย่างใกล้ชิดของการวิจัยทางวิชาการและพันธมิตรอุตสาหกรรมที่มีเทคโนโลยีสูงอาจเป็นกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มดีในการเอาชนะความท้าทายด้านโครงสร้างพื้นฐาน ในขณะที่สถาบันการศึกษาสามารถให้แนวคิดที่มาจากปัญหาและวิสัยทัศน์ที่ขับเคลื่อนด้วยสมมติฐานของแบบจำลองโรคใหม่ ๆ ได้ อุตสาหกรรมสามารถส่งมอบเทคโนโลยีที่จำเป็น ความสามารถในการผลิตขนาดใหญ่และการกำหนดมาตรฐาน การตั้งค่าโครงสร้างพื้นฐานการทำงานร่วมกันเหล่านี้มีความจำเป็นและสามารถส่งเสริมความก้าวหน้าของเทคโนโลยีสเต็มเซลล์ในอนาคตได้


Organoids ลำไส้สำหรับการสร้างแบบจำลองการพัฒนาลำไส้และโรค

โรคระบบทางเดินอาหารกำลังเป็นที่แพร่หลายมากขึ้นในประเทศที่พัฒนาแล้ว เซลล์และแบบจำลองสัตว์อมตะได้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญแต่จำกัดในกลไกที่เริ่มต้นและแพร่กระจายโรคเหล่านี้ แบบจำลองการพัฒนาลำไส้และโรคเฉพาะของมนุษย์มีความจำเป็นอย่างยิ่งซึ่งสามารถสรุปโครงสร้างและหน้าที่ของลำไส้ได้ ในหลอดทดลอง. ความก้าวหน้าในเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent และเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเบื้องต้นทำให้สามารถเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ในสามมิติที่ประกอบตัวเองเพื่อสร้าง 'อวัยวะในลำไส้' สารออร์กานอยด์เหล่านี้ทำให้เกิดโมเดลใหม่ๆ ที่จำเพาะต่อคน ซึ่งสามารถใช้เพื่อให้เข้าใจถึงโรคในทางเดินอาหารและอาจให้การรักษาใหม่ๆ เพื่อรักษา ที่นี่เราตรวจสอบปัจจุบัน ในหลอดทดลอง แบบจำลองของการพัฒนาและโรคในลำไส้ โดยพิจารณาจากจุดที่สามารถปรับปรุงได้และนำไปใช้ในอนาคตในด้านการสร้างแบบจำลองพัฒนาการ การทดสอบยา/ความเป็นพิษ และการใช้ในการรักษา

บทความนี้เป็นส่วนหนึ่งของหัวข้อ "นักออกแบบเนื้อเยื่อมนุษย์: มาที่แล็บใกล้คุณ"

1. โครงสร้างและหน้าที่ของลำไส้

ลำไส้เป็นอวัยวะสำคัญที่ได้มาจากเอ็นโดเดิร์มขั้นสุดท้ายและสามารถแบ่งย่อยออกเป็นลำไส้เล็กและลำไส้ใหญ่ได้ [1] Collectively, the small and large intestines perform the vital function of digestion, nutrient absorption and waste elimination [2]. The small intestine contains several functionally distinct areas including the duodenum, jejunum and ilium, and its surface comprises a highly folded epithelium of villi, microvilli and intestinal crypts [3]. This intricate folding of villi and microvilli serves to dramatically increase the total surface area of the small intestine, thereby facilitating greater nutrient absorption. The intestinal crypt functions as the niche in which the LGR5 + stem cells reside [4]. LGR5 + cells are relatively slow cycling cells and give rise to a highly proliferative and multipotent progenitor population known as the transit-amplifying (TA) cells, which differentiate as they migrate from the crypt towards the villi. By the time TA cells have moved out of the crypt, they are fully differentiated into one of the many cell types required for normal functionality of the epithelium [5].

The large intestine comprises four main regions: the ascending, transverse, descending and sigmoid colon [6]. While most digestion occurs in the small intestine, the large intestine functions to absorb water and ions, in addition to vitamins and short chain fatty acids (SCFA) synthesized by commensal bacteria. Production of SCFA by commensal bacteria in the large intestine is recognized as an important feature of maintaining normal gut health and has been shown to have several protective effects including creating an environment hostile to pathogenic microbes, providing an energy source for intestinal epithelial cells and enhancing mucus production [7].

2. Cells of the small and large intestine

The intestinal epithelium comprises several different cell types including enterocytes, goblet cells, Paneth cells and enteroendocrine cells, all of which are derived from the resident LGR5 + stem cells found at the base of intestinal crypts [8] (figure 1). Epithelial cells are critical in maintaining immune homeostasis within intestinal tissue, closely regulating the interplay between the intestinal mesenchyme, and commensal and pathogenic bacteria. They maintain a barrier formed with tight junctions, essential to the control of macromolecular transport and immune homeostasis. Enterocytes are the most common cell type found in the epithelium, and they mainly function in nutrient absorption. Secretory epithelial cells consist of Paneth and goblet cells and multiple enteroendocrine cell types, with functions ranging from cytokine to hormone production [9].

Figure 1. Anatomy of the small and large intestine. The small intestine is composed of repetitive villus and crypt structures. LGR5 + stem cells and Paneth cells are located at the base of the crypts, followed by the TA cells, and then mature epithelium composed of goblet cells, enteroendocrine cells and enterocytes (NS). The large intestine lacks the villi structures of the small intestine and instead is composed of colonic crypts. At the base of colonic crypts are LGR5 + stem cells and Reg4 + cells, followed by TA cells and mature epithelium that contains a high proportion of goblet cells (NS).

Goblet cells play a critical role in the functioning and protection of the intestinal tract. There are nearly twice as many goblet cells in the colon as in the small intestine, which is in proportion to the increase in bacteria [10]. Goblet cells function by producing glycoproteins known as mucins, which are vital constituents of the mucus that lines the epithelium. This mucosal layer acts as the first line of defence, preventing the bacteria present in the gut from being in direct contact with the intestinal epithelium [11]. Mucus production is increased in response to inflammatory cytokines including interferon-γ and interleukins-9, -10 and -13 [12]. The glycoproteins that comprise this mucus are toxic to many strains of bacteria. Additionally, this layer acts as a matrix to which defensins and antibodies adhere that target specific pathogenic bacteria adhere. When mucus production is hindered, this can cause commensal bacteria in the gut microbiota to penetrate the epithelial barrier, triggering an immune response [13]. Goblet cells also produce other constituents of the mucus layer, including trefoil factors that stabilize the mucus layer by forming cross-links between different components of the mucus [14]. This cross-linking creates a unique property in that the innermost layer is thicker and more viscous while the outer layer is more aqueous, allowing commensal bacteria to reside there.

The small and large intestine is a high turnover organ, with complete epithelial renewal approximately every 7 days. This process is driven by LGR5 + intestinal stem cells (figure 1NS,NS). The pioneering work of Hans Clevers demonstrated that LGR5 + stem cells reside at the base of the intestinal crypts that form the intestinal stem-cell niche [8,15]. LGR5 + cells are crucial for the continual renewal of the intestinal epithelium and undergo asymmetric division approximately every 24 h, giving rise to a daughter stem cell and a TA cell. These rapidly proliferating TA cells begin in the TA zone and migrate up the intestinal crypt, while dividing four to five times along the way, before terminally differentiating into any of the intestinal cell types [16]. Once differentiated, these cells continue to migrate upwards towards the top of the crypts and have a lifespan of approximately 7 days. Once these cells have reached the top of the villi, they typically undergo anoikis and are shed into the intestinal lumen.

Paneth are also generated from the asymmetrical division of the LGR5 + stem cell [16]. However, instead of migrating upwards, Paneth cells migrate downwards into the base of the crypt. Paneth cells are a longer-lived cell type, surviving for approximately 30 days at the base of intestinal crypts where they play an integral role in producing and maintaining the stem-cell niche [17,18]. In addition to maintaining the niche, Paneth cells secrete a substantial amount of antimicrobrial peptides such as defensins that help regulate intestinal microbiota and protect against invading pathogens.

Paneth cells are absent in the majority of colonic crypts. However, secretory cells expressing typical Paneth cell markers, including CD24 are present. Reg4 has been found to be a reliable marker of these cells, residing adjacent to LGR5 + stem cells in all colonic crypts [19]. These cells have been shown to secrete epidermal growth factor (EGF) and the Notch ligands DII1 and DII4, while LGR5 + stem cells were found to express the corresponding receptors [19]. These secretory Reg4 + cells were found to more closely resemble Paneth cells, rather than goblet cells found in either the small or large intestine. Reg4 + cells are integral to controlling stem-cell positioning in the crypt and for maintaining stemness of LGR5 + colonic stem cells. These cells have many distinct similarities with Paneth cells of the small intestine, with the exception that Reg4 + cells do not produce Wnt ligands, while colonic LGR5 + stem cells do express Wnt receptors [19]. Therefore, mesenchymal tissue surrounding the colonic crypts, known to produce Wnt ligands, may provide the necessary Wnt required for stem-cell maintenance in the intestinal crypt ในร่างกาย [20].

3. Cell signalling in the intestinal epithelium

Self-renewal and differentiation of LGR5 + stem cells are achieved via tight regulation of several signalling pathways within the intestinal crypts. Wnt signalling is considered the central signalling pathway maintaining LGR5 + stem-cell proliferation, controlling cell positioning within the crypt and activating terminal differentiation of Paneth cells. Dysregulation of this pathway has been shown to be important in the development of some colon cancers [21].

Higher concentrations of Wnt3a and EGF are present at the base of the crypts and are required for stem-cell maintenance and proliferation, respectively [22] (figure 2NS). A concentration gradient of Wnt3a is established in the intestinal crypt, with highest levels found in the base of the crypt that then decrease towards the top of the crypt [23]. This concentration gradient along with a decrease in Notch signalling and increased BMP signalling at the top of the crypts facilitates the initial differentiation of the LGR5 + stem cells along with the proliferation and terminal differentiation of the TA cells [24]. Paneth cells are integral in producing the crypt environment via secretion of several factors, including Wnt3a, EGF, transforming growth factor α (TGFα) and the Notch ligand D114 [18].

Figure 2. Regulation of stemness in the intestinal stem-cell niche. During normal maintenance of the stem-cell niche several signalling gradients are established that either promote stemness (Wnt) or differentiation (BMP) (NS). Multiple signal pathway agonists and antagonists are active in the intestinal crypts that are also used during ในหลอดทดลอง culture to simulate the crypt niche environment (NS).

4. Intestinal organoids

The identification of LGR5 + stem cells and the characterization of the intestinal stem-cell niche has led to the development of three-dimensional (3D) organoid cultures and the ability to amplify intestinal epithelium ในหลอดทดลอง. These primary tissue cultures can be maintained long term without any substantial changes to genetic integrity or tissue physiology.

Organoids are now becoming an increasingly popular option for exploring an array of diseases currently lacking suitable treatments. Multiple organoid culture platforms have now been described including liver and pancreatic organoids [25–28], kidney organoids [29], central nervous system organoids [30] and intestinal organoids [31–33]. An organoid is often defined as ‘an ในหลอดทดลอง 3D cellular cluster derived exclusively from primary tissue, ESCs or IPSCs, capable of self-renewal and self-organization, and exhibiting similar organ functionality as the tissue of origin' [34]. Indeed, intestinal organoids are clusters of cells that self-organize in 3D structures that recapitulate major features of their native tissue. Intestinal organoids have been derived from both human stem cells and direct biopsy of adult intestinal tissue. In each case, the resulting intestinal organoids share many features, including a highly folded epithelium structure consisting of crypts and villi similar to native intestinal epithelium. Once embedded in Matrigel™, they self-assemble so that the luminal surface of epithelium is directed towards the centre of the organoid and the basolateral side is in contact with the Matrigel™ and surrounding medium. Analysis of the different cell types present within intestinal organoids has shown that all cell types usually found ในร่างกาย are present, and are therefore useful for studying the complexities of interplay between cell types during homeostasis and disease states.

Intestinal organoids have been shown to exhibit the same functions as those that occur ในร่างกาย, including mucus production, and absorptive and secretory functions [24]. Intestinal organoids mimic ในร่างกาย epithelial regenerative capacity, with apoptotic cells being continually released into the lumen of the organoid as new cells are differentiated from the LGR5 + cells within the crypts to replenish the epithelium.

5. Isolation and culture of intestinal organoids

There are two approaches to creating intestinal organoids: either through isolation of intestinal crypts from patient donors or via ในหลอดทดลอง differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hIPSCs). Both methods result in organoids comprising all intestinal epithelial cell types found ในร่างกาย, in similar proportions and arrangements.

Culture conditions for both primary tissue and stem-cell-derived organoids are essentially the same, requiring a basal media comprising Advanced DMEM/F12, supplemented with N2 and B27, nicotinamide and NS-acetylcysteine. To the basal medium additional growth factors are added to support the growth of the organoids including EGF, Noggin and gastrin, which are essential for regulation of gut mucosal growth and proliferation of intestinal epithelial cells. The presence of Wnt3a is crucial to regulate self-renewal, proliferation and differentiation, as expression of LGR5 in stem cells found in intestinal crypts is dependent upon the canonical Wnt signalling pathway, regulated by R-Spondin-1 and BMP4 inhibition by Noggin [35,36] (figure 2NS).

Intestinal crypts can be isolated from intestinal biopsies during endoscopy or surgical resection [18,37] (figure 3). Crypts are manually dissected from the epithelium and embedded into a Matrigel™ containing Wnt, R-Spondin, EGF and Noggin. Once Matrigel™ has solidified and encapsulated the isolated crypts, the Matrigel™ is overlaid with tissue culture medium containing all additives and growth factors. Over the course of 7–10 days intestinal crypts elongate and expand to form the first organoid structures, which can then be manually dissociated and expanded. In addition to LGR5 + stem cells, mature enteroids and colonoids comprised enterocytes, enteroendocrine cells, goblets cells and Paneth cells.

Figure 3. Schematic of human intestinal organoid creation. Intestinal organoids can be generated directly from intestinal biopsy or tissue from surgical resection. Isolated crypts can be placed directly into 3D Matrigel™ cultures along with Wnt, Noggin, EGF and R-Spondin to establish stable cell lines. An alternative approach to generating patient-specific intestinal organoids requires a skin biopsy, isolation and amplification of skin fibroblasts. Skin fibroblasts can then be reprogrammed to hIPSCs using the Yamanaka factors and differentiated into endoermal cells and finally, intestinal epithelium before long-term culture in 3D Matrigel™ conditions.

Using a stem-cell-based approach, hESCs or hIPSCs can be differentiated following normal developmental stages to generate intestinal epithelium (figure 3). This includes differentiation of cells via the major developmental milestones of definitive endoderm, hindgut endoderm and intestinal progenitor cell stages. Once differentiated into sufficiently committed intestinal progenitor cells, they can be transitioned from what is normally a two-dimensional (2D) differentiation platform into the 3D organoid platform, where cells then spontaneously rearrange themselves into intestinal organoids.

6. Functional analysis of organoids

A variety of assays have been used to assess functionality of intestinal organoids. A primary function of enterocytes is transport of water and electrolytes across the intestinal barrier. ในหลอดทดลอง, organoids have been shown to maintain this function via derivation of organoids lacking the apical transporters SGLT-1 or PEPT1. These organoids were shown to have inhibited d -glucose, d -fructose and peptide transport across the epithelial membrane, validating their potential use as a model of nutrient and drug transport mechanisms [38].

Permeability of the intestinal epithelium is an important factor in both health and disease, affecting the diffusion of small molecules across the intestinal barrier and preventing bacterial translocation via the bloodstream. Recently, it has been demonstrated that intestinal organoids can be used to model epithelial permeability and changes can be recorded in real time [39]. เนินเขา et al. [39] demonstrated this technique by injecting fluorescently labelled dextran into the lumen of organoids while automated microscopy was used to capture, in real time, live cells and quantify breaks in the luminal surface. Using this technique, alterations to intestinal permeability can be studied under chronic inflammatory conditions and during bacterial invasions.

Forskolin-induced organoid swelling assay has also been used to demonstrate functionality of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ion channel. Organoids with a functional CFTR swell in response to forskolin treatment, while any changes to the function of CFTR due to inhibition or genetic mutation can be detected due to lack of swelling [40]. This assay has the potential to be adapted to a drug-screening platform for cystic fibrosis (CF).

7. Applications of organoid technology

Owing to its differing physiology and distinct functions, the gastrointestinal tract is affected by an array of disorders. The intestinal epithelium is continuously exposed to antigens from commensal bacteria and consumed food, hence it has an extensive immune system, inclusive of adjacent lymphoid tissue, heavily populated with lymphocytes. The mucosa is the main site at which the immunological functions take place however, loss of this carefully maintained immune homeostasis can cause chronic inflammation and multiple disorders. Intestinal organoids have now become increasingly popular as a platform to model many intestinal diseases caused by chronic inflammation or physical injury.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic, progressive and relapsing disease affecting the entire gastrointestinal tract. It is a result of dysregulated innate and adaptive immune responses against antigens present in the gastrointestinal tract. IBD is categorized into two main subtypes: ulcerative colitis (UC), which is restricted to the colon, and Crohn's disease (CD), which can affect any area of the digestive tract [41]. During active IBD, the small and large intestine can become highly inflamed, leading to destruction of the epithelium and deterioration in digestive capacity. Intestinal organoids derived from IBD patients present an opportunity to understand how innate immunity is regulated in IBD patients and to identify novel therapeutics to reduce the severity of the disease.

Short bowel syndrome (SBS) develops often due to partial resection of large intestine as a result of IBD, colorectal cancer (CRC) or ischaemic disease, or can be present at birth. Owing to a significantly reduced surface area of the intestinal epithelium, malabsorption and malnutrition are major issues. Congenital SBS has a genetic basis linked with the CLMP gene. Patient-derived small intestinal organoids offer a chance to study the genetic susceptibility in greater detail, including the molecular mechanisms involved in impaired intestinal elongation during development that are currently not well understood [42]. Furthermore, the combination of intestinal organoids with tissue-engineering techniques for the lengthening of the small intestine, offer a potential method for the restoration of normal functioning of the bowel irrespective of the cause of SBS.

Coeliac disease is an example of an autoimmune disease mainly affecting the small intestine upon consumption of gluten. The resulting inflammation causes malabsorption, leading to a range of other successive symptoms. Without exclusion of all gluten products from the diet, prolonged inflammation can lead to osteoporosis and cancer. Organoids cultured from patients suffering from coeliac disease can offer insight into genetic predispositions and mechanisms driving the disease forward. Alterations to intestinal barrier integrity, which are known to occur in coeliac patients, can be explored using organoids [43]. Similarly, patient-derived organoids could be used as a drug-screening platform for the identification of novel therapies.

Diverticular disease occurs typically in the sigmoid colon and is the result of physical damage to the intestines leading to loss of function. Diverticula are sacs that form from the herniation of the intestinal epithelium, erupting through the surrounding muscular layer. They are suspected to form due to excessive pressure throughout the large intestine, due, in part, to a low-fibre diet, however, aetiology remains largely unknown. These diverticula can become infected and inflamed, leading to the patient developing fever, pain, nausea and diarrhoea. A genetic element is suspected that predisposes individuals to developing diverticulitis. Therefore, genetic factors involved in the pathogenesis of diverticulitis can be studied using patient tissue-derived organoids from a relatively non-invasive intestinal biopsy. These can then be compared to healthy intestinal tissue to determine genetic and functional differences. Owing to the mechanical nature of the development of diverticular disease, mechanical stress could be applied to the individual organoids to examine the response of the intestinal epithelium under differing levels of stretch stress. However, a tissue-engineering approach is required in combination with organoid technology to model the development of diverticula. Intestinal organoids alone would not be suitable to model diverticula development due to the involvement of the mesenchyme and muscular layer surrounding the intestinal epithelium in vivo.

Cystic fibrosis is perhaps best known for its effect in the lung but also causes complications in other organs, including the pancreas and intestines. The most serious acute complication of the intestine in CF is obstruction of the terminal ileum or proximal large intestine, which if untreated can result in rupture and sepsis. Intestinal organoids are a suitable model of CF due to their expression of CFTR and by using a combination of forskolin-induced swelling and voltage-gate measurements, fluid and ion transport can be accurately measured. This assay has been performed on human intestinal organoids, demonstrating physiologically accurate CFTR function [44]. Drug responsiveness can, therefore, be measured using the current organoid model to identify the most effective treatment for CF or as a diagnostic tool [45].

CRCs are among the most commonly diagnosed cancers in the developed world. There are many contributing factors to development of CRC, but importantly long-term CD or UC significantly increases lifetime risk. Organoids are increasingly being used as models of CRC. Current models of CRC are unable to reproduce the progression of the disease at the early stages and are not representative of the heterogeneous nature of tumours. Genome-editing techniques, such as CRISPR/Cas9, however, can be used as a means to introduce genetic mutations into genes of interest. Following genetic manipulation organoids can then be transplanted into mice, in which the ในร่างกาย mechanisms of tumour progression and invasion can be measured [46].

8. Host–pathogen interactions

Different methods are employed to expose intestinal organoids to bacteria. Microinjection of live bacteria or bacterial proteins is a common approach to study intestinal infections, including ซัลโมเนลลา และ คลอสทริเดียม ดิฟิไซล์ การติดเชื้อ For example, Forbester และคณะ [31] used hIPSCs to generate intestinal organoids that were then microinjected with Salmonella. mRNA sequencing was used to create a global profile of changes in gene expression in response to ซัลโมเนลลา infection [31]. Similarly, Leslie และคณะ [35] used a microinjection methodology to deliver ค. difficile into the lumen of hIPSC-derived intestinal organoids. They then observed that ค. difficile remained in the lumen for a prolonged duration, suggesting that organoids possess suitable conditions for the survival of ค. difficile and hence other obligate anaerobes. Microinjection of ค. difficile toxins has also been shown to exhibit expected effects on epithelial integrity and changes to the expression of certain tight junctions [35].

9. Limitations of organoids

Despite increasing interest in organoid platforms to model intestinal development and disease, organoids used in today's research lack certain elements of the complete organ found ในร่างกาย (ตารางที่ 1). This includes a lack of mesenchymal tissue, immune and neural cells that ในร่างกาย contribute to the overall structure and functioning of the intestines. Organoids currently used in research are comprised mainly of epithelium, including the niche that enables self-renewal of intestinal stem cells.

Table 1. Advantages and disadvantages for the use of intestinal organoids in the study of disease.

Organoids differentiated from induced pluripotent stem cells (IPSCs) into intestinal epithelial structures are known as induced intestinal organoids [47]. The differentiation protocols promoting the generation of such organoids also generates mesenchyme that, when transplanted under the renal capsule of mice, differentiate into smooth muscle and myofibroblasts [24]. These, therefore, are more representative of the intestines ในร่างกาย. However, they require a longer period of time to generate and are still devoid of immune cells which are necessary to address the most common intestinal disease IBD.

Other limitations of intestinal organoid include practical limitations due to the fact that cells must be embedded in Matrigel™ and grown in 3D. This creates additional complications when manipulating cells for simple procedures such as isolating mRNA, DNA and performing immuncytochemistry because organoids will require removal from Matrigel™ prior to processing. 3D culture also creates problems when attempting genetic manipulation via transfection and CRISPR/Cas9 gene editing approaches. Again, cells require removal of Matrigel™ prior to manipulation, which can create suboptimal conditions for organoid maintenance and growth.

It is clear that intestinal organoids can be used as an effective model of host–pathogen interactions that occur within the intestinal tract. However, further study is required to incorporate additional immune elements into the model to give a more complete illustration of inflammatory response. Thus far, microinjection has been used effectively to deliver the bacteria into the lumen of the organoid. However, this is a time-consuming technique. Therefore, other techniques have been trialled as more efficient alternatives. Treating a monolayer, for example, is much quicker to execute, however, this method is less indicative of how the 3D ในร่างกาย intestine would respond due to the lack of 3D architecture and the stem-cell niche. Without this native architecture it cannot be determined how intestinal stem cells would respond to such an infection.

10. Future challenges

Intestinal organoids remain a promising, tunable model for developmental and disease modelling, drug and toxicity testing, and host–pathogen interaction studies. In the future, in conjunction with CRISPR/Cas9 technology intestinal organoids hold great potential for gene therapy and transplantation applications in humans to treat chronic inflammatory disorders, such as CD, UC and CRCs. However, there are many aspects of this technology that still require significant investment to create a model that is more representative of ในร่างกาย tissue and their translational use in humans to become a reality.

Culturing intestinal organoids in 3D creates additional layers of complexity when attempting manipulations involving gene editing, transfection or when studies require access to the apical surface of intestinal epithelium. Previously, processing organoids has required specialized and time-consuming procedures such as the use of micromanipulator and microinjection platforms. More recently, several studies have addressed this problem and have begun developing methodologies to use 2D culture of dissociated intestinal organoids as a platform for high-throughput drug testing, migration assays and host–pathogen interaction studies. By using transwells with permeable membranes, experimentation can be performed with ease of access to both the apical and basolateral sides of the newly formed epithelial membrane [24]. However, this approach also disrupts the stem-cell compartment, meaning that using current culture conditions cells cannot be propagated long term using this 2D culture approach. It is feasible, however, to maintain organoids in 3D while performing manipulations in transient 2D cultures.

Current organoid platforms require the spontaneous self-assembly of epithelial tissue following dissociation and then embedding in Matrigel™. This approach creates organoids of differing shapes and sizes that lack the gross anatomical features of the intestine. Accuracy in developmental and disease modelling will be dramatically enhanced by the use of 3D scaffolds constructed from either decellularization and then recellularization of an อดีตร่างกาย extracellular matrix or a cellularized synthetic scaffold. This approach offers a base on which to culture the cells into the tubular structure with more precise patterning of epithelium and consistent numbers of cells. This technique is potentially tunable, enabling the cell composition to be altered depending on the region of intestinal tract being studied or disease process being modelled. This model, as well as being a closer approximation of the intestine, is likely to be easier to manipulate by providing easier access to apical and basolateral sides of cells. Studies carried out into the development of this model have shown that it can accumulate a mucus layer on the luminal surface, as with organoids, with a thickness of 20 µm [48]. This can, therefore, recapitulate the host–pathogen interactions, occurring ในร่างกาย, that require an intact mucosal layer. So far, these models lack neural and immune cells to form a complete organ and require many months of set-up until the platform is suitable for experimental use. A notable disadvantage to this system is the deterioration in the model after only a few weeks following the seeding of cells to the 3D scaffold, which could be due to nutrient and oxygen starvation of cells, further reinforcing the need for models that recapitulate the complete organ including vascularization. This, therefore, must be overcome before it can be used for longer-term studies, including that of chronic inflammation.

Several studies have demonstrated the potential for direct transplantation of intestinal organoids into mice and rodents [32,49]. Fordham และคณะ successfully transplanted fetal intestinal progenitors, which had not yet been differentiated into intestinal organoids, into a colonic injury mouse model [32]. They found that immature enterospheres have regenerative capacity when transplanted into adult damaged colonic epithelium. Additionally, they demonstrated the ability of these immature cells to mature ในร่างกาย, appropriate for the region of engraftment, expressing Mucin-2-positive goblet cells and lacking markers of small intestine. Whether the same approach could be used to treat human intestinal injury from both acute and chronic IBD is yet to be determined. When combined with decellularization/recellularization techniques, 3D printing and development of synthetic and biodegradable scaffold technologies, stem-cell-derived intestinal tissue or patient-derived intestinal tissue could be used to replace large segments of the small and large intestine.

One of the more significant drawbacks to modelling disease using intestinal organoids is the absence of an immune element that can be used to understand mechanisms driving the autoimmune destruction of the intestinal mucosa that occurs during CD and UC ในร่างกาย. Thus far, intestinal organoids have been able to model the immune response at an innate level, determining the effects of gene expression and cytokine signalling in the development of CD and in host–pathogen interaction studies. CD is known to be triggered by a combination of genetic susceptibility and environmental factors, resulting in dysregulation of immune homeostasis. Studies have shown that human intestinal organoids generated from hIPSCs are a suitable model for studying the interactions between intestinal epithelium and the enteric pathogen เชื้อซัลโมเนลลา ไทฟิมูเรียม to dissect elements of the innate immune response [31]. The model, however, needs to be further developed to include elements of systemic immune regulation including cells such as macrophages, neutrophils, T cells, B lymphocytes, NK cells and dendritic cells. Addition of these cell types will create a more complete model but will be a significant challenge requiring all cell types to be from the same donor.

Intestinal organoids, whether derived from primary tissue biopsy or stem-cell differentiation techniques, have great potential in the future of disease modelling, drug discovery and personalized medicine. They have been shown to have stable phenotype, are relatively simple to create and manipulate while at the same time able to be maintained in long-term culture. However, current organoid derivation and culture techniques do not allow for the assembly of complex multi-cell-type organoids that can model the complete complexity of a multifactoral disease such as IBD. Furthermore, as our need to modify and manipulate organoids and organoid culture conditions advances, the practice of culturing intestinal organoids may pose technical limitations on what is achievable. Developing our understanding of the initiation and development of complex intestinal disease, such as IBD and CRC, will require continued investment and research into the development of more complex intestinal organoid platforms.


เชิงนามธรรม

Oral and intestinal mucositis is a debilitating, often dose limiting side effect of radiation treatment. A mouse model of mucositis, induced by gamma irradiation, leads to weight loss and tissue damage, similar to that observed in patients. This model reflects the human ailment as it responds to keratinocyte growth factor (KGF), the standard of care treatment.
Culturing of intestinal crypt organoids derived from primary cells allowed the development of a 3D assay to monitor the effect of treatments of intestinal epithelium to radiation-induced damage. This in vitro assay closely resembles the mouse model as KGF and Roof Plate-Specific Spondin-1 (RSPO1) enhanced the recovery of crypt organoids following radiation. Screening identified tool compounds that increased the survival of organoids post radiation. Repeated testing of these compounds revealed that the organoids changed their response over time. To investigate this adaptive behavior, intestinal organoid cultures were studied over time. Samples of organoids at various time points were used to prepare mRNA for unbiased transcriptome analyses. This expression profiling revealed a number of genes and pathways that were modulated over time, providing a rationale for the altered sensitivity of the intestinal crypt organoid cultures.
This report describes the development of an in vitro assay that reflects the response of disease to therapeutic treatment. The assay was miniaturized and used to identify bioactive tool compounds, which served as probes to interrogate the patho-physiology of organoids over prolonged culture conditions. In vitro disease models based on primary 3D cell cultures represent valuable tools to identify potential drug targets and bioactive hits.


สังกัด

Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Benjamin E. Mead & Jeffrey M. Karp

Institute for Medical Engineering and Science (IMES), Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Ragon Institute of Massachusetts General Hospital, Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Engineering in Medicine, Department of Medicine, Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Harvard−Massachusetts Institute of Technology Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA


ดูวิดีโอ: บทท7 cytoskeleton (มิถุนายน 2022).