ข้อมูล

เป้าหมายเวกเตอร์ความแตกต่างและเป้าหมายจีโนม

เป้าหมายเวกเตอร์ความแตกต่างและเป้าหมายจีโนม


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ในแผ่นข้อมูล Pfu turbo DNA Polymerase AD (และอาจมีในอื่นๆ อีกมาก) เป้าหมายการขยายสัญญาณที่แตกต่างกันจะแบ่งออกเป็นเป้าหมาย DNA ของ Genomic, เป้าหมาย Vector DNA และ cDNA อะไรคือความแตกต่างระหว่างสองตัวแรก?


จีโนม DNA เป็น DNA ที่มีข้อมูลทางพันธุกรรมทั้งชุดของสิ่งมีชีวิต คุณมักจะสกัดมันด้วยชุดสกัด DNA ทั้งหมด

Vector DNA เป็นเวกเตอร์ (โดยปกติคือพลาสมิด มันสามารถเป็นโครโมโซมเทียมได้… ประเภทของเวกเตอร์ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์และกลยุทธ์ที่คุณใช้) ที่คุณต้องการสตริงของ DNA ที่คุณต้องการ (เช่น ยีนที่คุณต้องการแทรก เข้าไปในสิ่งมีชีวิต) และคุณกำลังใช้มันเพื่อรับ DNA รีคอมบิแนนท์ของคุณไปยังสิ่งมีชีวิต

ฉันหวังว่ามันจะช่วยได้!


การบำบัดด้วยยีน: การบำบัดด้วยยีน Ex-Vivo และ In-Vivo (พร้อมแผนภาพ)

สิ่งนี้เกี่ยวข้องกับการถ่ายโอนยีนในเซลล์ที่เพาะเลี้ยง (เช่น เซลล์ไขกระดูก) ซึ่งจากนั้นก็นำกลับมาใช้ใหม่สู่ผู้ป่วย

ครั้งที่สอง การบำบัดด้วยยีนในร่างกาย:

การส่งยีนโดยตรงไปยังเซลล์ของเนื้อเยื่อเฉพาะเรียกว่าการบำบัดด้วยยีนในร่างกาย

พิมพ์ # I. Ex Vivo Gene Therapy:

การบำบัดด้วยยีน ex vivo สามารถใช้กับเนื้อเยื่อที่เลือกเท่านั้น (เช่น ไขกระดูก) ซึ่งสามารถเพาะเลี้ยงเซลล์ในห้องปฏิบัติการได้ เทคนิคการบำบัดด้วยยีน ex vivo มีขั้นตอนดังต่อไปนี้ (รูปที่ 13.2)

1. แยกเซลล์ที่มีความบกพร่องทางพันธุกรรมออกจากผู้ป่วย

2. ปลูกเซลล์ในการเพาะเลี้ยง

3. แนะนำยีนบำบัดเพื่อแก้ไขข้อบกพร่องของยีน

4. เลือกเซลล์ดัดแปลงพันธุกรรม (ทรานส์ฟอร์มเสถียร) และเติบโต

5. ย้ายเซลล์ที่ดัดแปลงไปยังผู้ป่วย

ขั้นตอนโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับการใช้เซลล์ของผู้ป่วยเองเพื่อการเพาะเลี้ยงและการแก้ไขทางพันธุกรรม จากนั้นจึงกลับไปหาผู้ป่วย เทคนิคนี้จึงไม่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ไม่พึงประสงค์หลังจากย้ายเซลล์ การบำบัดด้วยยีน Ex vivo จะมีประสิทธิภาพก็ต่อเมื่อยีนบำบัด (ยีนบำบัด) ถูกรวมเข้าไว้อย่างเสถียรและแสดงออกอย่างต่อเนื่อง สามารถทำได้โดยการใช้เวกเตอร์

เวกเตอร์ในยีนบำบัด:

อนุภาคพาหะหรือโมเลกุลที่ใช้ในการส่งยีนไปยังเซลล์โซมาติกเรียกว่าพาหะ เวกเตอร์ที่สำคัญที่ใช้ในการบำบัดด้วยยีน ex vivo แสดงไว้ด้านล่างและอธิบายโดยย่อต่อไป

ii. โครโมโซมเทียมของมนุษย์

พาหะที่ใช้บ่อยในการบำบัดด้วยยีนคือไวรัส โดยเฉพาะไวรัสย้อนยุค RNA เป็นสารพันธุกรรมใน retroviruses เมื่อรีโทรไวรัสเข้าสู่เซลล์โฮสต์ มันจะสังเคราะห์ DNA จาก RNA (โดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับ) DNA ของไวรัสที่ก่อตัวขึ้น (เรียกว่าโปรไวรัส) จะถูกรวมเข้ากับ DNA ของเซลล์เจ้าบ้าน

โดยปกติแล้วโปรไวรัสจะไม่เป็นอันตราย อย่างไรก็ตาม มีความเสี่ยงอย่างมาก เนื่องจากไวรัส retrovirus บางตัวสามารถเปลี่ยนเซลล์ปกติให้เป็นเซลล์มะเร็งได้ ดังนั้นจึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องแน่ใจว่าสิ่งนี้จะไม่เกิดขึ้น

ทำให้ retroviruses ไม่เป็นอันตราย:

นักวิจัยใช้วิธีทางชีวเคมีบางอย่างในการแปลงไวรัส retrovirus ที่เป็นอันตรายให้กลายเป็นไวรัสที่ไม่เป็นอันตราย ก่อนที่จะใช้เป็นพาหะ ตัวอย่างเช่น การนำยีนที่เข้ารหัสสำหรับซองจดหมายของไวรัสออกนอกลู่นอกทาง ไวรัสเรโทรไวรัสสามารถทำให้พิการและไม่เป็นอันตรายได้ เนื่องจากไม่มีซองจดหมาย retrovirus จะไม่สามารถเข้าสู่เซลล์โฮสต์ได้ การผลิตอนุภาคไวรัสจำนวนมาก (พันล้าน) สามารถทำได้โดยเริ่มจาก retrovirus ที่บกพร่องในซองเดียว (รูปที่ 13.3)

สิ่งนี้เกิดขึ้นได้โดยใช้ไวรัสตัวช่วยซึ่งมียีนปกติสำหรับการสร้างซองจดหมาย นอกจากไวรัสตัวช่วยแล้ว เวกเตอร์ (ที่มียีนซองจดหมายที่บกพร่อง) สามารถเข้าไปในเซลล์โฮสต์และทั้งคู่ก็ทวีคูณขึ้น ด้วยการคูณซ้ำในเซลล์เจ้าบ้าน ไวรัสเวกเตอร์และตัวช่วยจำนวนหลายพันล้านตัวถูกสร้างขึ้น

ไวรัสเวกเตอร์สามารถแยกออกจากไวรัสตัวช่วยและทำให้บริสุทธิ์ได้ การแยกไวรัสเวกเตอร์โดยปราศจากไวรัสตัวช่วยเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่ง การปนเปื้อนของไวรัสตัวช่วยเป็นภัยคุกคามใหญ่ต่อสุขภาพของผู้ป่วยที่ได้รับการบำบัดด้วยยีน

Retroviruses ในยีนบำบัด:

แผนที่ทางพันธุกรรมของไวรัส retrovirus ทั่วไปแสดงไว้ในรูปที่ 13.4A โดยทั่วไป อนุภาค retrovirus มี RNA เป็นจีโนมที่จัดเป็นหกภูมิภาค มีเทอร์มินอลรีพีทยาว 5′ (5′-LTR) ซึ่งเป็นลำดับที่ไม่มีการเข้ารหัสที่จำเป็นสำหรับ RNA บรรจุภัณฑ์ที่กำหนดเป็น psi (Ψ) ยีนปิดปากที่เข้ารหัสโปรตีนโครงสร้าง โพลของยีนที่กำหนดรหัสสำหรับทรานสคริปเทสแบบย้อนกลับ ยีน env เข้ารหัสสำหรับโปรตีนซองจดหมายและลำดับ 3-LTR

สำหรับการใช้ retrovirus เป็นเวกเตอร์ ยีนโครงสร้าง gag และ pol จะถูกลบออก ยีนเหล่านี้อยู่ติดกับบริเวณ Ψ จริงๆ นอกจากนี้ ยีนโปรโมเตอร์ยังรวมอยู่ด้วย (รูปที่ 13.4B) การออกแบบเวกเตอร์นี้ช่วยให้สามารถสังเคราะห์ยีนโคลนได้ รีโทรไวรัสเวคเตอร์สามารถขนส่ง DNA ที่ใช้รักษาโรคได้ขนาดสูงสุด 8 kb

DNA vector ของ retroviral สามารถใช้ในการเปลี่ยนเซลล์ได้ อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพของการนำส่งและการรวม DNA ในการรักษานั้นต่ำมาก ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา เทคนิคต่างๆ ได้รับการพัฒนาเพื่อส่งเวกเตอร์ RNA ไปยังเซลล์เจ้าบ้านด้วยความถี่สูง เพื่อจุดประสงค์นี้จะใช้อนุภาค retroviral RNA ที่บรรจุหีบห่อ เทคนิคนี้ช่วยให้สามารถรวม DNA ทางเภสัชกรรมเข้ากับจีโนมของโฮสต์ได้อย่างมีประสิทธิภาพสูง

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีการพัฒนาเวกเตอร์ไวรัสดัดแปลงหลายตัวสำหรับการบำบัดด้วยยีน สิ่งเหล่านี้รวมถึง oncoretrovirus, adenovirus, adenoassociated virus, ไวรัสเริมและเวกเตอร์ไฮบริดจำนวนหนึ่งที่รวมลักษณะที่ดีของพาหะนำโรค

ไวรัสมะเร็งเม็ดเลือดขาวในหนูในยีนบำบัด:

นี่คือไวรัส retrovirus ที่ทำให้เกิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดหนึ่งในหนู มันสามารถทำปฏิกิริยากับเซลล์ของมนุษย์และเซลล์ของหนูเมาส์ได้ เนื่องจากมีความคล้ายคลึงกันในโปรตีนของตัวรับที่พื้นผิว ไวรัสมะเร็งเม็ดเลือดขาวของหนู (MLV) มักใช้ในการถ่ายโอนยีน

ไวรัสเอดส์ในยีนบำบัด?

ขอแนะนำว่าไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ (HIV) สามารถใช้เป็นพาหะนำโรคในการถ่ายโอนยีนได้ แต่สิ่งนี้จะต้องสร้างความโกลาหลในที่สาธารณะ คนงานบางคนประสบความสำเร็จในการสร้างเอชไอวีที่ไม่เป็นอันตราย (เอชไอวีพิการ) โดยการกำจัดยีนทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับการสืบพันธุ์ ในเวลาเดียวกัน ยีนที่จำเป็นสำหรับการถ่ายโอนยีนจะยังคงอยู่ เอชไอวีมีข้อได้เปรียบที่ชัดเจนเมื่อเทียบกับเชื้อเอ็มแอลวี MLV สามารถนำการถ่ายโอนยีนออกมาได้เฉพาะในเซลล์ที่แบ่งตัวเท่านั้น เอชไอวีสามารถแพร่เชื้อได้แม้กระทั่งเซลล์ที่ไม่แบ่งตัว (เช่น เซลล์สมอง) และทำหน้าที่ถ่ายทอดยีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม เป็นที่น่าสงสัยว่าเอชไอวีสามารถใช้เป็นพาหะได้หรือไม่

ii. โครโมโซมประดิษฐ์ของมนุษย์:

รายละเอียดของโครโมโซมเทียมของมนุษย์ (HAC) มีการอธิบายไว้ที่อื่น HAC เป็นโครโมโซมสังเคราะห์ที่สามารถทำซ้ำกับโครโมโซมอื่น ๆ นอกเหนือจากการเข้ารหัสโปรตีนของมนุษย์ ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น การใช้ retroviruses เป็นพาหะในการบำบัดด้วยยีนมีความเสี่ยงสูง ปัญหานี้สามารถแก้ไขได้หากใช้ HAC ประสบความสำเร็จบางอย่างในทิศทางนี้

สาม. เซลล์ไขกระดูก:

ไขกระดูกประกอบด้วยเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน (ES) totipotent เซลล์เหล่านี้สามารถแบ่งและแยกความแตกต่างออกเป็นเซลล์ประเภทต่างๆ (เช่น เซลล์เม็ดเลือดแดง, เกล็ดเลือด, มาโครฟาจ, เซลล์สร้างกระดูก, B- และ T-ลิมโฟไซต์) ด้วยเหตุนี้ การปลูกถ่ายไขกระดูกจึงเป็นเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดสำหรับโรคทางพันธุกรรมหลายชนิด

และมีเหตุผลทุกประการที่เชื่อได้ว่าความผิดปกติทางพันธุกรรมที่ตอบสนองต่อการปลูกถ่ายไขกระดูกมีแนวโน้มที่จะตอบสนองต่อการบำบัดด้วยยีน ex vivo ด้วย (ตารางที่ 13.2) ตัวอย่างเช่น หากมีการกลายพันธุ์ของยีนที่ขัดขวางการทำงานของเม็ดเลือดแดง (เช่น โรคโลหิตจางชนิดเคียว) การปลูกถ่ายไขกระดูกจะเสร็จสิ้น เซลล์ไขกระดูกเป็นตัวเลือกที่มีศักยภาพสำหรับการบำบัดด้วยยีนของโรคโลหิตจางชนิดเคียว อย่างไรก็ตาม สิ่งนี้ไม่ง่ายอย่างที่ระบุไว้ในทฤษฎี

ตัวอย่างที่เลือกของ การบำบัดด้วยยีน Ex Vivo:

การบำบัดสำหรับภาวะขาดอะดีโนซีนดีอะมิเนส:

การบำบัดด้วยยีนของมนุษย์ครั้งแรกและได้รับการเผยแพร่มากที่สุดได้ดำเนินการเพื่อแก้ไขการขาดเอนไซม์อะดีโนซีนดีอะมิเนส (ADA) ดำเนินการเมื่อวันที่ 14 กันยายน พ.ศ. 2533 โดยทีมงานที่นำโดยเบลสและแอนเดอร์สันจากสถาบันสุขภาพแห่งชาติสหรัฐอเมริกา (เด็กหญิงคนนี้ชื่อ Ashanti อายุ 4 ขวบ)

ภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องแบบรวมอย่างรุนแรง (SCID):

นี่เป็นความผิดปกติของภูมิคุ้มกันที่สืบทอดมาซึ่งพบได้ยากที่เกี่ยวข้องกับ T-lymphocytes และ (ในระดับที่น้อยกว่า) ความผิดปกติของ B-lymphocytes ผู้ป่วย SCID ประมาณ 50% มีข้อบกพร่องในยีน (อยู่บนโครโมโซม 20 และมีคู่เบส 32,000 คู่และเอ็กซอน 12 คู่) ที่เข้ารหัสสำหรับอะดีโนซีน ดีอะมิเนส ในการขาดสาร ADA ดีออกซีอะดีโนซีนและสารเมตาโบไลต์ของมัน (โดยหลักคือดีออกซีอะดีโนซีน 5′-ไตรฟอสเฟต) จะสะสมและทำลายที-ลิมโฟไซต์

T-Lymphocytes มีความจำเป็นต่อภูมิคุ้มกันของร่างกาย นอกจากการมีส่วนร่วมโดยตรงในการป้องกันของร่างกายแล้ว ยังส่งเสริมการทำงานของ B-lymphocytes เพื่อผลิตแอนติบอดีอีกด้วย ดังนั้นผู้ป่วย SCID (ขาด ADA) ต้องทนทุกข์ทรมานจากโรคติดเชื้อและเสียชีวิตตั้งแต่อายุยังน้อย ก่อนหน้านี้ เด็กที่ทุกข์ทรมานจาก SCID ได้รับการรักษาด้วย conjugated bovine ADA หรือโดยการปลูกถ่ายไขกระดูก

เทคนิคการบำบัดสำหรับการขาด ADA:

รูปแบบทั่วไปของการบำบัดด้วยยีนที่นำมาใช้สำหรับการแนะนำยีนที่มีข้อบกพร่องในผู้ป่วยได้รับการอธิบายไว้ในรูปที่ 13.2 ขั้นตอนเดียวกันกับการดัดแปลงที่เหมาะสมยังสามารถนำไปใช้กับการบำบัดด้วยยีนอื่นๆ

พลาสมิดเวคเตอร์ที่มี DNA โปรไวรัสถูกเลือก ส่วนหนึ่งของ DNA ที่เป็นโปรไวรัสถูกแทนที่ด้วยยีน ADA และยีน (G 418) ซึ่งเข้ารหัสสำหรับการดื้อยาปฏิชีวนะ จากนั้นจึงทำการโคลน ยีนต้านทานยาปฏิชีวนะจะช่วยในการเลือกโคลนที่ต้องการด้วยยีน ADA

แผนภาพแสดงการรักษาผู้ป่วยที่ขาด ADP แสดงไว้ในรูปที่ 13.5

เซลล์ลิมโฟไซต์ที่ไหลเวียนจะถูกลบออกจากผู้ป่วยที่เป็นโรคขาด ADA เซลล์เหล่านี้ถูกถ่ายด้วยยีน ADA โดยเผยให้เห็น retroviruses หลายพันล้านตัวที่มียีนดังกล่าว เซลล์ลิมโฟไซต์ที่ดัดแปลงพันธุกรรมนั้นเติบโตในวัฒนธรรมเพื่อยืนยันการแสดงออกของยีน ADA และกลับสู่ผู้ป่วย ลิมโฟไซต์เหล่านี้ยังคงอยู่ในการไหลเวียนและสังเคราะห์ ADA

ส่งผลให้ความสามารถในการผลิตแอนติบอดีของผู้ป่วยเพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม มีข้อจำกัด ลิมโฟไซต์มีช่วงชีวิตที่สั้น (เพียงแค่มีชีวิตอยู่ได้ไม่กี่เดือน) ดังนั้นจึงต้องทำการถ่ายเลือดบ่อยๆ

การถ่ายโอนยีน ADA ไปเป็นสเต็มเซลล์:

ในปี 1995 ยีน ADA ถูกถ่ายโอนไปยังเซลล์ต้นกำเนิด ซึ่งได้จากเลือดจากสายสะดือ ณ เวลาที่ทารกคลอด สี่วันหลังคลอด ทารกได้รับเซลล์ที่ดัดแปลงกลับมา ด้วยวิธีนี้ ประชากรถาวรของเซลล์ที่ผลิตยีน ADA ได้ถูกสร้างขึ้น

การบำบัดสำหรับไขมันในเลือดสูงในครอบครัว:

ผู้ป่วยโรคไขมันในเลือดสูงในครอบครัวขาดตัวรับไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำ (LDL) ในเซลล์ตับ ส่งผลให้คอเลสเตอรอล LDL ไม่ถูกเผาผลาญในตับ LDL- คอเลสเตอรอลที่สะสมสร้างขึ้นในการไหลเวียน นำไปสู่การอุดตันของหลอดเลือดแดงและโรคหัวใจ

นักบำบัดด้วยยีนกำลังพยายามช่วยเหลือผู้ที่ตกเป็นเหยื่อของภาวะไขมันในเลือดสูงในครอบครัว อันที่จริงยังมีความสำเร็จอยู่บ้าง ในผู้หญิงคนหนึ่ง ตับ 15% ถูกกำจัดออกไป เซลล์ตับถูกแปลงสัญญาณด้วยรีโทรไวรัสซึ่งมียีนสำหรับตัวรับ LDL เซลล์ตับดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้ถูกฉีดเข้าไปในตับของผู้ป่วย

เซลล์ตับสร้างตัวเองในตับและผลิตตัวรับ LDL ที่ทำงานได้ การปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในสภาพของผู้ป่วย ตามที่ประเมินโดยการประมาณค่าพารามิเตอร์ไขมันในเลือด นอกจากนี้ ไม่มีแอนติบอดีที่ผลิตขึ้นเพื่อต่อต้านโมเลกุลตัวรับ LDL ซึ่งแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าเซลล์ตับดัดแปลงพันธุกรรมได้รับการยอมรับ

การบำบัดสำหรับกลุ่มอาการ Lesch-Nyhan:

โรค Lesch-Nyhan เป็นข้อผิดพลาดโดยกำเนิดในการเผาผลาญ purine เนื่องจากข้อบกพร่องในยีนที่เข้ารหัสสำหรับเอนไซม์ hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HCPRT) ในกรณีที่ไม่มี HGPRT เมแทบอลิซึมของ purine จะถูกรบกวนและระดับกรดยูริกจะเพิ่มขึ้น ส่งผลให้เกิดโรคเกาต์และไตถูกทำลายอย่างรุนแรง ผู้ที่ตกเป็นเหยื่อของโรค Lesch- Nyhan แสดงอาการปัญญาอ่อนนอกเหนือจากการกระตุ้นให้กัดริมฝีปากและนิ้วทำให้เกิดการทำร้ายตัวเอง

ด้วยการใช้ระบบ retroviral vector ยีนที่ผลิต HGPRT ถูกแทรกเข้าไปในเซลล์ไขกระดูกของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงได้สำเร็จ ปัญหาสำคัญของมนุษย์คือการมีส่วนร่วมของสมอง การทดลองที่ดำเนินการในสัตว์เป็นกำลังใจ อย่างไรก็ตาม เป็นที่น่าสงสัยว่าจะประสบความสำเร็จด้วยยีนบำบัดสำหรับกลุ่มอาการ Lesch-Nyhan ในมนุษย์หรือไม่ในอนาคตอันใกล้นี้

การบำบัดโรคฮีโมฟีเลีย:

ฮีโมฟีเลียเป็นโรคทางพันธุกรรมเนื่องจากขาดยีนที่เข้ารหัสปัจจัยการแข็งตัวของเลือดทรงเครื่อง เป็นลักษณะเลือดออกมากเกินไป โดยใช้ระบบ retroviral vector ยีนสำหรับการสังเคราะห์ปัจจัย IX ถูกแทรกเข้าไปในเซลล์ตับของสุนัข สุนัขเหล่านี้ไม่แสดงอาการของโรคฮีโมฟีเลียอีกต่อไป

การบำบัดด้วยยีน Ex Vivo ด้วยเซลล์ที่ไม่เป็นตัวเอง:

การบำบัดด้วยยีน ex vivo ที่อธิบายข้างต้นมีพื้นฐานอยู่บนการปลูกถ่ายเซลล์ดัดแปลงพันธุกรรมเพื่อการผลิตโปรตีนที่ต้องการ อย่างไรก็ตาม มีข้อจำกัดหลายประการในการใช้เซลล์ของผู้ป่วยเอง (เซลล์ autologous) สำหรับการบำบัดด้วยยีน ซึ่งรวมถึงการขาดเซลล์ที่เพียงพอจากเนื้อเยื่อเป้าหมาย การดูดซึมยีนที่บกพร่อง และการแสดงออกที่ไม่เพียงพอของพวกมัน เพื่อแก้ปัญหาเหล่านี้ จึงมีความพยายามในการพัฒนาวิธีการใช้เซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์ต้นกำเนิด (เช่น เซลล์จากบุคคลหรือสัตว์อื่นๆ) โครงร่างของขั้นตอนอธิบายสั้น ๆ ด้านล่าง

เลือกเซลล์เฉพาะเนื้อเยื่อที่สามารถเติบโตในวัฒนธรรมได้ ซึ่งรวมถึงไฟโบรบลาสต์จากผิวหนัง เซลล์ตับจากตับ และไมโอบลาสต์จากกล้ามเนื้อและแอสโตรไซต์จากสมอง เซลล์เหล่านี้ได้รับการเพาะเลี้ยงและดัดแปลงพันธุกรรมด้วยยีนบำบัด จากนั้น พวกมันถูกห่อหุ้มในเยื่อเทียมที่ประกอบด้วยโพลีเมอร์สังเคราะห์ (เช่น พอลิอีเทอร์ ซัลโทน, แอลจิเนส-โพลี L-ไลซีน-แอลจิเนต)

เยื่อโพลีเมอร์ไม่ก่อให้เกิดภูมิคุ้มกัน ดังนั้น ผู้ป่วยจึงสามารถยอมรับเซลล์ที่ห่อหุ้มที่ไม่เป็นเอกเทศได้ นอกจากนี้ เยื่อเหล่านี้สามารถซึมผ่านได้ในธรรมชาติ โดยยอมให้สารอาหารเข้าไป และโปรตีนที่เข้ารหัส (โดยยีนสำหรับการรักษา) จะผ่านไป

การทดลองที่ดำเนินการในสัตว์ได้แสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่น่าพึงพอใจสำหรับการใช้เซลล์ที่ไม่เป็นเอกเทศในการบำบัดด้วยยีน พบว่าเซลล์ที่ถูกห่อหุ้มขยายพันธุ์และผลิตโปรตีนที่ต้องการ อย่างไรก็ตาม ความสำเร็จนั้นจำกัดมากในการทดลองในมนุษย์

ประเภท #II. ในการบำบัดด้วยยีน Vivo:

การนำส่งยีนบำบัด (DNA) โดยตรงไปยังเซลล์เป้าหมายของเนื้อเยื่อเฉพาะของผู้ป่วยถือเป็นการบำบัดด้วยยีนในร่างกาย (รูปที่ 13.6) เนื้อเยื่อจำนวนมากเป็นตัวเลือกที่เป็นไปได้สำหรับแนวทางนี้ ได้แก่ ตับ กล้ามเนื้อ ผิวหนัง ม้าม ปอด สมอง และเซลล์เม็ดเลือด การนำส่งยีนสามารถทำได้โดยระบบเวกเตอร์ไวรัสหรือที่ไม่ใช่ไวรัส ความสำเร็จของการบำบัดด้วยยีนในร่างกายส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับพารามิเตอร์ต่อไปนี้

ผม. ประสิทธิภาพของการดูดซึมยีนบำบัด (บำบัด) โดยเซลล์เป้าหมาย

ii. การเสื่อมสภาพภายในเซลล์ของยีนและการดูดซึมโดยนิวเคลียส

สาม. ความสามารถในการแสดงออกของยีน

มีการอธิบายการบำบัดด้วยยีนในร่างกายที่มีการอ้างอิงพิเศษถึงระบบนำส่งยีน (แบบไวรัส ไม่ใช่ไวรัส) พร้อมตัวอย่างที่เหมาะสม

การส่งยีนโดยไวรัส:

ระบบเวกเตอร์ไวรัสจำนวนมากได้รับการพัฒนาสำหรับการส่งยีน ซึ่งรวมถึงไวรัส retroviruses, adenoviruses, adenoassociated virus และไวรัสเริม

ระบบเวกเตอร์ Retrovirus:

การจำลองแบบ retrovirus vector ที่มีข้อบกพร่องซึ่งไม่เป็นอันตรายกำลังถูกใช้อยู่ พลาสมิดร่วมกับรีโทรไวรัส ยีนบำบัด และโปรโมเตอร์เรียกว่าพลาสโมไวรัส พลาสโมไวรัสสามารถขนส่ง DNA (ยีนบำบัด) ที่มีขนาดน้อยกว่า 3.4 kb สามารถสร้างอนุภาคไวรัสที่มีข้อบกพร่องในการจำลองแบบได้จากพลาสโมไวรัส

ดังนั้น สำหรับการส่งยีนโดยรีโทรไวรัสเวคเตอร์ เซลล์เป้าหมายต้องอยู่ในระยะแบ่งตัว แต่เซลล์ในร่างกายส่วนใหญ่จะนิ่ง ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ไวรัสเวคเตอร์ได้รับการออกแบบมาเพื่อแพร่ระบาดในเซลล์ที่ไม่แบ่งตัว นอกจากนี้ ยังมีความพยายามในการรวม DNA ไว้ในรีโทรไวรัสเวคเตอร์ (โดยวิศวกรรม env ยีน) ที่เข้ารหัสสำหรับโปรตีนตัวรับเซลล์ หากทำได้สำเร็จ เรโทรไวรัสเวคเตอร์จะแพร่เชื้อไปยังเนื้อเยื่อเป้าหมายโดยเฉพาะ

ระบบเวกเตอร์ Adenoviral:

Adenoviruses (ที่มีจีโนม DNA) ถือเป็นพาหะที่ดีสำหรับการนำส่งยีน เนื่องจากสามารถแพร่เชื้อไปยังเซลล์ของมนุษย์ที่ไม่แบ่งแยกได้เกือบทั้งหมด adenovirus ไข้หวัดธรรมดาเป็นพาหะที่ใช้บ่อย เนื่องจากเซลล์เป้าหมายติดไวรัส recombinant adenovirus ยีนบำบัด (DNA) จะเข้าสู่นิวเคลียสและแสดงออก

อย่างไรก็ตาม DNA นี้ไม่ได้รวมเข้ากับจีโนมของโฮสต์ ดังนั้น การบำบัดด้วยยีนโดยอาศัยอะดีโนไวรัสจึงจำเป็นต้องให้ยารีคอมบิแนนท์ไวรัสเป็นระยะ ประสิทธิภาพของการส่งยีนโดย adenoviruses สามารถปรับปรุงได้โดยการพัฒนาไวรัสที่สามารถแพร่เชื้อไปยังเซลล์เป้าหมายได้โดยเฉพาะ สิ่งนี้เป็นไปได้โดยการผสมผสาน DNA ที่เข้ารหัสโปรตีนตัวรับเซลล์

ระบบเวกเตอร์ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ Adeno:

ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ Adeno เป็นไวรัสของมนุษย์ที่สามารถรวมเข้ากับโครโมโซม 19 ได้ เป็นไวรัส DNA ขนาดเล็กที่ไม่ก่อให้เกิดโรคแบบสายเดี่ยว (4.7 kb) เมื่อไวรัสที่เกี่ยวข้องกับอะดีโนเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน ดีเอ็นเอจะกลายเป็นสายคู่ ถูกรวมเข้ากับโครโมโซมและแสดงออก

ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ Adeno สามารถทำหน้าที่เป็นพาหะที่ดีสำหรับการส่งมอบยีนบำบัด ไวรัสลูกผสมถูกสร้างขึ้นโดยใช้พลาสมิดสองตัวและอะดีโนไวรัส (เช่น ไวรัสตัวช่วย) โดยใช้เทคนิคพิเศษ มีความพยายามในการใช้ยีนบำบัดรักษาโรคในมนุษย์ เช่น ฮีโมฟีเลีย (สำหรับการผลิตปัจจัยการแข็งตัวของเลือด IX) และซิสติก ไฟโบรซิส (สำหรับการสังเคราะห์โปรตีนควบคุมเมมเบรนของซิสติก ไฟโบรซิส) โดยใช้ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับอะดีโน

การบำบัดโรคซิสติกไฟโบรซิส:

Cystic fibrosis (CF) เป็นหนึ่งในโรคทางพันธุกรรมที่พบบ่อยที่สุด (ความถี่ 1: 2,500) และร้ายแรง เป็นลักษณะการสะสมของเมือกเหนียวเหนอะหนะที่ขาดน้ำในทางเดินหายใจและปอด ผู้ป่วยโรคหลอดเลือดหัวใจตีบมีความเสี่ยงสูงต่อการติดเชื้อแบคทีเรียในปอด และส่วนใหญ่เสียชีวิตก่อนอายุ 30 ปี Cystic fibrosis สามารถติดตามได้ในนิทานพื้นบ้านของยุโรปซึ่งเคยกล่าวไว้ว่า “วิบัติแก่เด็กคนนั้นที่จูบที่หน้าผากมีรสเค็ม เขาถูกแม่มดและต้องตายในไม่ช้า”

ในคนปกติ คลอไรด์ไอออนของเซลล์จะถูกผลักออกผ่านการมีส่วนร่วมของโปรตีนที่เรียกว่าซีสติก ไฟโบรซิส ทรานส์เมมเบรนเรกูเลเตอร์ (CFTR) ในผู้ป่วยโรคซิสติก ไฟโบรซิส โปรตีน CFTR จะไม่ถูกผลิตขึ้นเนื่องจากความบกพร่องของยีน ดังนั้นคลอไรด์ไอออนจึงเข้มข้นภายในเซลล์ที่ดึงน้ำจากสภาพแวดล้อม เป็นผลให้ระบบทางเดินหายใจและปอดขาดน้ำด้วยเมือกที่ไม่สบายซึ่งเป็นสภาพแวดล้อมที่เหมาะสำหรับการติดเชื้อแบคทีเรีย

เมื่อมีการระบุยีนที่บกพร่องสำหรับโรคซิสติกไฟโบรซิสในปี 1989 นักวิจัยจึงเริ่มทำงานเกี่ยวกับยีนบำบัดสำหรับโรคนี้ทันที มีการใช้ระบบเวกเตอร์ Adenoviral แม้ว่าความสำเร็จจะถูกจำกัด ข้อเสียเปรียบที่สำคัญคือผลประโยชน์มีอายุสั้น เนื่องจาก adenoviruses ไม่ได้รวมตัวเองเข้ากับเซลล์โฮสต์การใช้ recombinant adenovirus หลายครั้งทำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ทำลายเซลล์

โดยการใช้ระบบเวกเตอร์ไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ adeno รายงานผลการกระตุ้นบางอย่างได้รับการรายงานในการบำบัดด้วยยีนของ CF ในการทดลองทางคลินิกระยะที่ 1 กับผู้ป่วยโรค CF เวกเตอร์ยังคงมีอยู่ประมาณ 70 วัน และพบการปรับปรุงบางอย่างในผู้ป่วย นักวิจัยบางคนพยายามแทรกยีน CF เข้าไปในเซลล์ของทารกในครรภ์ที่กำลังพัฒนา (ในสัตว์ทดลอง เช่น หนู) เพื่อผลิตโปรตีน CFTR แต่ความก้าวหน้าครั้งสำคัญยังมาไม่ถึง

ระบบเวกเตอร์ไวรัสเริม:

รีโทรไวรัสและอะดีโนไวรัสที่ใช้ในการบำบัดด้วยยีนในร่างกาย ได้รับการออกแบบมาเพื่อแพร่เชื้อไปยังเซลล์เป้าหมายที่เฉพาะเจาะจง มีไวรัสบางชนิดที่มีแนวโน้มตามธรรมชาติที่จะแพร่เชื้อในเซลล์บางประเภท ตัวอย่างที่ดีที่สุดคือไวรัสเริม (HSV) ชนิดที่ 1 ซึ่งติดเชื้อและยังคงอยู่ในเซลล์ประสาทที่ไม่แบ่งตัว HSV เป็นเชื้อก่อโรคในมนุษย์ที่ทำให้เกิดโรค (แต่ไม่ค่อย) เป็นแผลเย็นและโรคไข้สมองอักเสบ

โรคเหล่านี้เป็นโรคจำนวนมาก (เมแทบอลิซึม, ความเสื่อมของระบบประสาท, ภูมิคุ้มกัน, เนื้องอก) ที่เกี่ยวข้องกับระบบประสาท HSV ถือเป็นพาหะนำโรคในอุดมคติสำหรับการบำบัดด้วยยีนในร่างกายของความผิดปกติทางประสาทหลายอย่าง

HSV มี DNA แบบสองสายที่มีความยาวประมาณ 152 kb เป็นจีโนมของมัน จีโนม HSV ประมาณ 30 kb สามารถแทนที่ด้วย DNA ที่ลอกแบบมาโดยไม่สูญเสียลักษณะพื้นฐาน (การจำลองแบบ การติดเชื้อ บรรจุภัณฑ์ ฯลฯ) แต่มีปัญหาทางเทคนิคบางอย่างในการจัดการกับ DNA ขนาดใหญ่ในการทดลองทางพันธุวิศวกรรม ได้มีการพัฒนาเวกเตอร์ HSV ที่ดัดแปลงด้วยขนาดจีโนมที่ลดลง

งานส่วนใหญ่เกี่ยวกับการบำบัดด้วยยีนที่เกี่ยวข้องกับการใช้ HSV เป็นพาหะกำลังดำเนินการในสัตว์ทดลอง และผลลัพธ์ก็ค่อนข้างน่ายินดี เวกเตอร์ HSV สามารถส่งยีนบำบัดไปยังสมองและส่วนอื่น ๆ ของระบบประสาท ยีนเหล่านี้แสดงออกและบำรุงรักษาอย่างดีเป็นเวลานาน อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมก่อนที่จะทำการทดลองในมนุษย์ หากประสบความสำเร็จ HSV อาจช่วยรักษาโรคเกี่ยวกับระบบประสาทหลายอย่าง เช่น โรคพาร์กินสันและโรคอัลไซเมอร์โดยการบำบัดด้วยยีน

การส่งมอบยีนโดยระบบที่ไม่ใช่ไวรัส:

มีข้อจำกัดบางประการในการใช้ไวรัสเวคเตอร์ในการบำบัดด้วยยีน นอกจากค่าใช้จ่ายในการดูแลรักษาไวรัสแล้ว โปรตีนจากไวรัสยังกระตุ้นให้เกิดการอักเสบในโฮสต์อีกด้วย ดังนั้นจึงมีการค้นหาอย่างต่อเนื่องโดยนักวิจัยเพื่อค้นหาทางเลือกอื่นแทนระบบเวกเตอร์ไวรัส

โครงสร้าง DNA บริสุทธิ์:

การแนะนำโดยตรงของโครงสร้าง DNA บริสุทธิ์ในเนื้อเยื่อเป้าหมายนั้นค่อนข้างง่าย อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพของการดูดซึม DNA โดยเซลล์และการแสดงออกของมันค่อนข้างต่ำ จึงต้องฉีด DNA ในปริมาณมากเป็นระยะ ยีนบำบัดสร้างโปรตีนในเซลล์เป้าหมายซึ่งเข้าสู่การไหลเวียนและมักจะเสื่อมโทรม

คอมเพล็กซ์ lipid-DNA เรียกว่า lipoplexes หรือ liposomes มากกว่าปกติ พวกมันมีโครงสร้าง DNA ล้อมรอบด้วยชั้นไขมันเทียม มีการเตรียมและใช้ lipoplexes จำนวนมาก ไม่เป็นพิษและไม่สร้างภูมิคุ้มกัน

ข้อจำกัดที่สำคัญของการใช้ไลโปเพล็กซ์ก็คือ เมื่อ DNA ถูกเซลล์ดูดเข้าไป ไลโซโซมส่วนใหญ่จะถูกย่อยสลายโดยไลโซโซม ดังนั้นประสิทธิภาพของการส่งยีนโดย lipoplex จึงต่ำมาก การทดลองทางคลินิกบางอย่างโดยใช้ยีนคอมเพล็กซ์ liposome-CFTR แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของยีนมีอายุสั้นมาก

คอนจูเกต DNA-โมเลกุล:

การใช้คอนจูเกต DNA-molecular หลีกเลี่ยงการสลายไลโซโซมของ DNA ข้อดีอีกประการของการใช้คอนจูเกตคือ DNA ที่ใช้รักษาโรคขนาดใหญ่ (> 10 kb) สามารถส่งไปยังเนื้อเยื่อเป้าหมายได้ คอนจูเกตสังเคราะห์ที่ใช้บ่อยที่สุดคือโพลี-แอล-ไลซีน ซึ่งจับกับตัวรับเซลล์เป้าหมายที่จำเพาะ จากนั้นจึงสร้าง DNA ในการรักษาเพื่อรวมกับคอนจูเกตเพื่อสร้างสารเชิงซ้อน (รูปที่ 13.7)

คอนจูเกตโมเลกุลดีเอ็นเอนี้จับกับตัวรับเซลล์จำเพาะบนเซลล์เป้าหมาย มันถูกกลืนโดยเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อสร้างเอนโดโซมซึ่งปกป้อง DNA จากการเสื่อมโทรม DNA ที่ปล่อยออกมาจากเอนโดโซมเข้าสู่นิวเคลียสซึ่งแสดงยีนบำบัด

โครโมโซมเทียมของมนุษย์:

โครโมโซมเทียมของมนุษย์ (HAC) ซึ่งสามารถขนส่งยีนบำบัดที่มี DNA ขนาดใหญ่ได้ตั้งแต่หนึ่งยีนขึ้นไปที่มีองค์ประกอบควบคุมเป็นพาหะที่ดีและเหมาะสม การศึกษาที่ดำเนินการในการเพาะเลี้ยงเซลล์โดยใช้ HAC เป็นกำลังใจ แต่ปัญหาหลักคือการส่งโครโมโซมขนาดใหญ่ไปยังเซลล์เป้าหมาย นักวิจัยกำลังทำงานเพื่อผลิตเซลล์ที่มี HAC ที่ดัดแปลงพันธุกรรม มีความเป็นไปได้ที่จะห่อหุ้มและฝังเซลล์เหล่านี้ในเนื้อเยื่อเป้าหมาย แต่หนทางยังอีกยาวไกล!

ประสิทธิภาพการส่งยีนโดยพาหะที่ไม่ใช่ไวรัส:

แม้ว่าจะพยายามอย่างต่อเนื่องในการค้นหาพาหะนำโรคที่ไม่ใช่ไวรัสที่เหมาะสมสำหรับการนำส่งยีน แต่ความสำเร็จก็มีจำกัดมาก สาเหตุหลักมาจากสองสาเหตุต่อไปนี้

1. ประสิทธิภาพของการเปลี่ยนถ่ายต่ำมาก

2. การแสดงออกของยีนบำบัดมีระยะเวลาสั้นมาก ดังนั้นจึงไม่มีการรักษาโรคอย่างมีประสิทธิภาพ

กลยุทธ์การบำบัดด้วยยีนสำหรับโรคมะเร็ง:

มะเร็งเป็นสาเหตุการเสียชีวิตอันดับต้นๆ ทั่วโลก แม้ว่าจะมีกลยุทธ์การรักษาที่เข้มข้น (การผ่าตัด เคมีบำบัด การฉายรังสี) การบำบัดด้วยยีนเป็นแนวทางใหม่ล่าสุดสำหรับการรักษามะเร็ง การพัฒนาบางส่วนได้อธิบายไว้โดยสังเขปในที่นี้

การบำบัดด้วยยีนบำบัดด้วยปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก:

Tumor necrosis factor (TNF) เป็นโปรตีนที่ผลิตโดยแมคโครฟาจของมนุษย์ TNF ให้การป้องกันเซลล์มะเร็ง สิ่งนี้นำออกมาโดยการเพิ่มความสามารถในการต่อสู้กับมะเร็งของเซลล์เม็ดเลือดขาวที่แทรกซึมของเนื้องอก (TILs) ซึ่งเป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันชนิดพิเศษ

ลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมของเนื้องอกถูกแปลงสภาพด้วยยีน TNF (พร้อมกับยีนที่ดื้อต่อนีโอมัยซิน) และใช้สำหรับการรักษาเนื้องอกชนิดร้าย (มะเร็งของเซลล์ที่ผลิตเมลานินมักเกิดขึ้นในผิวหนัง) TNF ดังกล่าวมีความเป็นพิษสูง และโชคดีที่ไม่มีการตรวจพบผลข้างเคียงที่เป็นพิษในผู้ป่วยมะเร็งผิวหนังที่ฉีด TIL ที่ดัดแปลงพันธุกรรมด้วยยีน TNF ผู้ป่วยมะเร็งดีขึ้นบ้าง

ยีนบำบัดการฆ่าตัวตาย:

ยีนที่เข้ารหัสเอ็นไซม์ไทมิดีนไคเนสมักถูกเรียกว่ายีนฆ่าตัวตาย และใช้สำหรับการรักษามะเร็งบางชนิด Thymidine kinase (TK) phosphorylates nucleosides เพื่อสร้างนิวคลีโอไทด์ซึ่งใช้สำหรับการสังเคราะห์ DNA ระหว่างการแบ่งเซลล์ ยาแกนซิโคลเวียร์ (GCV) มีโครงสร้างใกล้เคียงกับนิวคลีโอไซด์ (ไทมิดีน) บางชนิด โดยไม่ได้ตั้งใจ TK phosphorylates ganciclovir เพื่อสร้าง triphosphate-GCV ซึ่งเป็นนิวคลีโอไทด์ที่เป็นเท็จและไม่เหมาะสมสำหรับการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ Triphosphate-GCV ยับยั้ง DMA polymerase (รูปที่ 13.8)

ผลที่ได้คือ การยืดตัวของโมเลกุลดีเอ็นเอหยุดกะทันหันที่จุดที่มีนิวคลีโอไทด์ปลอม (ของแกนซิโคลเวียร์) นอกจากนี้ ไตรฟอสเฟต-GCV สามารถเข้าไปและฆ่าเซลล์มะเร็งที่อยู่ใกล้เคียง ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ที่เรียกว่าผลกระทบจากผู้ยืนดู ผลลัพธ์สุดท้ายคือเซลล์มะเร็งไม่สามารถเพิ่มจำนวนและตายได้ ดังนั้นยาแกนซิโคลเวียร์จึงสามารถใช้ฆ่าเซลล์มะเร็งได้

แกนซิโคลเวียร์มักถูกเรียกว่าโปรยาและวิธีการประเภทนี้เรียกว่าการบำบัดด้วยยีนกระตุ้นโปรยา มีการใช้แกนซิโคลเวียร์ในการรักษาเนื้องอกในสมอง (เช่น มะเร็งไกลโอบลาสโตมา มะเร็งเซลล์เกลียในสมอง) แม้ว่าจะประสบความสำเร็จเพียงเล็กน้อยก็ตาม

ในการบำบัดด้วยยีนการฆ่าตัวตาย เวกเตอร์ที่ใช้คือไวรัสเริม (HSV) ที่มียีนสำหรับไทมิดีนไคเนส (TK) แทรกอยู่ในจีโนมของมัน เซลล์สมองปกติจะไม่แบ่งตัวในขณะที่เซลล์เนื้องอกในสมองยังคงทำการหารโดยไม่มีการตรวจสอบ

ดังนั้นจึงมีการจำลองดีเอ็นเออย่างต่อเนื่องในเซลล์เนื้องอก โดยการใช้ยีนบำบัด GCV-HSVTK มีรายงานการลดลงของเซลล์เนื้องอกที่เพิ่มจำนวน มีการพัฒนากลยุทธ์ใหม่หลายอย่างเพื่อเพิ่มการส่งยีน HSVTK ไปยังเซลล์ทั้งหมดทั่วเนื้องอก

การบำบัดมะเร็งด้วยสองยีน:

สำหรับการรักษามะเร็งบางชนิด มีการใช้ระบบยีนสองระบบร่วมกัน ตัวอย่างเช่น ยีนการฆ่าตัวตายของ TK (เช่น GCV-HSVTK) ถูกจับคู่กับยีน interleukin-2 (เช่น ยีนที่ส่งเสริมภูมิคุ้มกันบำบัด) ผลิต Interleukin-2 ระดมการตอบสนองภูมิคุ้มกัน เชื่อกันว่าโปรตีนบางชนิดถูกปล่อยออกมาจากเซลล์เนื้องอกเมื่อตาย

โปรตีนเหล่านี้ ร่วมกับเซลล์ภูมิคุ้มกัน จะไปถึงเนื้องอกและเริ่มปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันที่มุ่งตรงไปที่เซลล์มะเร็ง การบำบัดด้วยยีนสองยีนได้ดำเนินการในสัตว์ทดลองที่เป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่และมะเร็งตับ และผลลัพธ์ก็น่ายินดี

การบำบัดทดแทนยีน:

ยีนชื่อ p 53 รหัสสำหรับโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุล 53 กิโลกรัมดาลตัน (ด้วยเหตุนี้ p 53) p 53 ถือเป็นยีนปราบปรามเนื้องอก เนื่องจากโปรตีนที่เข้ารหัสนั้นจับกับ DNA และยับยั้งการจำลองแบบ เซลล์เนื้องอกของเนื้อเยื่อต่างๆ (เต้านม สมอง ปอด ผิวหนัง กระเพาะปัสสาวะ ลำไส้ใหญ่ กระดูก) พบว่ามียีนที่เปลี่ยนแปลงไปของ p 53 (กลายพันธุ์ p 53 ) ซึ่งสังเคราะห์โปรตีนที่แตกต่างจากเดิม

โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงเหล่านี้ไม่สามารถยับยั้งการจำลองดีเอ็นเอได้ เป็นที่เชื่อกันว่ายีน p 53 ที่เสียหายอาจเป็นปัจจัยเชิงสาเหตุในการพัฒนาเนื้องอก คนงานบางคนพยายามที่จะแทนที่ยีน p 53 ที่เสียหายด้วยยีนปกติโดยใช้ระบบ adenovirus vector ผู้ป่วยมะเร็งตับมีผลลัพธ์ที่น่ายินดี

ยีนบำบัดโรคเอดส์:

โรคเอดส์เป็นโรคระดับโลกที่มีอุบัติการณ์เพิ่มขึ้นอย่างน่าตกใจทุกปี มันถึงตายได้อย่างสม่ำเสมอเนื่องจากไม่มีวิธีรักษา มีความพยายามในการบรรเทาผลกระทบของโรคเอดส์โดยการบำบัดด้วยยีน แนวทางบางส่วนจะกล่าวถึงในที่นี้

rev และ ยีน env:

สายพันธุ์กลายพันธุ์ของไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ (HIV) ซึ่งไม่มียีน rev และ env ได้รับการพัฒนา โปรตีนควบคุมและโปรตีนห่อหุ้มของ HIV นั้นผลิตโดยยีน rev และ env ตามลำดับ เนื่องจากขาดยีนเหล่านี้ ไวรัสจึงไม่สามารถทำซ้ำได้

นักวิจัยได้ใช้เอชไอวีที่ไม่มียีน rev และ env เพื่อวัตถุประสงค์ในการรักษา T-Lymphocytes จากผู้ป่วยที่ติดเชื้อ HIV จะถูกลบออกและใส่ไวรัสที่กลายพันธุ์เข้าไป T-lymphocytes ที่ดัดแปลงแล้วได้รับการปลูกฝังและฉีดเข้าไปในผู้ป่วย เนื่องจากขาดยีนที่จำเป็น ไวรัส (HIV) ไม่สามารถเพิ่มจำนวนได้ แต่สามารถกระตุ้นการผลิต CD8 (แอนติเจนของคลัสเตอร์ดีเทอร์มิแนนต์ 8) เซลล์ของที-ลิมโฟไซต์ ซีดี8 เซลล์คือเซลล์เม็ดเลือดขาวนักฆ่า ได้รับการพิสูจน์ในการศึกษาในห้องปฏิบัติการว่าลิมโฟไซต์เหล่านี้ทำลายเซลล์ที่ติดเชื้อเอชไอวี

ยีนของโปรตีนเอชไอวี:

ยีนบางตัวที่สังเคราะห์โปรตีน HIV นั้นติดอยู่กับ DNA ของไวรัสเมาส์ ไวรัสดัดแปลงพันธุกรรมเหล่านี้ถูกฉีดไปยังผู้ป่วยโรคเอดส์ที่มีอาการทางคลินิกของโรค เชื่อกันว่ายีนเอชไอวีกระตุ้นเซลล์ในร่างกายให้ผลิตโปรตีนเอชไอวี ในทางกลับกันกระตุ้นการผลิตแอนติบอดีต่อต้านเอชไอวีซึ่งป้องกันการจำลองแบบเอชไอวีในผู้ป่วยเอดส์

ยีนที่จะปิดการใช้งาน gp120:

gp120 เป็นไกลโคโปรตีน (น้ำหนักโมเลกุล 120 กิโลดาลตัน) อยู่ในซองของเอชไอวี จำเป็นอย่างยิ่งต่อการผูกมัดของไวรัสกับเซลล์เจ้าบ้านและทำให้เกิดการจำลองแบบ นักวิจัยได้สังเคราะห์ยีน (เรียกว่า F105) เพื่อผลิตแอนติบอดีที่สามารถยับยั้ง gp120 ได้

ในการบำบัดด้วยยาต้านเอดส์ เซลล์ที่ติดเชื้อ HIV ได้รับการออกแบบมาเพื่อผลิตแอนติบอดีต้าน HIV เมื่อฉีดเข้าสู่ร่างกาย การศึกษาที่ดำเนินการในสัตว์ทดลองพบว่าการสังเคราะห์ gp120 ลดลงอย่างมากเนื่องจากการรักษาด้วยยาต้านเอดส์ การผลิตอนุภาค F1IV ก็ลดลงเช่นกัน มีความพยายามที่จะป้องกันโรคเอดส์ด้วยการบำบัดด้วยความรู้สึก


พื้นหลัง

การหาลำดับดีเอ็นเอรุ่นถัดไป (NGS) ได้ปฏิวัติการถ่ายทอดทางพันธุกรรมโดยทำให้บุคคลสามารถจัดลำดับจีโนมได้เป็นประจำ ไม่ว่าจะในชุดย่อยทั้งหมดหรือเฉพาะเจาะจง เทคโนโลยี NGS ต้องการขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่ซับซ้อนซึ่งเกี่ยวข้องกับการเพิ่มอะแด็ปเตอร์ DNA ที่จำเพาะต่อซีเควนเซอร์เข้ากับชิ้นส่วนจีโนมของจีโนม การตัดดีเอ็นเอของจีโนม ชุดของปฏิกิริยาทางอณูชีววิทยา (การซ่อมแซมปลาย A-tailing อะแด็ปเตอร์ ligation และในกรณีส่วนใหญ่ PCR) และขั้นตอนการแยกทางกายภาพและการทำให้บริสุทธิ์ที่ตามมามักจะทำเพื่อสร้าง "ไลบรารีลำดับ" ตัวอย่างเช่น Illumina Genome Analyzer ใช้อะแด็ปเตอร์ DNA สองสายเสริมบางส่วนที่ใช้สำหรับการขยาย PCR และการรวมส่วนประกอบการจัดลำดับทั่วไปเข้ากับ DNA ที่กระจัดกระจาย [1] กลุ่มต่างๆ ได้ทำงานเพื่อปรับปรุงกระบวนการและลดความต้องการการขยายเสียงสำหรับไลบรารี NGS [2–4]

การหาลำดับเป้าหมายใหม่ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีประโยชน์สำหรับการใช้งานจำนวนมาก รวมถึงการตรวจสอบความถูกต้องของตัวแปรจากการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด การศึกษาชุดย่อยของยีนที่เกี่ยวข้องกับโรค และการตรวจหาการวินิจฉัยของตัวแปรที่ดำเนินการได้ทางคลินิก ตามแนวทางเหล่านี้ มีการพัฒนาวิธีการที่หลากหลายเพื่อเสริมสร้างภูมิภาคเฉพาะของจีโนม ซึ่งรวมถึงการคัดเลือกแบบผสม, มัลติเพล็กซ์-PCR และแนวทางการทำให้เป็นวงกลมเป้าหมาย วิธีการคัดเลือกแบบลูกผสมใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ถูกตรึงบนไมโครอาร์เรย์ [5–7] หรือเม็ดบีด [8] สำหรับการเพิ่มคุณค่าของเป้าหมายจีโนมจากตัวอย่างดีเอ็นเอดัดแปลง ในมัลติเพล็กซ์-PCR [9] ชุดไพรเมอร์เชิงซ้อนสามารถใช้เพื่อขยายบริเวณเป้าหมายอย่างเลือกสรรก่อนที่จะดัดแปลง DNA สำหรับซีเควนเซอร์ เมื่อเร็วๆ นี้ เทคโนโลยีไมโครดรอปเล็ต [10] ได้ถูกนำมาใช้เพื่อทำให้ปฏิกิริยา PCR ขนานกันอย่างมีประสิทธิภาพ โพรบผกผันโมเลกุลจับโพรบผกผันใช้ส่วนขยายโพลีเมอเรสข้ามเป้าหมายและ ligation เพื่อทำให้เป็นวงกลม ดังนั้นจึงเปิดใช้งานการเรียงลำดับเป้าหมายแบบมัลติเพล็กซ์สูง [11, 12] การทำให้เป็นวงกลมของจีโนมเป้าหมายจับสายหนึ่งของเป้าหมายดีเอ็นเอจีโนมโดยตรงโดยการแปลงดีเอ็นเอของชิ้นส่วนเป้าหมายเป็นวงกลมโดยใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์จับในสารละลาย [13] เมื่อเร็วๆ นี้ Oligonucleotide-Selective Sequencing ซึ่งเป็นวิธีการผสมพันธุ์เฉพาะเป้าหมายและการขยายสำหรับการจับลำดับเป้าหมายจีโนมได้รับการพัฒนา [14] วิธีการเหล่านี้เกือบทั้งหมดต้องการขั้นตอนเพิ่มเติมของอะแด็ปเตอร์ ligating sequencing ทั้งก่อนหรือหลังการเพิ่มคุณค่า

เนื่องจากการเพิ่มประสิทธิภาพเป้าหมายและการเตรียมห้องสมุดจัดลำดับเกิดขึ้นอย่างต่อเนื่อง วิธีการจัดลำดับเป้าหมายจึงมักจะลำบาก ใช้เวลานาน มีแนวโน้มที่จะเกิดข้อผิดพลาดในการทดลอง และยากที่จะทำให้เป็นระบบอัตโนมัติ นอกจากนี้ วิธีการเหล่านี้จำนวนมากมีโปรโตคอลที่ซับซ้อนซึ่งต้องการ DNA ของจีโนมเริ่มต้นจำนวนมาก ปัญหาอื่นๆ ได้แก่ ความอ่อนไหวต่อการครอบคลุมอคติรองจากการขยายและสิ่งประดิษฐ์ระดับโมเลกุล ในที่นี้ เราสาธิตวิธีการรวมทั้งการเตรียมห้องสมุด NGS และการจับเป้าหมายจีโนมเฉพาะ เราได้พัฒนาแนวทางที่การทำให้เป็นวงกลมของโมเลกุล DNA จีโนมจำเพาะรวมเอาส่วนประกอบไลบรารีการจัดลำดับของ Illumina โดยตรง (รูปที่ 1) อธิบายอย่างง่าย ๆ ว่าชิ้นส่วนจีโนมของ DNA เป้าหมายถูกทำให้เป็นวงกลม ส่วนประกอบไลบรารีการจัดลำดับทั้งหมดจะรวมอยู่ในขั้นตอนการหมุนเวียน เมื่อวงกลมเป้าหมายเฉพาะก่อตัวขึ้น ส่วนประกอบทั้งหมดของไลบรารีการจัดลำดับ Illumina จะถูกสร้างขึ้นในขั้นตอนการขยายสัญญาณ PCR เดียวที่มีไลบรารีเป้าหมายที่พร้อมสำหรับการจัดลำดับ วิธีการแบบขั้นตอนเดียวนี้ช่วยลดความซับซ้อนที่เกี่ยวข้องกับการกำหนดเป้าหมายใหม่ เรายังแสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ทางเทคนิคของการเรียงลำดับเป้าหมายแบบไม่มีการขยายเสียงอีกด้วย

วิธีการจัดเตรียมไลบรารีลำดับเป้าหมาย. (NS) ภาพรวมของการทดสอบ (NS) ขั้นตอนการเตรียมการเฉพาะ: (1) จีโนม DNA ถูกย่อยโดยใช้ Mseฉันจำกัดเอ็นโดนิวคลีเอส (2) จากนั้น ชิ้นส่วนจีโนมของ DNA จะถูกหมุนเวียนโดยใช้ DNA ligase ที่ทนความร้อนและ Taq DNA polymerase สำหรับการแก้ไข 5 ' กลุ่มของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ซึ่งมุ่งเป้าไปที่ปลาย 5' และ 3' ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอและโอลิโกนิวคลีโอไทด์ของเวกเตอร์ถูกใช้สำหรับการดักจับดีเอ็นเอที่เป็นเป้าหมาย (3) หลังจากการหมุนเวียนแล้ว PCR สามารถเตรียมไลบรารีลำดับ Illumina ปกติได้ (4) ชิ้นส่วนห้องสมุดที่ขยายโดย PCR นั้นคล้ายกับโครงสร้างไลบรารีของ Illumina ปกติและการหลอมเพื่อไพรเมอร์ที่ถูกตรึงบนโฟลว์เซลล์ (5) นอกจากนี้ โครงสร้างแบบวงกลมสามารถจัดลำดับได้โดยตรงเนื่องจากวงดีเอ็นเอจีโนมที่ดัดแปลงนั้นรวมเอาส่วนประกอบดีเอ็นเอทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการตรึงและการจัดลำดับของห้องสมุด (ค) โครงสร้างโมเลกุลของเวกเตอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์และการจับโอลิโกนิวคลีโอไทด์


เป้าหมายเวกเตอร์ความแตกต่างและเป้าหมายจีโนม - ชีววิทยา

การสร้างหนูกลายพันธุ์โดยการกำหนดเป้าหมายยีนใช้ประโยชน์จากความสามารถที่โดดเด่นของสายเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อน (ES) (1, 2) เพื่อมีส่วนร่วมในการก่อตัวของเซลล์สืบพันธุ์ของหนูเมื่อเซลล์ถูกใส่กลับเข้าไปในตัวอ่อนระยะแรก (3) . สายพันธุ์ของเซลล์ที่ได้รับการกำหนดเป้าหมายด้วยยีนได้รับการเสริมสมรรถนะโดยการรวมตัวของตัวทำเครื่องหมายที่เลือกได้เข้ากับเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย (4) จากชุดของสายพันธุ์ของเซลล์ที่อุดมสมบูรณ์นี้ เหตุการณ์การรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันที่ต้องการถูกระบุโดยการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลของ DNA จีโนม เซลล์ ES ที่เป็นเป้าหมายซึ่งมีจำนวนโครโมโซมปกติจะถูกระบุและเลือกเพื่อสร้างไคเมอรา

การกำหนดเป้าหมายสามารถใช้เพื่อสร้างน็อคเอาท์ น็อคอิน หรืออัลลีลแบบมีเงื่อนไข น็อคเอาท์ น็อคกิน และอัลลีลแบบมีเงื่อนไขถูกสร้างขึ้นในลักษณะเดียวกันโดยใช้โปรโตคอลที่ให้ไว้ที่นี่ สิ่งที่น่าพิศวงใช้เพื่อกำหนดความต้องการโดยรวมสำหรับยีนและเพื่อสร้างแบบจำลองการสูญเสียของการกลายพันธุ์ของฟังก์ชัน Knockins แนะนำลำดับการเข้ารหัสที่แตกต่างกัน เช่น นักข่าวหรือ DNA recombinase หรือเพื่อรวมการเปลี่ยนแปลงในลำดับดีเอ็นเอเพื่อ "ทำให้เป็นมนุษย์" ยีนของหนูเมาส์หรือเพื่อสร้างการกลายพันธุ์ของจุด การกลายพันธุ์แบบมีเงื่อนไขใช้เพื่อกำหนดอวัยวะ เนื้อเยื่อ หรือความเป็นอิสระของเซลล์ของผลกระทบจากการกลายพันธุ์ เพื่อเลี่ยงการตายของตัวอ่อน หรือเพื่อสร้างแบบจำลองการกลายพันธุ์ของโซมาติก

อุปสรรคสำคัญสองประการสำหรับการสร้างหนูที่มียีนเป้าหมายคือการได้รับการรวมตัวกันอีกครั้งและการถ่ายทอดเชื้อ แม้ว่าจะเป็นเวลาเกือบยี่สิบปีแล้วที่หนูที่มียีนเป้าหมายตัวแรกถูกสร้างขึ้น (4, 5) แต่พารามิเตอร์บางตัวที่ส่งผลต่อความถี่ของการรวมตัวที่คล้ายคลึงกันและการแพร่กระจายของเชื้อโรคก็ไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด อย่างไรก็ตาม เราให้เกณฑ์สำหรับพารามิเตอร์ที่ทราบ ให้คำแนะนำเกี่ยวกับวิธีการรับประกันความสำเร็จ และจัดเตรียมกลยุทธ์การกู้คืนและคำแนะนำในการแก้ไขปัญหา

การออกแบบเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย: หลักการทั่วไป

จุดประสงค์ของเราคือการนำเสนอการออกแบบเวกเตอร์ที่ใช้กันทั่วไปและแพร่หลายที่สุด (รูปที่ 1) มีรูปแบบที่หลากหลายที่เป็นไปได้ในการออกแบบเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายและการใช้งาน (7,8) ต่อไปนี้เน้นการใช้งานทั่วไปมากที่สุด

สำหรับเวคเตอร์การกำหนดเป้าหมายทั้งหมด ข้อควรพิจารณาต่อไปนี้: 1) เวกเตอร์ต้องถูกทำให้เป็นเส้นตรงนอกกลุ่มของความคล้ายคลึง ดังนั้นต้องมีการเตรียมการสำหรับลำดับการจดจำที่ไม่ซ้ำกันสำหรับเอ็นไซม์การจำกัดในสถานที่ที่เหมาะสม 2) กลยุทธ์ในการตรวจหายีน การกำหนดเป้าหมายโดยการวิเคราะห์ Southern blot ของจีโนม DNA จะต้องได้รับการพัฒนา 3) ยิ่งมีจำนวนการจับคู่ลำดับมากเท่าใด โอกาสที่การกำหนดเป้าหมายก็จะยิ่งประสบความสำเร็จมากขึ้นเท่านั้น



[คลิกที่รูปเพื่อดูภาพขนาดเต็ม]

รูปที่ 1 การออกแบบเวกเตอร์และการตรวจจับการกำหนดเป้าหมาย A) การออกแบบเวกเตอร์สำหรับยีนที่กำหนดเป้าหมายเป็นโมฆะ อัลลีลแบบ knockin และแบบมีเงื่อนไขจะแสดงขึ้น (ซ้ายไปขวา) อัลลีลแบบไวด์ที่มีเอ็กซอนสามตัวจะแสดงที่ด้านบน เวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายในบรรทัดถัดไป อัลลีลที่กำหนดเป้าหมายอย่างถูกต้องในบรรทัดถัดไป และอัลลีลที่เป็นเป้าหมายหลังจากการตัดตอนของนีโอ cassette โดยการทรานส์เฟกชันของ Cre recombinase ในเซลล์ ES B) กลยุทธ์ในการตรวจจับอัลลีลที่กำหนดเป้าหมายอย่างถูกต้องโพรบ DNA สำหรับการวิเคราะห์ Southern blot ถูกเลือกซึ่งอยู่ในยีนที่จะกำหนดเป้าหมาย แต่อยู่ภายนอกกับเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย (โพรบ 5 'และ 3') หลังจากการกำหนดเป้าหมาย การแทรกแบบสุ่มของเวกเตอร์ที่รอดจากการเลือกจะไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงของยีนภายใน (ช่อง 1 และ 3) แต่เส้นที่กำหนดเป้าหมายอย่างถูกต้องจะแสดงอัลลีลประเภทไวด์และชิ้นส่วนที่คาดการณ์ไว้สำหรับอัลลีลที่เป็นเป้าหมาย การตัดออกของนีโอยังได้รับการยืนยันโดยการสังเกตการเปลี่ยนแปลงที่คาดการณ์ไว้ในขนาดชิ้นส่วน กลยุทธ์การตรวจจับที่แสดงขึ้นอยู่กับการลบไซต์ Hind III และการเปลี่ยนแปลงขนาดของชิ้นส่วน แต่กลยุทธ์อาจขึ้นอยู่กับการแนะนำไซต์ (นีโอและ tk บ่งชี้มินิยีนที่ประกอบด้วยโปรโมเตอร์ ลำดับการเข้ารหัสและสัญญาณโพลีอะดีนิเลชันสำหรับการดื้อยานีโอมัยซินและยีน HSV ไทมิดีนไคเนสตามลำดับ)

เวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายสำหรับ Null Alleles

เราแนะนำให้สร้างเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายสำหรับการสร้างอัลลีลที่เป็นโมฆะด้วยจีโนม DNA จากหนู 129 สายพันธุ์ โดยอย่างน้อย 7 kb ของความคล้ายคลึงทั้งหมดถูกแยกออกเป็นสองแขน ซึ่งอยู่ในตำแหน่งที่จะลบ exons การเข้ารหัสในช่วงต้นหรือวิกฤตของยีน ( รูปที่ 1). เครื่องหมายที่เลือกได้สองตัวรวมอยู่ในเวกเตอร์ (4) ยีนต้านทานนีโอมัยซิน (นีโอ) ควรขนาบข้างด้วยตำแหน่ง loxP และอยู่ระหว่างแขนทั้งสองข้าง ควรวางยีน thymidine kinase (tk) ไวรัสเริม (HSV) ไว้นอกแขนข้างหนึ่งของเวกเตอร์ ยีนต้านทาน neomycin จะถูกลบออกในเซลล์ ES ผ่านกิจกรรมของ Cre recombinase ที่ทำหน้าที่บนไซต์ loxP หลังจากการกำหนดเป้าหมายของยีน

เวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายสำหรับ Knockin Alleles

เพื่อสร้างอัลลีลแบบน็อคอิน (รูปที่ 1) ลำดับการเปลี่ยนหรือลำดับการเข้ารหัสที่ถูกแทรกถูกรวมเข้าไว้ในแขนข้างหนึ่งของเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย (9) เป้าหมายคือเพื่อลดการหยุดชะงักอื่น ๆ ของการทำงานของยีน ยีนต้านทานนีโอมัยซินขนาบข้างด้วยไซต์ loxP เพื่อให้สามารถตัดออกได้โดยการแสดงออกของ Cre recombinase และโดยทั่วไปแล้วจะถูกแทรกเข้าไปในอินตรอน ในการออกแบบ Knockins โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยหรือเล็กน้อย จำเป็นต้องมีการจัดเตรียมเพื่อตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลง Knockin นั้นได้รับการบูรณาการตามที่ตั้งใจไว้หรือไม่ ซึ่งจำเป็นเนื่องจากการแลกเปลี่ยนการรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันอาจเกิดขึ้นภายในการเปลี่ยนแปลงที่ตั้งใจไว้และไม่ รวมลำดับที่เปลี่ยนแปลง (ดูตัวอย่างในรูปที่ 2 สำหรับอัลลีลแบบมีเงื่อนไข: เช่นเดียวกับอัลลีล knockin) นีโอมาร์กเกอร์จะถูกลบออกในเซลล์ ES ก่อนสร้างคิเมรา

เวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายสำหรับอัลลีลแบบมีเงื่อนไข

อัลลีลแบบมีเงื่อนไขมีฟังก์ชันประเภทไวด์ แต่สามารถกลายพันธุ์เป็นอัลลีลที่เป็นโมฆะในเซลล์ซึ่งแสดง Cre recombinase (10) เพื่อรักษาฟังก์ชันไวด์ไวด์ จะไม่มีการลบส่วนใดส่วนหนึ่งของยีน และไซต์ loxP จะถูกแทรกเข้าไปในอินตรอนห่างจากลำดับที่อาจทำงานในการประกบและการถอดรหัส (รูปที่ 1)

เวคเตอร์การกำหนดเป้าหมายสำหรับอัลลีลแบบมีเงื่อนไขควรถูกสร้างขึ้นสำหรับอัลลีลที่เป็นโมฆะ ยกเว้นว่ายีนต้านทานนีโอมัยซินที่มีไซต์ loxP ขนาบข้างนั้นถูกแทรกเข้าไปในอินตรอน และ loxP ถูกแทรกเข้าไปในอินตรอนที่ต่างกัน ดังนั้นการลบลำดับระหว่างไซต์ loxP ที่ส่วนปลายที่สุด จะลบ exon การเข้ารหัสที่จำเป็น

เช่นเดียวกับกลยุทธ์ Knockin ต้องมีการเตรียมการเพื่อตรวจหาการรวมไซต์ loxP ที่ส่วนปลาย เนื่องจากไม่ใช่ recombinants ที่คล้ายคลึงกันทั้งหมดที่จะรวม loxP ไว้ในระยะห่างจาก neo (รูปที่ 2)

ยีนต้านทานนีโอมัยซินจะถูกลบออกด้วย Cre recombinase ในเซลล์ ES และระบุอัลลีลที่มีไซต์ loxP สองไซต์ขนาบข้าง exon ที่จำเป็น อัลลีลแบบมีเงื่อนไขถูกนำเข้ามาในหนูโดยใช้ไคเมอรา และยีนถูกกลายพันธุ์เป็นอัลลีลที่เป็นโมฆะผ่านการกระทำของ Cre recombinase บนไซต์ loxP ที่เหลืออีกสองไซต์ โดยจะลบลำดับระหว่างพวกมัน

สิ่งสำคัญคือต้องตรวจสอบว่าลำดับ loxP จะทำงานและไม่มีการแนะนำการเปลี่ยนแปลงลำดับที่ไม่ได้ตั้งใจ ดังนั้นจึงควรจัดลำดับเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายทั้งหมดสำหรับอัลลีลแบบมีเงื่อนไขก่อนที่จะทำการกำหนดเป้าหมาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีที่ PCR สร้างบางส่วนของเวกเตอร์



[คลิกที่รูปเพื่อดูภาพขนาดเต็ม]

รูปที่ 2 ตำแหน่งของครอสโอเวอร์ (เส้นประสีแดง) อาจส่งผลให้เกิดการรวม (A) หรือการยกเว้น (B) ของการเปลี่ยนแปลงลำดับที่เชื่อมโยง ในกรณีนี้คือตำแหน่ง loxP ส่วนปลาย (สีเขียว) แสดงเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายเพื่อสร้างอัลลีลแบบมีเงื่อนไข distal loxP (สีเขียว) มีไซต์ Hind III ที่ได้รับการแนะนำเพื่ออำนวยความสะดวกในการตรวจจับ และ floxed neo จะลบไซต์ Hind III ด้วยเพื่ออำนวยความสะดวกในการตรวจจับ หลักการเดียวกันนี้ใช้กับอัลลีล Knockin ซึ่งการเปลี่ยนแปลงลำดับถูกแยกออกจากนีโอโดย DNA ที่คล้ายคลึงกัน

ความถี่ของการรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันขึ้นอยู่กับระดับของการจับคู่ลำดับและความยาวของลำดับการจับคู่ (11, 12) โดยปกติจำเป็นต้องมี DNA มากกว่า 7 กิโลเบสของการจับคู่ลำดับที่สมบูรณ์แบบเพื่อให้ได้การรวมตัวใหม่ที่เหมือนกันที่ความถี่เชิงปฏิบัติ ความสัมพันธ์ระหว่างความแตกต่างของลำดับและอัตราการกำหนดเป้าหมายยังไม่ได้รับการตรวจสอบอย่างเป็นระบบ แต่การแสดงความแตกต่างของลำดับประมาณ 0.5% ส่งผลให้ความถี่การกำหนดเป้าหมายลดลง 20 เท่าสำหรับโครงสร้างที่กำหนดเป้าหมายตำแหน่ง Rb (11) ในเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย การจับคู่ลำดับที่แน่นอนมักจะถูกขัดจังหวะด้วยช่องว่างและ/หรือการแทรกโดยแต่ละส่วนของการจับคู่ทั้งสองส่วนลดลงครึ่งหนึ่งโดยประมาณ ความขัดแย้งที่เห็นได้ชัดที่ลำดับตรงกับยีนเป้าหมายต้องใกล้เคียงกันโดยที่ช่องว่างหรือการแทรกอาจมีขนาดใหญ่ถึง 10 kb อาจเกิดขึ้นได้เนื่องจากมีเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันอิสระสองเหตุการณ์ที่เกิดขึ้นในการกำหนดเป้าหมายยีน หนึ่งเหตุการณ์สำหรับแต่ละแขน

ลำดับจีโนมของสายพันธุ์แท้ของหนูเมาส์ต่างกันมากพอที่ DNA จากสายพันธุ์เดียวกันกับเซลล์ ES ที่น่าจะจำเป็นเพื่อสร้างเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย เซลล์ ES ส่วนใหญ่ทำมาจากหนูสายพันธุ์ 129 สายพันธุ์ ดังนั้นเวกเตอร์ที่กำหนดเป้าหมายมักจะทำจากจีโนม DNA 129 ตัว มีสายย่อยที่แตกต่างกันหลายสายของ 129 สายพันธุ์ แต่ความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้ไม่น่าจะดีพอที่จะส่งผลต่อการกำหนดเป้าหมายของยีน ไลบรารีจีโนมของหนู 129 ตัวมีอยู่ในแลมบ์ดาฟาจเวคเตอร์จากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์ (Stratagene 946313) 129 genomic clones ใน BAC vectors (.pdf) สามารถซื้อได้จาก Sanger Institute คุณสามารถระบุ BAC ที่มียีนของคุณได้โดยใช้เบราว์เซอร์จีโนมทั้งมวล โดยเลือกแหล่ง DAS "โคลน 129S7/AB2.2" หากคุณต้องการรับโคลนเฉพาะ การคลิกที่ BAC จะเป็นการเปิดเมนู และการเลือกลิงก์ที่ด้านล่างของรายการจะนำคุณไปยังแบบฟอร์มการสั่งซื้อ

อีกทางเลือกหนึ่ง ดีเอ็นเอจากยีนโคลนนิ่ง C57BL/6J BAC สามารถใช้เพื่อสร้างเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายสำหรับสายเซลล์ 129 ES หากไม่มีความหลากหลายในขอบเขตของยีนระหว่างสายพันธุ์ C57BL/6J และ 129S1/SvImJ ของหนูเมาส์ ความแตกต่างระหว่างลำดับ 129 และ C57BL/6J ถูกกระจายในบล็อกที่ประกอบด้วยลำดับที่แตกต่างกันและเหมือนกันอย่างสำคัญ ไม่ว่าจะมีนิวคลีโอไทด์พหุสัณฐานเดียวระหว่าง 129 และ C57Bl/6 สำหรับภูมิภาคจีโนมของคุณหรือไม่ สามารถตรวจสอบได้ที่นี่บนเว็บไซต์ Jax และสามารถระบุโคลน C57BL6J BAC ด้วยเบราว์เซอร์จีโนม UC Santa Cruz และซื้อจากศูนย์ทรัพยากร BACPAC CHORI

อีกทางเลือกหนึ่ง สามารถใช้ PCR ระยะไกลเพื่อแยกโครงสร้างแขนออกจากจีโนม DNA ของเซลล์ ES DNA ที่กู้คืนโดย PCR ควรถูกจัดลำดับเพื่อให้แน่ใจว่า PCR ไม่ได้แนะนำการกลายพันธุ์ที่ไม่ได้ตั้งใจเข้าไปในเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการกำหนดเป้าหมายของยีนแบบน็อคอินและแบบมีเงื่อนไข

สุดท้าย สายเซลล์ C57BL/6 ES สามารถกำหนดเป้าหมายด้วย DNA ที่สร้างจาก C57BL/6 (หรือ 129 หากไม่มีความหลากหลายในชิ้นส่วนของ DNA นั้น)

ยีนต่างชนิดกันถูกรวมเข้าไว้ในเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายสำหรับการเพิ่มคุณค่าของเหตุการณ์การกำหนดเป้าหมาย ระหว่างแขนของเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย ยีนซึ่งประกอบด้วยโปรโมเตอร์ ลำดับการเข้ารหัสสำหรับโปรตีนต้านทานยาและสัญญาณโพลีอะดีนิเลชันถูกรวมเข้าไว้ โดยทั่วไปแล้วจะใช้ลำดับการเข้ารหัสการดื้อยานีโอมัยซิน เนื่องจากจะให้การดื้อต่อนีโอมัยซินอะนาลอก G418 ที่แขนข้างหนึ่ง มียีนสำหรับแสดง Herpes Simplex Virus thymidine kinase (tk) ในการรวมตัวกันอีกครั้งที่ประสบความสำเร็จ ยีน tk ไม่ได้ถูกรวมเข้ากับจีโนมและสูญหายไป เซลล์ที่ tk ถูกรวมเข้ากับจีโนม DNA สามารถฆ่าได้โดยการคัดเลือกด้วยยา FIAU ในการทรานส์เฟกชันส่วนใหญ่ เซลล์ส่วนใหญ่ที่รวมเวคเตอร์การกำหนดเป้าหมายไม่ทำเช่นนั้นโดยการรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้นเซลล์ส่วนใหญ่จึงรวมเครื่องหมายที่เลือกได้ tk และการเลือก FIAU จะฆ่าเซลล์เหล่านี้ ยีนการคัดเลือกยาทางเลือกก็มีให้เช่นกัน (8)

การวางแนวของหน่วยการถอดรหัสยีนมาร์กเกอร์ที่เลือกได้สัมพันธ์กันและยีนเป้าหมายดูเหมือนจะไม่สำคัญ

หลีกเลี่ยงผลที่ไม่ได้ตั้งใจ

สิ่งสำคัญคือต้องคาดการณ์ผลที่ตามมาของการกำหนดเป้าหมายยีนเพื่อให้แน่ใจว่ายีนเป้าหมายขาดการทำงานทั้งหมดตามที่ตั้งใจไว้ ตรวจสอบรูปแบบการประกบที่อาจคาดว่าจะเกิดขึ้นในอัลลีลที่เป็นเป้าหมาย โดยมองหาการประกบในเฟรมซึ่งอาจส่งผลให้ผลิตภัณฑ์โปรตีนผิดปกติมีกิจกรรมที่เปลี่ยนแปลงไป หลีกเลี่ยงการออกแบบที่อาจก่อให้เกิดโปรตีนที่มีกิจกรรมการทำงานเชิงลบหรือการทำงานอื่นๆ เพิ่มขึ้น

ลำดับการเข้ารหัสการดื้อยานีโอมัยซินและโปรโมเตอร์ PGK1 ของมันอาจมีผลที่ไม่ได้ตั้งใจต่อยีนเป้าหมายและต่อยีนที่อยู่ติดกันหากพวกมันถูกทิ้งไว้ในยีน (13-16) ยีนต้านทาน neomycin ประกอบด้วยตัวรับและผู้บริจาคที่เป็นความลับซึ่งสามารถนำไปใช้โดยการถอดเสียงจากยีนเป้าหมาย นอกจากนี้ หน้าที่ของยีนที่อยู่ติดกับยีนเป้าหมายสามารถเปลี่ยนแปลงได้โดยยีนนีโอมัยซินที่แทรกที่ตำแหน่งเป้าหมาย ในกรณีหนึ่งการแทรกแซงนี้แสดงให้เห็นว่าเกิดจากการถอดความจากโปรโมเตอร์ PGK1 และการประกบกันของลำดับนีโออย่างผิดปกติลงในยีนที่อยู่ติดกัน แต่กลไกอื่นๆ เป็นไปได้ รวมถึงการรบกวนผ่านการแข่งขันของเอนแฮนเซอร์ ถ้าเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายได้รับการออกแบบด้วยลำดับการจดจำสำหรับ DNA recombinase จำเพาะตำแหน่งที่ขนาบข้างยีนนีโอตามที่บรรยายไว้ข้างต้น มันสามารถถูกกำจัดออกหลังจากการกำหนดเป้าหมายของยีนโดยการแสดงออกของ DNA recombinase DNA recombinase เฉพาะไซต์ Cre รับรู้ลำดับคู่เบส 34 ลำดับ ไซต์ loxP ลำดับระหว่างคู่ของไซต์ที่ตรงกันในการวางแนวการทำซ้ำโดยตรงจะถูกลบ โดยปล่อยให้เป็นลำดับ loxP เดียว

การวางแผนสำหรับการตรวจจับการกำหนดเป้าหมายยีน

กลยุทธ์ในการระบุโลคัสที่เป็นเป้าหมายโดยการวิเคราะห์ Southern blot ต้องได้รับการพัฒนาควบคู่ไปกับการออกแบบเวกเตอร์ (รูปที่ 1) โพรบ DNA สองตัวจากยีนในแต่ละด้านภายนอกเวคเตอร์การกำหนดเป้าหมายจะต้องสามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของขนาดชิ้นส่วน ซึ่งเป็นผลมาจากการแนะนำหรือการกำจัดตำแหน่งเอ็นไซม์จำกัด

หลีกเลี่ยงการใช้เอ็นไซม์จำกัดซึ่งมีลำดับการรู้จำซึ่งมีไดนิวคลีโอไทด์ 5'CG3' เนื่องจากลำดับนี้ส่วนใหญ่มักจะถูกเมทิลเลตในดีเอ็นเอของจีโนมของเซลล์ ES และจะทนต่อการตัด ตัวอย่างเช่น ลำดับการรู้จำสำหรับ Xho I คือ 5'CT CG AG3' และด้วยเหตุนี้ Xho I จึงควรหลีกเลี่ยง Hind III รู้จักลำดับ 5'AAGCTT3' และเหมาะสม ก่อนที่จะทรานส์เฟกเซลล์ ES ด้วยเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย ให้ทดสอบโพรบสำหรับการวิเคราะห์ Southern blot เกี่ยวกับการย่อยจีโนมของ DNA เซลล์ ES เพื่อตรวจสอบว่าพวกมันทำงานได้ดี

สิ่งสำคัญคือต้องตรวจสอบเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันจากทั้งสองฝ่ายด้วยโพรบภายนอกกับเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายเนื่องจากการรวมตัวกันอาจเกิดขึ้นได้เพียงด้านเดียวเท่านั้น (17-18 และรูปที่ 2) ในทางปฏิบัติ การระบุเบื้องต้นของเหตุการณ์การรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันนั้นทำได้โดยใช้โพรบภายนอกหนึ่งตัว จากนั้นเซลล์เป้าหมายของผู้สมัครจะถูกละลาย เตรียม DNA จีโนมจำนวนมากขึ้น และการกำหนดเป้าหมายจะได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์จีโนม Southern blot อย่างกว้างขวางโดยใช้โพรบและการย่อยหลายตัว


[คลิกที่รูปเพื่อดูภาพขนาดเต็ม]

รูปที่ 3 ภาพประกอบของการกำหนดเป้าหมายที่ถูกต้อง (A) และการกำหนดเป้าหมายที่ผิดปกติ (B) ในบางกรณี การรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันเกิดขึ้นเพียงด้านเดียวเท่านั้นตามที่แสดง (B) B) การรวมตัวใหม่ที่เหมือนกันเกิดขึ้นที่ปลาย 5' แต่ปลาย 3' ถูกแทรก ในกรณีนี้ โพรบภายนอก 5' จะแสดงแฟรกเมนต์ที่คาดไว้สำหรับอัลลีลเป้าหมาย แต่ด้าน 3' แสดงแฟรกเมนต์ชนิดไวด์ ดังนั้น ควรใช้โพรบภายนอกทั้งสองด้านเพื่อตรวจสอบว่าการกำหนดเป้าหมายบรรลุผลตามที่ต้องการ

การรวมตัวใหม่ที่เหมือนกันอาจเกิดขึ้นในลักษณะที่อาจส่งผลให้ผลิตภัณฑ์ไม่เป็นที่ต้องการ การรวมตัวใหม่ที่เหมือนกันอาจเกิดขึ้นที่ปลายด้านหนึ่งของเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายโดยมีการทำซ้ำที่ปลายอีกด้านหนึ่ง recombinants เหล่านี้ถูกแยกออกโดยการตรวจจับผลิตภัณฑ์ที่คาดหวังด้วย ทั้งสอง โพรบภายนอก 3' และโพรบภายนอก 5' ด้านที่เกิดการรวมตัวใหม่ที่คล้ายคลึงกันจะให้รูปแบบที่คาดหวังและกำหนดเป้าหมายใน Southern blot แต่ด้านที่ซ้ำกันจะให้รูปแบบประเภท wild

ในกลยุทธ์การกำหนดเป้าหมายแบบมีเงื่อนไขและแบบจุดกลายพันธุ์ องค์ประกอบลำดับทางวิศวกรรม (การกลายพันธุ์แบบจุดหรือไซต์ loxP) ที่ระยะห่างจากนีโอคาสเซ็ตต์อาจไม่รวมอยู่ด้วย สิ่งนี้สามารถเกิดขึ้นได้เนื่องจากการรวมตัวกันใหม่เกิดขึ้นภายใน ระหว่างองค์ประกอบและนีโอ ดังนั้น กลยุทธ์สำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์แบบมีเงื่อนไขและแบบจุดจึงต้องรวมวิธีการในการตรวจจับองค์ประกอบที่อยู่ห่างจากนีโอ

การทำให้เป็นเส้นตรงเวกเตอร์

เวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายถูกทำให้เป็นเส้นตรงก่อนการทรานส์เฟกชัน ดังนั้นจำเป็นต้องมีการจัดเตรียมสำหรับลำดับการจดจำที่ไม่ซ้ำใครเพื่อทำให้เวกเตอร์เป็นเส้นตรง ตามหลักการแล้ว ไซต์นี้ถูกวางในลักษณะที่ว่าเมื่อเวกเตอร์ถูกตัด เวกเตอร์จะมีแขนข้างหนึ่งคล้ายคลึงกันที่ปลายด้านหนึ่ง และที่ปลายอีกด้านหนึ่ง กระดูกสันหลังของเวกเตอร์อยู่ภายนอกยีน tk

การประกอบเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย

เราไม่ได้จัดเตรียมโปรโตคอลที่อธิบายการสร้างเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมาย แต่เทคโนโลยีที่เกี่ยวข้องนั้นพบได้ทั่วไปในการจำลองย่อยของชีววิทยาระดับโมเลกุลส่วนใหญ่ มีบริษัทหลายแห่งที่จะสร้างเวคเตอร์การกำหนดเป้าหมายโดยมีค่าธรรมเนียม พลาสมิดที่มีมาร์กเกอร์แบบเลือกได้แบบนีโอขนาบข้างด้วยไซต์ loxP, pflox (19) และมาร์กเกอร์แบบเลือกได้ tk, pPNT (20) ได้จากห้องทดลองที่มีแหล่งกำเนิด ติดต่อเราเพื่อขอรายละเอียด


บทสรุป

การแก้ไขยีนที่แม่นยำในสปีชีส์พืชผลเป็นทางเลือกแทนการทรานส์เจเนซิสแบบดั้งเดิม ซึ่ง DNA แปลกปลอมถูกแทรกเข้าไปในจีโนมพืชเพื่อสร้างลักษณะที่มีคุณค่า [24, 25] ในขณะที่การแก้ไขยีนและการแปลงยีนเร่งการพัฒนาลักษณะ ในบางกรณี การแก้ไขยีนนำไปสู่พืชผลที่ไม่มี DNA แปลกปลอม และด้วยเหตุนี้จึงอาจเป็นอุปสรรคต่อการควบคุมน้อยลงสำหรับการใช้งานพันธุ์ มีการผลิตพืชผลไม่กี่ชนิดโดยใช้นิวคลีเอสเฉพาะพื้นที่เพื่อสร้างการกลายพันธุ์ที่เป็นเป้าหมายผ่านการซ่อมแซมส่วนที่ขาดโดย NHEJ [26–29] อย่างไรก็ตาม ในการใช้ประโยชน์จากศักยภาพของการแก้ไขยีนได้อย่างเต็มที่ จำเป็นต้องมีวิธีการที่มีประสิทธิภาพสำหรับการดัดแปลงยีนอย่างแม่นยำ ตัวอย่างเช่น เพื่อสร้างอัลลีลใหม่โดยการแนะนำการกลายพันธุ์ของจุดในกรณีที่ไม่ต้องการให้เกิดการน็อคเอาท์ของยีน การศึกษาของเราแสดงตัวอย่างวิธีการดังกล่าวในการสร้างต้นมะเขือเทศที่ดัดแปลงโดย GT เมื่อเทียบกับวิธี GT อื่นๆ ในพืช [6, 16] การใช้ geminivirus replicons จะสร้างพืชที่ดัดแปลงจีโนมโดยไม่จำเป็นต้องรวมเอาทรานส์ยีนที่เสถียร ซึ่งจะต้องถูกแยกออกจากกันในรุ่นต่อๆ ไปเพื่อผลิตสายพืชที่ไม่ดัดแปลงพันธุกรรม เราแสดงให้เห็นว่าเจมิไนไวรัสเวคเตอร์เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับ GT ในมะเขือเทศ และเมื่อใช้ร่วมกับรีเอเจนต์ TALEN หรือ CRISPR/Cas9 พวกมันทำให้สามารถกำหนดเป้าหมายของลำดับใดๆ ก็ได้ในจีโนมที่กำหนด ทำให้สามารถขยายเทคโนโลยีนี้ไปยังสายพันธุ์พืชผลอื่นๆ เพื่อสร้างคุณค่า ลักษณะ


จีโนมของพฤติกรรมการหาโฮสต์

แนวคิดของความจุเวกเตอร์พิจารณาผลรวมของปฏิสัมพันธ์ระหว่างเวกเตอร์กับโฮสต์และปรสิต ซึ่งรวมถึงความเร่งของสายพันธุ์เวกเตอร์ที่จะกินอย่างพิเศษบนโฮสต์ที่กำหนด ขนาดประชากรเวกเตอร์ ความไวต่อการติดเชื้อ และอัตราการรอดชีวิต [41] พารามิเตอร์การกำหนดลักษณะโฮสต์ โดยเฉพาะระดับของมานุษยวิทยา (การกัดของมนุษย์) จะส่งผลกระทบต่ออัตราการแพร่กระจายของเชื้อก่อโรคเฉพาะโฮสต์อย่างมาก ในทางกลับกัน เวกเตอร์ที่เลือดเลี้ยงอย่างฉวยโอกาสจะส่งผ่านเชื้อโรคที่จำเพาะต่อเจ้าบ้านอย่างมีประสิทธิภาพน้อยกว่า

พฤติกรรมการหาโฮสต์ระยะยาวและระยะกลาง ซึ่งกำหนดอย่างคร่าวๆ ว่าเกิดขึ้นนอกรัศมีไม่กี่เมตรรอบ ๆ โฮสต์ เกี่ยวข้องโดยตรงกับการดมกลิ่นที่เกี่ยวข้องกับโฮสต์และตัวชี้นำทางเคมีอื่น ๆ และส่งผลกระทบต่อความสามารถเวกเตอร์ของแมลงอย่างมาก ดังนั้น การสนับสนุนระดับโมเลกุลของปฏิกิริยาเคมีจึงเป็นประเด็นหลักสำหรับการศึกษาขั้นพื้นฐานและการควบคุมพาหะนำโรค เนื่องจากส่วนประกอบต่างๆ ของเครื่องจักรส่งสัญญาณเคมีมักจะถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นอย่างสูงภายในส่วนต่อที่จำเพาะ เช่น เสาอากาศ กระดูกขากรรไกรบน และลาเบลลัม โปรไฟล์ทรานสคริปโทมที่จำเพาะต่อเนื้อเยื่อจึงมีความจำเป็นสำหรับการวัดปริมาณของทรานสคริปต์ที่มิฉะนั้นจะเจือจางและอาจตรวจไม่พบในภาพรวมทั้งหมด การเตรียมร่างกายของ RNA ตรงกันข้ามกับความขัดสนสัมพัทธ์ของการศึกษาเกี่ยวกับอวัยวะในอาหาร การหาปริมาณความอุดมสมบูรณ์ของตัวรับเคมีโดย RNA-seq ได้ดำเนินการอย่างครอบคลุมในหลายส่วนต่ออวัยวะรับกลิ่นที่สำคัญของ หนึ่ง. แกมเบีย [42], C. quinquefasciatus [43], เอ๋. อียิปต์ [38], หนึ่ง. รูปสี่เหลี่ยม [37], Cimex lectularius [44] และ ต. brasiliensis [28].

การศึกษา RNA-seq เบื้องต้นของ หนึ่ง. แกมเบีย เสาอากาศแสดงให้เห็นว่าระดับของตัวรับเคมีในเพศชายโดยรวมต่ำกว่าในเพศหญิง การสังเกตนี้ส่วนใหญ่เกิดจากความแตกต่างระหว่างเพศของหนวดเคราที่มีอยู่ระหว่างตัวเมียที่ป้อนเลือดและเพศผู้ที่ไม่ให้อาหาร แต่ข้อมูลการแสดงออกของอาร์เอ็นเอยังเผยให้เห็นการค้นพบที่น่าประหลาดใจว่าความหลากหลายและความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของตัวรับเคมีนั้นได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างน่าทึ่ง ระหว่างเพศ [42]. ใน .ด้วย หนึ่ง. แกมเบียการศึกษาหลักสูตรตามเวลาของ RNA-seq เปิดเผยความสัมพันธ์ระหว่างความแตกต่างของการถอดรหัสของตัวรับเคมีและชีววิทยาการสืบพันธุ์ ริงเกอร์และคณะ [45] สังเกตว่า โพรไฟล์การถอดเสียงของตัวรับกลิ่น (OR) แต่ละตัวในหนวดตัวเมียเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยเมื่อรับประทานเลือดป่น แต่เมื่อพิจารณาโดยรวมแล้ว ผลสะสมของการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยเหล่านี้แสดงให้เห็นว่ามีการเปลี่ยนแปลงโดยรวมในการตอบสนองต่อกลิ่นใน ล่วงหน้าของการวางไข่ ในทำนองเดียวกัน ความแตกต่างที่ละเอียดอ่อนในโปรไฟล์ OR ทรานสคริปโทมถูกรายงานในการศึกษาสองชิ้นที่เปรียบเทียบยุงสายพันธุ์ที่มีความแตกต่างทางฟีโนไทป์ในแง่ของความชอบของโฮสต์ การเปรียบเทียบครั้งแรกระหว่าง หนึ่ง. แกมเบีย และสายพันธุ์พี่น้องที่เป็นมานุษยวิทยาน้อยกว่า หนึ่ง. รูปสี่เหลี่ยม ชี้ไปที่การเพิ่มคุณค่าโดยรวมของการถอดเสียงสำหรับ OR หลายรายการใน หนึ่ง. แกมเบีย ที่คาดว่าจะดำเนินการพร้อมกันเพื่อเพิ่มการตอบสนองต่อกลิ่นที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์ [37] ในการศึกษาครั้งที่สอง ความแตกต่างในโปรไฟล์การถอดเสียงของเสาอากาศของสองชนิดย่อยของ เอ๋. อียิปต์ ที่แตกต่างกันในความชอบของพวกเขาในการกินมนุษย์ได้รับการตรวจสอบ ผลลัพธ์ชี้ให้เห็นถึงความแตกต่างที่น่าสังเกตทั้งในความอุดมสมบูรณ์และการตอบสนองเชิงหน้าที่ของ OR ตัวเดียว ซึ่งบ่งชี้ว่ามันอาจจะเชื่อมโยงกับมานุษยวิทยาที่แสดงโดยหนึ่งชนิดย่อย [19, 38] ไม่ว่าระดับที่แตกต่างกันของมานุษยวิทยาใน เอ๋. อียิปต์ สามารถนำมาประกอบกับตัวรับเคมีตัวเดียวมากกว่าที่จะเป็นชุดของยีนตัวรับเคมีบำบัดหรือยีนอื่น ๆ ยังคงเป็นคำถามเปิด

ตรงกันข้ามกับของยุง หนวดของตัวเรือด ค. lectularius มีขนที่รับกลิ่นน้อยมาก (sensilla) และด้วยเหตุนี้จึงแสดง OR ค่อนข้างน้อย [44] การค้นพบนี้สอดคล้องกับวิถีชีวิตนอกระบบของตัวเรือด โดยที่พวกมันใช้ชีวิตอยู่ในบริเวณใกล้เคียงกับโฮสต์ของพวกมัน ดังนั้นจึงไม่เกี่ยวข้องกับการหาโฮสต์ระยะยาว ภาพใหญ่ที่โผล่ออกมาจากการศึกษาทั้งการถอดเสียงเป็นคำที่คัดลอกมาจากอวัยวะรับความรู้สึกทั้งในแมลงเวกเตอร์และแมลงที่ไม่ใช่เวกเตอร์สะท้อนความต้องการในการดมกลิ่นของสิ่งมีชีวิต การเปลี่ยนแปลงในระดับของการถอดเสียงเหล่านี้ซึ่งให้ระดับของพลาสติกที่ตอบสนองต่อสารเคมีสามารถปรับเปลี่ยนสัญญาณการรับกลิ่นส่วนปลายเพิ่มเติมเพื่อตอบสนองต่อสัญญาณทางสรีรวิทยาและชีวภาพ กลไกดังกล่าวอาจเป็นประโยชน์สำหรับการปรับตัวเฉพาะที่เป็นส่วนประกอบสำคัญของการเก็งกำไร ที่สำคัญ เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงในโพรไฟล์การถอดรหัสมักเกิดขึ้นโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงใดๆ ภายในรายการยีนเกี่ยวกับเคมีบำบัดพื้นฐานของสิ่งมีชีวิต การศึกษาเชิงปริมาณ RNA-seq-based ของเนื้อเยื่อเคมีจึงเป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับการตรวจสอบความแตกต่างทางฟีโนไทป์ที่เกี่ยวข้องกับการดมกลิ่นที่ละเอียดอ่อน แต่มีความสำคัญอย่างยิ่ง .


วัสดุและวิธีการ

ยุง

ยุงก้นปล่อง stephensi ยุงสายพันธุ์ (UCISS2018) จากอนุทวีปอินเดีย (ของขวัญจาก M. Jacobs-Lorena, Johns Hopkins University) [71] ได้รับการดูแลในสภาพแมลง (27 ° C และความชื้น 77%) โดยมีช่วงแสง 12 ชั่วโมง: 12 h dark รวมทั้งรุ่งเช้าและค่ำ 30 นาทีที่ University of California, Irvine (UCI) เลี้ยงตัวอ่อนในน้ำกลั่นและป้อนอาหารปลา TetraMin® บดผสมกับผงยีสต์ ผู้ใหญ่มีการเข้าถึงสารละลายซูโครสอย่างไม่จำกัด (10% โดยน้ำหนัก/ปริมาตร) และตัวเมียได้รับอาหารจากเลือดซึ่งประกอบด้วยเลือดลูกวัวที่สกัดแล้ว (Colorado Serum Co., เดนเวอร์) ผ่านระบบให้อาหารแบบเมมเบรนของ Hemotek® เราสร้างสายพันธุ์ isofemale จากอาณานิคมและผสมพันธุ์โดยผสมพันธุ์เป็นเวลา 5 รุ่นก่อนการจัดลำดับ

การจัดลำดับจีโนม

จีโนม DNA จากยุงตัวผู้และตัวเมียที่โตเต็มวัย 70 ตัวถูกสกัดโดยใช้ Qiagen Blood & amp Cell Culture DNA Midi Kit ตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [72] จีโนม DNA ถูกตัดด้วยเข็มทู่ขนาด 21 จำนวน 10 ครั้ง ตามด้วยเข็มปลายทู่ขนาด 24 จำนวน 10 ครั้ง เราสร้างการอ่าน PacBio โดยใช้ 31 SMRTcells บนแพลตฟอร์ม RSII (เคมี P6-C4) ที่ UC San Diego Genomics Core และ 2 SMRTcells บนแพลตฟอร์ม Sequel I ที่ Nucleome (ไฮเดอราบาด อินเดีย) จากจีโนม DNA เดียวกัน เรายังสร้างการอ่านแบบคู่ขนาน 300bp ขนาด 3.7 GB ที่แกนจีโนมิกของ UC San Diego และ 32.37 GB ที่อ่านค่าแบบจับคู่ 150-bp Illumina จาก Nucleome เพื่อระบุกลุ่มที่เชื่อมโยง Y เราได้สร้าง Illumina ที่จับคู่แบบคู่ 27.8 GB และ 28.5 GB 100 bp จาก DNA จีโนมชายและหญิงตามลำดับที่ UCI Genomics High-Throughput Facility (GHTF)

การแยกและการจัดลำดับอาร์เอ็นเอ

RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากตัวอย่างทั้งหมด 6 ตัวอย่างที่เตรียมจากบุคคลที่รวมกลุ่ม: ชายที่เลี้ยงด้วยน้ำตาลอายุ 5-7 วัน, ผู้หญิงที่กินน้ำตาลอายุ 5-7 วัน และตัวเมียที่เลี้ยงด้วยเลือด 3-6 ชั่วโมง, 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง และ 72 ชั่วโมงหลังให้อาหาร สระชายมี 15 คน สระหญิงมี 10 คน ตัวอย่างทั้งหมดแยกได้จากกรงยุงเดียวกัน ในการทำเช่นนั้น เก็บตัวอย่างเพศชายและเพศหญิงที่ป้อนน้ำตาล และให้อาหารเลือดเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตัวเมียที่ไม่ได้รับอาหารจะถูกลบออกจากกรงและตัวเมียที่เลี้ยงด้วยเลือดจะถูกดึงออกมาในแต่ละจุดเวลาที่ระบุ ในช่วงเวลาของการรวบรวม ตัวอย่างถูกแช่ใน 500 ไมโครลิตรของ RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen) และเก็บไว้ที่ 4 °C รวม RNA ถูกสกัดโดยใช้ RNeasy Mini Kit (Qiagen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ Total RNA จากเนื้อเยื่อสัตว์ ตัวอย่างที่สกัดออกมาได้รับการบำบัดด้วย Kit (Ambion) ที่ปราศจาก DNA เพื่อขจัดร่องรอยของจีโนม DNA สุดท้าย ทำความสะอาดตัวอย่างโดยใช้ RNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research) การเลือก mRNA, การสังเคราะห์ cDNA และการเตรียมไลบรารี Iso-Seq ดำเนินการที่ UCI GHTF ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Pacific Biosciences) สำหรับแต่ละตัวอย่างจากหกตัวอย่าง การอ่าน SMRTcell ของ Iso-seq หนึ่งรายการถูกสร้างขึ้นบนแพลตฟอร์ม Sequel I

การประกอบจีโนม

เราใช้การอ่านแบบยาว 42.4 GB หรือ 180✕ (สมมติว่าจีโนมเดี่ยวขนาด G = 235 Mb) เพื่อสร้างชุดร่างสองชุดของ หนึ่ง. stephensi ใช้ Canu v1.7 [73] และ Falcon v2.1.4 [74] เหยี่ยวนกเขาถูกใช้เพื่อประกอบบริเวณเฮเทอโรไซกัส (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S1) ซึ่งต่อต้านคานู เราเติมช่องว่างในชุดประกอบ Canu โดยใช้ส่วนต่อประสานหลักของ Falcon ตามวิธีการผสานสองขั้นตอนด้วย Quickmerge v0.3 โดยที่ชุดประกอบ Canu ถูกใช้เป็นชุดอ้างอิงในขั้นตอนการรวมแรก [72, 75] แอสเซมบลีที่เป็นผลลัพธ์ถูกประมวลผลด้วย FinisherSC (v2.1) เพื่อลบส่วนที่ซ้ำซ้อนและเพื่อเติมช่องว่างเพิ่มเติมด้วยการอ่านข้อมูลดิบ [76] แอสเซมบลี PacBio นี้ (613 contigs, contig N50 = 38.1 Mb, ทั้งหมด 257.1 Mb) ได้รับการขัดสองครั้งด้วย Arrow (smrtanalysis v5.2.1) และสองครั้งด้วย Pilon v1.22 โดยใช้

400X (80 Gb) 150 bp PE Illumina อ่านจากชุดข้อมูล Illumina สามชุดของเรา [77]

การระบุการกลายพันธุ์หลายรูปแบบ

เพื่อระบุตัวแปรที่แยกจากกันในสายพันธุ์ที่จัดลำดับ เราได้จัดแนว contigs haplotype สำรอง (a_ctg.fa) ที่ระบุโดย Falcon กับชุดประกอบนั่งร้าน จากนั้นเราเรียกอินเดลโดยใช้ SVMU v0.2 (ตัวแปรโครงสร้างจาก MUmmer) อินเดลถูกทำเครื่องหมายเป็น TE โดยอิงจากการทับซ้อนกับ Repeatmasker ที่มีคำอธิบายประกอบ TE ในการประมาณค่า heterozygosity เราจับคู่ Illumina ที่อ่านกับโครงโครโมโซมโดยใช้ Bowtie2 (v2.2.7) และแปลงการจัดตำแหน่งเป็นไฟล์ bam ที่จัดเรียงโดยใช้ SAMtools (v1.9) ไฟล์ VCF ที่มี SNP และอินเดลขนาดเล็กถูกสร้างขึ้นโดยใช้ช่องฟรีเบย์ (v1.3.2-40-gcce27fc) และความหลากหลายของนิวคลีโอไทด์แบบคู่ (pi) ถูกคำนวณผ่านหน้าต่างขนาด 25-kb โดยใช้ vcftools (vcftools --window-pi 25,000 v0.1.14 v0.1.14)

การชะล้างลำดับจุลินทรีย์

จุลินทรีย์ในแอสเซมบลีถูกระบุโดยใช้ Kraken v2.0.7-beta [78] (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ข้อความเสริม) [79,80,81,82] ซึ่งกำหนดป้ายกำกับการจัดหมวดหมู่ให้กับ 613 contigs (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S4 ). Kraken จับคู่ k-mers (ค่าเริ่มต้น 31–35 nt) จากลำดับ 613 ต่อกับฐานข้อมูลจากชุดโดเมนหกชุด: แบคทีเรีย อาร์เคีย ไวรัส UniVec_Core เชื้อรา และโปรโตซัวจากศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) และจีโนม ชุดรวมถึงยุงอ้างอิงตัวแทนจาก VectorBase v2019-02 และ แมลงหวี่ จีโนม (NS = 24 ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S9) ฐานข้อมูลจะจับคู่ k-mers กับบรรพบุรุษร่วมที่ต่ำที่สุด (LCA) ของจีโนมทั้งหมดที่ทราบว่ามี k-mer ที่กำหนด ป้ายกำกับ Kraken สำหรับแต่ละ contig ถูกจัดประเภทเพิ่มเติมเป็นอย่างใดอย่างหนึ่ง ยุงก้นปล่อง, ปนเปื้อน (ไม่ใช่ยุงก้นปล่อง) หรือไม่จำแนกประเภท (ไม่มีการโจมตีในฐานข้อมูล) (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S4) เพื่อป้องกันผลบวกที่ผิดพลาดในผลลัพธ์ ลำดับที่มีความซับซ้อนต่ำในชุดประกอบถูกปิดบังด้วยหน้ากากกันฝุ่น (blast v2.8.1) [83] ก่อนที่จะรัน Kraken จีโนมของยลของ หนึ่ง. stephensi ถูกระบุโดยการจัดแนวไมโทจีโนมที่มีอยู่ (GenBank No. KT899888) กับ contig โดยใช้ nucmer ใน MUMmer v4.0.0b [84]

นั่งร้าน

ในการ de novo นั่งร้านจุลินทรีย์ที่กำจัดการปนเปื้อน 566 contigs (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ข้อความเสริม) [85,86,87,88,89] เราได้รวบรวมข้อมูล HiC จากยุงตัวผู้และตัวเมียที่โตเต็มวัยที่เติมเครื่องหมาย 1 มล. ของ 1.5- มล. หลอด Eppendorf เราแช่แข็งยุงที่โตเต็มวัยแล้วส่งไปที่ Arima Genomics (ซานดิเอโก) เพื่อสร้างห้องสมุด HiC โดยใช้ชุดอุปกรณ์ Arima ไลบรารีนี้ถูกจัดลำดับบนโฟลว์เซลล์เดียวของเครื่องมือ Illumina HiSeq 2500 ซึ่งสร้างการอ่านแบบคู่ของ Illumina 150-bp ขนาด 326 GB เราจับคู่ HiC อ่านกับ หนึ่ง. stephensi contigs โดยใช้ Juicer v1.5.6 [90] และใช้ contact map ที่เป็นผลลัพธ์ในการนั่งร้าน contig โดยใช้ 3D-DNA v180922 [91] ลำดับและทิศทางของโครโมโซมทั้งสามถูกตรวจสอบโดย nucmer ในการจัดตำแหน่ง MUMmer v4.0.0b ของ 20 ยีน/โพรบข้อมูลแผนที่ทางกายภาพ (X, 5 โพรบ 2, 7 3, 8) ที่สร้างขึ้นจากการเรืองแสงในแหล่งกำเนิดไฮบริด (FISH) บนโพลีทีน โครโมโซม (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S10 ไฟล์เพิ่มเติม 9: ตารางที่ S10) [18] เทียบกับชุดโครโมโซม Hi-C โพรบที่จัดตำแหน่งแสดงเอกลักษณ์ของลำดับ 83–100% ในแอสเซมบลีของเรา ยืนยันการตั้งชื่อโครโมโซมที่เราใช้ตามซินเทนนี (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S10 ไฟล์เพิ่มเติม 9: ตาราง S10)

การประมาณค่า QV และสถิติการประกอบ

ในการประมาณอัตราความผิดพลาดในการประกอบขั้นสุดท้าย เราได้แมป Illumina ที่จับคู่แล้วที่อ่านไปยังแอสเซมบลีโดยใช้ bwa mem (bwa v0.7.17-5) การจัดตำแหน่งถูกแปลงเป็นรูปแบบ bam แล้วจัดเรียงโดยใช้ SAMtools (v.1.8-11) เราเรียกตัวแปรโดยใช้ freeBayes v0.9.21 [92] (คำสั่ง: freebayes -C 2 -0 -O -q 20 -z 0.10 -E 0 -X -u -p 2 -F 0.75) และปฏิบัติตามแนวทางของ [73 ] เพื่อคำนวณ QV (10*-log10(2981/250,632,892)) โดยสังเขป เรานับจำนวนฐานที่ประกอบด้วยตัวแปร homozygous ในแอสเซมบลี (2981) แล้วหารด้วยฐานที่แมปทั้งหมดที่มีความครอบคลุมอย่างน้อยสาม (250,632,892) เราใช้ QUAST v5.0.3 เพื่อรับสถิติการประกอบ [93] จาก 250 Mb, 205 Mb (82%) ถูกจัดวางในโครงนั่งร้านที่มีความยาวโครโมโซมสามโครงซึ่งสอดคล้องกับโครงสร้างทั้งสาม หนึ่ง. stephensi โครโมโซม (chrX, 22.7 Mb chr2, 93.7 Mb chr3, 88.7 Mb) เราระบุ 66 contig ที่ไม่ได้จัดวางเป็น haplotigs สำรอง (66 contigs = 7.2 Mb) โดยใช้การจัดตำแหน่ง mummer ของ contig กับโครโมโซมหลัก นอกจากนี้ 103 (8.6 Mb) จาก 458 (35.9 Mb) contig ที่ไม่ได้จัดหรือไม่จัดประเภทถูกระบุว่าเป็น haplotig สำรองโดยใช้ชุดข้อมูล BUSCO v4.1.4 Diptera odb10 [23] และซอฟต์แวร์ Purge_dups v1.0 [94] (ตารางที่ 1) (ไฟล์เพิ่มเติม 10: ตาราง S12) แผนที่ Hi-C สุดท้ายถูกแสดงภาพโดยใช้ HiCExplorer v3.4.2 [95] เราประเมินสัดส่วนของจีโนมเดี่ยวนั่งร้านโดยใช้ทรัพยากรที่เปิดเผยต่อสาธารณะใน หนึ่ง. stephensi และ หนึ่ง. แกมเบีย ขนาดจีโนม [96, 97]. NS มูลค่าของ หนึ่ง. stephensi คือ 0.24 และของ หนึ่ง. แกมเบีย คือ 0.27 ขึ้นอยู่กับอัตราส่วนอัตราต่อรองของขนาดจีโนมของทั้งสองชนิดโดยประมาณจากของพวกเขา ค่านิยมและ หนึ่ง. แกมเบีย ขนาดจีโนม (265 Mb) เราอนุมานขนาดจีโนมสำหรับ หนึ่ง. stephensi เป็น

คำอธิบายประกอบซ้ำ

เราได้สร้างไลบรารี TE แบบกำหนดเองโดยใช้ EDTA (Extensive de-novo TE Annotator) ไปป์ไลน์ [98] และ Repeatmodeler v2.0.0 (http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler/) เพื่อใส่คำอธิบายประกอบ TE LTR retrotransposons และองค์ประกอบ DNA ถูกระบุ de novo โดยใช้ EDTA แต่เนื่องจาก EDTA ไม่ได้ระบุ retrotransposons ที่ไม่ใช่ LTR จึงมีการใช้ Repeatmodeler เพื่อระบุสิ่งเหล่านี้ ไลบรารีทั้งสองถูกรวมเข้าด้วยกัน และไลบรารีสุดท้ายถูกใช้กับ Repeatmasker (v4.0.7) เพื่อใส่คำอธิบายประกอบ TE ทั่วทั้งจีโนม การทำซ้ำแบบตีคู่ถูกใส่คำอธิบายประกอบโดยใช้ Tandem Repeat Finder v4.09 [99] ระบุจำนวนและจำนวนสำเนาของไมโครแซทเทิลไลท์ขนาดเล็กและมาโครที่ครอบคลุมในแต่ละหน้าต่างที่ไม่ซ้อนทับกัน 100 กิโลไบต์ของโครโมโซมทั้งสาม การจำแนกประเภทดาวเทียมทำขึ้นตามที่อธิบายไว้ใน [18] โดยสังเขป การทำซ้ำแบบตีคู่ถูกจัดประเภทเป็นดาวเทียมขนาดเล็ก (1–6 ฐาน) ขนาดเล็ก (7–99 ฐาน) และมาโคร (≥ 100 ฐาน) ดาวเทียมขนาดเล็กและมาโครได้รับการพิจารณาก็ต่อเมื่อมีหมายเลขสำเนามากกว่า 2 การทำซ้ำอย่างง่ายทั้งสามนี้จะถูกพิจารณาก็ต่อเมื่อมีความเหมือนกันของลำดับอย่างน้อย 80% และตั้งค่าการตัดบางส่วน (≥ 2 หมายเลขสำเนา ≥ 80% เอกลักษณ์) เพื่อคัดกรองความมั่นใจสูงซ้ำแล้วซ้ำอีกจึงคำนวณความอุดมสมบูรณ์โดยรวม

คำอธิบายประกอบโดยใช้ Iso-Seq

ทั้งหมด 6 ตัวอย่าง (หญิง 5 คน ชาย 1 คน) จาก หนึ่ง. stephensi ยุงถูกใช้สำหรับการจัดลำดับ Iso-Seq (ดูหัวข้อ “การแยกอาร์เอ็นเอและการจัดลำดับ”) ข้อมูลการจัดลำดับโมเลกุลยาวของ Raw PacBio ถูกประมวลผลโดยใช้ไปป์ไลน์ Iso-Seq3 การวิเคราะห์ SMRT v7.0.0 [100] โดยสังเขป CCS ถูกใช้เพื่อสร้างการอ่านแบบเต็มความยาว (FL) ซึ่งมีการจัดลำดับไพรเมอร์ 5′-end, polyA tail และไพรเมอร์ 3′-end ทั้งหมด จากนั้น Lima ใช้เพื่อระบุและลบ 5′- และ 3′-end cDNA ไพรเมอร์จาก FL อ่าน ไฟล์ bam ที่เป็นผลลัพธ์ได้รับการประมวลผลด้วย Iso-Seq3 เพื่อปรับแต่งและจัดกลุ่มการอ่าน ซึ่งถูกขัดเกลาด้วย Arrow ไปป์ไลน์ใหม่นี้ส่งออกไฟล์ FASTQ ที่มีไอโซฟอร์มแบบเต็มความยาวที่แก้ไขข้อผิดพลาดสองชุด: (i) ชุดคุณภาพสูงมีไอโซฟอร์มที่รองรับโดยการอ่าน FL อย่างน้อยสองชุดโดยมีความแม่นยำอย่างน้อย 99% และ (ii) ชุดคุณภาพต่ำประกอบด้วยไอโซฟอร์มที่มีความแม่นยำ < 99% ที่เกิดขึ้นเนื่องจากการครอบคลุมไม่เพียงพอหรือการถอดเสียงที่หายาก ไอโซฟอร์มคุณภาพสูงถูกยุบด้วย Cupcake v10.0.1 และถูกใช้ใน Talon v5.0 สำหรับคำอธิบายประกอบ [101] เรารวมไอโซฟอร์มคุณภาพสูงเข้ากับหลักฐานอื่นๆ โดยใช้ MAKER2 v2.31.10 เพื่อสร้างคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย (ดูด้านล่าง)

คำอธิบายประกอบ MAKER

คำอธิบายประกอบสุดท้ายของจีโนมดำเนินการโดยใช้ MAKER2 v2.31.10 [102] ซึ่งรวมหลักฐานเชิงประจักษ์และการทำนายยีน ab initio เพื่อสร้างคำอธิบายประกอบขั้นสุดท้าย เราใช้ MAKER2 สำหรับการทำนายยีนสามรอบ อย่างแรก ข้อมูล Iso-Seq ถูกใช้เป็นหลักฐานสำหรับการฝึก MAKER2 สำหรับการทำนายยีน เรายังใช้ข้อมูลลำดับการถอดรหัสและเปปไทด์จาก หนึ่ง. แกมเบีย (PEST4.12) และ หนึ่ง. funestus (FUMOZ 3.1) เป็นหลักฐานทางเลือกเพื่อสนับสนุนแบบจำลองยีนที่คาดการณ์ไว้ ก่อนที่จะมีคำอธิบายประกอบของยีน การทำซ้ำถูกปิดบังโดยใช้ RepeatMasker ที่รวมอยู่ใน MAKER2 การทำแผนที่ของ EST และหลักฐานโปรตีนกับจีโนมโดย MAKER2 โดยใช้ BLASTn และ BLASTx ตามลำดับ ให้ผล 12,324 ยีนที่ถ่ายทอด 14,888 mRNAs ผลลัพธ์ของแบบจำลองยีนรอบแรกถูกใช้สำหรับรอบที่สอง โดยที่ MAKER2 ใช้ SNAP และ AUGUSTUS สำหรับการทำนายยีน ab initio ถัดไป มีการดำเนินการคาดการณ์ SNAP และ AUGUSTUS อีกรอบเพื่อสังเคราะห์หมายเหตุประกอบขั้นสุดท้ายที่สร้างยีน 14,966 ยีน ถ่ายทอด 16,559 mRNAs โดยรวมแล้ว เราได้ระบุเอ็กซอน 56,388 รายการ, UTR ปลาย 9791 5′-end, 9290 3′end UTR และ 503 tRNA (ตารางที่ 1 ดูส่วน "วัสดุและวิธีการ") นอกจากนี้เรายังคาดการณ์ว่าจะเริ่มมี mRNAs/โปรตีนเพิ่มขึ้นอีก 14,192 mRNAs/โปรตีน แต่เนื่องจากการสนับสนุนที่อ่อนแอจึงไม่ได้รับการพิจารณา บันทึกย่อของ MAKER ขั้นสุดท้ายได้รับการประเมินโดยใช้เมตริกทางสถิติของ AED และ Pfam ที่แนะนำ

แบบจำลองยีนได้รับการอธิบายเชิงหน้าที่ใน MAKER2 v2.31.10 ผ่านการค้นหา BLAST ที่คล้ายคลึงกันกับฐานข้อมูล UniProt-Sprot ในขณะที่โดเมนในโปรตีนที่มีคำอธิบายประกอบถูกกำหนดจากฐานข้อมูล InterProScan (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ข้อความเสริม) เราเปรียบเทียบคำอธิบายประกอบแบบจำลองยีนของเรากับชุดประกอบแบบร่างโดยใช้ OrthoFinder v2.3.7 [103] การวิเคราะห์การตกแต่ง GO ดำเนินการใน PANTHER v15.0 โดยใช้ชุดข้อมูลหมายเหตุประกอบกระบวนการทางชีวภาพ PANTHER GO-SLIM [104] นอกจากนี้ 1% orthologous ด้านบนของ หนึ่ง. stephensi ลำดับโปรตีนของยีนที่ถูกควบคุมใน หนึ่ง. แกมเบีย ถูกระบุโดย OrthoFinder v2.3.7

การตรวจสอบและการหาปริมาณด้วย RNAseq และ Iso-Seq

ในการหาปริมาณจำนวนมากของการถอดเสียงโดยใช้การอ่าน Iso-seq การอ่านข้อมูลดิบถูกแมปกับการประกอบจีโนมโดยใช้ minimap2 [105] และวัดปริมาณการถอดรหัสเฉพาะของยีนโดยใช้ bedtools โดยกำหนดให้ Iso-seq อ่านคาบเกี่ยวกันอย่างน้อย 75% ของความยาวยีน ใส่คำอธิบายประกอบด้วย TALON v5.0 (ความครอบคลุมเครื่องมือนอน -mean -F 0.75 -a talon.gff -b minimap.bam) [106] เพื่อพิจารณาความผันแปรอันเนื่องมาจากผลลัพธ์ของการจัดลำดับต่อ SMRTcell ในขณะที่คำนวณความอุดมสมบูรณ์ของการถอดรหัส ความครอบคลุม Iso-seq ของแต่ละยีนจะถูกหารด้วยปัจจัยการทำให้เป็นมาตรฐาน ซึ่งคำนวณโดยการหารจำนวนการอ่านทั้งหมดสำหรับแต่ละตัวอย่างด้วยจำนวนการอ่านทั้งหมดจากค่าที่ไม่ได้ป้อน ตัวอย่างผู้หญิง เพื่อระบุยีนที่ควบคุมขึ้นหรือลงเนื่องจากการป้อนเลือด เราได้เปรียบเทียบความอุดมสมบูรณ์ของการถอดรหัสของเพศหญิงวัย 5-7 วันก่อนและหลังมื้ออาหารด้วยเลือด เพื่อระบุยีนที่การแสดงออกได้รับผลกระทบอย่างรุนแรงจากเลือดปน เราได้จัดลำดับความแตกต่างของความอุดมสมบูรณ์ของการถอดรหัสสำหรับยีนทั้งหมดที่แสดงความอุดมสมบูรณ์ของการถอดรหัสที่ไม่เป็นศูนย์ในตัวอย่างใดตัวอย่างหนึ่งจากสองตัวอย่าง ที่นี่ เรารายงานยีนที่อยู่ใน 1% แรกของความแตกต่างของระดับการถอดรหัสซึ่งสอดคล้องกับยีนทั้งหมดที่แสดง >

การเพิ่มขึ้นหรือลดลง 64 เท่าของความอุดมสมบูรณ์ของการถอดเสียงระหว่างสองตัวอย่าง

เพื่อให้ได้ระดับการถอดรหัสของยีนที่เชื่อมโยงกับ Y จากตัวอ่อน ตัวอ่อน และตัวเต็มวัย เราใช้ข้อมูล RNA-seq ที่เปิดเผยต่อสาธารณะ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตารางที่ S11) การอ่าน RNA-seq ถูกแมปกับจีโนมโดยใช้ HISAT2 และความครอบคลุมการอ่านต่อฐานคำนวณจากไฟล์ bam ที่เรียงลำดับโดยใช้ความลึกของ samtools นอกจากนี้ ไฟล์ bam ยังได้รับการประมวลผลด้วย stringtie เพื่อสร้างคำอธิบายประกอบการถอดเสียงเฉพาะตัวอย่างในรูปแบบ GTF [107] ไฟล์ GTF เฉพาะตัวอย่างถูกรวมเข้ากับ stringtie เพื่อสร้าง GTF สุดท้าย เพื่อให้ได้แบบจำลองยีนและการถอดเสียงไอโซฟอร์มของ kdr, stringtie ใส่คำอธิบายประกอบการถอดเสียงที่ครอบคลุมทั้ง ORF ที่คาดการณ์ไว้ทั้งหมดตามความคล้ายคลึงกันกับ ง. melanogaster para [108] ถูกนำมาใช้

การระบุยีนใหม่และองค์ประกอบซ้ำ

เพื่อระบุลำดับที่ไม่สมบูรณ์หรือขาดหายไปในลำดับที่ต่อเนื่องกันมากที่สุด หนึ่ง. stephensi แอสเซมบลีที่เผยแพร่ [18] คอนติกจากแอสเซมบลีแบบร่างถูกจัดแนวกับแอสเซมบลีใหม่โดยใช้ nucmer [84] และการจัดตำแหน่งเนื่องจากการทำซ้ำถูกกรองโดยใช้ตัวกรองเดลต้าเพื่อสร้างการแมป 1 ต่อ 1 (delta-filter -r -q ) ระหว่างสองชุดประกอบ ไฟล์เดลต้าที่เป็นผลลัพธ์ถูกแปลงเป็นรูปแบบการจัดตำแหน่งที่คั่นด้วยแท็บโดยใช้ยูทิลิตี้ show-cords ใน MUMmer (v4) เพื่อระบุลำดับ TE ที่มีอยู่ในการชุมนุมของเรา แต่ไม่มีใน Jiang et al (2014) เราใส่คำอธิบายประกอบ TE ในภายหลังโดยใช้ RepeatMasker และคำนวณจำนวนคลาสต่างๆ ของ TE (DNA, LTR, Long Interspersed Nuclear Elements หรือไม่ใช่ LTR) จากเอาต์พุตของ RepeatMasker นอกจากนี้ เรายังระบุลำดับ TE ในชุดประกอบของเราที่มีการแยกส่วนหรือขาดหายไปใน Jiang et al [18] แอสเซมบลี contig โดยมองหาลำดับ TE ที่ไม่สามารถแมปหรือแมปเพียงบางส่วนกับลำดับหลัง เพื่อระบุยีนที่กระจัดกระจายหรือขาดหายไปจาก Jiang et al. [18] ข้อมูล เรารวมสองแนวทางเสริมเข้าด้วยกัน อันดับแรก เราใช้การจัดตำแหน่งจีโนมแบบ 1 ต่อ 1 เพื่อระบุยีนที่แยกจากกัน > 1 contig ประการที่สอง เราจับคู่ลำดับโปรตีนที่มีคำอธิบายประกอบจากการศึกษาของเรากับลำดับโปรตีนที่รายงานใน Jiang et al โดยใช้ OrthoFinder v.2.3.7 [103] และระบุการถอดเสียงที่มีอยู่เฉพาะในการศึกษาของเรา เรารวมยีนเฉพาะที่พบโดยแต่ละวิธีเข้าไว้ด้วยกันเพื่อคำนวณจำนวนยีนที่ไม่สมบูรณ์หรือขาดหายไปก่อนหน้านี้ เพื่อขจัดข้อผิดพลาดในการประกอบในชุดประกอบใหม่อันเป็นสาเหตุของความคลาดเคลื่อนระหว่างสองชุดประกอบ การสุ่มเลือกคุณสมบัติ 20 รายการที่ไม่ตรงกันระหว่างชุดประกอบแต่ละประเภท และตรวจสอบด้วยตนเองใน IGV การอ่านแบบยาวอย่างน้อย 3 ครั้งซึ่งครอบคลุมคุณลักษณะทั้งหมดถูกใช้เป็นหลักฐานสำหรับการประกอบคุณลักษณะที่ถูกต้อง

บัตรประจำตัวของ Y contigs

เพื่อระบุส่วนที่เป็นสมมุติฐาน Y พบว่า k-mer เฉพาะตัวผู้และตัวเมียถูกระบุจากการอ่านค่า Illumina ที่ปลายคู่ชายและหญิงโดยใช้แมงกะพรุน [109] (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S11)ความหนาแน่นของ k-mer เพศผู้และเพศเมียสำหรับแต่ละ contig ถูกคำนวณ และ contig ที่แสดงความหนาแน่นที่สูงกว่าสองเท่าของ k-mer ที่จำเพาะเพศชายถูกกำหนดให้เป็น Y contig สมมุติฐาน ที่น่าสนใจคือ Serratia จีโนมที่เรารวบรวมยังแสดงให้เห็นการเสริมสมรรถนะของ k-mer เพศชายที่คล้ายคลึงกันกับกลุ่ม Y

การตรวจสอบการทดลองของ contig ที่ลิงก์ Y

วิธีการที่ใช้ k-mer-based เพื่อระบุ kmers เฉพาะเพศชายที่เกิดขึ้นในอัตราที่สูงกว่า kmers เฉพาะเพศหญิง 20 เท่าใน หนึ่ง. stephensi นั่งร้าน (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S11) เพื่อตรวจสอบลำดับสมมุติที่เชื่อมโยง Y ชายหรือหญิงอายุ 2-3 วันสิบคน หนึ่ง. stephensi ใช้ยุงต่อตัวในการทดลอง ดีเอ็นเอจีโนมถูกสกัดจากแต่ละตัวอย่างโดยใช้ DNeasy Blood and Tissue Kit (Cat # 69504) ไพรเมอร์เฉพาะยีน (Y15 ไปข้างหน้า (F)—ATT TTA GTT ATT TAG AGG CTT CGA, Y15 ย้อนกลับ (R)—GCG TAT GAT AGA AAC CGC AT Y22 F—ATG CCA AAA AAA CGG TTG CG, Y22 R—CTA GCT CTT GTA AAG AGT CAC CTT Y28 F—ATG CTA CAA AAC AGT GCC TT, Y28 R—TTA GGT CAG ATA TAG ACA CAG ACA CA) ได้รับการออกแบบตามลำดับจีโนมเพื่อขยายผลิตภัณฑ์≥ 500-bp โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ปฏิกิริยา. การขยายเสียงทำได้โดยใช้ 2X Master Mix ที่มีความแม่นยำสูง Q5 (Cat # M0492) แอมพลิคอนได้รับการแก้ไขในเจลอากาโรสและเปรียบเทียบแอมพลิฟายเออร์ตัวผู้กับตัวเมีย ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกชะด้วยเจลและเรียงลำดับแซงเจอร์ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S11) (Genewiz) ด้วยไพรเมอร์ PCR ไปข้างหน้า เอกลักษณ์ของการจัดลำดับได้รับการยืนยันโดยการจัดแนวลำดับแอมพลิคอนกับ หนึ่ง. stephensi การประกอบจีโนมโดยใช้ BLAST

การระบุตระกูลยีนภูมิคุ้มกันสมมุติ

การศึกษารูปแบบของวิวัฒนาการในยีนภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดช่วยให้เข้าใจพลวัตวิวัฒนาการของ หนึ่ง. stephensi และเชื้อโรคที่พวกมันอาศัยอยู่ โปรตีนภูมิคุ้มกันที่ดูแลด้วยตนเองทั้งหมด 1,649 รายการของ หนึ่ง. แกมเบีย (อากัม 385), เอ๋. อียิปต์ (แอ๊ก 422), ลูกบาศ์ก quinquefasciatus (Cpip 495) และ ง. melanogaster (Dmel 347) ใน ImmunoDB (ไฟล์เพิ่มเติม 8: ตาราง S8) [110] ถูกใช้เป็นฐานข้อมูลเพื่อค้นหาโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันสมมุติในลำดับโปรตีนที่มีคำอธิบายประกอบโดย MAKER2 ของ หนึ่ง. stephensi การประกอบโดยใช้การจัดตำแหน่งลำดับและวิธีการที่อิงจากการอนุมานสายวิวัฒนาการใน OrthoFinder v2.3.7 จำนวนออร์โธกรุ๊ปสำเนาเดียว/โปรตีนออร์โธโลกัส (หนึ่งต่อหนึ่ง) และโปรตีนร่วมและโปรตีนพาราโลกัสใน หนึ่ง. stephensi ถูกระบุ (one-to-many many-to-one many-to-many) (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ข้อความเสริม) [111]


ลำดับ

หลังจากการโคลนและการขยายพันธุ์ของโคลนในโฮสต์ที่เหมาะสม ดีเอ็นเออาจถูกจัดลำดับ โดยทั่วไป ปฏิกิริยาการจัดลำดับจะมีประสิทธิภาพมาก และแทบไม่ล้มเหลวในการสร้างข้อมูลบางส่วนเป็นอย่างน้อย แม้ว่าจะมีปัญหาหลายประการที่เกี่ยวข้องกับองค์ประกอบลำดับดีเอ็นเอที่อาจส่งผลต่อการเรียกฐาน แต่ปฏิกิริยาที่ล้มเหลวอย่างสมบูรณ์นั้นเกิดขึ้นได้ยาก

คุณภาพของ DNA อาจมีผลกระทบต่อประสิทธิภาพโดยรวม บ่อยครั้ง การโอเวอร์โหลดปฏิกิริยาการหาลำดับวงจรด้วยเทมเพลต DNA อาจส่งผลกระทบในทางลบ ดังนั้น เราขอแนะนำให้คุณกำหนดความเข้มข้นและมวลของ DNA ให้ถูกต้องก่อนทำการหาลำดับ

โดยปกติ หากผลการจัดลำดับไม่ดี แต่การขยาย DNA ของจีโนมประสบความสำเร็จตามที่ตัดสินโดยการสร้างภาพเจล ความเห็นพ้องต้องกันก็คือการปนเปื้อนและการยับยั้งจากจีโนม DNA ไม่ได้ส่งผลต่อผลลัพธ์ที่ไม่ดี ผลลัพธ์ที่ไม่ดีอาจเนื่องมาจากไพรเมอร์หรือรีเอเจนต์อื่นๆ ที่ใช้ใน ปฏิกิริยาการเรียงลำดับ

ผลการจัดลำดับโดยทั่วไปโดยใช้ illustra triplePrep Kit ซึ่งสามารถแยกจีโนม DNA, RNA ทั้งหมด และโปรตีนที่แปลงสภาพทั้งหมดออกจากตัวอย่างที่ไม่มีการแบ่งแยกเดี่ยว หรือ DNeasy™ Kit แสดงใน รูปที่ 4.2. คะแนน Phred สูง 20 คะแนนบ่งชี้ถึงคุณภาพของ DNA จีโนมสำหรับการใช้งานต่างๆ เช่น PCR และการจัดลำดับ


ประสิทธิภาพการกำหนดเป้าหมายและการกลายพันธุ์นอกเป้าหมาย

ประสิทธิภาพการกำหนดเป้าหมายหรือเปอร์เซ็นต์ของการกลายพันธุ์ที่ต้องการสำเร็จเป็นหนึ่งในพารามิเตอร์ที่สำคัญที่สุดในการประเมินเครื่องมือแก้ไขจีโนม ประสิทธิภาพการกำหนดเป้าหมายของ Cas9 เปรียบเทียบได้ดีกับวิธีการที่เป็นที่ยอมรับมากขึ้น เช่น TALEN หรือ ZFN (8) ตัวอย่างเช่น ในเซลล์ของมนุษย์ ZFN และ TALEN ที่ออกแบบเองสามารถบรรลุประสิทธิภาพตั้งแต่ 1% ถึง 50% (29&ndash31) เท่านั้น ในทางตรงกันข้าม ระบบ Cas9 ได้รับรายงานว่ามีประสิทธิภาพสูงถึง >70% ในปลาม้าลาย (32) และพืช (33) และอยู่ในช่วงตั้งแต่ 2&ndash5% ในเซลล์ต้นกำเนิด pluripotent ที่เหนี่ยวนำ (34) นอกจากนี้ Zhou และเพื่อนร่วมงานยังสามารถปรับปรุงจีโนมที่กำหนดเป้าหมายได้มากถึง 78% ในตัวอ่อนของเมาส์เซลล์เดียว และประสบความสำเร็จในการแพร่เชื้อของเชื้อผ่านการใช้ sgRNA คู่เพื่อกำหนดเป้าหมายยีนแต่ละตัวพร้อมกัน (35)

วิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการระบุการกลายพันธุ์คือการทดสอบการตรวจจับการกลายพันธุ์ T7 Endonuclease I (36, 37) (รูปที่ 3) การสอบวิเคราะห์นี้จะตรวจจับดีเอ็นเอเฮเทอโรดูเพล็กซ์ซึ่งเป็นผลมาจากการหลอมของสายดีเอ็นเอ รวมถึงการกลายพันธุ์ที่ต้องการด้วยสายดีเอ็นเอไวลด์ไทป์ (37)

รูปที่ 3 T7 Endonuclease I การทดสอบประสิทธิภาพการกำหนดเป้าหมาย

จีโนมดีเอ็นเอถูกขยายด้วยไพรเมอร์ที่ยึดตำแหน่งที่ดัดแปลง จากนั้นผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกแปลงสภาพและอบใหม่โดยให้ผลผลิต 3 โครงสร้างที่เป็นไปได้ ดูเพล็กซ์ที่ไม่ตรงกันจะถูกย่อยโดย T7 Endonuclease I จากนั้น DNA จะถูกแยกด้วยอิเล็กโตรโฟรีอิก และใช้การวิเคราะห์ชิ้นส่วนเพื่อคำนวณประสิทธิภาพการกำหนดเป้าหมาย

พารามิเตอร์ที่สำคัญอีกประการหนึ่งคืออุบัติการณ์ของการกลายพันธุ์นอกเป้าหมาย การกลายพันธุ์ดังกล่าวมีแนวโน้มที่จะปรากฏในตำแหน่งที่มีความแตกต่างเพียงไม่กี่นิวคลีโอไทด์เมื่อเปรียบเทียบกับลำดับดั้งเดิม ตราบใดที่พวกมันอยู่ติดกับลำดับ PAM สิ่งนี้เกิดขึ้นเนื่องจาก Cas9 สามารถทนต่อการไม่ตรงกันของเบสได้ถึง 5 รายการภายในขอบเขตโปรโตสเปเซอร์ (36) หรือความแตกต่างของเบสเดียวในลำดับ PAM (38) การกลายพันธุ์นอกเป้าหมายมักจะตรวจจับได้ยากกว่า ซึ่งต้องใช้การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อแยกแยะพวกมันออกทั้งหมด

การปรับปรุงล่าสุดสำหรับระบบ CRISPR สำหรับการลดการกลายพันธุ์นอกเป้าหมายได้เกิดขึ้นผ่านการใช้ gRNA ที่ถูกตัดปลาย (ถูกตัดให้สั้นลงภายในลำดับที่ได้มาจาก crRNA) หรือโดยการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ของกัวนีน (G) พิเศษสองตัวที่ปลาย 5´ (28, 37) อีกวิธีหนึ่งที่นักวิจัยพยายามลดผลกระทบนอกเป้าหมายคือการใช้ &ldquopaired nickases&rdquo (20) กลยุทธ์นี้ใช้ D10A Cas9 และ sgRNA สองอันประกอบกันกับพื้นที่ที่อยู่ติดกันบนเส้นตรงข้ามของไซต์เป้าหมาย (รูปที่ 2B) แม้ว่าสิ่งนี้จะกระตุ้น DSB ใน DNA เป้าหมาย แต่ก็คาดว่าจะสร้างเพียงชื่อเล่นเดียวในตำแหน่งนอกเป้าหมาย ดังนั้นจึงส่งผลให้เกิดการกลายพันธุ์นอกเป้าหมายน้อยที่สุด

โดยใช้ประโยชน์จากการคำนวณเพื่อลดการกลายพันธุ์นอกเป้าหมาย หลายกลุ่มได้พัฒนาเครื่องมือบนเว็บเพื่ออำนวยความสะดวกในการระบุไซต์เป้าหมาย CRISPR ที่เป็นไปได้ และประเมินศักยภาพของไซต์เหล่านั้นสำหรับความแตกแยกนอกเป้าหมาย ตัวอย่าง ได้แก่ CRISPR Design Tool (38) และ ZiFiT Targeter เวอร์ชัน 4.2 (39, 40)


เป้าหมายเวกเตอร์ความแตกต่างและเป้าหมายจีโนม - ชีววิทยา

Retroviruses ประกอบด้วยไวรัส RNA ที่ห่อหุ้มในตระกูลที่หลากหลาย ซึ่งน่าทึ่งสำหรับการใช้การถอดรหัสย้อนกลับของ RNA ของไวรัสลงใน DNA แบบเส้นคู่ในระหว่างการจำลองแบบและการรวม DNA นี้เข้ากับจีโนมของเซลล์เจ้าบ้านในภายหลัง สมาชิกในครอบครัวนี้ประกอบด้วยเชื้อโรคที่สำคัญ เช่น HIV-1 มะเร็งเม็ดเลือดขาวในแมว และไวรัสที่ก่อให้เกิดมะเร็งหลายชนิด อย่างไรก็ตาม ความสนใจในไวรัสเหล่านี้มีมากกว่าความสามารถในการก่อให้เกิดโรค ตัวอย่างเช่น การวิจัยในพื้นที่นี้นำไปสู่การค้นพบเนื้องอก ซึ่งเป็นความก้าวหน้าครั้งสำคัญในด้านพันธุศาสตร์มะเร็ง การศึกษาไวรัส retroviruses มีส่วนอย่างมากต่อความเข้าใจของเราเกี่ยวกับกลไกที่ควบคุมการแสดงออกของยีนยูคาริโอต นอกจากนี้ retroviruses ยังพิสูจน์ได้ว่าเป็นเครื่องมือวิจัยที่มีคุณค่าในด้านอณูชีววิทยา และมีการใช้อย่างประสบความสำเร็จในการบำบัดด้วยยีน

หนังสือเล่มนี้เขียนขึ้นโดยผู้เชี่ยวชาญด้าน retroviral ชั้นนำ หนังสือเล่มนี้เป็นการทบทวนเกี่ยวกับจีโนม อณูชีววิทยา และการเกิดโรคของไวรัสที่สำคัญเหล่านี้ ซึ่งครอบคลุมความก้าวหน้าล่าสุดทั้งหมดอย่างครอบคลุม หัวข้อรวมถึง: ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโฮสต์และองค์ประกอบย้อนยุค, ไวรัสย้อนยุคภายใน, โปรตีนและจีโนมของไวรัสย้อนยุค, การเข้าและการเปิดเผยของไวรัส, การถอดรหัสย้อนกลับและการรวมเข้าด้วยกัน, การถอดความ, การประกบและการขนส่ง RNA, การเกิดโรคของการติดเชื้อไวรัส, การเกิดโรคของการติดเชื้อไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่อง, ปัจจัยจำกัด retroviral วัคซีนโมเลกุลและ มีความสัมพันธ์กันของการป้องกัน, เวกเตอร์แกมมาเรโทรไวรัสและเลนติไวรัส, รีโทรไวรัสของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและปลาที่ไม่ใช่ไพรเมต, ไวรัสเรโทรจากภายนอก simian และ HTLV และ HIV การอ่านที่จำเป็นสำหรับนัก retrovirologist ทุกคนและข้อความแนะนำสำหรับห้องปฏิบัติการไวรัสวิทยาและชีววิทยาระดับโมเลกุลทั้งหมด

"บทที่ยอดเยี่ยมเกี่ยวกับ retroviruses ที่ไม่ใช่สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม, simian retroviruses, fish retroviruses, การใช้ retoviral vectors และปัจจัยด้านเซลล์ที่ จำกัด การติดเชื้อ retroviral บททั้งหมดมีภาพประกอบและเขียนอย่างสวยงามโดยเจ้าหน้าที่ที่เคารพนับถือมากที่สุดในภาคสนาม ฉันขอแสดงความนับถือ แนะนำหนังสือ "Retroviruses" ของ K และ B ให้กับทั้งนักเรียนและเพื่อนร่วมงานที่เชี่ยวชาญ" จากบล็อก Retrovirology

"ผลงานที่น่าประทับใจ ทรัพยากรจำนวนมากในสาขานี้ สถานะการวิจัยอย่างละเอียดโดยผู้เชี่ยวชาญชั้นนำ การอ่านที่จำเป็นสำหรับนักวิทยาศาสตร์สัตวแพทย์ แพทย์ นักไวรัสวิทยา และนักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษาในสาขานี้" จาก SciTech Book News (มีนาคม 2010)

"บทสรุปทางชีววิทยาที่กระชับและทันสมัย ​​ไม่เพียงแต่ไวรัสย้อนยุคเท่านั้น แต่ยังรวมถึงองค์ประกอบย้อนยุคอื่นๆ ด้วย งานอ้างอิงที่ครอบคลุม สะดวก และน่าพอใจ" จาก Microbiology Today (2010)

"แนะนำสำหรับนักวิจัยด้านชีววิทยาศาสตร์และนักศึกษาสาขาวิชาชีววิทยา" จาก Arzneimittelforschung (2010) 60:466-469

(EAN: 9781904455554 9781912530977 Subjects: [ไวรัสวิทยา] [จุลชีววิทยา] [จุลชีววิทยาทางการแพทย์] [จุลชีววิทยาระดับโมเลกุล] [จีโนมิกส์] )